CN108795942B - 一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用。该诱导表达启动子序列如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，本发明还提供了另一种外因诱导表达启动子，其序列如SEQ ID No:2所示。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以在水淹或多盐环境下，启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株中诱导表达，因此可以用于提高和改善水稻在水淹环境下的生长特性，从而培育出理想的水稻品种。

Description

一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻外因胁迫诱导表达启动子及其应用。

背景技术

水稻是广泛分布在我国南方的粮食作物，洪涝灾害一般出现在4-7月，降雨强度大，时间长。早稻生长易受其影响，导致水稻大面积被淹，产量下降，严重时部分地区甚至出现绝收的现象，影响我国粮食安全。

水稻作为一种半水生植物，能够耐受一定程度的水淹环境，但不同的水稻品种对完全水淹的耐受力是不同的。大多数水稻品种是非常敏感的，会在水淹一周之内死亡，但也存在一些水稻在完全水淹数周后仍能存活。因此，研究水稻的耐淹机制对提高水稻的品质和产量就有重要的推动作用。目前，随着分子生物学、生物信息学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，通过现代基因工程技术进行分子育种已成为改良水稻耐受水淹的一种高效途径。

据悉水稻对水淹胁迫的耐受力主要与SK1基因、SK2基因、Sub1A基因有关。这三个基因能够直接或间接调节植株的发酵作用、细胞伸长、碳水化合物代谢及能量代谢等作用。其中SK1、SK2基因位于水稻12号染色体上，编码两个ERF蛋白。当水稻处于部分水淹即深水条件时，这两个基因能够参与乙烯信号转导途径，并且通过促进赤霉素的合成而使水稻植株显著伸长，进而使水稻叶片伸出水面与氧气接触来赋予水稻耐淹性。在非深水品种中不存在SK基因，即所有的粳稻中都不存在SK基因。Sub1A基因位于9号染色体着丝点附近，编码一个ERF蛋白。

SK1基因、SK2基因、Sub1A基因通过作用于下游的脱落酸或赤霉素来控制芽的生长，产生两种相反的应对水淹的适应性策略，由SK1、SK2基因控制的机制称为逃逸策略，即当水稻受到淹涝胁迫时，它们可能会促进的赤霉素积累以最终促使植株的伸长生长，从而使植株重新伸出水面恢复有氧代谢来逃避洪水造成的水淹环境而避免死亡。由Sub1A基因控制的机制称为静止策略，即水稻在受到淹涝胁迫时，植物不能进行快速的伸长生长，因此植物需储存碳水化合物使其能够在爆发洪水的条件下生存。在此种机制中,植株生长减缓,从而保存了能量及碳水化合物以待洪水退去后继续生长时使用。在其他物种(如拟南芥、莲花、白杨等)也存在类似的耐淹机制,这说明植物中存在一种保守的水淹响应网络。

在植物基因工程中，为了提高植物的耐淹能力，往往使用组成型启动子如35S、Ubiqitin去驱动外源基因的表达。在基因高强度表达的同时，也造成了植株生长过程中的物质和能量浪费，甚至由于外源基因的积累，影响了植株的正常生长和发育。为了克服这一不足，诱导性启动子即在某种条件出现后才启动下游基因表达的启动子越来越受到人们的关注。到目前为止，植物中受水淹诱导的启动子为数不多。我国水稻资源丰富，从水稻种发掘、克隆耐水淹相关基因及其水淹诱导启动子，将对水稻耐水淹品种的选育具有重要的理论及实际意义，利用水稻来源的水淹诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻中驱动外源基因在外部诱导条件下，尤其是水淹条件下特异性表达的启动子以及该启动子的应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种水稻外因诱导型组织特异性启动子，其特征在于，该启动子包含序列表中SEQ ID No.1或2所示的核苷酸序列及其同源衍生物。

优选地，所述启动子由序列表中SEQ ID No.1中所示序列构成，所述外因为水淹。

另一方面，本发明提供一组扩增权利要求1所述核苷酸序列的全部或其任意片段的引物对。

优选地，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

另一方面，本发明提供一种权利要求1所述的水稻外因诱导型组织特异性启动子在培育转基因植物中的应用。

另一方面本发明提供一种增强植物耐水淹能力的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2中所述的水稻水淹诱导表达启动子Psubs3连接耐淹基因，构成重组载体，将所述重组载体导入到目标植株中，当所述目标植株遭受水淹环境时，所述水稻水淹诱导特异性启动子Psubs3诱导所述耐水淹基因大量表达，以促进植物的根、茎、叶的耐水淹性状。

