CN115927309B

CN115927309B - 月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用

Info

Publication number: CN115927309B
Application number: CN202210892334.9A
Authority: CN
Inventors: 韩瑜; 刘笑雨; 段若昕; 陈润清; 于超; 罗乐; 潘会堂; 程堂仁; 张启翔
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-07-27
Also published as: CN115927309A

Abstract

本发明公开了月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用。本发明首次从月季中克隆一种赤霉素(GA)应答的月季根特异表达的启动子proRcPRX10，将其应用于构建重组表达载体，可使基因在根中特异表达，并且响应外源激素GA处理，以期达到精准调控月季根发育和抗逆，创造新型转基因月季等目的。

Description

月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用。

背景技术

启动子是基因的重要组成部分，可通过与转录因子结合调控基因起始与表达强度。启动子可活化RNA聚合酶，使其与模板DNA特异性结合，从而具有转录起始功能(陆等,2018)。目前开发利用高效启动子成为基因工程技术的研究热点之一。启动子根据其作用机制可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子(刘等, 2022)。其中，组织特异性启动子具有在特定部位表达而不改变其它组织的性状的优势(焦等,2019)，使其在提高植物的抗逆性和改善观赏特性等方面都有着巨大的应用前景。

月季是蔷薇科蔷薇属的木本花卉，是全世界广泛栽培且最受喜爱的观赏植物之一。月季品种繁多，其观赏特性和抗逆性等性状是一直以来的研究重点 (SMULDERS等,2019)。由于月季复杂的遗传背景，采用分子育种技术改良月季品种存在许多障碍(XU等,2018)。因此研究和开发高效的组织特异性启动子对于创造新型转基因月季具有重要意义。目前对于月季的组织特异性启动子研究主要集中于花器官等组织上(KHAN等,2015；王等,2020)，没有在月季根中特异性表达启动子的研究。

根系是植物的地下器官，起到固定和支撑的作用，还为植物提供所需的养料和水分(PETRICKA等,2012)。研究根特异性启动子可有效提高植物根系抵御生物及非生物胁迫的能力，从而增强植物的抗性和品质(王等,2013)。植物激素在根的生长发育过程中起着重要作用。赤霉素(gibberellins，GA)为调控植物生长发育过程的内源性植物激素，可在植物的生命周期中发挥重要功能，如促进种子萌发、营养组织的生长及成花诱导等；还在干旱、盐碱胁迫中起重要作用(ACHARD等,2008)。

PRX(class III peroxidase)是植物特异性氧化还原酶，参与植物体内多种不同的生理过程，如参与植物生长素的合成与代谢、细胞壁的合成、生物与非生物胁迫反应等(ALMAGRO等,2009；DUROUX等,2003)。如各种激素诱导下巴西橡胶树中的基因HbPRX53的表达发生显著变化(王等,2017)。目前PRX基因及相应顺式作用元件研究报道主要集中于水稻、玉米和拟南芥等植物中(王,2021；TOGNOLLI等, 2002)，在观赏植物中鲜有报道。

总之，从月季中分离并克隆得到根特异性启动子，并对其进行功能鉴定和应用，这对于调控植物根系发育和研究激素响应机制，培育新型植物品种具有重要意义。

观赏植物中组织特异性启动子研究较少，尽管已有与月季花瓣等植物组织特异性启动子相关的研究(王等,2020；谢,2016；KHAN等,2015；ZHANG等,2012)，但尚未见月季根特异性启动子的研究；应答赤霉素的根特异性启动子在观赏植物中研究中还未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供月季根特异表达启动子proRcPRX10，所述启动子为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％ SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。

启动子proRcPRX10具有响应赤霉素(GA)的特性。

第二方面，本发明提供含有所述启动子的表达盒。

第三方面，本发明提供含有所述启动子或所述表达盒的载体(表达载体)。

优选地，出发载体为pBI121。

第四方面，本发明提供含有所述启动子、所述表达盒或所述载体的工程菌。

第五方面，本发明提供一种在植物中表达目的核酸分子的方法，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子。

