CN107417778B - 抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 - Google Patents

抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗病转TaOMT‑A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用。本发明首先保护一种蛋白质，获自小麦种质CI12633，命名为TaOMT‑A蛋白，为如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码TaOMT‑A蛋白的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaOMT‑A基因导入目的植物中，得到对纹枯病的抗性高于目的植物的转基因植物。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

Description

抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用。
背景技术
小麦(Triticuma aestivum)是人类赖以生存的四大作物之一，世界上1/3以上的人口以小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，土传病害纹枯病在我国小麦生产区呈加重发生态势,已成为制约小麦高产、稳产的重要因素之一。
小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是一种世界性小麦土传真菌病害,主要由腐生营养型真菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)融合群引起。我国小麦纹枯病主要病原真菌为禾谷丝核菌。
纹枯病一般发生地块可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产40％以上。据全国农技推广站报道，2005-2016年我国有1亿-1.4亿亩小麦遭受纹枯病侵害，经济损失数十亿元以上，已成为我国小麦主产区小麦第一大土传病害。因此，选育和推广抗病小麦新品种是防治小麦病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于理想的小麦抗病种质资源匮乏，小麦纹枯病抗性由多基因控制，常规育种方法在选育抗纹枯病小麦品种方面的研究进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。植物抗性蛋白基因的分离克隆与功能分析，对阐明植物抗病防御机制、有效地进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物科学研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用。
本发明首先保护一种蛋白质，获自小麦种质CI 12633，命名为TaOMT-A蛋白，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
所述标签见表1。
表1标签的序列
TaOMT-A蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码TaOMT-A蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码TaOMT-A蛋白的基因命名为TaOMT-A基因。
TaOMT-A基因具体为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列1第62-1132位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列1所示的DNA分子；
(3)序列表中序列3所示的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的TaOMT-A基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的TaOMT-A基因具有87％或者更高同一性的核酸，只要编码TaOMT-A蛋白且具有TaOMT-A蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明提供的TaOMT-A基因具有86％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有所述TaOMT-A基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物均属于本发明的保护范围。
所述表达盒自上游至下游依次包括启动子、TaOMT-A基因和终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)，来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)，西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)，热休克启动子(美国专利5，187，267)，四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)，种子特异性启动子[如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))]。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。可用于本发明的终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子),花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子,tml终止子,豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有TaOMT-A基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pWMB123、pAHC25、pAHC20、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在单子叶植物表达载体pWMB123的多克隆位点(例如SmaⅠ和SpeⅠ酶切位点之间)插入TaOMT-A基因得到的重组质粒。
所述重组微生物的出发微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。
所述转基因植物组织或所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还保护TaOMT-A蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)调控植物对纹枯病的抗性；
(d2)调控小麦对纹枯病的抗性；
(d3)提高植物对纹枯病的抗性；
(d4)提高小麦对纹枯病的抗性。