另一方面，本发明提供一种培育具有增强外因抵抗力的水稻的培育方法，其特征在于，将权利要求1中所述的水稻外因诱导表达启动子连接至耐淹基因或耐盐基因，构成重组载体，将所述重组载体转入到目标植株中。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻水淹诱导表达启动子，本文中称为Psubs3或启动子Psubs3。

本发明提供上述水稻水淹诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻水淹诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达基因采用耐淹基因。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

TTTACTCACCGTGTCCTCTGTTGATTTTTGTGATGCCCAAATTGTTTGATTTCATGATGTGCTTAGAACTGTTGCCAGTGCAAGTTGATTTACATGTAAACCTATTCTATGATGCATTTCTTTCATCCTTCATGTGTGAATCTGTGAGATGAATGCAACTACAACTAGCAAAAGAACATTTTTTTCACAGGTAACCAGCAGCATTGATGGGCCGCATTGTGCTACTCGTCACATGTAACTCACTTGTGACGGGTTGTGACGCGACAAGTTAAAAGGGGGTTAACATTACCTGTGACGGGTTGTCATTTGTAATCTGTCAGAGGTGATTCATACTAGTGACGTGCCTTTAGCCGTCAAAGATAAGTTTAGTCATCACTAACCACTCATCTCTTACCAACGCCCTACCCGTTAGAGGTGACAGTTTGAGCCTGTCACCGATGACCCAATCTAGTGTAATGATTCTCAATATCAAAATTGTATAACTCGACGAGGTCAACCATTCTAGATTTGATGACTATTCTTTTGATGTCACTAGCAAAATGCCCATGCGTTGCACCGGGTAATGTCGCGTTGGATAAAGTTTAACTGAACGATTTTTTAAGCGGTATAGTATGACAATAATAGTGATCAAGTAATCGTTCATAATTTTCTAGCAATTTTAAAATGGCTCAAAATAATGCCAAGAAAATTTTGTAAACGACTAAATAAATTAAATCGATGGAATTAAATAAAATTCTATTTCGACCTATTACTTTTGTAACTGACCCAAAAAATCGGATCGGCCCGTTTAGCGCGAGCCGATTGCACTACAAGTGGCCCATCTACCGGCGACGGCCCGACACGCGGCAAAGGGCACGCGGCTCAGTTGTCTTCCATGGCCCAAAGACTGCACGGCCCAATAGCGGTGGCGGCCCGATGCGGGGCCGATCTGACCCATCCGATCTGATGGACAGCTTGGATTGGTCCCGCGCCAATGAAATCGCCGGCCGGAAGGGGAGGGTCCGAAAACCCTAACCCTAATTGCCTTTCTTCCCTACTCTCCCTGATCCAATCTCTGGCGACGCGAGAGAGTGGACGGCGATGATCTAGTCTTTCTCCGCGTCTTTCCGTCTTCCACCCGAGTTGTCGCCGACTAGATCATCCACCGGCTCCAAGCCGTCATTCATGCTCGTGTGGATCCGCCGTCGGCGCCTAGATCCCATCGTCTCTCGGCGATAGCCGCATGGCAGCTGCGATGGCCAAGGCGCGTGGGCAGCAGCGAGACTGGTGGGCGGCGGATCTGCCGGCTGGGGAGGCTTGAGGGCGCGGAGGTGGCTGAGTTTTGGCAGCCGCCTCACAAAGTTGCCGCCACCGCCTGCTTCCTCGACATCGCCACTAGCGGGAGATGTTAACAAGGCTAACATGTAACGTATGAGCCCCAAATTTGAATCCTATATGCTACATGTGTGAAAATTTGTGTGTAGATGTATAGTAAAATGTGAACTTTTTTTTATGGTTTTTTCACCTATAAAAATAAAAATTGGAAAATTATTTTCTTGGTTGGTTTCTTAAGAGAGCCGTGTATGAAAATGAGATCATCACAAGAGTTTTGTTAAGAGGACCGCCAAATGGTTCTCTCCTTGCCGCTCGATGCATGTGGAAATAGTTGTTTTTCTACAGGTTACAGCTTACAAGTGACATAACGGTTTGATAAACGACTGTAGCCAAAAGTACTTTTCAATCACTTTAATTTTGGTCAGCTCCCGTACATGTAGTTAACTTGATCTTTGCACGCAAGCAATTATTTTTCTGTCACCACGCTCCTCGACGACCTCTGCATACGGCTATAAAATCACATGCAACCCCTCAATAACCAAAGCATCTTACTCAAAGTCTCAAACGATAACCACAGGGAGAGGAGCTAGTAAAAATAGCTAGCTAACTACCAGAGAGAGATACA

