CN114908118A - 表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养生长阶段的方法 - Google Patents

表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养生长阶段的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养生长阶段的方法。本发明通过分子生化实验鉴定了韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)编码的RNase HI，命名为LasRNHI，并明确其可与柑橘编码的一种BBX锌指蛋白CsBBX28直接互作，形成复合体。相比野生型(wt)拟南芥，共表达LasRNHI和CsBBX2828的拟南芥株系开花推迟大约4周，营养生长期显著延长，莲座叶数量明显增多。由此表明，LasRNHI‑CsBBX28复合体具有延长植物营养生长期、提高叶片等营养器官产量的功能，在生物育种工程中具有重要的应用价值。

Description

表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养 生长阶段的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养生长阶段的方法。
背景技术
高等植物的生长通常分为营养生长和生殖生长两个阶段。根、茎、叶是植物的营养器官，负责营养物质的吸收和有机物的制造，这些器官的建成与生长过程即为植物的营养生长阶段；花、果实、种子是植物的生殖器官，其建成与生长称为生殖生长。开花是高等植物由营养生长阶段转向生殖生长阶段的标志事件，是植物发育的核心生命活动，由光周期、春化、自主途径、激素和年龄等因素协同调控。
针对收获物为营养器官的作物，需要培育营养生长期长、植株硕大、开花推迟的作物品种，使有机和无机养分集中于营养器官的生长，提高农产品的产量和品质。
RNase HI是一种进化保守的核酸内切酶，在细菌、真菌、植物与动物中广泛存在，其催化结构域由150个氨基酸组成，活性位点包含一个DEDD基序，由D、E、D和D四个高度保守的氨基酸残基组成，其中前三个氨基酸残基构成活性位点的核心。RNase HI特异性水解DNA/RNA杂合链中的RNA链，能够有效消除基因组中的R-loop，阻止基因转录过程中R-loop的积累，具有维持基因组稳定的功能。原核生物仅编码一种RNase HI，定位于拟核区域；植物RNase HI分为细胞核、叶绿体、线粒体三种类型，分别定位于相应的亚细胞区域。
BBX蛋白是一类具有B-box结构域和锌指结构的转录因子，其二级结构高度保守，氨基端包含一个或两个串联的B-box结构域，由保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成，三级结构因结合锌离子而稳定。BBX类转录因子以家族蛋白形式在植物中广泛存在，如：拟南芥编码32个BBX蛋白，根据蛋白结构可细分为五个亚组，其中BBX1-17分属于亚组I、II和III，其羧基端有一个CCT结构域，而BBX18-32分属于亚组IV和V，其羧基端不包含CCT域。在高等开花植物中，BBX家族蛋白广泛参与开花、光形态建成、生物和非生物胁迫以及植物激素代谢等重要生命活动，在生长与发育过程中发挥重要的调控作用。
RNase HI与BBX作为重要的功能蛋白，针对其已经开展了大量的研究，但没有关于RNase HI与BBX互作形成蛋白复合体，进而调控植物生长发育的文献或报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种延长植物营养生长阶段的方法。
本发明的再一目的是提供一种延长植物开花和增加叶片数量的方法。
本发明的再一目的是提供韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因用于延长植物营养生长期的应用。
根据本发明的延长植物营养生长阶段的方法，包括以下步骤：
在植物中表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因，其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
根据本发明的延长植物营养生长阶段的方法，其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述柑橘CsBBX28基因的核苷酸序列SEQID NO:3所示。
韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
