CN118048339A - 一种杨树gstf12基因及其在植物抗盐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杨树GSTF12(PtrGSTF12)基因及其在植物抗盐性中的应用，属于功能基因技术领域。本发明从杨树中扩增得到一个phi类GST编码基因PtrGSTF12，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。实验表明，所述PtrGSTF12通过正调控发挥在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

Description

一种杨树GSTF12基因及其在植物抗盐性中的应用

技术领域

本发明属于功能基因技术领域，具体涉及一种杨树GSTF12(PtrGSTF12)基因及其在植物抗盐性中的应用。

背景技术

谷胱甘肽s-转移酶(GSTs)是一个由庞大基因家族编码的蛋白质超家族，广泛分布于原核生物和真核生物(昆虫、哺乳动物和高等植物中)，其中在植物生长发育过程中起着至关重要的作用。据报道，在高等植物中，GSTs在植物应对外源伤害及多种逆境环境中具有重要作用，例如玉米GSTs具有消除三氮苯类除草剂阿特垃津对玉米的毒性，同时还有研究表明玉米对异丙甲草胺、丙草丹的抗性与体内GSTs活性密切相关。此外，在小麦、高粱、烟草等作物的研究中，发现了GSTs活性预期对除草剂抗性密切关系。另外还有一些研究发现，GST活性还与植物对重金属离子、热激作用、病原菌因子，外源植物激素等多种毒害作用的抵抗能力有关。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杨树来源的GSTF12，具有提高植物耐盐性和促进植物生长的功能。

本发明提供了一种杨树来源的GSTF12，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种杨树来源的GSTF12基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种重组载体，包含所述杨树来源的GSTF12基因。

优选的，所述重组载体的骨架载体包括植物表达载体。

本发明提供了一种重组菌株，包含所述杨树来源的GSTF12基因或所述重组载体。

优选的，所述重组菌株的宿主菌株包括原核表达系统类型菌株和真核表达表达系统类型菌株。

本发明提供了所述杨树来源的GSTF12、所述杨树来源的GSTF12基因、所述重组载体或所述重组菌株在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

本发明提供了PtMYB108基因联合所述杨树来源的GSTF12基因在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

优选的，所述植物包括木本植物和/或草本植物。

优选的，所述木本植物包括杨树；

所述草本植物包括烟草。

本发明提供了一种杨树来源的GSTF12，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明从杨树中分离到一个phi类GST编码基因PtrGSTF12，该基因在盐胁迫下的表达显著上调。将所述PtrGSTF12在烟草中过表达，结果表明，与野生型(WT)相比，转基因烟草表现出显著的耐盐性，并且在盐胁迫下，转基因烟草植株株高和根长显著增加，同时转基因烟草中活性氧积累减少，具有更高的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性，丙二醛含量降低等生理优势。实时定量聚合酶链反应实验表明，过表达PtrGSTF12可增强植株中盐胁迫相关基因的表达。此外，通过酵母单杂交实验和荧光素酶互补实验发现，参与杨树耐盐性的MYB转录因子PtMYB108可以直接激活PtrGSTF12基因的启动子。综上所述，所述PtrGSTF12通过正调控提高植物的耐盐性，并同时促进植物在含盐环境中的快速生长。

附图说明

图1为本发明提供的PtGSTF12与其他物种GST基因的比对和聚类分析结果，其中A为杨树GSTF家族基因的系统发育树，B为杨树GSTF基因结构，C为GSTF蛋白的保守基序，D为基于杨树GSTFs及其同源蛋白的系统进化树；

图2为本发明提供的杨树中PtGSTF12在不同胁迫处理下的表达情况，其中A为PtrGSTF12启动子分析，B为PtrGSTF12在NaCl、PEG、水杨酸、MeJA和低氮条件下的相对转录水平，C为用0、50、100、150和200mM NaCl处理48h后PtrGSTF12的表达水平，D为用150mMNaCl处理0、6、24、48h后PtrGSTF12的表达水平；

图3为过表达PtGSTF12的转基因烟草植株抗盐性验证结果，其中A为构建过表达载体，B为通过PCR验证过表达系，C为转基因烟草植株中PtrGSTF12转录水平，D为不同NaCl浓度下WT和转基因烟草株系的表型，E为不同NaCl浓度下WT和转基因烟草株系的根长，F为不同NaCl浓度下WT和转基因烟草株系的株高；

图4为过表达PtGSTF12的转基因烟草植株生理生化指标检测结果，其中A为不同NaCl浓度下WT和转基因烟草株系苗期表型变化，B为盐胁迫下WT和PtrGSTF12过表达植株的DAB染色，C为盐胁迫下WT和PtrGSTF12过表达植株的NBT染色，D为盐胁迫下WT和过表达植株的SOD含量，E为盐胁迫下WT和过表达植株的POD含量，F为盐胁迫下WT和过表达植株的CAT含量，G为盐胁迫下WT和过表达植株的MDA含量；