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以下划线表示的序列“TTTACTCACCGTGTCCTCTGTT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以下划线表示表示的序列“CTAACTACCAGAGAGAGATACA”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到的1939bp的DNA序列，并将其命名为Psubs3(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在水淹诱导处理后，整体上的GUS基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1939bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的GUS基因在水稻水淹诱导处理后特异性表达。

技术效果

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水淹诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。本发明所克隆的水稻启动子Psubs3能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，代替35S等组成型启动子，去驱动与水淹相关基因的表达，从而提高植物的耐淹水平，增强植物在水淹条件下的生存能力。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Psubs3启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，其中示出了利用Psubs3启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行克隆和pCAMBIA1381-Psubs3载体酶切验证的结果示意图。

图3为萌发21天后的Psubs3::GUS转基因植株组织染色图。正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A)，茎(B)，叶(C)均无GUS活性，而经水淹处理1小时，经24小时染色后，在根(A)，茎(B)，叶(C)均有GUS强烈表达(标尺＝5mm)。

图4为转基因植株经水淹处理后，由Psubs3驱动的GUS基因表达量变化的实时荧光定量PCR检测结果。

图5为本发明实施例2中所提供的启动子的表达情况；

图6是本发明实施例2中的启动子在经处理情况下的表达量。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1

步骤1、启动子Psubs3克隆和pCAMBIA1381-Psubs3载体构建

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据序列表SEQ ID No.1中的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。用于扩增的引物为：

正向引物： EcoRI GAATTCTTTACTCACCGTGTCCTCTGTT

反向引物： HindIII AAGCTTTGTATCTCTCTCTGGTAGTTAG

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Psubs3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1939bp。将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，并送交Invitrogen公司测序，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

用HindIII和EcoRI对连有Psubs3的PGEM-T-Easy载体进行双酶切，回收启动子Psubs3片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1381进行线性化处理，将上述的Psubs3片段连接至pCAMBIA1381载体上，得到启动子Psubs3与GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-Psubs3，示意图如图2所示。利用冻融法将植物表达载体pCAMBIA1381-Psubs3转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。

步骤2：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟的日本晴水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

将转入了pCAMBIA1381-Psubs3重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得32株植株。提取这些植株的DNA，经PCR鉴定后，获得28株阳性的pCAMBIA1381-Psubs3植株。

步骤3、Psubs3启动子活性鉴定

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

经种子萌发21天后的阳性转基因植株组织进行染色。在正常条件下生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A)，茎(B)，叶(C)均无GUS活性，而经水淹处理1小时，经24小时染色后，在根(A)，茎(B)，叶(C)均有GUS强烈表达(标尺＝5mm)。结果见图3。

提取水淹前后的14天幼苗的RNA，经反转录后成cDNA。利用实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量，同时以水稻看家基因ACTIN为对照。通过GUS基因的表达变化，来反映Psubs3启动子的水淹诱导活性。

RT-qPCR采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒(TIANGEN，SYBRGreen，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因–CT内参基因；ΔΔCT＝ΔCT处理后–ΔCT对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：Actin-FP 5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’；和Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’用于ACTIN的扩增；Gus-FP，5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’和Gus-RP，5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’用于GUS的扩增。图4结果显示，水淹处理后，转基因植株中的GUS基因的表达量是未经处理转基因植株的15.3倍，因此说明，Psubs3启动子具有较强的水淹诱导活性。本申请将GUS基因替换成水稻常用的几种耐淹基因进行了类似实验，通过对生长数据的对比，表面其可以驱动其他目标基因表达。

实施例2

1、含有酶切位点的POssalt2启动子的获得

(1)、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列。根据序列表SEQ ID No.2的启动子序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1381(来自于pCAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为GUS基因，具体设计的引物序列如下，斜体碱基为酶切位点：

正向引物：GAATTCAATCTCTACTACTTAAATTCCAEcoRI

反向引物：GGATCCCCAAATCAGCTAACCCGCGCCTBamHI

(2)、启动子的克隆和表达载体构建

以水稻基因组DNA为模板，采用KOD高保真聚合酶进行PCR扩增。扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。回收PCR产物，为其加上polyA尾并连接T载体，获得克隆载体。将克隆载体送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析，最终获得长度为2072bp的启动子POssalt2。