ATGGATTCTAAACATTTGAGAGAAGTTCACGCATATACTGATGGCGCTTGTTCCGGCAATCCAGGTCCTGGAGGATGGGGCGTGCTACTACGATATAAAGGAAAAGAAAAAATTATTTCTGGAGGAGAGAAAGAAACAACTAATAATAGAATGGAATTGATGGCTGCGATTAAAGCTCTGACTGCTCTCAAGTACCCTTGTAAAGTACTTTTATATACAGATAGCTCCTATGTTCATAAAGGTTTTTCACAATGGATAAAAAAATGGCAACAAAATGGGTGGAAGACTTCTGATAAAAAAACCGTTAAAAATATAGATCTCTGGATGAAATTTGTAGAAGCCTCTGCACAACATAAAGTTGATTTGTATTGGATAAAAGGTCATGCGGGCAATCAAGAAAACGAGAAGGTTGATCGTATAGCACGGAACGCTGCCGTTTCTTTTAAAAACAAAATATAA
韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
MDSKHLREVHAYTDGACSGNPGPGGWGVLLRYKGKEKIISGGEKETTNNRMELMAAIKALTALKYPCKVLLYTDSSYVHKGFSQWIKKWQQNGWKTSDKKTVKNIDLWMKFVEASAQHKVDLYWIKGHAGNQENEKVDRIARNAAVSFKNKI
柑橘CsBBX28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
ATGAGGAAGTGTGAGCTGTGTGAATGCCCGGCAAGAATGTACTGCGAATCGGACCAGGCGAGCTTATGCTGGGACTGCGACGAGAAAGTACACTGTGCGAATTTTCTGGTCGCCAAGCACTTACGCTGCCTTCTTTGTCACGTCTGTCAGTCACTCACGCCGTGGAAAGCCTCCGGCCCGAAGCTGGGCCCCACAGTTTCCGTGTGCGACGCGTGCGTTGCCGCCGCTCGCTGTGGAGTCAATGATGACGATAAGGCTGTCGTTCGACGAGGAAGTCAGAGTGAAAGAATCAGCGGCCATGACGAGACTGATGATGATGATGATTACGAAGACGAAGACGACGATGACGATGACGATGAGGATCCTGATGAGGAAGAAGAAGAGGAGGATGACGAGAATCAAGTGGTGCCGTGGTCGGGGGACGATTCACAATCGCCGCCGCAGCCGCCGCCGCCGCCGGTGTCCAGTTCCTGTAGTAGTATTAGTGAAGAAGACTTTTCGTTGAAACGGATGCGTGATTTTGGTGATCTTTTTTCTGATGACGAAATCGGGTGCTCTTCGCGACCAGTCACAAATGAGGAAGCCGCCGCTTCAATGAGCTCATATAGGCCATTGAAACAGCCAAGACCAACGATATCTGATTGTGACCGAGATCACGGTCAATCAGTCTCCAGATCAACGGCTATTATTAGCTCCCTCCGGGGACTCCAAAATCAGACGATGACAGACCAGGGTGACGCCGCCGCTGCAATTACTGGGATCTGTCGATTGAGCAGAGATCATCAGACCCGTTGA
柑橘CsBBX28基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
MRKCELCECPARMYCESDQASLCWDCDEKVHCANFLVAKHLRCLLCHVCQSLTPWKASGPKLGPTVSVCDACVAAARCGVNDDDKAVVRRGSQSERISGHDETDDDDDYEDEDDDDDDDEDPDEEEEEEDDENQVVPWSGDDSQSPPQPPPPPVSSSCSSISEEDFSLKRMRDFGDLFSDDEIGCSSRPVTNEEAAASMSSYRPLKQPRPTISDCDRDHGQSVSRSTAIISSLRGLQNQTMTDQGDAAAAITGICRLSRDHQTR
根据本发明的延长植物营养生长阶段的方法，其中，所述植物为十字花科植物。
根据本发明的延长植物营养生长阶段的方法，其中，所述植物为拟南芥。
根据本发明的延长植物营养生长期的方法，其中，所述方法包括分别构建包含所述达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的载体和包含所述柑橘CsBBX28基因的载体的步骤。
根据本发明的延长植物营养生长阶段的方法，其中，所述方法进一步将构建的包含所述达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的载体和包含所述柑橘CsBBX28基因的载体导入植物的步骤。
根据本发明的延迟植物开花和增加叶片数量的方法，包括以下步骤：
在植物中表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因，其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
本发明提供了韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因用于延长植物营养生长期的应用，其中，在植物中共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