进一步地，所述目的核酸分子可选自结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA等。

进一步地，所述植物为双子叶植物，优选蔷薇属植物。

所述植物优选月季或拟南芥。

第六方面，本发明提供所述启动子的以下任一应用：

1)用于构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；

2)用于构建转基因植物；

3)用于植物育种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明对月季中RcPRX10基因的时空表达水平进行研究，对其表达分析表明该基因在月季根中特异性表达；并进一步克隆获得RcPRX10基因的启动子，通过构建proRcPRX10::GUS转基因拟南芥并对其进行GUS染色，发现在proRcPRX10::GUS转基因株系中，GUS蛋白的蓝色信号在根部特异表达，其它部位的GUS没有表达；本发明首次获得来源于月季的根特异性启动子proRcPRX10；对GUS蛋白活性进行检测，发现proRcPRX10响应外源赤霉素，说明基因RcPRX10在响应激素信号和改善植物抗性等方面中可能起重要作用，为研究月季PRX基因参与植物抗逆提供了新的思路和证据。proRcPRX10可应用于在月季以及其他植物的根中，特异表达目的基因，并赋予目的基因响应赤霉素的能力，对于提高植物抗性和培育优新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中基因RcPRX10在不同月季器官中的RT-qPCR分析图。横坐标前四种材料分别是取自绿瓣期(具有绿色花瓣的幼嫩花苞)、转色期(花瓣开始转色的花苞)、红瓣期(花瓣完成着色的花苞)和盛开期(花朵完全开放)的花瓣，其他材料分别是月季的叶、茎、皮刺、雄蕊、雌蕊和根。

图2为本发明较佳实施例中酶切检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DNAMarker II；泳道2为载体pBI121-35S::GUS；泳道3为重组表达载体pBI121- proRcPRX10::GUS。采用Hind III和BamH I限制性内切酶进行双酶切。

图3为本发明较佳实施例中重组表达载体pBI121-proRcPRX10::GUS示意图。

图4为本发明较佳实施例中转基因拟南芥株系GUS染色示意图。其中，左图为转pBI121-35S::GUS对照植株，右图为转pBI121-proRcPRX10::GUS实验株系。

图5为本发明较佳实施例中转pBI121-proRcPRX10::GUS拟南芥在正常和赤霉素激素处理条件下GUS蛋白活性检测。

具体实施方式

本发明旨在提供一种在月季根中特异性表达的启动子proRcPRX10序列的鉴定及应用。所述启动子能够启动外源基因在植物根中进行特异性表达。

本发明还提供一种含有上述组织特异性表达的启动子的重组表达载体。

可以将上述的组织特异性启动子及重组表达载体应用于构建转基因株系，开展植物根系对赤霉素响应的研究，培育具有抗逆性强等优点的植物新品种等。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种在月季‘月月粉’根中特异性表达的启动子proRcPRX10，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，来自于月季‘月月粉’。

本发明还提供一种月季根特异性启动子的重组表达载体，如连接根特异性启动子proRcPRX10的pBI121载体。

本发明利用农杆菌介导法进行转化，如包含重组表达载体pBI121- proRcPRX10::GUS的农杆菌AGL0感受态，最终获得转基因拟南芥，验证该启动子在根中特异性表达。

本发明进一步提供启动子proRcPRX10的用途，如启动子proRcPRX10的表达受到外源激素GA诱导，显著增强GUS基因活性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例使用的载体pBI121购自NovoPro公司。

实施例1根特异性基因RcPRX10的RT-qPCR分析

材料的准备：取月季‘月月粉’的不同组织如根、茎、叶、不同开放阶段的花瓣、皮刺、雄蕊、雌蕊等共10个样品，每个样品设置3次重复。对样品进行液氮速冻，并保存于-80℃冰箱备用。