分别用相应的酶切启动子POssalt2和线性化处理pCAMBIA1381质粒。并用T4连接酶进行连接获得相应的pCAMBIA1381-POssalt2表达载体。

(3)、表达载体转化根癌农杆菌EHA105

①取10μL表达载体质粒DNA加入从超低温冰箱取出的农杆菌感受态细胞，混匀后冰浴30min；

②用液氮速冻1min；

③加入1mL LB培养基，28℃120r/min培养4h；

④4000r/min离心1min，弃上清；加150μL LB培养基重悬，将菌液涂布与含50μg/mLKan和10μg/mL Rif的LB固体平板；

⑤28℃培养2～3d至单菌落长出，进行菌落PCR鉴定。

⑥挑取阳性克隆，用50％甘油(1：1)保存。

2、转基因植株的获得

(1)水稻遗传转化

①愈伤组织诱导：消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

②预培养：从诱导培养基上挑选颗粒状的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

③侵染及共培养：将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入农杆菌菌液(OD600＝0.2)浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将愈伤上的残余菌液吸干。将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗下培养2～3d。

④恢复：将共培养的愈伤转移至恢复培养基上，30℃黑暗培养3～5d。

⑤筛选：从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，接种于筛选培养基上，每皿30粒。30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

⑥分化：每一转化事件挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

⑦生根：每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

(2)转基因植株鉴定

共获得33株pCAMBIA1381-POssalt2植株(POssalt2：：GUS转基因水稻植株)。采用常规方法提取转基因植株的DNA，用PCR扩增潮霉素基因对转化植株进行检测，获得阳性植株30株。

3、启动子活性鉴定

(1)GUS组织化学染色

参照Jefferson等的方法，对PCR检测呈阳性的植株进行200mM NaCl溶液处理前后的GUS染色分析。将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h。然后用100％乙醇浸泡直至完全脱色，进行拍照。

染色结果如图5所示。在200mM NaCl溶液未处理的转基因植株的根(A)、茎(B)和叶(C)组织中，没有明显的着色；而当用200mM NaCl溶液处理后，转基因植株的根(D)、茎(E)和叶(F)组织中有很深的蓝色，这说明当用盐处理后，盐启动子能够驱动GUS基因的表达，证明该启动子是一个盐诱导表达启动子，且没有背景表达。

(2)定量PCR分析启动子活性

GUS染色结果定性说明，POssalt2是一个盐诱导表达启动子。为验证POssalt2受盐的诱导活性强弱，我们提取200mM NaCl溶液诱导前后的10天的转基因幼苗的RNA，然后反转录成cDNA，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测200mM NaCl溶液诱导前后POssalt2驱动GUS基因的表达变化。

采用天根公司(北京)植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，离心柱型，DP432)。所获RNA按如下程序进行cDNA反转录：在RNase-free离心管中加入5μL RNase-Free ddH₂O，2μL 5×gDNAbuffer，3μL RNA，置于42℃孵育3min，然后置于冰上放置；在上述反应液中，依次加入5μL RNase-Free ddH₂O，2μL FQ-RT Primer Mix，2μL 10×Fast RT Buffer，1μL RT EnzymeMix充分混匀，置于42℃孵育15min；95℃孵育3min，之后放于冰上，即为cDNA。

RT-qPCR采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒(TIANGEN，SYBRGreen，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因–CT内参基因；ΔΔCT＝ΔCT处理后–ΔCT对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：Actin-FP 5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’；和Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’用于ACTIN的扩增；Gus-FP，5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’和Gus-RP，5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’用于GUS的扩增。

定量PCR结果如图6所示，以200mM NaCl溶液未处理的10天转基因幼苗中的GUS基因表达量作为1，分别检测了200mM NaCl溶液处理4h、8h、12h和24h的转基因植株中的GUS基因表达量变化。当处理时间由4h延长至12h时，相比于未处理时，启动子驱动的GUS基因表达量由4.7倍提高至33.5倍，随后，当处理时间达到24小时时，活性降低至7.8倍。由此说明，POssalt2启动子是一个盐诱导表达启动子，诱导后的活性是诱导前的几十倍，且诱导活性在12h时达到最高。由此说明，POssalt2是一个没有背景表达，且诱导活性强的盐诱导表达启动子。