本发明提供了韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因用于延迟植物开花期的应用。
本发明提供了韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因用于促进植物叶片数量增多的应用。
本发明通过分子生化实验鉴定了韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacterasiaticus,CLas)编码的RNase HI，命名为LasRNHI，并明确其可与柑橘编码的一种BBX锌指蛋白直接互作，形成复合体，命名为CsBBX28。相比野生型(wt)拟南芥，共表达LasRNHI和CsBBX2828的拟南芥株系开花推迟大约4周，营养生长期显著延长，莲座叶数量明显增多。由此表明，LasRNHI-CsBBX28复合体具有延长植物营养生长期、提高叶片等营养器官产量的功能，在生物育种工程中具有重要的应用价值。
附图说明
图1显示LasRNHI的体外RNase H活性分析；
图2显示LasRNHI与CsBBX28在酵母细胞中互作；
图3显示LasRNHI与CsBBX28在体外直接互作；
图4显示LasRNHI与CsBBX28在植物细胞中互作；
图5显示共表达LasRNHI和CsBBX28的转基因拟南芥的RT-PCR检测
图6显示共表达LasRNHI和CsBBX28导致植物开花推迟，营养生长期延长，叶片数量增多。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例详细描述本申请的技术方案。
本发明通过分子生化实验鉴定了韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacterasiaticus,CLas)编码的RNase HI，命名为LasRNHI，并明确其可与柑橘编码的一种BBX锌指蛋白直接互作，形成复合体，命名为CsBBX28。
用原核表达的GST-LasRNHI处理柑橘基因组DNA，以商品化RNase H(NEB,USA)为阳性对照，GST为阴性对照，检测韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI编码蛋白的RNase H活性。结果显示，与商品化RNase H相似，GST-LasRNHI能够迅速破坏基因组DNA中的R-loop结构，LasRNHI具有RNase HI的功能。
进一步，本申请检测了韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI和柑橘CsBBX28编码蛋白直接互作。利用酵母双杂交筛选获得LasRNHI的寄主互作蛋白CsBBX28，进一步用GSTpull down证明LasRNHI与CsBBX28在体外系统中直接互作，用双分子荧光互补证明LasRNHI与CsBBX28在体内互作，且发生在植物细胞的核仁区域。
制备表达CsBBX28的拟南芥(35S::CsBBX28)、表达LasRNHI的拟南芥(35S::LasRNHI)，以及共表达CsBBX28和LasRNHI的拟南芥(35S::CsBBX28-35S::LasRNHI)的转基因植株。RT-PCR检测结果证实目的基因在相应的转基因株系中均转录表达。
分析共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI和柑橘CsBBX28基因延长植物营养生长期、提高营养器官产量的功能。本发明制备种植表达CsBBX28的转基因拟南芥(35S::CsBBX28)、表达LasRNHI的拟南芥(35S::LasRNHI)，以及共表达CsBBX28和LasRNHI的拟南芥(35S::CsBBX28-35S::LasRNHI)，分析在22℃、16h/8h的长日照条件下，表达CsBBX28的拟南芥(35S::CsBBX28)、表达LasRNHI的拟南芥(35S::LasRNHI)开花时间延迟5～7天，相比WT、35S::LasRNHI和35S::CsBBX28，共表达CsBBX28、LasRNHI的拟南芥(35S::CsBBX28-35S::LasRNHI)开花推迟时间更长，营养生长期显著延长；WT、35S::LasRNHI和35S::CsBBX28的莲座叶一般为7～9片，35S::CsBBX28-35S::LasRNHI的莲座叶数量平均达到30片，显著增多。由此表明，LasRNHI和CsBBX28共表达能够显著延长植物营养生长期，明显提高叶片等营养器官的产量。
下面实施案中采用的酶与试剂：限制性内切酶、Taq酶、基因克隆试剂盒、质粒提取试剂盒与DNA凝胶回收试剂盒等。
在基因克隆、双荧光互补、酵母双杂交、植物遗传转化试验步骤中所用引物如以下表1所示。
表1.所用引物序列表
Figure BDA0003687263330000051
Figure BDA0003687263330000061
实施例1：克隆韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因
1、核酸提取和cDNA合成