RNA提取和cDNA合成：RNA提取采用Trizol法，参考SV Total RNA提取试剂盒(Promega,WI,USA)说明书。第一链cDNA合成参考PrimeScript^TM RT reagent试剂盒(TaKaRaBio,Inc.,Tokyo,Japan)说明书。取1μg RNA合成cDNA，并依次加入2μL 5×gDNA EraserBuffer，1μL gDNA Eraser，加RNase free dH₂O至10μL，混匀后于 42℃温育2min，然后于冰上迅速降温。然后依次加入反应组分5×PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT酶1μL、RT Primer Mix 1μL和RNase Free ddH₂O 4μL。 PCR反应程序为：37℃孵育15min，85℃加热5s终止反应，最后合成cDNA后置于- 20℃冰箱内保存。

RT-qPCR分析：通过实时荧光定量PCR检测基因RcPRX10在月季不同部位的表达，采用TB Premix Ex Taq^TMII(RR420Q，TaKaRa)试剂盒，按照试剂盒说明书操作。扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，95℃延伸5 s，以上程序40个循环；95℃5s；融解曲线温度为65～95℃，以0.5℃/s的速度升温。 RT-qPCR反应体系如表1。以RcActin为内参基因，验证引物见表2。

表1RT-qPCR反应体系

表2验证引物

从定量结果看，RcPRX10基因在‘月月粉’的根中表达量最高，而在其它部位不表达，说明RcPRX10基因在月季根中存在特异性表达模式(图1)。

实施例2根特异性启动子proRcPRX10的克隆

月季DNA提取：月季DNA提参考植物DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek, Doraville,GA,USA)说明书。根据月季基因组数据库(https://lipm- browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)提供的RcPRX10基因序列，通过 DNAMAN软件设计引物，对RcPRX10基因全长序列进行扩增。使用KOD-plus高保真酶(KOD-201，TOYOBO CO.,LTD.Life ScienceDepartment OSAKA JAPAN)，参考KOD-plus说明书配制PCR反应体系(50μL)。引物见表3。PCR的反应程序为： 94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共设置32个循环；72℃延伸5min。利用琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测并送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

表3扩增引物

启动子proRcPRX10的克隆：以上述月季DNA为模板，设计引物对基因 RcPRX10的启动子进行扩增，参考KOD-plus高保真酶说明书配制PCR反应体系(50 μL)，扩增引物见表3。PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共设置35个循环；72℃延伸2min。扩增产物通过 1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，天根生化科技(北京)有限公司)进行回收纯化。将回收产物与-Blunt克隆载体(CB501-01，北京全式金生物有限公司)连接、转化大肠杆菌Trans T1感受态，并将阳性菌斑送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，得到的重组质粒命名为 pEASY-proRcPRX10。

实施例3载体pBI121-proRcPRX10::GUS的构建

选择Hind III和BamH I限制性内切酶(TaKaRa)对重组质粒pEASY-proRcPRX10 和目的载体pBI121进行双酶切，37℃反应1h，反应体系见表4。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后切胶回收酶切产物。采用T4连接酶(2011A，TaKaRa)连接目的片段和载体，连接体系见表5。将连接产物转化大肠杆菌感受态并将阳性菌液送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。对质粒pBI121-35S::GUS及重组质粒 pBI121-proRcPRX10::GUS进行酶切检测(图2)，最终获得重组表达载体pBI121- proRcPRX10::GUS(图3)。

表4酶切体系

表5连接体系

实施例4启动子proRcPRX10表达模式分析

制备重组农杆菌菌液：将构建的载体pBI121-35S::GUS和pBI121- proRcPRX10::GUS分别导入农杆菌AGL0感受态中，并将其接种到LB培养基(含抗生素利福平Rif和卡那霉素Kan)，28℃200rpm振荡培养，得到OD₆₀₀＝0.6-0.8的重组农杆菌菌液。

将启动子proRcPRX10转入拟南芥：采用花序侵染法对拟南芥植株进行转化，将拟南芥植株的花序分别放入到含有载体pBI121-35S::GUS或pBI121- proRcPRX10::GUS的重组农杆菌菌液中浸泡3-5min，避光放置24h，然后继续培养至收获成熟种子。