本发明还保护一种植物抗病剂，其活性成分为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)TaOMT-A蛋白；
(e2)TaOMT-A基因；
(e3)所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物。
所述植物抗病剂可为植物抗纹枯病制剂。所述纹枯病可由禾谷丝核菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌R0301。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaOMT-A基因导入目的植物中，得到对纹枯病的抗性高于目的植物的转基因植物。
上述方法中，TaOMT-A基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
①根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaOMT-A基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
②修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
③与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
④与适合的转录终止子连接，也可以提高基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
⑤引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
TaOMT-A基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法,转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中TaOMT-A基因的表达，得到对纹枯病的抗性低于目的植物的转基因植物。
“抑制目的植物中TaOMT-A基因的表达”具体可通过导入干扰片段实现。所述干扰片段具体可为序列表中序列1的第1022-1254位所示的DNA分子的反向互补序列。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中TaOMT-A蛋白的含量和/或活性，从而增加目的植物对纹枯病的抗性。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaOMT-A基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦，例如小麦品种扬麦16或小麦种质CI12633。
以上任一所述纹枯病可由禾谷丝核菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌R0301。
实验证明，使植物中的TaOMT-A蛋白水平增高(具体可为过表达TaOMT-A基因)可以显著增强植物的抗病性，降低植物中的TaOMT-A蛋白水平(具体可为抑制TaOMT-A基因表达)可以显著降低植物的抗病性。将TaOMT-A基因转入植物中，得到的TaOMT-A过表达转基因植物的病情指数为26.67-45.00，转TaOMT-A基因植物的纹枯病病级为1.31-2.25，转TaOMT-A基因植物的病情指数和病级均极显著低于野生型扬麦16植株(病情指数58.33，病级2.91)。说明TaOMT-A基因是小麦抗纹枯病反应中抗病重要基因，正向参与小麦抗纹枯病反应。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。
附图说明
图1为小麦TaOMT-A基因在抗纹枯病小麦、感纹枯病小麦品系中的表达模式。其中，CI12633和山红麦为抗纹枯病小麦品系、山农0431为中抗纹枯病小麦品系、扬麦158为中感纹枯病小麦品系、温麦6号为高感纹枯病小麦品系。上述RNA均提取于接种纹枯病菌21天的小麦茎秆组织。
图2为接种BSMV病毒的小麦CI12633植株中TaOMT-A基因的表达分析结果。其中，BSMV:GFP表示接种BSMV:GFP的小麦植株；接种BSMV:TaOMT-A-1～BSMV:TaOMT-A3表示三株接种BSMV:TaOMT-A的小麦。
图3为TaOMT-A基因沉默的小麦CI12633植株及其对照的纹枯病表型。其中，BSMV:GFP表示接种BSMV:GFP小麦CI12633对照植株；BSMV:TaOMT-A-1～3表示三株接种BSMV:TaOMT-A的小麦CI12633植株。
图4为TaOMT-A过表达转基因小麦的PCR检测结果。其中，p表示重组表达载体pWMB123-TaOMT-A；Y16表示扬麦16；OM1～OM5均表示转基因植株。
图5为转TaOMT-A基因小麦T1代植株中TaOMT-A的定量PCR分析结果。其中，Y16表示扬麦16，OM1～OM5均表示转基因植株。**表示在转基因株系与扬麦16(Y16)之间TaOMT-A基因表达量有极显著差异(P<0.01)。
图6为转TaOMT-A基因小麦植株和受体扬麦16的纹枯病表型比较结果。其中，Y16表示扬麦16，OM1～OM5均表示转基因植株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦种质CI 12633为抗纹枯病材料，来自于江苏农业科学院种质资源库。小麦地方品种山红麦为抗纹枯病材料，小麦品种温麦6号为高感纹枯病材料，来自于中国农业科学院种质资源库。小麦品系山农0431为中抗纹枯病材料。小麦品种扬麦16、杨158为中感纹枯病材料，来自于江苏里下河地区农业科学研究所。以上小麦材料，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
实施例中的小麦纹枯病致病菌均采用禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。提及“禾谷丝核菌R0301”的文献为：冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报.2010，26(6)：1176-1180；Chen Liang,ZhangZengyan，Liang Hongxia，Liu Hongxia，Du Lipu，Xu Huijun，XinZhiyong.2008.Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot intransgenic wheat.Journal of Experimental Botany.59:4195-4204。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
