CN111454963A - 火龙果耐盐基因HuERF1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了一种新型的火龙果乙烯响应因子HuERF1，其cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明基因HuERF1属于乙烯响应因子基因家族，受到高盐诱导表达，编码的蛋白质与火龙果提高盐耐受性有关。构建HuERF1基因的过表达载体，经过农杆菌介导的遗传转化，将过表达载体片段转入野生型拟南芥，能够明显提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。

Description

火龙果耐盐基因HuERF1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一个火龙果耐盐HuERF1基因及其应用。

背景技术

火龙果(Hylocereus spp.)是仙人掌科、量天尺属的一种新兴热带水果。火龙果花、茎、果实皆可食用和观赏，果实可制成多种加工品，是集果树、花卉、蔬菜特点于一体的特色植物，极具观赏价值。火龙果原产于墨西哥及美洲大陆等地，是当地传统的食物来源和经济作物。

植物在生长发育的过程中会面临各种生物和非生物胁迫，盐碱是限制农作物产量的主要非生物胁迫之一(Bo Yer et al,Plant productivity and environment.Science,1982，218,443-448)。全世界有800万hm²以上的土地受到盐害的威胁，土壤盐渍化严重，其面积约占全球面积的6％。目前，我国有0.2亿hm²以上盐碱地和0.07hm²以上盐渍化土壤，约占可耕地面积的20％，且呈逐年增加趋势(Zhu.,Plant salt tolerance.Trends PlantSci,2001，6,66-71)。大面积的盐碱地和盐渍化土壤，使得一部分农作物品种因受不同程度盐害的影响而难以发挥产量潜力。植物的抗盐性是一个复杂的数量性状，是由多基因决定的，不同植物的耐盐方式和耐盐机理不同，其组织或细胞的耐盐反应也不同。随着耕地面积不断减少、人口不断增长，研究作物的耐盐机理，培育耐盐品种，对开发和有效利用盐碱地具有重要的现实意义。

乙烯响应因子AP2/ERF(APETALA2/Ethylene Responsive Factor)是植物中最大的转录因子(TF)家族之一，已证明其家族成员在植物代谢、发育和胁迫响应中起重要作用(Licausi et al.APETALA2/Ethylene Responsive Factor(AP2/ERF)transcriptionfactors:Mediators of stress responses and developmental programs.New Phytol，2013,199：639–649)。AP2/ERF超家族分为5个亚家族：AP2、RAV(与ABI3/VP1有关的)、DREB、ERF和Soloists.其中，DREB进一步分为A1-A6亚家族和ERF分为B1-B6亚家族(Sakuma,Y etal.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs,transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem Biophys Res Commun，2002,290,998–1009)。Nakano等人把AP2/ERF分为三个家族：AP2、ERF和RAV(Nakano,T et al.Genome-wide analysis of the ERF genefamily in Arabidopsis and rice.Plant Physiol，2006,140,411–432)。

乙烯作为一种激素能促进植物的成熟，乙烯响应因子在生长发育、器官形成、抗病虫害以及对胁迫环境的响应等方面具有重要作用。近年来，乙烯的研究已经延伸到下游转录因子的调控机制，转录因子在植物的次生代谢过程中参与多步反应，因而也具有重要的调控作用。