取200mg感染黄龙病菌的柑橘叶片，在液氮中充分研磨，平均分为两份：一份用RNeasy Mini Kit提取总RNA，参考PrimeScript TM RT reagent Kit试剂盒方法，合成cDNA，用于柑橘CsBBX28基因的克隆；另一份用CTAB法提取DNA，用于韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的克隆。
2、LasRNHI与CsBBX28基因的克隆
以上述DNA为模板，RNH-F/RNH-R为引物(表1)，扩增LasRNHI；以上述cDNA为模板，BBX-F/BBX-R为引物，扩增CsBBX28。PCR产物连接至pMD18-T载体，测序验证。
实施例2：LasRNHI的体外RNase H活性分析
分离柑橘细胞核，提取基因组DNA。取1μg DNA为底物，分别加入大肠杆菌表达的融合蛋白GST-LasRNHI和GST(阴性对照)，以商品化的RNase H(NEB,USA)为阳性对照。反应体系如下表2所示。
表2
Figure BDA0003687263330000062
37℃反应20min，65℃热失活20min，置于-20℃备用。
剪取大小合适的HybondTM N+尼龙膜，2×SSC浸泡5-10min，放置在Slot blot模具中央备用；将DNA样品分别加入模具的狭缝处，模具与真空泵连接，抽真空2-3次，直至尼龙膜表面没有残液；取出尼龙膜，3000mJ/cm2紫外交联1min；室温晾干，加入抗体anti-R-loop[S9.6]抗体，检测DNA:RNA杂合链降解情况。结果显示，GST-LasRNHI迅速破坏了基因组DNA中的R-loop结构，表现出与商品化RNase H一致的结果(图1)，由此说明LasRNHI具有RNaseHI的活性。
实施例3：LasRNHI与CsBBX28互作分析
1.利用酵母双杂分析LasRNHI与CsBBX28在酵母细胞中互作
以含有LasRNHI的质粒为模板，用引物5′BD-RNH/3′BD-RNH(表1)扩增目的基因，插入pGBKT7，构建pBD-RNHI；以含有CsBBX28的质粒为模板，用引物5′AD-BBX/3′AD-BBX(表1)扩增，获得的PCR产物插入pGADT7，构建pAD-BBX。
利用ZYMO Frozen-EZ Yeast Transfomation II Kit制备酵母AH109感受态细胞，并参照说明书，用pAD-BBX/pBD-RNHI转化感受态细胞，同时将阴性对照组pAD-BBX/pGBKT7、pGADT7/pBD-RNHI分别转化感受态细胞，涂布于SD-Leu/Trp平板，30℃倒置培养5d。
挑取单克隆，在SD-Leu/Trp液体培养基中过夜培养。按10-1、10-2和10-3梯度稀释菌液，取3μL分别点于SD-Leu/Trp、SD-Leu/Trp/His/Ade平板，30℃倒置培养3-4d，对比阴性对照组，记录实验结果。结果显示，共转化pAD-BBX与pBD-LasRNHI的酵母细胞在SD-Leu/Trp/His/Ade培养基上正常生长，而阴性对照组pAD-BBX/pGBKT7或pGADT7/pBD-LasRNHI不能生长(图2)，由此确证LasRNHI和CsBBX28在酵母细胞中发生互作。
2.利用GST-pull down分析LasRNHI与CsBBX28在体外直接互作
参考Thermo PierceTMGST Protein Interaction Pull-Down Kit说明书进行，步骤简述如下：
分别取大肠杆菌表达的融合蛋白GST-LasRNHI和GST(阴性对照)10μg于1.5mL EP管中，加入适量wash buffer(TBS:Pull-Down Lysis Buffer＝1:1)，稀释100倍；分别加入10μg融合蛋白CsBBX28-His，4℃孵育3h；
取50μL GlutathioneAgarose，平衡处理，加入上述蛋白混合液中，4℃孵育1h；吸取混合液，转移至离心柱中，1200g，离心30s。将蛋白吸附到离心柱上；用400μLwash buffer冲洗吸附柱5-7次，1300g离心30s；加240μL Glutathione elution buffer，洗脱蛋白；12％SDS-PAGE电泳，用western blot检测蛋白间的互作。结果表明，GST-LasRNHI和CsBBX2828-His具有较强的结合作用，而对照组GST和CsBBX2828-His没有目的条带出现(图3)，说明LasRNHI和CsBBX28在体外直接互作。
3.利用双分子荧光互补分析LasRNHI与CsBBX28在植物细胞中互作
以含有LasRNHI或CsBBX28的质粒为模板，利用引物5′RNH-nYFP/3′RNH-nYFP或5′BBX-cYFP/3′BBX-cYFP(表1)扩增，回收目的片段分别插入pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体，构建pRNHI-nYFP和pBBX-cYFP，导入农杆菌感受态EHA105，同时分别转化空载体pSPYNE、pSPYCE。