本实施例所克隆的水稻启动子POssalt2是一个盐诱导表达启动子。该启动子可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。该启动子序列可以用于驱动靶标基因如一些逆境响应基因，构建重组植物表达载体，经转化后，在盐诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果，而在没有盐诱导条件下，不影响植株的生长和发育，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<120> 一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1939

<212> DNA

<213> 启动子(rice)

<400> 1

tttactcacc gtgtcctctg ttgatttttg tgatgcccaa attgtttgat ttcatgatgt 60

gcttagaact gttgccagtg caagttgatt tacatgtaaa cctattctat gatgcatttc 120

tttcatcctt catgtgtgaa tctgtgagat gaatgcaact acaactagca aaagaacatt 180

tttttcacag gtaaccagca gcattgatgg gccgcattgt gctactcgtc acatgtaact 240

cacttgtgac gggttgtgac gcgacaagtt aaaagggggt taacattacc tgtgacgggt 300

tgtcatttgt aatctgtcag aggtgattca tactagtgac gtgcctttag ccgtcaaaga 360

taagtttagt catcactaac cactcatctc ttaccaacgc cctacccgtt agaggtgaca 420

gtttgagcct gtcaccgatg acccaatcta gtgtaatgat tctcaatatc aaaattgtat 480

aactcgacga ggtcaaccat tctagatttg atgactattc ttttgatgtc actagcaaaa 540

tgcccatgcg ttgcaccggg taatgtcgcg ttggataaag tttaactgaa cgatttttta 600

agcggtatag tatgacaata atagtgatca agtaatcgtt cataattttc tagcaatttt 660

aaaatggctc aaaataatgc caagaaaatt ttgtaaacga ctaaataaat taaatcgatg 720

gaattaaata aaattctatt tcgacctatt acttttgtaa ctgacccaaa aaatcggatc 780

ggcccgttta gcgcgagccg attgcactac aagtggccca tctaccggcg acggcccgac 840

acgcggcaaa gggcacgcgg ctcagttgtc ttccatggcc caaagactgc acggcccaat 900

agcggtggcg gcccgatgcg gggccgatct gacccatccg atctgatgga cagcttggat 960

tggtcccgcg ccaatgaaat cgccggccgg aaggggaggg tccgaaaacc ctaaccctaa 1020

ttgcctttct tccctactct ccctgatcca atctctggcg acgcgagaga gtggacggcg 1080

atgatctagt ctttctccgc gtctttccgt cttccacccg agttgtcgcc gactagatca 1140

tccaccggct ccaagccgtc attcatgctc gtgtggatcc gccgtcggcg cctagatccc 1200

atcgtctctc ggcgatagcc gcatggcagc tgcgatggcc aaggcgcgtg ggcagcagcg 1260

agactggtgg gcggcggatc tgccggctgg ggaggcttga gggcgcggag gtggctgagt 1320

tttggcagcc gcctcacaaa gttgccgcca ccgcctgctt cctcgacatc gccactagcg 1380

ggagatgtta acaaggctaa catgtaacgt atgagcccca aatttgaatc ctatatgcta 1440

catgtgtgaa aatttgtgtg tagatgtata gtaaaatgtg aacttttttt tatggttttt 1500

tcacctataa aaataaaaat tggaaaatta ttttcttggt tggtttctta agagagccgt 1560

gtatgaaaat gagatcatca caagagtttt gttaagagga ccgccaaatg gttctctcct 1620

tgccgctcga tgcatgtgga aatagttgtt tttctacagg ttacagctta caagtgacat 1680

aacggtttga taaacgactg tagccaaaag tacttttcaa tcactttaat tttggtcagc 1740

tcccgtacat gtagttaact tgatctttgc acgcaagcaa ttatttttct gtcaccacgc 1800

tcctcgacga cctctgcata cggctataaa atcacatgca acccctcaat aaccaaagca 1860

tcttactcaa agtctcaaac gataaccaca gggagaggag ctagtaaaaa tagctagcta 1920

actaccagag agagataca 1939

<210> 2

<211> 2072

<212> DNA

<213> 启动子(rice)