图5为过表达PtGSTF12的转基因烟草植株在盐胁迫下中氧化相关基因表达量变化情况；

图6为转录因子PtMYB108直接结合并激活PtGSTF12的启动子的验证结果，其中A为PtrGSTF12启动子中MBS的分布，B为PtrMYB108与PtrGSTF12启动子在体外直接结合的酵母单杂交分析，C为酵母单杂交的MBS序列，D为酵母单杂交分析PtrMYB108与PtrGSTF12启动子中的MBS直接结合，E为双荧光素酶报告实验的Effecter和Reporter示意图，F为PtrMYB108与PtrGSTF12启动子直接结合的双荧光素酶报告基因分析。

具体实施方式

本发明提供了一种杨树来源的GSTF12，氨基酸序列如SEQ ID NO:1(MVVKVYGPAMAVCPQRVMACLLEKGVEFDLVHVDLDSGEQKLPEFLLKQPFGQ VPVVEDGDFKLFESRAIIRYYAAKYEDRGPNLLGNTLEEKALVDQWLEIEAHNFND LVFNIVFQVVILPRIGQQGDSELVRTYEEKLEKVLDVYEQRLSKSKYLAGDSFTLAD LSHLPATRYLVNEAGLGHLVKDRKKLNAWWEDISSRPAWKKLINLAGF)所示。

本发明提供了一种杨树来源的GSTF12基因(PtGSTF12)，核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ATGGTTGTTAAAGTGTATGGTCCAGCCATGGCTGTTTGCCCACAAAGGG TCATGGCTTGCCTCTTAGAGAAAGGAGTGGAATTTGATCTTGTACATGTTGATCTTGATTCCGGTGAGCAGAAGCTACCTGAATTCCTCCTCAAACAGCCTTTTGGGCAAGTTCCTGTTGTTGAAGATGGTGATTTCAAGCTTTTTGAGTCCAGAGCAATCATAAGATACTATGCAGCAAAGTATGAAGACCGTGGACCGAATCTACTCGGAAATACACTAGAAGAGAAAGCTCTGGTAGATCAATGGCTAGAAATTGAAGCCCACAACTTCAATGATCTGGTGTTCAATATAGTCTTCCAAGTTGTAATCCTGCCAAGAATTGGGCAGCAAGGTGACTCCGAGCTGGTCAGGACTTACGAGGAAAAGCTAGAGAAGGTGTTGGATGTGTATGAGCAAAGGTTGTCAAAGAGCAAATATTTAGCTGGAGATAGCTTCACTCTTGCTGATTTAAGCCATCTGCCTGCCACCAGATACCTAGTCAACGAAGCTGGATTAGGGCACTTGGTGAAGGACAGAAAGAAATTGAATGCTTGGTGGGAGGACATTTCAAGCAGGCCTGCTTGGAAGAAACTGATAAATCTTGCTGGCTTCTAG)所示。

在本发明中，所述PtGSTF12利用引物从杨树中经PCR扩增得到。所述杨树优选为84K杨树。所述引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。所述PCR扩增的反应体系优选为50μl，包括以下组分：10×PCR Buffer forKOD-Plus-Neo 5μl、DNA模板1μl、2mM dNTPs 5μl、引物(10μM each)1.5μl、KOD-Plus-Neo(1U/μl)1μl、ddH₂O 32μl。所述PCR扩增的程序优选为94℃2min，98℃10s，58℃30s，68℃1min，34个循环；68℃1min，68℃7min。

在本发明中，由基因结构分布分析表明，所述PtGSTF12具有GST家族典型的GST活性结合位点和GST家族高保守位点。此外，通过预测目标基因的启动子中顺式作用元件可知，所述PtGSTF12含有多种MYB转录因子结合元件和各种植物激素反应元件，如生长素反应元件、赤霉素反应元件、水杨酸反应元件和脱落酸反应元件。组织表达特异性检测结果表明，PtGSTF12在杨树的根茎叶中均有表达。

此外，本发明还验证了所述PtGSTF12在盐胁迫后的响应，结果表明，150mM NaCl处理后，所述PtGSTF12在叶中显著上调表达，可能参与盐胁迫响应。本发明实施例进一步开展了不同盐浓度胁迫以及不同时间盐胁迫后基因的表达量，结果表明，所述PtGSTF12的表达量随盐浓度升高而升高，在50mM NaCl处理下PtGSTF12的表达达到最高，同时在盐胁迫48h时，PtGSTF12的表达达到最高。

本发明提供了一种重组载体，包含所述杨树来源的GSTF12基因。

在本发明中，所述重组载体的骨架载体优选包括植物表达载体。在本发明实施例中，所述植物表达载体优选为pBI121。在本发明实施例中，所述pBI121用于转基因植物的构建。PtGSTF12在pBI121质粒的克隆位点为CaMV 35S启动子的下游。本发明对重组载体的构建方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的重组载体的制备方法即可，例如基因合成或同源重组的方法克隆。

本发明提供了一种重组菌株，包含所述杨树来源的GSTF12基因或所述重组载体。

在本发明中，所述重组菌株的宿主菌株优选包括原核表达系统类型菌株和真核表达表达系统类型菌株。所述原核表达系统优选包括农杆菌。在本发明实施例中，包含所述PtGSTF12的重组载体在农杆菌的介导下转化植物中，用于验证PtGSTF12的生物学功能。