单子叶植物表达载体pWMB123：由中国农业科学院作物科学研究所王珂等构建(参考文献：Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat viaanAgrobacterium-mediated co-transformation strategy incommercial Chinese wheatvarieties,KeHuiyunLipu Du an d Xingguo Ye*,Plant BiotechnologyJournal(2016),pp.1–10doi:10.1111/pbi.12660)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
BSMV-γ载体、BSMV-α载体和BSMV-β载体、BSMV-γ-GFP载体，记载于如下文献：Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-inducedgene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327)。从美国引入，本实验室保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。
小麦纹枯病病级标准见表2。
表2小麦纹枯病病级标准
小麦纹枯病病级(IT) 小麦纹枯病病症
0级 植株的叶鞘与茎部均无病斑
1级 植株的叶鞘有病斑但不侵茎
2级 植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎0～1/2
3级 植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎1/2～3/4
4级 植株的叶鞘与茎部均有病斑，且病斑环茎3/4～1
5级 植株的叶鞘与茎部均有病斑，且植株出现枯孕穗或枯白穗
0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。
长满禾谷丝核菌R0301的牙签的制备方法：将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌R0301的菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。
实施例1、小麦抗病相关蛋白TaOMT-A及其编码基因的克隆
本申请的发明人，从抗纹枯病小麦种质CI 12633中分离克隆出一个小麦抗病相关蛋白，如序列表的序列2所示，将其命名为TaOMT-A蛋白。将编码TaOMT-A蛋白的基因命名为TaOMT-A基因，如序列表的序列1所示。
TaOMT-A基因的具体克隆方法如下：
取禾谷丝核菌R0301接种后的小麦种质CI12633的茎部组织，液氮处理，按照Invitrogen TRIZOL Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板。
为了获得TaOMT-A基因全长的cDNA序列，采用巢式PCR方法进行扩增。利用TaOMT-A-1F(5’-GAAAGTAGGTCATCGCTCAGTC-3’)和AUAP(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')组成的引物对进行第一轮PCR扩增；PCR扩增体系为：10×PS Buffer(TaKaRa)10μL，cDNA 2.0μL(50ng)，2.5mM dNTPs(TaKaRa)4.0μl，10μmol/LTaOMT-A-1F1μL，10μmol/L AUAP1μL，5U/μlTaKaRa Prime STAR酶0.5μl，ddH2O补至50μL；PCR扩增程序为：先98℃预变性1分钟；然后98℃10秒，56℃15秒，72℃2分钟，共30个循环；再72℃延伸10分钟。然后，将第一轮PCR扩增的产物稀释至50倍后作为模板，利用TaOMT-A-24F(5’-CTCGCTCACACTCAACGC-3’)和TaOMT-A-1342R(5'-GGTGGATTTTAATACACACAA-3')组成的引物对进行第二轮PCR扩增；PCR扩增体系为：10×PS BufferⅠ(TaKaRa)10μL，第一轮PCR扩增的产物的50倍稀释液2.0μL，2.5mMdNTPs(TaKaRa)4.0μl，10μmol/LTaOMT-A-24F 1μL，10μmol/LTaOMT-A-1342R 1μL，5U/μlTaKaRa Prime STAR酶0.5μl，ddH2O补至50μL；PCR扩增程序为：先98℃预变性1分钟；然后98℃10秒，58℃15秒，72℃2分钟，共30个循环；再72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果表明，扩增得到一条DNA片段，将该DNA片段连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明,该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列1所示，其编码区为第62-1132位核苷酸，编码序列表的序列2所示的蛋白质。
实施例2、TaOMT-A基因表达量与纹枯病抗病程度的关联分析
为了研究TaOMT-A基因表达量与小麦纹枯病抗病程度是否相关，利用Q-RT-PCR方法，比较分析TaOMT-A基因在禾谷丝核菌R0301接种21天的纹枯病抗病程度不同的小麦材料中的表达情况。小麦材料分别为：抗病小麦种质CI12633、抗病小麦品种山红麦、中抗小麦山农0431、中感小麦品种杨158、高感小麦品种温麦6号。
具体试验方法如下：
1、在小麦分蘖期，将一个长满禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入小麦幼苗的叶鞘与茎之间，接种21天后，剪取小麦茎部组织，液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱，以备提取RNA。
2、提取小麦茎部组织的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据天根生化科技公司第一链cDNA合成试剂盒的程序反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后通过实时定量RT-PCR分析，采用2-△△CT法(Livak KJ,SchmittgenTD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25:402-408)获得TaOMT-A基因的相对表达量。每组样品重复3次。
用于鉴定内参基因(actin基因)的引物对如下：
TaActinF：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；
TaActinR：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。
用于鉴定TaOMT-A基因的引物对如下：
TaOMT-A-Q-F:5’-AGAAGGTGCCCTCGGGT-3'；
TaOMT-A-Q-R:5’-TGCATTGGCGTAGATGTAAGTG-3’。
TaOMT-A基因的相对表达量见图1。接种禾谷丝核菌21天后，抗纹枯病小麦材料中TaOMT-A基因的相对表达量明显高于感纹枯病小麦材料中TaOMT-A基因的相对表达量，在抗病小麦山红麦中TaOMT-A表达量最高,高感小麦温麦6号中TaOMT-A表达量最低，表明TaOMT-A基因表达量和小麦对纹枯病的抗性呈正相关。