乙烯响应因子(ERF)以前称为乙烯响应元件结合蛋白(EREBPs)。首先从烟草中分离出ERF蛋白，它们属于植物中广泛存在的新型转录因子家族的成员(Ohme-takagi,M etal.Ethylene-inducible DNA binding proteins that Interact with an ethylene-responsive element.Plant Cell,1995，11,173–182)。ERF包含来自拟南芥中122个转录因子的植物特异性超家族的AP2DNA结合结构域。在番茄基因组中，大约85个ERF家族蛋白基因仍无法鉴定(Sharma,M.K et al.Identification,phylogeny,and transcript profilingof ERF family genes during development and abiotic stress treatments intomato.Mol Genet Genomics,2010，284,455–475)。ERF蛋白由高度保守的核心DNA结合结构域组成，被命名为约含58-59个氨基酸序列的ERF结构域(Ohme-takagi,M etal.Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element.Plant Cell,1995，11,173–182)。ERF结构域的α-螺旋和β-折叠识别乙烯响应启动子区域中靶DNA的核心顺式作用元件AGC CGC C(GCC盒)(Hao,D etal.Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive element-binding factor(ERF domain)in plant.J Biol Chem,1998，273(41),26857–26861)。这些GCC盒元件和发病相关(PR)基因一起表达(Sessa,G et al.A GCCelement and a G-box motif participate in ethylene-induced expression of thePRB-lb gene.Plant Mol Biol,1995,1,145–153)。此外，很少有非AP2结构域的保守基序赋予特定基因转录激活或抑制，例如ERF相关的两亲抑制(EAR：DLNxxP)基序(Ohta,M etal.Repression domains of class II ERF transcriptional repressors share anessential motif for active repression.The Plant Cell,2001,13,1959–1968)。ERF蛋白与已知的DNA结合蛋白既没有同源性，也没有基本的亮氨酸拉链或锌指基序，这表明ERF是一组新的DNA结合蛋白(Woo,H R et al.The RAV1transcription factor positivelyregulates leaf senescence in Arabidopsis.J Exp Bot,2010,61(14),3947–3957)。新型AP2/ERF型转录因子JcERF2，是由盐、干旱、脱落酸和乙烯相对诱导的转录因子。cERF2在转基因烟草植物中的过表达增强了非生物胁迫相关基因的表达，合成游离脯氨酸和可溶性碳水化合物，并赋予对干旱和盐胁迫的耐受性(Wang,X et al.A new AP2/ERFtranscription factor from the oil plant Jatropha curcas confers salt anddrought tolerance to transgenic tobacco.Appl Biochem Biotech,2015,176(2),582–597)。在转基因品系的一项研究中，转基因烟草中GmERF3的过量表达增加了对盐、干旱和植物病害的更高耐受性(Zhang,G et al.Overexpression of the soybean GmERF3 gene,anAP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt,droughtand diseases in transgenic tobacco.J Exp Bot,2009,60(13),3781–3796)。据报道，DREB2A和DREB2B是拟南芥中的盐诱导基因(Nakashima,K et al.Organization andexpression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteinsinvolved in dehydration-and high-salinity-responsive gene expression.PlantMolBiol,2000,42,l657–658)。

乙烯是一种气态激素，通过铜辅因子与五个家族膜结合的内质网定位受体ETR1/ETR2，ERS1/ERS2和EIN4结合(Bleecker,A.B.Ethylene perception and signaling:Anevolutionary perspective.Trends Plant Sci.1999，4(7),269–274)。位于CTR1下游的五个膜结合受体EIN2，EIN3，EIN5，EIN6和EIN7是乙烯反应的正调节剂。但是，CTR1通过EIN2，EIN3和EIL负向调节下游组件(Kieber,J.J et al.CTRI,a negative regulator of theethylene pathway in Arabidopsis,encodes a member of the raf family of proteinkinases.Cell,1993,72(3),427–441)。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种火龙果盐胁迫应答HuERF1基因和蛋白。

实现上述目的的技术方案如下。

一种火龙果盐耐受HuERF1基因，其cDNA阅读框为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；或为含有SEQ ID No.1所示的序列且序列中有一个或几个核苷酸的替换、缺失或增加，但具有相同功能的核苷酸序列；或为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

火龙果盐耐受HuERF1蛋白，其cDNA阅读框具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种含有上述火龙果盐耐受HuERF1基因的过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

本发明的另一目的是提供所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的制备方法。

所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的制备方法，包括以下步骤：

(A)得到SEQ ID NO.3所示核苷酸片段；

(B)将所述SEQ ID NO.3所示核苷酸片段连接于线性化pCAMBIA-1302载体上，得到连接产物；

(C)把连接产物转化大肠杆菌DH5α，培养，得到所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

本发明的另一目的是提供导入有上述火龙果盐耐受HuERF1基因或上述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的植物，优选地，所述植物为拟南芥，更优选地，所述拟南芥为野生型。