本发明提供了所述杨树来源的GSTF12、所述杨树来源的GSTF12基因、所述重组载体或所述重组菌株在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

在本发明中，所述植物优选包括木本植物和/或草本植物。所述木本植物优选包括杨树。所述草本植物优选包括烟草。所述盐优选包括氯化钠。所述含盐环境优选包括盐化水体和/或盐渍土壤。所述盐的浓度为75mM以上，更优选为100～200mM，最优选为150mM。

在本发明中，开展了盐胁迫处理杨树后使PtGSTF12基因上调表达，且表达随盐浓度升高呈先升高后降低的趋势，在150mM时PtGSTF12基因表达量达到最高值。同时，PtGSTF12基因表达量随着盐胁迫处理时间延长而升高。为了进一步明确PtGSTF12基因与植物抗盐性的关系，将PtGSTF12基因的编码序列转化至植物中过表达，结果表明，在盐胁迫下，转基因植株的生长状态显著优于对照(野生型植株)，并且在盐胁迫下，转基因植株的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性高于对照。本发明还测定转基因植株中与耐盐相关的基因的表达情况，在盐胁迫条件下，与对照相比，转基因植株中氧化相关基因(NtSOD、NtPOD和NtCAT)和MYB转录因子基因(NtMYB81、MYB102、NtMYB103、NtMYB127和NtMYB149)的表达也上调。此外，本发明通过测定根长和株高发现，在盐胁迫下，转基因植株的株高和根长均显著高于野生型植株，这表明，所述PtGSTF12基因不仅能提高植物的抗盐性，还能促进植物在盐化环境中的生长。

本发明提供了PtMYB108基因联合所述杨树来源的GSTF12基因在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

在本发明中，所述PtMYB108的核苷酸序列如SEQ ID NO：36(ATGATGGATGTTGAAGGCAACAGCAACAGCTCCTCCTCCACCACACAAAGTGATGAAGAGATGATGGTTGACTTAAGAAGAGGTCCATGGACTGTTGAAGAAGACTTCAAGCTTATCGATTACATTGCTACTCATGGTGAGGGACGCTGGAATTCTCTGGCTCGCTGTGCAGGCCTCAAACGAACTGGAAAGAGTTGCAGATTAAGATGGCTCAACTATCTAAGGCCTGATGTTCGACGTGGAAACATTACTCTCGAAGAACAACTCATGATCCTTGAACTTCATTCTCGATGGGGCAATCGATGGTCTAAAATTGCACAACACTTGCCAGGGAGAACCGACAATGAAATCAAGAATTATTGGAGAACCCGAGTACAAAAGCACGCAAAACAACTTAAATGTGACGTGAATAGCAAGCAATTCAAGGACACCATGAGATACCTATGGATGCCTAGGTTAATTGAAAGAATTCAAGCTGCGGCAGCTGCCACCAGCAGCAGCACTGCCACATCTGCTTCCCCGGCTGCTTCCACTAATCACCACTTGATCAATAATAATGACGTTGGCACTGGTAACTTGGTCATGCCACATGGAGTCATCGGCAATGACTTTGGTGTCTCACATGTTACACCAAGTTACACCCCGGAGAATTCCAGCACTGCTGCCTCGTCGGACTCGTTTGCTGCTCAAGTTTCGCCTGTTTCGGACTTGACTACTGATTATTACTATATCCCGGTTAATCATAACCCTAATCCGGATTATTTCCAAGCTGACCAAGGTGGTTACTCAGAGTCCATGATCAGTCCTGCTGGTTATTTTAACCAAGGATTAGATTTCCAAGCTATGGAGCACAACAGCAATCAATGGCTAATGGAAAGTGGAGACACATCGGACAACTTGTGGAATCCTGAGGATATTTGGTTCTTACAGCAGCAGATGAATTACAACATGTGA)所示。所述PtMYB108是一个关键的R2R3 MYB转录因子，控制着杨树的耐盐性。实验表明，所述PtMYB108通过特异性结合PtGSTF12基因启动子中MBS3元件(CAACTG)，激活PtGSTF12基因的启动子。

下面结合实施例对本发明提供的一种杨树来源的GSTF12及其在植物抗盐性和/或促进植物生长中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.材料与方法

1.1.植物材料与生长环境

84K杨(Populus alba×P.glandulosa)无性系组培苗用于本实验。组培苗在含有约80ml生根培养基的组培瓶中生长。培养条件：光照强度为6000～8000勒克斯，光照/黑暗周期为16h/8h，平均温度为25℃，相对湿度为60％～70％。

为了检测PtGSTF12的组织表达模式，组培苗杨树生长一个月后，选择健壮的组培苗，用流水将根部培养基洗净，在Hoagland溶液(Coolaber,Beijing，China)中继续培养一个星期，将生长状态一致的植株平均分为5组，分别用150mMNaCl溶液、5％PEG溶液、低氮、100μM茉莉酸和100μM水杨酸处理48h，用水处理48h作为对照。然后，收集杨树根茎叶样品于液氮中速冻，放于-80℃冰箱中备用。

