CN115927311B - 月季根特异表达启动子proRcbHLH120及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了月季根特异表达启动子proRcbHLH120及其应用。本发明首次从月季中克隆一种脱落酸(ABA)应答的月季根特异表达的启动子proRcbHLH120，将其应用于构建特定的表达载体，可使目标基因在根中特异表达，并且响应外源激素ABA处理，达到调控月季根发育和抗逆，创制基因工程月季等目的。

Description

月季根特异表达启动子proRcbHLH120及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及月季根特异表达启动子proRcbHLH120及其应用。

背景技术

基因工程技术常用于改良观赏植物性状和培育优新品种，其中开发利用高效特异的启动子对改良植物性状有重要的应用价值(李等,2015)。启动子为一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，是RNA聚合酶识别、结合和起始转录的重要元件，可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子(邓等,2021)。组成型启动子可以调控下游的基因在不同组织不同时间段比较恒定的表达，常用的是花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)，但组成型启动子在基因工程应用时，会消耗植物过多能量，打破代谢平衡，引起基因沉默，不利于植物生长(ROBINSON,1996；MCELROY等,1990；ZHENG等,2007)。组织特异性启动子只在植物特异器官或组织部位启动基因表达，其在应用上则有很大灵活性和目的性，可以更精准的调控外源基因的表达，在转基因定向改良植物性状方面有着重要的意义(贺等,2014)。其中，根特异性启动子可用于研究转基因植物的形态发生、根际分泌及损伤修复的问题(王等,2013)，最重要的是提高植物根部抗性的同时而不改变植株地上部位的性状。目前，观赏植物中的组织特异性启动子研究较少。

月季是蔷薇科蔷薇属多年生木本花卉，常被作为观赏植物的模式物种进行研究，其中对月季的抗性研究较为广泛(HIBRAND SAINT-OYANT等,2018)。根在植株生长发育及防御生物与非生物胁迫过程中起到了重要的作用，它不仅可以吸收植物生长发育所需的水分和养分，合成氨基酸和激素等微量活性物质并将其转化，还可产生各种根系分泌物响应外界胁迫(向等,2009)。根系分泌物中的植物激素参与调控根系的功能及逆境胁迫的应答，其中脱落酸(abscisic acid，ABA)对根发育的调节机制涉及转录因子调控，微管蛋白作用及细胞壁成分变化等多个方面(吴等,2021)。已有报道转录因子如AtMYC2(bHLH)和AtMYB2(MYB)在ABA信号通路中起转录激活作用(ABE等,2003)。

bHLH(basic/helix-loop-helix，碱性/螺旋-环-螺旋)基因为bHLH基因家族中的一员，可参与植物防御与信号传导激素反应，如外源激素ABA处理下拟南芥根中高度表达的基因AtbHLH129表达量降低(TIAN等,2015)；对玉米研究表明4个候选基因ZmbHLHs可能参与依赖ABA途径的胁迫响应过程(姜,2021)。

综上所述，挖掘月季根特异性表达的启动子，开展该启动子对植物激素ABA的应答研究，可应用于在月季以及其他植物的根中，特异表达目的基因，并赋予目的基因应答ABA的能力，对于提高植物抗性和培育优新品种具有重要意义。

观赏植物中组织特异性启动子研究较少，尽管已有与月季花瓣等植物组织特异性启动子相关的研究(王等,2020；谢,2016；ZHANG等,2012；KHAN等,2015)，但尚未见月季根特异性启动子的研究。

发明内容

本发明的目的是提供月季根特异表达启动子proRcbHLH120及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供月季根特异表达启动子proRcbHLH120，所述启动子为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。

启动子proRcbHLH120具有响应脱落酸(ABA)的特性。

第二方面，本发明提供含有所述启动子的表达盒。

第三方面，本发明提供含有所述启动子或所述表达盒的载体(表达载体)。

优选地，出发载体为pBI121。

第四方面，本发明提供含有所述启动子、所述表达盒或所述载体的工程菌。

第五方面，本发明提供一种在植物中表达目的核酸分子的方法，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子。

