CN116254282A - 一种调控谷子锈病抗性的SiPK6基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控谷子锈病抗性的SiPK6基因及其应用。本研究从谷子中分离和克隆到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因SiPK6，将该基因在谷子中超量表达后，得到锈病抗性提高的转基因植株，具体表现为：过表达SiPK6基因的株系与野生型株系相比，接种谷锈病菌后第14天，SiPK6转基因后代植株的叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低，抗病能力提高，说明SiPK6参与了谷子的抗锈病过程。因此，SiPK6基因对于提高谷子抗锈病性具有重要的理论和实际意义，将在谷子抗病育种改良中发挥作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控谷子锈病抗性的SiPK6基因及其应用。
技术背景
谷子(Setaria italica(L.)Beauv.)抗旱耐瘠、粮草兼用、营养丰富，分布于亚、欧等地。谷子在中国的种植面积和产量均居世界之首，是我国北方重要的杂粮作物。
谷子锈病由粟单胞锈菌(Uromyces setariae-italicae Yoshino)引起，是谷子生产上的主要气传流行性病害之一，一般减产10％～30％，流行年份植株倒伏，颗粒无收，严重影响着谷子的稳产和高产。随着谷子产业化水平的大幅提高，锈病流行年份危害更加严重，已经成为制约谷子产业发展的重要因素之一。防治谷锈病最经济有效的措施是培育和利用谷子抗锈品种，为此，广泛挖掘与克隆谷子抗锈及其相关基因是非常必要的前提。
凝集素类受体蛋白激酶(Lectin receptor-like kinases，LecRLKs)，是类受体激酶(Receptor-like kinases，RLKs)的一个家族，主要包括胞外凝集素lectin结构域、跨膜结构域和胞内激酶结构域，通过胞外凝集素区域与外界信号分子的识别与结合、胞内激酶结构域进行信号的传递，在植物生长发育和对生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用。LecRLKs根据胞外凝集素结构域差异分为三类：L、G和C型，其中L型是凝集素类受体激酶中的一个大家族，参与植物的抗病反应。目前已报道16个L型凝集素类受体激酶参与了植物抗病，其中拟南芥中11个。例如，拟南芥中的LecRK-V.5负调控气孔介导的免疫反应，基因突变后，植物会增加对丁香假单胞菌Pst DC3000的抗性，而降低对疫霉菌的抗性；过表达该基因会使植物易感染Pst DC3000。LecRK-V1.2参与抗丁香假单胞杆菌和胡萝卜软腐果胶杆菌，其表达受病原菌的诱导。小麦中LecRK-V的表达在白粉病菌Bgt接种后迅速上调，转入该基因的易感品种可显著提高其在苗期和成熟期的白粉病抗性，并且苗期转基因植株高抗多种Bgt分离株，表明LecRK-V对白粉病具有广谱抗性；并且其在大麦中的同源基因Rphq2和Rphq22也参与了抗叶锈病反应。因此，L型凝集素类受体激酶广泛参与植物的抗病反应。目前，谷子中L型凝集素类受体激酶尚未有报道。
发明内容
本发明提供了一种调控谷子锈病抗性的SiPK6基因及其应用。本发明从谷子中分离和克隆到SiPK6基因，编码L型凝集素类受体激酶，将其全长CDS连接到ubiqutin(缩写为Ubi)启动子启动的表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子。实验证实接种谷锈病菌后第14天，SiPK6转基因后代植株的叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低，提高了谷子抗锈病性。
为实现发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种调控谷子抗锈病的SiPK6基因，所述SiPK6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述SiPK6基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码产生的SiPK6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了所述的SiPK6基因在提高谷子抗谷子锈病中的应用。
进一步的，将含有SiPK6基因的过表达载体转化到谷子中，获得具有锈菌侵染后的谷子叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低的谷子株系。
进一步的，所述含有SiPK6基因的过表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与Ubi启动的pTCK303表达载体连接获得的。
进一步的，所述基因克隆的引物序列为：
PK6-F：5’-ATGCCTCTCGAGCTTCTCC-3’；
PK6-R：5’-CCTTCCTCCAGAGAGATCAG-3’。
进一步的，过表达SiPK6基因的株系与野生型株系相比，谷锈菌侵染后第14天谷子叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低，从而提高了谷子的抗锈病性。
进一步的，在未接菌条件下，过表达SiPK6基因的株系与野生型株系相比，籽粒大小没有明显变化。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
本发明将SiPK6基因全长CDS连接到Ubi启动的pTCK303表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子，经实验验证SiPK6基因过表达可以使接种谷锈菌后第14天的谷子转基因株系的叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低，从而提高了谷子的抗锈病性。SiPK6基因属于植物凝集素类受体蛋白激酶家族基因。鉴于SiPK6基因在转基因谷子中呈现的表型，能够认为该基因对于提高谷子抗病性具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
附图说明
图1是构建的过表达载体的示意图以及酶切位点。其中，表达载体为pTCK303，启动子为Ubi，目的基因SiPK6两端的酶切位点分别为KpnⅠ和SpeⅠ。
图2A为克隆得到目的基因SiPK6的示意图，大小为2016bp；图2B为目的基因连接到pTCK303表达载体所得到的阳性克隆。
图3为转基因株系阳性苗表达量鉴定。
图4A为转基因株系Ubi︰︰SiPK6与野生型Ci846接种锈菌后第14天的叶片示意图；图4B为转基因株系Ubi︰︰SiPK6与野生型Ci846接种锈菌后第14天的叶片严重度统计数据。
图5A、5B、5C分别为转基因株系Ubi︰︰SiPK6与野生型Ci846粒长、粒宽、千粒重统计数据。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1：SiPK6转基因株系的获得
一、谷子SiPK6基因的序列克隆与载体构建：
本发明利用谷子参考基因组数据库phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Sitalica_v2_2)找到基因SiPK6。SiPK6基因序列全长为2322bp(序列如SEQ ID NO.1所示)，CDS序列为2016bp(序列如SEQ IDNO.2所示)，其编码产生的SiPK6蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。