实施例3、TaOMT-A沉默小麦的获得和抗病性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用禾谷丝核菌R0301接种小麦种质CI12633基部茎秆与叶鞘间，4天后提取小麦茎部组织总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，用TaOMT-A-V-F和TaOMT-A-V-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。
TaOMT-A-V-F:5’-TAGCTAGCAGGGAGAGGTACGAGAGGG-3’(下划线指示的序列为NheI酶切位点)；
TaOMT-A-V-R:5’-GCGCTAGCGAATGGACGACGCAAACA-3’(下划线指示的序列为NheI酶切位点)。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，32个循环；72℃10min。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶NheI酶切，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶NheI酶切BSMV-γ-GFP载体，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的酶切产物和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到重组载体BSMV-γ-TaOMT-A。
经测序，对重组载体BSMV-γ-TaOMT-A进行结构描述如下：将序列表中序列1的第1022-1254位所示的DNA分子反向插入了BSMV-γ-GFP载体的NheI酶切位点。
二、BSMV载体的线性化和体外转录
1、取BSMV-α载体，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化载体，命名为线性化的BSMV-α。
2、取BSMV-γ-GFP载体，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化载体，命名为线性化的BSMV-γ-GFP。
3、取重组载体BSMV-γ-TaOMT-A，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化载体，命名为线性化的BSMV-γ-TaOMT-A。
4、取BSMV-β载体，用限制性内切酶Spe I进行酶切，回收线性化载体，命名为线性化的BSMV-β。
5、参照RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7kit(Promega)说明书，进行体外转录反应，体系如下：
体外转录反应于37℃恒温条件下进行2h，得到转录反应液。
线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。
线性化的载体为线性化的BSMV-γ-GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ-GFP。
线性化的载体为线性化的BSMV-γ-TaOMT-A时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ-TaOMT-A。
线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。
三、BSMV接种小麦植株
取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ-TaOMT-A，混匀，然后加入60μlRNase-free ddH2O，再加入90μlGKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K2HPO4、1％Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV:TaOMT-A病毒混合液。
将转录反应液BSMV-γ-TaOMT-A替换为转录反应液BSMV-γ-GFP，其他同上，得到BSMV:GFP病毒混合液。
待小麦种质CI 12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取10μl的BSMV:TaOMT-A病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片上，然后在该叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，于22℃-23℃条件下保湿2天，得到接种BSMV:TaOMT-A小麦。
待小麦种质CI 12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取10μl的BSMV:GFP病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片上，然后在该叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，于22℃-23℃条件下保湿2天，得到接种BSMV:GFP小麦。
四、沉默效果检测及抗病鉴定
接种BSMV:TaOMT-A小麦、接种BSMV:GFP小麦生长至分蘖期时，进行如下操作：将一个长满禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入小麦叶鞘与茎之间。
接种第14天，剪取第四叶片液氮速冻后提取总RNA。利用定量RT-PCR(Q-RT-RCR)技术检测TaOMT-A基因的相对表达量。利用小麦actin基因作为内参。用于检测TaOMT-A基因的引物：TaOMT-A-Q-F:5’-CAAGAACTGCTACGACGCC-3'；TaOMT-A-Q-R:5’-GCATTGGCGTAGATGTAAGTG-3’。结果见图2。与接种BSMV:GFP病毒的植株相比，接种BSMV:TaOMT-A病毒的植株的叶片中TaOMT-A基因表达量明显降低，说明接种BSMV:TaOMT-A可引起植株中TaOMT-A基因表达的沉默。
接种30天后观察、统计小麦茎秆上纹枯病症，结果见图3。接种BSMV:GFP病毒的CI12633植株的病级为2.1级，表现为中抗纹枯病表型。三株接种BSMV:TaOMT-A的CI12633植株的病级分别为3.5级、3.2级、4.3级，出现了典型的小麦纹枯病病斑，表现为感纹枯病表型。以上结果说明：TaOMT-A基因表达沉默，显著降低了小麦对纹枯病抗性，TaOMT-A基因是小麦小麦种质CI 12633防御纹枯病菌反应所需的基因。
实施例4、TaOMT-A过表达转基因小麦的获得和抗病性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用禾谷丝核菌R0301接种于小麦种质CI 12633的基部茎与叶鞘间，4天后提取小麦茎部组织总RNA，反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用TaOMT-A-SmaI-F和TaOMT-A-SpeⅠ-R组成的引物对，在高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。