本发明的另一目的是提供上述火龙果盐耐受HuERF1基因的应用。

上述火龙果盐耐受HuERF1基因在培育耐盐性转基因植物中的应用。

上述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1在培育耐盐性转基因植物中的应用。

本发明的另一目的还在于一种提高拟南芥对盐的耐受性的方法。

一种提高拟南芥对盐的耐受性的方法，包括导入有上述火龙果盐耐受HuERF1基因或上述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

本发明采用对盐处理的火龙果转录组测序的方法，筛选得到一个高盐响应的基因，经过序列分析表明，该序列编码与乙烯响应转录因子同源，该基因命名为HuERF1。通过对HuERF1基因过表达介导的遗传转化，使HuERF1基因在拟南芥转基因株系中的表达量上升，用120mM NaCl处理拟南芥，发现超表达转基因拟南芥比野生型的耐盐性显著增强，从而证实了该基因的功能。

附图说明

图1.Over-expression载体实验所用的pCAMBIA1302载体图谱。

图2.火龙果幼苗用450mM NaCl后，HuERF1基因在火龙果不同组织中的表达水平。

图3.用450mM NaCl处理火龙果幼苗，HuERF1在不同时间点的相对表达水平。

图4.HuERF1转基因拟南芥阳性植株的筛选电泳图谱。

图5.HuERF1转基因拟南芥和野生型拟南芥在含有120mM NaCl MS培养基上的表型的比较。

图6.生长10天的拟南芥幼苗，用200mM NaCl处理，HuERF1转基因拟南芥和野生型拟南芥表现型的比较。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明在其中一个实施例中，提供了一种火龙果盐耐受HuERF1基因，所述HuERF1基因的cDNA如SEQ ID NO.1所示，其阅读框全长为897bp，编码298个氨基酸，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，其用于构建转基因过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该基因编码的蛋白乙烯响应因子(ERFs)是AP2/ERF超家族蛋白，属于多种非生物胁迫耐受的最大转录因子家族，如盐、干旱、热和冷，具有相当保守的DNA结合域。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

应当理解，在不影响HuERF1蛋白结构和活性的前提下，本领域技术人员可对SEQID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和(或)缺失一个或几个氨基酸具有同等功能的氨基酸序列。

在其中一个实施例中，以火龙果的cDNA为模板，设计上游引物

5’-TGACCATGGTAGATCTGATGTGTGGCGGTGCAATCTT-3’，下游引物

5’-CTTCTCCTTTACTAGTAGCAGCAGAAGAAGGAACATC-3’，经PCR扩增后获得一个894bp片段。将该片段构建进入pCAMBIA1302 vector后，经测序分析，该片段含有894bp的阅读框，我们将该阅读框对应的基因命名为HuERF1,该cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述HuERF1基因受到高盐胁迫诱导上调表达，具有明显的组织特异性表达模式。构建HuERF1基因的过表达载体，经过农杆菌介导的遗传转化，将过表达载体片段转入野生型拟南芥，能够明显提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。

因此，上述火龙果盐耐受HuERF1基因或上述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1可应用于培育耐盐性转基因植物中，该植物可以是拟南芥，或者是其他对盐耐受的植物。