大花烟草(Nicotiana alataLinket Otto)组培苗用于本实验。对于烟草转基因株系的盐处理，烟草转基因株系组培苗先在组培瓶生长一个月左右，之后移到土里生长一个星期，之后分别用0mM NaCl和150mM NaCl的Hoagland液浇灌两周，拍照，取材，样品于液氮中速冻，放于-80℃冰箱中备用。本氏烟草(Nicotiana benthamiana)用于本实验，在23℃的恒温温室中培养(光照16h/黑暗8h，4200勒克斯)。

1.2.PtGSTF12的生物信息学分析

PtGSTF12(Potri.017G138800)的CDS序列(SEQ ID NO:2)在Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)网站上获得，并通过正向引物(CGTCTAGAATGGTTGTTAAAGTGTATG，SEQ ID NO:3)和反向引物(CGGGTACCGAAGCCAGCAAGATTTATCA，SEQ ID NO:4)对该基因进行克隆。

具体方法如下：

扩增体系如下：

扩增条件为：

使用Pfam(https://www.evolgenius.info//evolview/#login)鉴定了PtGSTF12及杨树GSTF家族基因(PtrGSTF1(Potri.002G015100.1)、PtrGSTF2(Potri.002G015200)、PtrGSTF3(Potri.014G132200.1)、PtrGSTF4(Potri.T035400)、PtrGSTF5(Potri.T035300.1)、PtrGSTF6(Potri.T035100.1)、PtrGSTF7(Potri.T035000.1))的结构域分布。使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站预测PtGSTF12启动子上的顺式作用元件。通过MEGA6，EvolView(https://www.evolgenius.info//evolview/#login)和Ensembl(http://ensem bl.grame ne.org/)构建PtGSTF12的进化树，并通过DNAMAN对PtGSTF12及其同源物的氨基酸序列进行比对。这些蛋白质包括来自拟南芥的AtTT19(Q9FE46)，来自葡萄的VvGST4(Q56AY1)，来自棉花的GhGSTF12(A0A1U8P0Y8)，来自荔枝的LcGST4(A0A0U4AVK2)，来自桃的PpGST1(M5WTI5)。

1.3.杨树的基因表达模式

通过qRT-PCR鉴定了正常生长下杨树的根、茎和叶中PtGSTF12的表达量，以及检测分别经150mM NaCl、5％PEG、低氮、茉莉酸和水杨酸处理48h后的基因表达水平。qRT-PCR的具体步骤如下：

(1)反转录cDNA

首先对杨树的根、茎和叶样品进行总RNA的提取，之后在RNase free PCR管中，完成反转录的同时实现基因组DNA的去除。按照下列配比配制反转录体系如表1：

表1反转录体系

将上述体系轻轻混匀，于PCR仪中42℃孵育15min，之后85℃加热5s使RT/RI和gDNARemover彻底失活，产物保存在-20℃。

(2)qRT-PCR验证

反转录生成的cDNA按照各自的浓度分别稀释不同的倍数，使各样品的终浓度保存一致，按照表2所示qPCR反应体系进行配制：

表2 qPCR反应体系

其中：内参引物为

qPag18SF:CGAAGACGATCAGATACCGTCCTA(SEQ ID NO:5)；

qPag18SR:TTTCTCATAAGGTGCTGGCGGAGT(SEQ ID NO:6)；

PtGSTF12的定量引物为：

qGSTF12F:AGAATTGGGCAGCAAGGTGA(SEQ ID NO:7)；

qGSTF12R:TGGCAGGCAGATGGCTTAAA(SEQ ID NO:8)。

将上述体系轻轻混匀，于AppliedBiosystems 7300/7500仪中采取两步法进行RealTime PCR扩增，扩增程序如下：

Stage 1：预变性95℃，30秒，一个循环；

Stage 2：PCR反应，95℃(5秒)，60℃(32秒)，40个循环；

Stage 3：95℃(15)，60℃(60秒)，95℃(15秒)。

每个样品进行三次技术重复和三次生物学重复。数据导出后，利用LinRegPCR软件计算表达量。

为了进一步检测PtGSTF12对盐胁迫的响应，用不同浓度的盐处理杨树，并在150mM盐处理下的不同时间点进行取材，qRT-PCR检测PtGSTF12的表达。简单地说，使用RNAprep纯植物试剂盒(天根生物技术(北京)有限公司)从1g植物组织中分离总RNA。使用Nanodrop-ND-2000分光光度计(Thermo Fisher Sci-entific)对RNA进行定量，并在1％琼脂糖上检查RNA。然后使用PrimeScript IV第一链cDNA合成混合物(代码6215A)将RNA逆转录成cDNA。将所得cDNA产物用作PCR扩增的模板，并使用TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(代码RR420A/B)进行RT-qPCR。作为内部对照，杨树Actin-7(GenBankID:LOC7492024)用于使用2^-ΔΔCT方法量化每个靶基因转录物的相对表达。使用三个生物重复分析每种组织类型(Cq平均值＝24.65)。