TaOMT-A-SmaI-F:
5’-ATCCCGGGATGGGCTCCATCGCCGCC-3’(下划线指示的序列为SmaI酶切位点)；
TaOMT-A-SpeI-R:
5’-GGACTAGTCTACTTAGTGAACTCGATGGCCCA-3’(下划线指示的序列为SpeI酶切位点,方框指示的序列为6×HIS标签编码序列)。
PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃10s、56℃15s、72℃1min20s，34个循环；72℃10min。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶SmaⅠ和SpeⅠ酶切，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶SmaⅠ和SpeⅠ酶切单子叶植物表达载体pWMB123，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的酶切产物和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到重组表达载体pWMB123-TaOMT-A。
根据测序结果，对重组表达载体pWMB123-TaOMT-A进行结构描述如下：在单子叶植物表达载体pWMB123的SmaⅠ和SpeⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列3所示ORF的DNA分子(编码融合有6×HIS标签的TaOMT-A蛋白)。重组表达载体pWMB123-TaOMT-A中，TaOMT-A基因受Ubiquitin启动子控制。重组表达载体pWMB123-TaOMT-A中还具有1个受35S启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。
二、转基因植物的获得
1、将重组表达载体pWMB123-TaOMT-A导入农杆菌C58C1的感受态细胞，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌转化扬麦16的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。
3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。
4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。
5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。
获得了45株再生植株。
6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。
移栽3周以后，有22株植株(T0代)成活。
7、对T0代植株进行PCR鉴定
将步骤6得到的22株植株进行PCR鉴定。
在4叶期，每株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaOMT-A基因ORF序列特异的一段序列作为上游引物(TaOMT-A-964JCF)，载体pWMB123-TaOMT-A特异的一段序列作为下游引物(TaOMT-A-1281JCR，位于NOS终止序列)，进行PCR检测。以重组表达载体pWMB123-TaOMT-A为阳性对照，以扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为318bp。
TaOMT-A-964JCF:5’-GAGAGGTACGAGAGGGAGTT-3’；
TaOMT-A-1281JCR:5’-TAAATGTATAATTGCGGGAC-3’。
PCR扩增体系(25μl)：2×Taq MasterMix(全式金)12.5μl，TaOMT-A-964JCF1μl，TaOMT-A-1281JCR 1μl，模板DNA 100ng，补ddH2O至25μl。
PCR扩增程序：94℃5min；32×(94℃30s，56℃30s，72℃25s)；72℃10min；16℃保存。
PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。
22株植株中，PCR阳性植株17株，即为转基因植株。
17株转基因植株中，收取到种子的植株为5株。
8、对T1代单株进行PCR鉴定
将5株收到种子的转基因植株的种子种植，得到T1代单株。将T1代单株进行PCR鉴定，方法同步骤7。
在41株T1代单株中，阳性植株30株，分属5个株系，阳性率73.2％。
部分T1代单株植株及其相应的T0代植株的PCR检测结果见图4。图4中，p代表重组表达载体pWMB123-TaOMT-A，Y16代表扬麦16，OM1、OM2、OM3、OM4和OM5分别代表5个转基因株系。
利用TaOMT-A基因特异的定量引物(TaOMT-A-QF:5’-CAGAAGGTGCCCTCGGG-3',TaOMT-A-Q-R:5’-TGCATTGGCGTAGATGTAAGTG-3’)和qRT-PCR技术分析5个转基因株系(OM1～OM5)的T1代植株中TaOMT-A基因的相对表达量。利用小麦内源actin基因作为内参。结果见图5。图5中，Y16代表扬麦16，OM1、OM2、OM3、OM4和OM5分别代表5个转基因株系。转基因植株中TaOMT-A基因的相对表达量明显高于扬麦16。
三、转空载体植物的获得
用单子叶植物表达载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaOMT-A，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。
四、转基因植物的纹枯病抗性鉴定
试验材料为：OM1株系T1代植株(12株)、OM2株系T1代植株(12株)、OM3株系T1代植株(15株)、OM4株系T1代植株(13株)、OM5株系T1代植株(16株)、T1代转空载体植株(15株)、扬麦16(20株)。
具体方法如下：在小麦分蘖盛期，用消毒镊子夹取长满禾谷丝核菌R0301的麦粒，轻轻地放入麦粒茎基部(每株放5粒麦粒，保湿3天)；于小麦收获期,调查小麦单株的纹枯病发病情况，计算纹枯病病情指数。
病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。
收获期小麦的表型照片以及相应病级见图6。
病情指数的结果见表3。转基因植株的病情指数为26.67-45.00,病情指数均显著低于受体野生型植株扬麦16(58.33)。转基因植株的病级为1.31-2.25，病级均显著低于受体野生型植株扬麦16(2.91)。结果表明，转TaOMT-A基因小麦对纹枯病的抗性增强。
表3转基因小麦植株与对照纹枯病病情调查的结果
株系 病级 病情指数
OM1 1.31 26.67*
OM2 1.31 26.67*