SEQ ID No.1为HuERF1基因的cDNA阅读框序列，共计897个碱基，包括翻译起始密码子和终止密码子。

SEQ ID No.2为HuERF1蛋白的氨基酸序列，共计298个氨基酸。

SEQ ID No.3为用于构建HuERF1基因的转基因over-expression过表达载体的cDNA序列片段，共计894个碱基。

SEQ ID No.1

ATGTGTGGCGGTGCAATCTTAGCTGATCTTATACCTCGAAACCAAGGTCGATGGGTTTCTGACTCTGACTTCTGGCCTAGTGCTTTCTTCGCTAAGTCCAATCAGTTTGCCAAGGAAGACGCTGCTGTTCCTGTCAAACGTACACTTCCCTCTTCAGGTGGTGTGCAATCGGAGAAGCGCCCCAAGAAGCAGAGGAAGACGCAGTACAGAGGGATCCGGCAGCGACCCTGGGGCAAATGGGCTGCGGAGATCCGAGACCCGAGGAAAGGGGTCCGCGTCTGGCTGGGTACTTTCAATACCCCTGAAGAAGCTGCCCGAGCTTATGACAGAGAGGCCCGTAAAATTCGGGGAAAGAAAGCCAAGGTGAACTTCCCCAATGAAGAGGACGACGTCGTTTACCCCTCGCAAAACCACCAGAAGCATCGTGTTCCAAGTTCAACTCCGCCATATCAACCCTTTTACTCCTCCTCCATCCCCGAAAATCTGAGTTTCGGGTACCCAACTTATCTGAACCAAGTCCAGCAATTTCCTTCAAATGGGTTAGCCTTAAATGAGGAAAATCCATCTGGGTTTGCCTCAGAATGTGGTTATAACGTTCCGAATTTGATGGGGCCTGTGACCCAGCAAGTGAAGGAGGAGGTGAGAGAAAGCTCGGAGGAGGAGGAGGTGAGGAGAGAGAAAGAGGAGGTGGCTATGGTGGAAAATGCGTTAGACGAGGAGAATGAAGTGCAGAAGCTTTCAGAAGAGCTAATGGCGTATGAAAACTACATGAAATTCTACGAACTTCCCTATCTGGATGGGCAGTCTGCCACCGCTCCCGCGGCGGCGTGTTGTCAGGACGGCGGAGCCACCTTGGATCTATGGAGCTTCGAAGATGTTCCTTCTTCTGCTGCTTAA

SEQ ID No.2

MCGGAILADLIPRNQGRWVSDSDFWPSAFFAKSNQFAKEDAAVPVKRTLPSSGGVQSEKRPKKQRKTQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPRKGVRVWLGTFNTPEEAARAYDREARKIRGKKAKVNFPNEEDDVVYPSQNHQKHRVPSSTPPYQPFYSSSIPENLSFGYPTYLNQVQQFPSNGLALNEENPSGFASECGYNVPNLMGPVTQQVKEEVRESSEEEEVRREKEEVAMVENALDEENEVQKLSEELMAYENYMKFYELPYLDGQSATAPAAACCQDGGATLDLWSFEDVPSSAA

SEQ ID No.3

ATGTGTGGCGGTGCAATCTTAGCTGATCTTATACCTCGAAACCAAGGTCGATGGGTTTCTGACTCTGACTTCTGGCCTAGTGCTTTCTTCGCTAAGTCCAATCAGTTTGCCAAGGAAGACGCTGCTGTTCCTGTCAAACGTACACTTCCCTCTTCAGGTGGTGTGCAATCGGAGAAGCGCCCCAAGAAGCAGAGGAAGACGCAGTACAGAGGGATCCGGCAGCGACCCTGGGGCAAATGGGCTGCGGAGATCCGAGACCCGAGGAAAGGGGTCCGCGTCTGGCTGGGTACTTTCAATACCCCTGAAGAAGCTGCCCGAGCTTATGACAGAGAGGCCCGTAAAATTCGGGGAAAGAAAGCCAAGGTGAACTTCCCCAATGAAGAGGACGACGTCGTTTACCCCTCGCAAAACCACCAGAAGCATCGTGTTCCAAGTTCAACTCCGCCATATCAACCCTTTTACTCCTCCTCCATCCCCGAAAATCTGAGTTTCGGGTACCCAACTTATCTGAACCAAGTCCAGCAATTTCCTTCAAATGGGTTAGCCTTAAATGAGGAAAATCCATCTGGGTTTGCCTCAGAATGTGGTTATAACGTTCCGAATTTGATGGGGCCTGTGACCCAGCAAGTGAAGGAGGAGGTGAGAGAAAGCTCGGAGGAGGAGGAGGTGAGGAGAGAGAAAGAGGAGGTGGCTATGGTGGAAAATGCGTTAGACGAGGAGAATGAAGTGCAGAAGCTTTCAGAAGAGCTAATGGCGTATGAAAACTACATGAAATTCTACGAACTTCCCTATCTGGATGGGCAGTCTGCCACCGCTCCCGCGGCGGCGTGTTGTCAGGACGGCGGAGCCACCTTGGATCTATGGAGCTTCGAAGATGTTCCTTCTTCTGCTGCT