1.4.转基因烟草的构建

将基因PtGSTF12的CDS克隆到pBI121表达载体中XbaI和KpnI多克隆位点处，位于CaMV 35S启动子的下游。将重组载体转移到农杆菌菌株GV3101中，并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。不定芽长到2cm后，将其转移到含有0.1 mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)的生根培养基中。为了鉴定转基因烟草，使用十六烷基-三甲基溴化铵(CTAB)方法提取植物的基因组DNA(gDNA)。然后，使用引物(OE-Nt-DNAF:AGGTGGCTCCTACAAATGCC，SEQ ID NO:9；OE-Nt-DNAR:CGAGTAGATTCGGTCCACGG，SEQ ID NO:10)，通过PCR鉴定阳性PtGSTF12过表达株系。

为了确认转化烟草系的表达水平，使用EASY旋转试剂盒(Aidlab，中国北京)提取总RNA。然后根据产品说明书，使用5×TRUE RT Mix(Aidlab，中国北京)合成第一链cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq(Takara，大连，中国)评估基因表达水平。ACTIN基因(XM_016618073)被用作内部对照，以计算基因的相对表达水平。涉及的引物序列如下：

ACTIN引物为qNtActinF:GCTGGTCGTGACTTGACTGA(SEQ ID NO:11)；

qNtActinR:AAAGGACTTCAGGGCATCGG(SEQ ID NO:12)。

PtGSTF12的定量引物为：

qGSTF12F:AGAATTGGGCAGCAAGGTGA(SEQ ID NO:13)；

qGSTF12R:TGGCAGGCAGATGGCTTAAA(SEQ ID NO:14)。

1.5.DAB和硝基蓝四氮唑(NBT)染色

将长势相同的野生型和过表达植株的新长出的叶片剪下放入培养皿中，加入10mlDAB或NBT染色液，使染色液浸没叶片，在黑暗中放置12h以上。倒掉染色液，加入漂白液(乙醇：乙酸：甘油＝3:1:1，体积比)，放置在沸水中煮沸10～15min，然后更换漂白液，培养30min，观察叶片的颜色变化并拍摄图像。

1.6.抗氧化酶活性和丙二醛含量的测定

使用相应的商业试剂盒，按照制造商的方案(北京索拉生物科技有限公司，北京，中国)测定过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。通过先前描述的方法(Song,Y.,Li,S.,Sui,Y.,Zheng,H.,Han,G.,Sun,X.,Yang,W.,Wang,H.,Zhuang,K.,Kong,F.,Meng,Q.,Sui,N.,2022.SbbHLH85,a bHLH member,modulatesresilience to salt stress by regulating root hair growth insorghum.Theoretical and Applied Genetics 135,201-216.https://doi.org/10.1007/s00122-021-03960-6)，测定丙二醛(MDA)的含量。

1.7氧化相关基因的表达情况

利用qRT-PCR技术测定PtrGSTF12转基因植株中，氧化相关基因(NtSOD、NtPOD和NtCAT)和MYB转录因子基因(NtMYB81、MYB102、NtMYB103、NtMYB127和NtMYB149)的表达。其中涉及的各基因引物如下：

qNtSOD-F:GACCTTCTCGCTGCCGGAT(SEQ ID NO:15)；

qNtSOD-R:AGAGCCCTGTAAAGCAGCAC(SEQ ID NO:16)；

qNtPOD-F:TGGCTCCTTCTTCTTTAGCAATTT(SEQ ID NO:17)；

qNtPOD-R:AGCTTGCTGAATAACATTTTGCAC(SEQ ID NO:18)；

qNtCAT-F:GGATCTTGTCCAACGATCAGC(SEQ ID NO:19)；

qNtCAT-R:AGCTGGGAGCTGCAAATAGT(SEQ ID NO:20)；

qNtMYB081-F:GAAAGAGTTGTAGGCTTCGTTG(SEQ ID NO:21)；

qNtMYB081-R:TCGGGTGGTTTCACTGTATATT(SEQ ID NO:22)；

qNtMYB102-F:CGAAGAAGACGAGCTTTTACAG(SEQ ID NO:23)；

qNtMYB102-R:TAATGGTCTCATCTTCTTCGGG(SEQ ID NO:24)；

qNtMYB103-F:GCTGAAAACATAGCGAAATTGC(SEQ ID NO:25)；

qNtMYB103-R:GGAAAGTGACTCAAATTCCTCG(SEQ ID NO:26)；

qNtMYB127-F:AAGAATTACTGGAGAACCCGAG(SEQ ID NO:27)；

qNtMYB127-R:GCTTGAATTCTCTCAACTAGCG(SEQ ID NO:28)；

qNtMYB149-F:CTAACATCTGATCATCACCCGA(SEQ ID NO:29)；

qNtMYB149-R:ATCAAAGTATCAACGGACTCGA(SEQ ID NO:30)；

内参引物序列同上。

扩增条件为：同实施例1记载。

每个样品进行三次技术重复和三次生物学重复。数据导出后，利用LinRegPCR软件计算表达量。

1.8.酵母单杂交实验(Y1H)