OM3 1.67 33.33*
OM4 2.25 45.00*
OM5 1.32 26.67*
扬麦16(Y16) 2.91 58.33
转空载体植株 2.85 57.00
注：*表示在P<0.05水平上各转基因株系与扬麦16有显著差异。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 抗病转TaOMT-A基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
<130> GNCYX170804
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1319
<212> DNA
<213> 小麦（Triticuma aestivum）
<400> 1
ctcgctcaca ctcaacgcac gtacccgcag ctcggctccg gagaggcaga agctagcaga 60
gatgggctcc atcgccgccg gcgccgatga ggatgcgtgc atgtacgctc tccagctcgt 120
ctcgtcgtcc atcctcccga tgacgctgaa gaacgccatc gagctgggac tcctcgagac 180
tctgatgtct gccggcggca agttcttgac tcccgccgag gtggctgcca agctcccatc 240
cgcagcgaat ccggaagcgc cggacatggt ggaccgtatg ctccgtctgc tggcctcgta 300
caacgtggtg tcgtgcagaa cggaggaggg caaggacggc cgtctctcca ggcggtatgg 360
tgctgcgccc gtgtgcaagt acctcacccc caacgaggac ggcgtctcga tgtcagcgct 420
cgcgctcatg aaccaggaca aggtcctcat ggagagctgg tactatctca aggatgcggt 480
cctcgacggt ggcatcccat tcaacaaggc atacgggatg tcggcgttcg agtaccacgg 540
cacggacctg cgcttcaacc gcgtcttcaa cgaagggatg aagaaccatt ccatcatcat 600
caccaagaag ctcctcgaac tctacaaggg cttcgagggc ctcaacaccc tcgtcgacgt 660
gggcgggggc gtcggcgcca ccgtggccgc catcaccgct cactaccccg ccatcaaggg 720
catcaacttc gaccttcccc acgtcatctc cgaggcgccg ccgttccccg gtgtcaccca 780
cgtcggcggc gacatgttcc agaaggtgcc ctcgggtgac gccatcctca tgaagtggat 840
cctccacgac tggagcgacg agcactgcgc taagctgctc aagaactgct acgacgcctt 900
gccggcgcac ggcaaggtgg tgctcgtgga gtgcatcctg ccggtgaacc cggaagccac 960
gcctaaggcg cagggagtgt tccatgtcga tatgatcatg ctcgcgcaca acccgggtgg 1020
cagggagagg tacgagaggg agttcgaggc cctggccaag ggcgccgggt tcgccgccat 1080
gaagaccact tacatctacg ccaatgcatg ggccatcgag ttcactaagt agatgatgaa 1140
tgacaacgtc cacccatctg atgcatccac ctgcatgtgt actttctctt ggtttttcct 1200
taattttgtc attctctgag tcattctaaa ttctaatgtt tgcgtcgtcc attcattcga 1260
aatgtactac cattaataat gttaattgct cttaatggtt gtgtgtatta aaatccacc 1319
<210> 2
<211> 356
<212> PRT
<213> 小麦（Triticuma aestivum）
<400> 2
Met Gly Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Glu Asp Ala Cys Met Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Gln Leu Val Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr Leu Lys Asn Ala
20 25 30
Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Thr Leu Met Ser Ala Gly Gly Lys Phe
35 40 45
Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Ala Ala Asn Pro
50 55 60
Glu Ala Pro Asp Met Val Asp Arg Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Val Val Ser Cys Arg Thr Glu Glu Gly Lys Asp Gly Arg Leu Ser
85 90 95
Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Pro Val Cys Lys Tyr Leu Thr Pro Asn Glu
100 105 110
Asp Gly Val Ser Met Ser Ala Leu Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val
115 120 125
Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly
130 135 140
Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Ser Ala Phe Glu Tyr His Gly
145 150 155 160
Thr Asp Leu Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His
165 170 175
Ser Ile Ile Ile Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Lys Gly Phe Glu
180 185 190
Gly Leu Asn Thr Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val