挑取单克隆，接种于5mLYEB液体培养基(50mg/mL Kan，50mg/mL Rif)中，28℃，220rpm过夜培养；翌日将含有pRNHI-nYFP、pBBX28-cYFP、pSPYNE、pSPYCE的农杆菌菌液分别用MMA溶液(10mM MgCl2,10m M MES,0.1mM AS)重悬至OD600＝0.5-0.6，按照1:1的比例混合制备pRNHI-nYFP/pBBX-cYFP、pRNHI-nYFP/pSPYCE和pSPYNE/pBBX-cYFP三组菌液，注射4周龄本氏烟叶片，25℃温室培养60h。
用LSM700共聚焦显微镜观察YFP的黄色荧光，激发波长为514nm，发射波长为520-555nm。结果表明，共表达LasRNHI-nYFP和CsBBX28-cYFP的细胞在细胞核仁的位置观察到强烈的YFP荧光，而共表达LasRNHI-nYFP和cYFP或者CsBBX28-cYFP和nYFP的细胞没有出现黄色荧光(图4)，由此确证LasRNHI与CsBBX28在植物细胞中相互作用，且主要发生在核仁中。
实施例4：制备共表达LasRNHI和CsBBX28的转基因拟南芥
以含有LasRNHI或CsBBX28的质粒为模板，利用引物5′1300-RNH/3′1300-RNH或5′1305-BBX/3′1305-BBX(表1)扩增，目的基因分别插入pCAMBIA1300-35S-DsRed和pCAMBIA1305.1，构建植物表达载体p1300-RNHI和p1305-BBX。
按照育苗基质：珍珠岩：蛭石＝2:1:1的比例配好营养土，取拟南芥Col-0种子播种于直径为7cm的育苗小方盆中，在22℃，16h/8h(光照/黑暗)条件下培养；待拟南芥抽薹5-7cm，去顶，继续培养，直至植株侧枝生长至盛花期。
转化EHA105农杆菌感受态细胞，挑取单克隆，接种于5mLYEB液体培养基(50mg/mLKan，50mg/mL Rif)中，28℃，220rpm过夜培养；收集菌体，用侵染缓冲液(10％蔗糖，0.02％SilwetL-77，100μMAS)重悬菌体，调OD600至0.5左右，4℃静置1-2h。
采用蘸花法，将LasRNHI和CsBBX2828两个基因单独或共转化至拟南芥中，简述如下：在上午8点到10点，将拟南芥花序完全浸没在含有pCAMBIA1300-35S-DsRed、pCAMBIA1305.1或pCAMBIA1300-35S-DsRed+pCAMBIA1305.1的侵染缓冲液中，45s后取出，黑暗培养24h；然后转移至22℃，16h光照/8h黑暗条件下继续培养，待拟南芥成熟；收集T0代种子，利用选择培养基筛选转基因拟南芥。加代至T2代，取幼嫩叶片提取RNA，进行RT-PCR确证。结果显示，CsBBX2828和LasRNHI在过表达CsBBX2828(35S::CsBBX2828)、LasRNHI(35S::LasRNHI)以及CsBBX2828和LasRNHI(35S::CsBBX2828-35S::LasRNHI)的转基因株系中均转录生成mRNA(图5)。
实施例5：LasRNHI和CsBBX28共表达对植物营养生长的影响
将T2代转基因拟南芥种子在22℃、16h/8h的长日照条件下进行培养，并持续观察表型，结果显示：野生型(WT)拟南芥在第3周开始成花转变，35S::CsBBX2828或35S::LasRNHI开花时间与WT拟南芥相比一般延迟5～7天，而35S::CsBBX2828-35S::LasRNHI延迟开花更为明显，通常比WT晚4周(图6中A图)，莲座叶数量平均达到30片，显著高于WT，以及35S::LasRNHI和35S::CsBBX2828(图6中B图)。由此表明，LasRNHI和CsBBX2828共表达能够显著抑制拟南芥从营养生长到生殖生长的转换，延长营养生长期，促进叶片数量增多。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
序列表
<110> 北京农学院
<120> 表达LasRNHI基因和/或CsBBX28基因的应用及延长植物营养生长阶段的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)
<400> 1
atggattcta aacatttgag agaagttcac gcatatactg atggcgcttg ttccggcaat 60
ccaggtcctg gaggatgggg cgtgctacta cgatataaag gaaaagaaaa aattatttct 120
ggaggagaga aagaaacaac taataataga atggaattga tggctgcgat taaagctctg 180
actgctctca agtacccttg taaagtactt ttatatacag atagctccta tgttcataaa 240
ggtttttcac aatggataaa aaaatggcaa caaaatgggt ggaagacttc tgataaaaaa 300
accgttaaaa atatagatct ctggatgaaa tttgtagaag cctctgcaca acataaagtt 360
gatttgtatt ggataaaagg tcatgcgggc aatcaagaaa acgagaaggt tgatcgtata 420
gcacggaacg ctgccgtttc ttttaaaaac aaaatataa 459