首先将PtMYB108的CDS克隆到载体pJG4-5中KpnI和BamHI多克隆位点处，并将PtGSTF12的2000bp长度的启动子(ATGGCTATTGTCCTCAGTTATGGTTTTGC CCTTTTGTTTTCTTTTTGATACTTCTGTTGCGGTAAATAGGACCTTGCTAAGCTTTATCCTACAATGTTCTCATGATTACCAAGATCAGAAATTCATCTTTTCAGCAATCGAACAAATTAGCATTGTCATCACGCCAAACTAACAAAAGGATTAGCATTTCTGACTGAGAAATTTAGAATCATAGCTAGGATGTTCTTTCGATAATCGATAGTATCTTTTCCGCCTACTTTTGCTTATGATTGCGCAATGTTTTCGGATGTTGCAGGTTTGGGCATCCTTGCTGCTATATCGCCAAATACTAGACGAGATAGAGGCTAACGATTACAACAGCTTCACAAAGAGGGCATATGTGAGAAAAGCCAAGAAGATAGTTGCTTTGCCAGTTGCGTATGCAAAATCCCTCATTAGTCCATCATCGAGAGTGCCATCTCCTTTGGCAAAAACATAAACTGCAATATGAACTTGAAACTCAAATATTTTATACCTAGTGGATAAAATGGTTTAAATATTGTAATGTATATCAGCATGCAAGCATACATCCATACAGCAAGTATTCATTGAAAGTTAGAATGAAATTCAATTACATTTGAAGGCTTGAACTCTACAGTGAGTTGCAAAGAGCGAAACAAAATCATGTGGTTAGGCATTTTGCATTTCTAGCAACAGATTGGACGGCCTTCCTTTTGTGTCTTCAGAGTAATGTGGCCTTTGCTTTTAGGTCCATGTAGAGCTAACAAGATTTGAAGATCAGCACTAGACAAGTCACCAACTGAAAGAACAAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAGTGTAAAATATATCATTACCAAATTCTAAATGGTTGATCCACGCAGTATTCCCCCCCCCCCTGTAGATTCCACTTCTGAAACAAACGCAAAAGAAATGGATTCGGGAATGTTCATCGGAAATTAATTGAATGTAATGAAGGGAAGATAATCATTCGAGATGAAAGAATTGTAATATATGTTGTCCAAATCGGGAAAAAAGACCTTGCGTACTGCAACGCTTACTGAAAAAGACTTCAGGTGACCTTGACCTCGGGTGTGTTTTGAAGCGCTATGTTTTTAGAAGTTTTTTTTTTTTAAAATAAAGTATTATTTAATAATTTTAATGTATTAATATTAAAAATAAAAAAATTATTTTGAAAATCATGTTGTACTATAATCTTAAACACATACCTTGTAAAATATAAATGAAATCAAAATTAAAATTATTATAAATTTAATTATGAAAACATGAATTAAATATGTTAATTCAGATTGAGCCAGGTCAACTCAAAATATTATTATTTATTTTTTAAATCTAAATTAAATCAAGGATTGATATGTTTAAAAATTCTATCCTAATCAATTTTAAAAACAATAAATCAAACATATTTTGTAATTTAAAGAATTGAGATTTGCACTTTGATTCTCATTGTTTCTCAAAATATATTTAGGTTGAAAAGACATAAATTTGTAAAATAGTATTTTATATGTTTTTTTTTATAATCTTGAACTAAGGATAATTAAAATCATTAAAAATACATTTCCATCTTTAAAAGAAAAACAATTTTACTCACGTTAATTTTAATACTTATATAAAGTAGGTGTGATATCGTTTAGTAGGTAGACGATAATTTTCAAAATATATTTGGATATAAAAAAGCCATCGATTTACTCTCTTTCTTGTGTGTTTTCGATACAATAATGATAAAAAAAAACACCCTTAATATTTTTATTTTTTTAAAAAGCCTTTCAACTATATACTATACATGGTTAATGGATAATATTCATCCACTTGAACCCAAATAATTTAAAGTTCCCAAAGTTTGGCCTCCACCAACCGGTTGTTCTTGCATGTGACAACCCCCATAACCATAAAATGGGAAGAATTCATTCGATGTTGCTTTGACTTGCATGGCAAGCCTCGAGTTCTTGTTGCAGAGCTCACGTGACAACCCCCGGCTTATATC，SEQ ID NO:31)分别构建到载体pLacZi中KpnI和Sal I多克隆位点处。MBS序列是MYB转录因子的结合域。将PtGSTF12基因启动子区中的结合序列串联重复3-5次，人工合成为单链DNA，然后再变性为双链DNA，并连接构建MBS1-pLacZi、MBS2-pLacZi、MBS3-pLacZi、MBS4-pLacZi重组载体(MBS1：CCTCAGTTATGGCCTCAGTTATGGCCTCAGTTATGGCCTCAGTTATGG，SEQ ID NO:32；MBS2：TGCCAGTTGCGTTGCCAGTTGCGTTGCCAGTTGCGTTGCCAGTTGCGT，SEQ ID NO:33；MBS3：CACCAACTGAAACACCAACTGAAACACCAACTGAAACACCAACTGAAA，SEQ ID NO:34；MBS4：TATTTAGGTTGAATATTTAGGTTGAATATTTAGGTTGAATATTTAGGTTGAA，SEQ ID NO:35)。然后将组合质粒共转化到EGY48酵母细胞中，并在30℃下在SD/-Trp/-Ura培养基上培养三天，然后，将阳性克隆点在加入了5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷(X-a-gal)的SD/-Trp-Ura(SD/-Trp-Ura+X-a-gal)培养基上，30℃培养3～5d后观察并拍照。