195 200 205
Ala Ala Ile Thr Ala His Tyr Pro Ala Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp
210 215 220
Leu Pro His Val Ile Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Thr His
225 230 235 240
Val Gly Gly Asp Met Phe Gln Lys Val Pro Ser Gly Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ala Lys Leu
260 265 270
Leu Lys Asn Cys Tyr Asp Ala Leu Pro Ala His Gly Lys Val Val Leu
275 280 285
Val Glu Cys Ile Leu Pro Val Asn Pro Glu Ala Thr Pro Lys Ala Gln
290 295 300
Gly Val Phe His Val Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly
305 310 315 320
Arg Glu Arg Tyr Glu Arg Glu Phe Glu Ala Leu Ala Lys Gly Ala Gly
325 330 335
Phe Ala Ala Met Lys Thr Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Trp Ala Ile
340 345 350
Glu Phe Thr Lys
355
<210> 3
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggctcca tcgccgccgg cgccgatgag gatgcgtgca tgtacgctct ccagctcgtc 60
tcgtcgtcca tcctcccgat gacgctgaag aacgccatcg agctgggact cctcgagact 120
ctgatgtctg ccggcggcaa gttcttgact cccgccgagg tggctgccaa gctcccatcc 180
gcagcgaatc cggaagcgcc ggacatggtg gaccgtatgc tccgtctgct ggcctcgtac 240
aacgtggtgt cgtgcagaac ggaggagggc aaggacggcc gtctctccag gcggtatggt 300
gctgcgcccg tgtgcaagta cctcaccccc aacgaggacg gcgtctcgat gtcagcgctc 360
gcgctcatga accaggacaa ggtcctcatg gagagctggt actatctcaa ggatgcggtc 420
ctcgacggtg gcatcccatt caacaaggca tacgggatgt cggcgttcga gtaccacggc 480
acggacctgc gcttcaaccg cgtcttcaac gaagggatga agaaccattc catcatcatc 540
accaagaagc tcctcgaact ctacaagggc ttcgagggcc tcaacaccct cgtcgacgtg 600
ggcgggggcg tcggcgccac cgtggccgcc atcaccgctc actaccccgc catcaagggc 660
atcaacttcg accttcccca cgtcatctcc gaggcgccgc cgttccccgg tgtcacccac 720
gtcggcggcg acatgttcca gaaggtgccc tcgggtgacg ccatcctcat gaagtggatc 780
ctccacgact ggagcgacga gcactgcgct aagctgctca agaactgcta cgacgccttg 840
ccggcgcacg gcaaggtggt gctcgtggag tgcatcctgc cggtgaaccc ggaagccacg 900
cctaaggcgc agggagtgtt ccatgtcgat atgatcatgc tcgcgcacaa cccgggtggc 960
agggagaggt acgagaggga gttcgaggcc ctggccaagg gcgccgggtt cgccgccatg 1020
aagaccactt acatctacgc caatgcatgg gccatcgagt tcactaagca tcatcatcat 1080
catcactag 1089
<210> 4
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Glu Asp Ala Cys Met Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Gln Leu Val Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr Leu Lys Asn Ala
20 25 30
Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Thr Leu Met Ser Ala Gly Gly Lys Phe
35 40 45
Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Ala Ala Asn Pro
50 55 60
Glu Ala Pro Asp Met Val Asp Arg Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Val Val Ser Cys Arg Thr Glu Glu Gly Lys Asp Gly Arg Leu Ser
85 90 95
Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Pro Val Cys Lys Tyr Leu Thr Pro Asn Glu
100 105 110
Asp Gly Val Ser Met Ser Ala Leu Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val
115 120 125
Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly
130 135 140
Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Ser Ala Phe Glu Tyr His Gly
145 150 155 160
Thr Asp Leu Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His
165 170 175