<210> 2
<211> 152
<212> PRT
<213> 韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)
<400> 2
Met Asp Ser Lys His Leu Arg Glu Val His Ala Tyr Thr Asp Gly Ala
1 5 10 15
Cys Ser Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Gly Val Leu Leu Arg Tyr
20 25 30
Lys Gly Lys Glu Lys Ile Ile Ser Gly Gly Glu Lys Glu Thr Thr Asn
35 40 45
Asn Arg Met Glu Leu Met Ala Ala Ile Lys Ala Leu Thr Ala Leu Lys
50 55 60
Tyr Pro Cys Lys Val Leu Leu Tyr Thr Asp Ser Ser Tyr Val His Lys
65 70 75 80
Gly Phe Ser Gln Trp Ile Lys Lys Trp Gln Gln Asn Gly Trp Lys Thr
85 90 95
Ser Asp Lys Lys Thr Val Lys Asn Ile Asp Leu Trp Met Lys Phe Val
100 105 110
Glu Ala Ser Ala Gln His Lys Val Asp Leu Tyr Trp Ile Lys Gly His
115 120 125
Ala Gly Asn Gln Glu Asn Glu Lys Val Asp Arg Ile Ala Arg Asn Ala
130 135 140
Ala Val Ser Phe Lys Asn Lys Ile
145 150
<210> 3
<211> 795
<212> DNA
<213> 柑橘(Citrus)
<400> 3
atgaggaagt gtgagctgtg tgaatgcccg gcaagaatgt actgcgaatc ggaccaggcg 60
agcttatgct gggactgcga cgagaaagta cactgtgcga attttctggt cgccaagcac 120
ttacgctgcc ttctttgtca cgtctgtcag tcactcacgc cgtggaaagc ctccggcccg 180
aagctgggcc ccacagtttc cgtgtgcgac gcgtgcgttg ccgccgctcg ctgtggagtc 240
aatgatgacg ataaggctgt cgttcgacga ggaagtcaga gtgaaagaat cagcggccat 300
gacgagactg atgatgatga tgattacgaa gacgaagacg acgatgacga tgacgatgag 360
gatcctgatg aggaagaaga agaggaggat gacgagaatc aagtggtgcc gtggtcgggg 420
gacgattcac aatcgccgcc gcagccgccg ccgccgccgg tgtccagttc ctgtagtagt 480
attagtgaag aagacttttc gttgaaacgg atgcgtgatt ttggtgatct tttttctgat 540
gacgaaatcg ggtgctcttc gcgaccagtc acaaatgagg aagccgccgc ttcaatgagc 600
tcatataggc cattgaaaca gccaagacca acgatatctg attgtgaccg agatcacggt 660
caatcagtct ccagatcaac ggctattatt agctccctcc ggggactcca aaatcagacg 720
atgacagacc agggtgacgc cgccgctgca attactggga tctgtcgatt gagcagagat 780
catcagaccc gttga 795
<210> 4
<211> 264
<212> PRT
<213> 柑橘(Citrus)
<400> 4
Met Arg Lys Cys Glu Leu Cys Glu Cys Pro Ala Arg Met Tyr Cys Glu
1 5 10 15
Ser Asp Gln Ala Ser Leu Cys Trp Asp Cys Asp Glu Lys Val His Cys
20 25 30
Ala Asn Phe Leu Val Ala Lys His Leu Arg Cys Leu Leu Cys His Val
35 40 45
Cys Gln Ser Leu Thr Pro Trp Lys Ala Ser Gly Pro Lys Leu Gly Pro
50 55 60
Thr Val Ser Val Cys Asp Ala Cys Val Ala Ala Ala Arg Cys Gly Val
65 70 75 80