进一步地，所述目的核酸分子可选自结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA等。

进一步地，所述植物为双子叶植物，优选蔷薇属植物。

所述植物优选月季或拟南芥。

第六方面，本发明提供所述启动子的以下任一应用：

1)用于构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；

2)用于构建转基因植物；

3)用于植物育种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明对月季中RcbHLH120基因时空表达进行研究，结果表明该基因在根中特异表达；并进一步克隆获得RcbHLH120基因的启动子，通过构建proRcbHLH120::GUS转基因拟南芥并对转基因株系GUS染色，发现在proRcbHLH120::GUS转基因株系中，GUS蛋白的蓝色信号集中在根部，其它部位的GUS没有表达。本发明首次获得来源于月季的根特异性启动子proRcbHLH120；对GUS蛋白活性进行检测，发现proRcbHLH120响应外源激素ABA，说明基因RcbHLH120在响应激素信号和改善植物抗性等方面可能起重要作用，为研究月季bHLH基因参与调控植物抗性的方式提供了新的思路和证据。

启动子proRcbHLH120可应用于月季以及其他植物的根中，特异表达目的基因，并赋予目的基因响应ABA的能力，对于提高植物抗性和培育优新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中月季基因RcbHLH120在不同月季器官中的表达模式图(RT-qPCR分析)。横坐标前四种材料分别是取自绿瓣期(具有绿色花瓣的幼嫩花苞)、转色期(花瓣开始转色的花苞)、红瓣期(花瓣完成着色的花苞)和盛开期(花朵完全开放)的花瓣，其他材料分别是月季的叶、茎、皮刺、雄蕊、雌蕊和根。

图2为本发明较佳实施例中载体pBI121-35S::GUS及重组表达载体pBI121-proRcbHLH120::GUS酶切检测琼脂糖凝胶电泳图，使用Hind III和BamH I内切酶。左侧为DNA Marker II。

图3为本发明较佳实施例中启动子proRcbHLH120与载体pBI121连接后构建的重组表达载体pBI121-proRcbHLH120::GUS示意图。

图4为本发明较佳实施例中启动子proRcbHLH120驱动下GUS基因的表达模式图。在T3代拟南芥植株中进行检测。图中从左到右顺序为：野生型植株，转pBI121-35S::GUS对照植株，转pBI121-proRcbHLH120::GUS实验株系1(Line 1)，转pBI121-proRcbHLH120::GUS实验株系2(Line 2)，转pBI121-proRcbHLH120::GUS实验株系3(Line 3)。

图5为本发明较佳实施例中在100μM ABA处理10min和30min，转pBI121-proRcbHLH120::GUS拟南芥的GUS蛋白活性检测。

具体实施方式

本发明提供一种在月季根中特异性表达的启动子proRcbHLH120。利用启动子特异性构建重组载体并转化拟南芥获得转基因株系，对转基因拟南芥进行GUS染色和外源激素ABA处理，最后对GUS蛋白活性进行测定。研究表明月季启动子proRcbHLH120在根中特异性表达，并在响应激素ABA和增强植物抗性方面起重要作用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种在月季‘月月粉’根中特异性表达的基因启动子proRcbHLH120，所述启动子包含SEQ ID NO:1所示的DNA序列。

本发明还提供一种重组表达载体pBI121-proRcbHLH120::GUS，所述重组表达载体包含SEQ ID NO:1所示序列的月季根特异性表达启动子。其中标记基因为GUS基因。

进一步将重组表达载体pBI121-proRcbHLH120::GUS用于构建转基因拟南芥，通过对植株进行组织化学染色和人为损伤，来研究该启动子在不同部位的特异性表达。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例使用的载体pBI121购自NovoPro公司。

实施例1组织特异性基因RcbHLH120的表达分析(RT-qPCR)

1.月季总RNA提取和cDNA获得

以月季‘月月粉’为试验材料，分别选取不同组织如根、茎、叶、不同开放阶段的花瓣、皮刺、雄蕊、雌蕊进行液氮速冻，并保存于-80℃冰箱备用。RNA提取采用Trizol法，参考SV Total RNA提取试剂盒(Promega,WI,USA)说明书提取月季RNA。各取1μg总RNA，2μL的Oligo(dT)₁₅，混匀后70℃变性5min，然后迅速置于冰上降温2min。依次加入RNaseInhibitor 0.6μL、M-MLV buffer 5μL、M-MLV反转录酶1μL、dNTP 1.25μL，最后加入RNasefree ddH₂O补至25μL反应，合成cDNA后置于-20℃冰箱内保存。以上试剂均购自TaKaRa公司。