Ser Ile Ile Ile Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Lys Gly Phe Glu
180 185 190
Gly Leu Asn Thr Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val
195 200 205
Ala Ala Ile Thr Ala His Tyr Pro Ala Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp
210 215 220
Leu Pro His Val Ile Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Thr His
225 230 235 240
Val Gly Gly Asp Met Phe Gln Lys Val Pro Ser Gly Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ala Lys Leu
260 265 270
Leu Lys Asn Cys Tyr Asp Ala Leu Pro Ala His Gly Lys Val Val Leu
275 280 285
Val Glu Cys Ile Leu Pro Val Asn Pro Glu Ala Thr Pro Lys Ala Gln
290 295 300
Gly Val Phe His Val Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly
305 310 315 320
Arg Glu Arg Tyr Glu Arg Glu Phe Glu Ala Leu Ala Lys Gly Ala Gly
325 330 335
Phe Ala Ala Met Lys Thr Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Trp Ala Ile
340 345 350
Glu Phe Thr Lys His His His His His His
355 360

Claims (10)

1.一种蛋白质，为如下(a)或(c)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列1第62-1132位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列1所示的DNA分子；
(3)序列表中序列3所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白质的应用，为调控小麦对纹枯病的抗性；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
6.权利要求1所述蛋白质的应用，为提高小麦对纹枯病的抗性；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
7.一种植物抗病剂，其活性成分为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)权利要求1所述蛋白质；
(e2)权利要求2或3所述基因；
(e3)权利要求4所述重组表达载体、表达盒或重组微生物；
所述植物为小麦；
所述抗病为抗纹枯病；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
8.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到对纹枯病的抗性高于目的植物的转基因植物；所述植物为小麦；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
9.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到对纹枯病的抗性低于目的植物的转基因植物；所述植物为小麦；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
10.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，从而增加目的植物对纹枯病的抗性；所述植物为小麦；所述纹枯病是由禾谷丝核菌引起的。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275202A (zh) * 2013-05-28 2013-09-04 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白rcr1及其相关生物材料与应用
CN103923196A (zh) * 2014-04-02 2014-07-16 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用
CN104004073A (zh) * 2014-05-27 2014-08-27 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaCPK7-R及其相关生物材料与应用
CN105585623A (zh) * 2016-03-09 2016-05-18 中国农业科学院作物科学研究所 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
CN105753953A (zh) * 2016-03-17 2016-07-13 中国农业科学院作物科学研究所 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275202A (zh) * 2013-05-28 2013-09-04 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白rcr1及其相关生物材料与应用
CN103923196A (zh) * 2014-04-02 2014-07-16 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用
CN104004073A (zh) * 2014-05-27 2014-08-27 中国农业科学院作物科学研究所 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaCPK7-R及其相关生物材料与应用
CN105585623A (zh) * 2016-03-09 2016-05-18 中国农业科学院作物科学研究所 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
CN105753953A (zh) * 2016-03-17 2016-07-13 中国农业科学院作物科学研究所 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用

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