1.9.双荧光素酶报告基因测定/瞬时双荧光素酶测定

将PtGSTF12的2000bp长度的启动子克隆到pGreen II0800-Luc中KpnI和XbaI多克隆位点处，构建LUC-PtGSTF12重组载体。将PtMYB108的CDS(ATGATGGATGTTGAAGGCAACAGCAACAGCTCCTCCTCCACCACACAAAGTGATGAAGAGATGATGGTTGACTTAAGAAGAGGTCCATGGACTGTTGAAGAAGACTTCAAGCTTATCGATTACATTGCTACTCATGGTGAGGGACGCTGGAATTCTCTGGCTCGCTGTGCAGGCCTCAAACGAACTGGAAAGAGTTGCAGATTAAGATGGCTCAACTATCTAAGGCCTGATGTTCGACGTGGAAACATTACTCTCGAAGAACAACTCATGATCCTTGAACTTCATTCTCGATGGGGCAATCGATGGTCTAAAATTGCACAACACTTGCCAGGGAGAACCGACAATGAAATCAAGAATTATTGGAGAACCCGAGTACAAAAGCACGCAAAACAACTTAAATGTGACGTGAATAGCAAGCAATTCAAGGACACCATGAGATACCTATGGATGCCTAGGTTAATTGAAAGAATTCAAGCTGCGGCAGCTGCCACCAGCAGCAGCACTGCCACATCTGCTTCCCCGGCTGCTTCCACTAATCACCACTTGATCAATAATAATGACGTTGGCACTGGTAACTTGGTCATGCCACATGGAGTCATCGGCAATGACTTTGGTGTCTCACATGTTACACCAAGTTACACCCCGGAGAATTCCAGCACTGCTGCCTCGTCGGACTCGTTTGCTGCTCAAGTTTCGCCTGTTTCGGACTTGACTACTGATTATTACTATATCCCGGTTAATCATAACCCTAATCCGGATTATTTCCAAGCTGACCAAGGTGGTTACTCAGAGTCCATGATCAGTCCTGCTGGTTATTTTAACCAAGGATTAGATTTCCAAGCTATGGAGCACAACAGCAATCAATGGCTAATGGAAAGTGGAGACACATCGGACAACTTGTGGAATCCTGAGGATATTTGGTTCTTACAGCAGCAGATGAATTACAACATGTGA，SEQ ID NO:36)插入pBI121载体中XbaI和KpnI多克隆位点处。将LUC-PtGSTF12的细菌悬浮液与等量的pBI121-PtMYB108的细菌悬浮物混合，然后转化为五周龄的烟草幼苗。经过一天的暗处理和两天的光处理后，使用专用的植物体内成像仪获得了烟叶的照片。

1.10.统计分析

数据以平均值±标准差表示，并使用SPSS 17.0版通过Duncan检验进行分析。不同的字母表示邓肯检验的平均值(0.05)之间存在显著差异。

2.结果

2.1.PtGSTF12是杨树GST家族基因的一个成员，具有典型的GST结构域

基因组注释确定了杨树中Phi类GST基因共有8个。这8个基因的聚类有三个分支，其中PtGSTF4、PtGSTF5、PtGSTF6聚为一类，PtGSTF3、PtGSTF7聚为一类，PtGSTF1、PtGSTF2、PtGSTF12聚为一类(图1)。从12个物种中选择了PtGSTF12及其同源物的氨基酸序列，通过邻居连接方法确定系统发育关系。结果表明，杨树GSTF家族基因中只有PtGSTF12与来自葡萄的VvGST4和来自于棉花的GhGST12聚为一类，三个蛋白质的序列相似性高达81.93％。PtGSTF12的645 bp CDS从84K杨中扩增，编码214个氨基酸，同源序列对比发现，PtGSTF12具有GST家族典型的GST活性结合位点和GST家族高保守位点，这表明，杨树中的PtGSTF12与含有典型GST结构域的各种其他GST蛋白质具有高度的序列相似性，可能具有相似的生物学功能。

2.2.PtGSTF12受到盐胁迫的强烈诱导

通过PlantCARE预测了PtGSTF12的2000bp长度启动子中的顺式作用元件。结果表明，它含有多种MYB转录因子结合元件和各种植物激素反应元件，如生长素反应元件、赤霉素反应元件、水杨酸反应元件和脱落酸反应元件(图2中A)。这表明PtGSTF12可能受到MYB基因的调节，并对各种植物激素产生反应。为了确定其功能，本实施例检测了该基因在各种杨树组织中的表达模式。结果表明，该基因在杨树的根茎叶组织中均有表达(图2中B)。

为了验证PtGSTF12在胁迫后的反应，通过qRT-PCR分析了PtGSTF12基因在150mMNaCl、5％PEG、低氮、茉莉酸、水杨酸处理48h下的表达模式。结果表明，PtGSTF12都受到一定程度的诱导或抑制，其中在150 mMNaCl处理下，PtGSTF12在叶中受强烈诱导，表明PtGSTF12可能参与杨树盐胁迫的响应(图2中B)。