根据SiPK6基因的CDS序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：
(1)RNA的提取：使用植物组织RNA快速提取试剂盒(天根#DP452)提取谷子的总RNA。
(2)反转录cDNA第一链的合成：将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用Fastking cDNA第一链合成试剂盒(天根#KR116)进行反转录。
取3μg总RNA，5×gDNA Buffer，置于42℃孵育3min进行基因组DNA的去除；在gDNA去除的管中加入10×King RT Buffer 2μL，FastKing RT Enzyme Mix 1μL，FQ-RT PrimerMix 2μL，补水到20μL，42℃孵育15min，95℃失活3min，得到cDNA溶液。
(3)SiPK6基因的克隆：
上游引物5’-GGTACCATGCCTCTCGAGCTTCTCC-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物5’-ACTAGTTCACCTTCCTCCAGAGAGATC-3’(SEQ ID NO.5)；
其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为KpnⅠ，下游引物的酶切位点为SpeⅠ。
以谷锈菌侵染后的十里香叶片cDNA为模板，使用诺唯赞高保真酶(Vazyme#P520)进行扩增。50μL PCR反应体系：2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)25μL、模板DNA 2μL、10μmol/L上下游引物各2μL、灭菌ddH2O 19μL。PCR扩增程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火5s，72℃延伸5s，35个循环反应；最后72℃再延伸1min。
反应结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒(美基生物#D2111)说明书步骤对目的条带(图2A)进行切胶回收。
(4)取上述3μL胶回收产物与酶切后的Ubi启动的pTCK303表达载体进行连接(图1)，操作步骤按照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(诺唯赞#C115)说明书进行。连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(Kan+)的LB平板上生长过夜。挑取白色单菌落至LB液体培养基(Kan+)振荡过夜培养，使用DNA聚合酶(康为世纪#CW0690)进行菌落PCR(图2B)，PCR检测20μL体系：2×Es Taq MasterMix(Dye)10μL、模板DNA2μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL、灭菌ddH2O 7μL。PCR扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环反应；最后72℃再延伸5min。
(5)序列测定：将阳性克隆的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。
二、谷子SiPK6的遗传转化和纯合转基因株系的筛选
将测序正确的阳性克隆在LB液体培养基(Kan+)中扩大培养，使用高纯度质粒提取试剂盒(美基生物#P1001)提取质粒DNA。
取2μL质粒转化至农杆菌EHA105，侵染谷子胚性愈伤组织细胞。谷子胚性愈伤组织细胞来自谷子的野生型品种Ci846。通过潮霉素筛选，得到Ubi︰︰SiPK6/Ci846的过表达材料。通过Real-time PCR检测，获得#7、#14，#15三个稳定过表达转基因材料。
实施例2：SiPK6影响植株对锈病的抗性
一、过表达SiPK6转基因株系的锈病抗性表型
1、将野生型谷子Ci846作为对照，对获得的纯合转基因材料Ubi︰︰SiPK6进行SiPK6基因表达量检测。结果如图3所示，与野生型Ci846相比，转基因材料#7、#14，#15中的SiPK6基因的表达量均明显上升，证明本发明确实获得了过表达SiPK6的谷子转基因株系。
2、将谷子转基因株系Ubi︰︰SiPK6和野生型谷子Ci846于相同条件下进行栽培种植，于6叶期进行谷锈菌接种鉴定。对接种后第14天的转基因株系Ubi︰︰SiPK6与野生型Ci846的发病叶片上夏孢子堆进行观察和统计，结果如图4所示，与野生型相比，谷子转基因株系的叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小，具体表现为夏孢子堆占叶面积的比例降低了约24％。
二、过表达SiPK6转基因株系的农艺性状表型
对成熟后转基因株系与野生型Ci846的粒长、粒宽、千粒重进行测量和统计，结果如图5所示，过表达SiPK6的转基因株系的粒长、粒宽、千粒重均与野生型相似，没有明显变化。
上述结果表明，SiPK6基因可以降低谷子叶片上锈菌夏孢子堆的数量，而不影响谷子籽粒大小，进而SiPK6基因在提高谷子锈病抗性上具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种调控谷子锈病抗性的SiPK6基因，其特征在于，所述SiPK6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的调控谷子锈病抗性的SiPK6基因，其特征在于，所述SiPK6基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码产生的PK6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的SiPK6基因在用于提高谷子抗锈病性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将含有SiPK6基因的过表达载体转化到谷子中获得具有抗锈病性提高的谷子株系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述含有SiPK6基因的过表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与Ubi启动的pTCK303表达载体连接获得的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因克隆的引物序列为：
PK6-F：5’-ATGCCTCTCGAGCTTCTCC-3’；
PK6-R：5’-TCACCTTCCTCCAGAGAGATC-3’。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达SiPK6基因的株系与野生型株系相比，接种谷锈菌后第14天谷子叶片上锈菌夏孢子堆数量减少、占叶面积的比例变小、严重度降低，从而提高了谷子的抗锈病性。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达SiPK6基因的株系与野生型株系相比，谷子的籽粒大小没有明显变化。
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