2.RT-qPCR验证

在CFX Connect Real-Time System仪上进行实时荧光定量PCR，使用TB Premix Ex Taq^TM II(RR420Q，TaKaRa Bio,Inc.,Tokyo,Japan)试剂盒。反应程序为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，以上程序40个循环；95℃5s；融解曲线温度为65～95℃，以0.5℃/s的速度升温。RT-qPCR反应体系如表1。每个样品设置3个生物学重复，以RcActin为内参基因。验证引物见表2。

表1 RT-qPCR反应体系

表2验证引物

从定量结果看，RcbHLH120基因在‘月月粉’的根中表达量很高，而在其它部位不表达，说明RcbHLH120基因在月季根中存在特异性表达模式(图1)。

实施例2启动子proRcbHLH120的克隆

1.月季DNA提取

月季DNA提取采用CTAB法，参考植物DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek,Doraville,GA,USA)说明书。根据月季基因组数据库(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)提供的RcbHLH120基因序列，通过DNAMAN软件设计RcbHLH120基因全长引物进行扩增。使用KOD-plus高保真酶(KOD-201，TOYOBO CO.,LTD.Life ScienceDepartment OSAKA JAPAN)，参考KOD-plus说明书配制PCR反应体系(50μL)。引物见表3。PCR的反应程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共设置32个循环；72℃延伸2min。扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，天根生化科技(北京)有限公司)进行回收纯化。取4μL回收产物与1μL-Blunt克隆载体(CB501-01，北京全式金生物有限公司)连接，并转化大肠杆菌Trans T1感受态，挑取单克隆菌斑进行扩大培养。对PCR检测呈阳性的重组质粒送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。然后将测序结果与已知数据库的DNA序列比对，获得RcbHLH120基因全长序列。

表3扩增引物

2.启动子proRcbHLH120的克隆

以获得的月季DNA为模板，设计引物对基因RcbHLH120的启动子进行扩增，参考KOD-plus高保真酶说明书配制PCR反应体系(50μL)，扩增引物见表3。PCR的反应程序为：94℃5min，94℃30s，51℃30s，72℃1min 30s，共设置35个循环；72℃延伸2min。对PCR产物进行检测并回收纯化。然后将其与-Blunt克隆载体连接、转化大肠杆菌Trans T1感受态细胞，并将阳性菌斑送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，得到的重组质粒命名为pEASY-proRcbHLH120。

实施例3重组表达载体的构建

选择Hind III和BamH I限制性内切酶(TaKaRa)对重组质粒pEASY-proRcbHLH120和目的载体pBI121进行双酶切，37℃反应1h，反应体系见表4。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后切胶回收酶切产物。采用T4连接酶(2011A，TaKaRa)连接目的片段和载体，连接体系见表5。将连接产物转化大肠杆菌感受态并将阳性菌液送公司测序。对质粒pBI121-35S::GUS及重组质粒pBI121-proRcbHLH120::GUS进行酶切检测(图2)，最终获得重组表达载体pBI121-proRcbHLH120::GUS(图3)。

表4酶切体系

表5连接体系

实施例4构建拟南芥遗传转化体系

1.重组农杆菌菌液获取

将载体pBI121-35S::GUS和pBI121-proRcbHLH120::GUS分别导入农杆菌AGL0中，得到重组农杆菌，并将其接种到LB培养基(含抗生素利福平Rif和卡那霉素Kan)，28℃200rpm振荡培养，得到OD₆₀₀＝0.6-0.8的重组农杆菌菌液。

2.拟南芥植株的种植

将野生型拟南芥种子播种在基质(草炭和蛭石，体积比3:1)中，在光照培养箱中培养生长，设置生长条件为16h光照/8h黑暗，温度23℃，湿度70％左右。采用花序侵染法对拟南芥植株进行转化。将拟南芥的花序分别放入到含有载体pBI121-35S::GUS或pBI121-proRcbHLH120::GUS的重组农杆菌菌液中浸泡3-5min，然后继续培养至收获T0代种子为止。