为了进一步研究PtGSTF12在盐胁迫下的响应模式，还测定了不同盐浓度胁迫下和不同时间盐胁迫下该基因的表达量。结果显示，PtGSTF12的表达随着盐浓度的上升而上升，在150 mMNaCl处理下PtGSTF12的表达达到最高(图2中C)。而当150mMNaCl处理杨树幼苗不同时间时，PtGSTF12的表达在48h下达到最高，这表明它可能参与了杨树的盐胁迫反应(图2中D)。

2.3.PtGSTF12在烟草中的异源表达增强了植株的耐盐性

为了鉴定PtGSTF12的生物学功能，通过农杆菌介导的转化将CaMV 35S:PtGSTF12过表达载体引入烟草中。利用PCR技术筛选了8株过表达阳性植株(图3中B)。通过qPCR分析，在8株阳性植株中鉴定出PtrGSTF12基因的表达(图3中C)，并选择3株过表达植株(OE-1、OE-5和OE-15)进行后续实验(图3中D)。野生型和过表达烟草株系在生根培养基上生长一周之后，小心转移到75 mM NaCl和150 mMNaCl的培养基中，生长两周。在盐胁迫下，OE植株的生长表现优于WT对照。测定根长和株高发现，在正常条件下，烟草转基因株系的根长和株高与野生型植株的株高没有显著差异。在75和150mMNaCl胁迫条件下，转基因株系的植株高度和根长均高于野生型植株的植株(图3中E和F)。

通过DAB和NBT染色检测PtGSTF12过表达植株的耐盐性是否与生理生化变化有关。在正常条件下，DAB染色和NBT染色显示转基因烟草和野生型烟草叶片的颜色深度相似。然而，DAB染色显示，盐胁迫下WT植株的叶片颜色明显比转基因植株深(图4中B)。NBT染色显示，OE-PtrGSTF12植株的染色最轻，表明过表达PtGSTF12的植株含有的超氧化物自由基最少(图4中C)。此外，在盐胁迫下，转基因植株的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性高于WT植株(图4中D～F)。此外，尽管盐胁迫后所有植物的MDA含量都有所增加，但与WT植物相比，转基因植物的MDA含量增加并不明显(图4中G)。这些发现表明，转基因烟草植株比WT植株具有更高的活性氧清除能力，这可以从转基因植株中较低的活性氧积累得到证明。

为了进一步证实PtGSTF12在植物耐盐性中的作用，对盐胁迫处理后PtGSTF12过表达烟草系的抗盐反应相关基因进行了qRT-PCR分析。研究发现，与野生型植株相比，转基因植株中许多基因的表达发生了显著变化。在PtrGSTF12转基因植株中，一些氧化相关基因(NtSOD、NtPOD和NtCAT)和MYB转录因子基因(NtMYB81、MYB102、NtMYB103、NtMYB127和NtMYB149)的表达也上调(图5)。数据表明，在盐胁迫下，过表达PtrGSTF12的植株中，盐反应相关基因的表达水平高于WT植株。表明PtrGSTF12过表达会影响烟草盐胁迫相关基因的表达。

2.4.PtMYB108直接结合并激活PtGSTF12的启动子

在本实施例中，在PtGSTF12的启动子中鉴定了4个MBS元件(图6中A)。通过酵母单杂交实验研究PtMYB108是否能调控PtGSTF12的表达。正如预期的那样，PtMYB108直接结合到PtGSTF12启动子上(图6中B)。

为了更清楚地阐明MBS元件在PtGSTF12启动子中的作用，测定了每个MBS的活性。如图6中D所示，PtMYB108识别MBS3。然而，当CAACTG(MBS3)突变为CAACGG(Mut)时，结合活性消失(图6中C和D)。这些发现表明，PtMYB108蛋白特异性结合到PtGSTF12启动子的MBS3元件上。

PtMYB108-pBI121共转化PtrGSTF12-pro::LUC后，荧光素酶互补成像检测在体内检测到强烈的荧光信号。然而，PtrGSTF12-pro::LUC与pBI121共转化未检测到荧光信号(图6中E和F)。综上所述，这些发现证实了PtMYB108在体外和体内通过结合PtGSTF12启动子直接相互作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种杨树来源的GSTF12，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种杨树来源的GSTF12基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述杨树来源的GSTF12基因。

4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括植物表达载体。

5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述杨树来源的GSTF12基因或权利要求3或4所述重组载体。

6.根据权利要求5所述重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主菌株包括原核表达系统类型菌株和真核表达表达系统类型菌株。

7.权利要求1所述杨树来源的GSTF12、权利要求2所述杨树来源的GSTF12基因、权利要求3或4所述重组载体或权利要求5所述重组菌株在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

8.PtMYB108基因联合权利要求2所述杨树来源的GSTF12基因在促进植物抗盐性和/或促进植物在含盐环境生长中的应用。

9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述植物包括木本植物和/或草本植物。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述木本植物包括杨树；

所述草本植物包括烟草。