<400> 2

aatctctact acttaaattc cataatttta gaaagggtga aaaaaaatca tgcgggaaaa 60

gaaaacgcat cgtaatgaaa cgcgaaagaa aaacagcgaa aaaaagtccg atccggactg 120

gaaacgggaa aaataatgtg gcggaaaaaa gctgaaaaaa acagaaaaag ccgactgtac 180

aaaaatataa aagtcgccga tcgtaaaaaa aataaagaaa gccacgcgaa actgtcgtct 240

aaaaaacggt gtagaaaaaa gaccgtaaaa attaccagag aaaaaaacac attataaaac 300

agcaaaaaaa agtccctctc ttttatccgc cttttttttc ttcttttttt ccgcttttat 360

ttttttccca tccgcttttt ttgtccttat attttattcg caatttttgt catgagaaag 420

ggtctgtgca cattgtgagg attctttttt tttatctacc cggttttttc gtcgtcgggc 480

cgaactctag caccaccgcc acatcgatcg gccttctcat gctttccctc ctccaattga 540

ttgaaaaatc aattctccac tactccatca tcattttccc cataattttt tcttttattt 600

ccgctttaat ttatcagatt caatctctat atttagaagt caccatttat atcctagagt 660

tttatggatt cgctgcggtt ttgataaaaa cggaaagaaa agatcgagtg aataagagca 720

ctcaaccaat tttaggagat tgagaaagat tggatcgtat ttgatgggga gtattggttc 780

tggcatcata ctacacggtc ctatcttcga ggttgaacac ggcagtcgac tatacgagat 840

aggcctatag ctctacttgt ggtctaggtt caaaagaagt aagccaagta gagagaagta 900

gcgggttggg ccgagactga ataggaagga agaaaataag tttttatcca aaaccaaaag 960

gtacaatgta tatcaataca ttttaccaaa atgggcaacg ttgcgtgccc gtaaaaaaga 1020

tcattgtatg attatgattt ttagacctgt atggatacaa gtctaaataa tatgatctta 1080

tacagtatag gtcaggatct aagctaaaaa acctggttcc ttcatggttt taaccattat 1140

aagctcgttg gtaattggca gatgagtaac gccaattttt gatgtaagct ctcacgagca 1200

tcctcaaccg actctacagt catacaactg tagtagttaa caattattta ttcagaaaaa 1260

aaccaatttc taaccatatc taaatacgta ttcacaagtt ttttttctag gacagagcca 1320

cgaagggagt atagctacag agaggtgttt aataaactat acaaggtgcc accaagcaca 1380

atttattcgg gtgtttgatt attatctaga tgaaccacga agcctatccc tataaaaaaa 1440

aggaaggtgc atttggtctg aggttgtcgc agccatggcg caagaggtcg ctttttggcg 1500

tcttgcccat attcattgta ctgtgcccta tcgtttagtg tttttttttt gttttttttt 1560

ttacggaggg agtacatcct gaccgcaagt tggtccactg tcagctacgg cacaccagat 1620

cccagccgct cgtgtcaaaa ttgcacccgt gcgtctaggt gtccgcgtga tacggggccc 1680

cacggtccag gccacgaccg ggcaggctcc tctcggcccg gctggcaaca cacgtctcgc 1740

tgccacccct ggcccaccat cccgcagggc ggcagcatct cctgacccca cactccagtc 1800

acccgccccg ccctaaaacc cactgcgccg gggcccaccc cgcccccgcc tccccgccgc 1860

cgcaccacgc tgctcctacg cgttcttcgt cgagacggcg acgtgagctc tccaagcgcg 1920

cgctctcctc cgctataaaa ccaggcgccg cgtggaagct tctctcctct tgctagcccc 1980

accccctcct cctcgtcgtc gtcgtcgtcg tggtctctcc tgctccggcg aggcgacccc 2040

acggccgcca aggcgcgggt tagctgattt gg 2072

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(rice)

<400> 3

gaattcttta ctcaccgtgt cctctgtt 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(rice)

<400> 4

aagctttgta tctctctctg gtagttag 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(rice)

<400> 5

gaattcaatc tctactactt aaattcca 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(rice)

<400> 6

ggatccccaa atcagctaac ccgcgcct 28

Claims (3)

1.水稻外因诱导型组织特异性启动子Psubs3，其特征在于，

所述启动子由序列表中SEQ ID No.1中所示序列构成，所述外因为水淹。

2.一组扩增权利要求1所述核苷酸序列的引物对，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

3.一种增强植物耐水淹能力的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1中所述的水稻水淹诱导表达启动子Psubs3连接耐淹基因，构成重组载体，将所述重组载体导入到目标植株中，当所述目标植株遭受水淹环境时，所述水稻水淹诱导特异性启动子Psubs3诱导所述耐水淹基因大量表达，以促进植物的根、茎、叶的耐水淹性状，所述植物为单子叶植物。

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