转基因拟南芥的抗性筛选：将收取的种子进行消毒灭菌后，涂布在含有抗生素(Kan，50mg/L)的MS培养基上；然后于长日照16h/短日照8h条件下生长，长出的幼苗移栽到土壤中，长大后进行分子检测。播种繁殖多代后，以T3代种子阳性苗进行启动子GUS染色分析。

实施例5转基因拟南芥根特异性GUS蛋白的染色试验

通过检测GUS活性来分析启动子proRcPRX10在转基因拟南芥中的分布。分别取培养30d的拟南芥苗，将整株苗全部浸入到GUS染色液中，GUS染色液配制见表6。将离心管放到37℃的培养箱中避光染色24h，将染色后的植株用70％乙醇脱色，期间不断更换70％乙醇，至植物组织绿色部分变白色为止。最后观察记录GUS基因在植株中的表达情况。如图4所示转pBI121-35S::GUS的对照植株整株呈蓝色，转 pBI121-proRcPRX10::GUS试验株系根部呈蓝色而其它部位未被染色，最终说明启动子proRcPRX10在根中特异性表达。

表6 GUS染色液配制

实施例6启动子proRcPRX10对外源激素GA的响应

拟南芥根中GUS蛋白提取：将proRcPRX10::GUS转基因拟南芥的根放入含有 100μM赤霉素的液体培养基(1/2MS+15g/L蔗糖，pH 5.8)中处理，并以pBI121- 35S::GUS为对照。分别在0、10、30min分离植株根部，取0.1g样品置于液氮中充分研磨，进行3次生物学重复。同时加入1mL的蛋白提取缓冲液，颠倒混匀，于4℃ 8,000rpm离心5min轻轻吸出上清液，可置于-80℃冰箱保存。

GUS蛋白含量测定及酶活反应：蛋白含量的测定采用Bradford法(BRADFORD,1976)。酶活反应各反应液配制见表7。取500μL酶反应缓冲液37℃预热5min，向离心管中加入预热的500μL酶反应缓冲液，再加入50μL上清液，轻轻混匀。立即吸出 100μL加入到900μL酶反应终止液中并混匀，作为反应零时样品(荧光测定时以此为空白)并计时。酶反应体系在37℃孵育30min后，取100μL与900μL酶反应终止液混匀，用于荧光测定。制作标准曲线：用酶反应终止液将l mM 4-MU贮存液按1:9 (v/v)比例稀释成20nM，40nM，60nM，80nM，100nM，10μM与100μM浓度，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定样品荧光值，酶反应终止液作为空白对照，荧光值对4-MU浓度进行统计处理得到回归方程。以零时对照样品为空白，在上述条件下检测各样品的荧光强度，从回归方程计算4-MU的含量。酶活力单位定义：每分钟水解4-MUG生成1nM或1μM 4-MU的酶量作为一个活力单位。GUS基因表达活性：以每mg蛋白的酶活力来计算，结果表示成4-MU nmol/min/mg蛋白。

GUS酶活性检测结果见图5。与对照相比，转入pBI121-proRcPRX10::GUS的拟南芥根中GUS蛋白酶活性随GA处理时间延长而显著提升，表明启动子proRcPRX10 能响应外源GA信号。

表7酶活反应液配制

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims

1.月季根特异表达启动子proRcPRX10，其特征在于，所述启动子为：

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述启动子的表达盒。

3.含有权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达盒的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，出发载体为pBI121。

5.含有权利要求1所述启动子、权利要求2所述表达盒或权利要求3或4所述载体的工程菌。

6.在植物中表达目的核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有权利要求1所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子，所述植物为月季或拟南芥。

7.权利要求1所述启动子的以下任一应用：

1)用于构建表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；

2)用于构建转基因植物；

3)用于植物育种；

所述植物为月季或拟南芥。