3.转基因拟南芥的抗性筛选

将T0代种子接种在含有抗生素(Kan，50mg/L)的MS培养基上，直接筛选出转基因阳性的幼苗并移栽于培养土，收集T1代种子。将T1代种子铺种在含有抗生素(Kan，50mg/L)的MS培养基上并移栽于培养土中，然后对T1代植株进行PCR鉴定，如果此时阳性苗与阴性苗的比例符合性状分离比，则收集T2代种子(单株收种)。采用相同的方法筛选T2代植株。最后，播种繁殖后，以T3代种子阳性苗进行GUS染色分析。

实施例5转基因拟南芥根特异性GUS蛋白的染色试验

用镊子取出培养20d的拟南芥幼苗，将整株幼苗全部浸入到新配置的GUS染色液的离心管中，GUS染色液配制见表6。将离心管放到37℃的培养箱中避光染色24h，然后用70％乙醇脱色至对照的植物组织变白色为止。最后观察记录GUS基因在植株中的表达情况。图4结果显示，野生型植株未被染色，转pBI121-35S::GUS对照植株整株呈蓝色，转pBI121-proRcbHLH120::GUS试验株系1-3(Line1-3)根部呈蓝色而其它部位未被染色，最终说明启动子proRcbHLH120在根中特异性表达。

表6 GUS染色液配制

实施例6启动子proRcbHLH120对外源激素ABA的响应

1.拟南芥根中GUS蛋白提取

将proRcbHLH120::GUS转基因拟南芥的根放入含有脱落酸(ABA，100μM)的液体培养基(1/2MS+15g/L蔗糖，pH5.8)中，并以野生型为对照。分别在0、10、30min分离植株根部，每个样品取0.1g置于液氮中充分研磨，需要进行3次生物学重复。同时加入1mL的蛋白提取缓冲液，颠倒混匀，于4℃8000rpm离心5min轻轻吸出上清液，可置于-80℃冰箱保存。

2.GUS蛋白含量测定及酶活反应

蛋白含量的测定采用Bradford法(BRADFORD,1976)。酶活反应各反应液配制见表7。取500μL酶反应缓冲液37℃预热5min，向离心管中加入预热的500μL酶反应缓冲液，再加入50μL上清液，轻轻混匀。立即吸出100μL加入到900μL酶反应终止液中并混匀，作为反应零时样品(荧光测定时以此为空白)并计时。酶反应体系在37℃孵育30min后，取100μL与900μL酶反应终止液混匀，用于荧光测定。制作标准曲线：用酶反应终止液将l mM 4-MU贮存液按1:9(v/v)比例稀释成20nM，40nM，60nM，80nM，100nM，10μM与100μM浓度，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定样品荧光值，酶反应终止液作为空白对照，荧光值对4-MU浓度进行统计处理得到回归方程。以零时对照样品为空白，在上述条件下检测各样品的荧光强度，从回归方程计算4-MU的含量。酶活力单位定义：每分钟水解4-MUG生成1nM或1μM 4-MU的酶量作为一个活力单位。GUS基因表达活性：以每mg蛋白的酶活力来计算，结果表示为4-MU nmol/min/mg蛋白。

GUS酶活性检测结果见图5。与对照相比，转入pBI121-proRcbHLH120::GUS的拟南芥根中GUS蛋白酶活性随ABA处理时间延长而显著提升，表明启动子proRcbHLH120能响应外源ABA信号。

表7酶活反应反应液配制

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims (8)

1.月季根特异表达启动子proRcbHLH120，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的表达盒。

3.含有权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达盒的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，出发载体为pBI121。

5.含有权利要求1所述启动子、权利要求2所述表达盒或权利要求3或4所述载体的工程菌。

6.在植物中表达目的核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有权利要求1所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子；

其中，所述植物为月季或拟南芥。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目的核酸分子选自结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA。

8.权利要求1所述启动子的以下任一应用：

1)用于构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；

2)用于构建转基因植物；

3)用于植物育种；

其中，所述植物为月季或拟南芥。