Asn Asp Asp Asp Lys Ala Val Val Arg Arg Gly Ser Gln Ser Glu Arg
85 90 95
Ile Ser Gly His Asp Glu Thr Asp Asp Asp Asp Asp Tyr Glu Asp Glu
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Pro Asp Glu Glu Glu Glu Glu
115 120 125
Glu Asp Asp Glu Asn Gln Val Val Pro Trp Ser Gly Asp Asp Ser Gln
130 135 140
Ser Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Cys Ser Ser
145 150 155 160
Ile Ser Glu Glu Asp Phe Ser Leu Lys Arg Met Arg Asp Phe Gly Asp
165 170 175
Leu Phe Ser Asp Asp Glu Ile Gly Cys Ser Ser Arg Pro Val Thr Asn
180 185 190
Glu Glu Ala Ala Ala Ser Met Ser Ser Tyr Arg Pro Leu Lys Gln Pro
195 200 205
Arg Pro Thr Ile Ser Asp Cys Asp Arg Asp His Gly Gln Ser Val Ser
210 215 220
Arg Ser Thr Ala Ile Ile Ser Ser Leu Arg Gly Leu Gln Asn Gln Thr
225 230 235 240
Met Thr Asp Gln Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ile Thr Gly Ile Cys Arg
245 250 255
Leu Ser Arg Asp His Gln Thr Arg
260

Claims (10)

1.一种延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在植物中表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因，其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述柑橘CsBBX28基因的核苷酸序列SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述植物为十字花科植物。
4.根据权利要求3所述的延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。
5.根据权利要求1所述的延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述方法进一步包括分别构建包含所述达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的载体和包含所述柑橘CsBBX28基因的载体的步骤。
6.根据权利要求5所述的延长植物营养生长阶段的方法，其特征在于，所述方法进一步将构建的包含所述达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因的载体和包含所述柑橘CsBBX28基因的载体导入植物的步骤。
7.一种延迟植物开花和增加叶片数量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在植物中共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因，其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
8.韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因与柑橘CsBBX28基因用于延长植物营养生长期的应用，其特征在于，通过在植物中共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因延长植物营养生长期，
其中，所述韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质，所述柑橘CsBBX28基因编码基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过在植物中共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因推迟植物开花。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过在植物中共表达韧皮部杆菌亚洲种LasRNHI基因和/或柑橘CsBBX28基因促进植物叶片数量增多。
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