实施例1.HuERF1基因的Over-expression过表达载体的构建和遗传转化

本发明所用的过表达载体是本实验室构建的pCAMBIA1302-ERF1。该载体的构建步骤如下：提取火龙果幼苗中的总RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板，以上游引物:5’-TGACCATGGTAGATCTGATGTGTGGCGGTGCAATCTT-3’(SEQ ID No.4)和下游引物5’-CTTCTCCTTTACTAGTAGCAGCAGAAGAAGGAACATC-3’(SEQ ID No.5)，扩增得到894bp长度的核苷酸片段(SEQ IDNo.3)。

用infusion方法将该片段连接于线性化pCAMBIA-1302载体(请参见图1—pCAMBIA1302的图谱)上。反应体系：线性化载体pCAMBIA13020.5μl、PCR片段2μl、酶0.5μl、H₂O 2μl，总体积5μl，50℃孵育30min，然后4℃，5min。把2μl连接产物转化大肠杆菌DH5α，加800ml LB，复苏1h，涂于卡那抗生素的LB平板(已经涂布X-gal/IPTG)，37℃过夜。挑取白色克隆，在含有卡那抗生素的液体LB培养基中扩增培养，测序鉴定并抽提质粒。

采用农杆菌EHA105介导的花序浸泡法(先将已经结荚的剪掉，然后将整个花序浸入上述浸染液中约20–30s，1h后再浸染一遍。)，将过表达载pCAMBIA1302-ERF1导入野生型拟南芥中。未转基因的野生型拟南芥作为对照。

HuERF1具有明显的组织特异表达模式，提取火龙果不同组织中的RNA，反转录成cDNA后，用荧光定量PCR(q-RT-PCR)检测HuERF1的表达。HuERF1在根中的表达量明显高于茎、花瓣、花萼和鳞片的表达量(如图2)。我们先将萌发的拟南芥幼苗种植在带蛭石的培养土中，于28℃下12h光照/12h黑暗培养室中生长，40天后用450mM NaCl处理火龙果幼苗，在不同时间点取材，提取RNA并反转录成cDNA，用qRT-PCR检测HuERF1的相对表达量，发现HuERF1基因受到高盐胁迫诱导表达上调，在24、72小时两个时间点表达量最高(如图3)。

实施例2.采用100mM NaCl观察对拟南芥种子萌发的影响

我们将克隆pCAMBIA302-ERF1转化到农杆菌EHA105中，通过花序浸泡法浸染野生型拟南芥花序，得到T0代种子后。通过kan抗生素的MS培养基中进行阳性转基因植株的筛选。实验方法如下：用70％乙醇洗涤种子1次，然后用1％次氯酸钠+0.01％Triton X-100消毒10min；用灭菌蒸馏水洗种子3–5次；将洗好的种子平铺于MS或MS+Kan固体培养基平板中，平板置于4℃冰箱3d；将平板置于拟南芥生长房中继续培育；平板中拟南芥长成2片子叶大小时，将其移栽至营养土中。长成幼苗后，用PCR鉴定(如图4所示，阳性HuERF1 OE lines代表HuERF1的过表达植株，WT代表野生型植株)，获得阳性植株。单株收种，T2获得纯合株系。

种子萌发时，将野生型拟南芥Col-0和过表达拟南芥经120mM NaCl处理，结果发现，种子萌发二周后野生型拟南芥基本枯黄，而过表达HuERF1的转基因拟南芥均能存活，且生长较好(如图5所示，WT代表野生型植株；HuERF1OE lines代表HuERF1过表达纯合株系，3#，4#代表不同的转基因株系)。

实施例3.苗期用200mM NaCl处理拟南芥幼苗

正常种子萌发后，正常种植在培养基中，于26℃12h光照/12h黑暗生长二周后持续用200mM的NaCl处理拟南芥，发现野生型植株很多枯黄，开花，矮小，而过表达HuERF1的转基因拟南芥生长明显较对照好(如图6所示，WT：代表野生型植株；OE：HuERF1过表达植物)。以上研究结果表明，过表达HuERF1能提高植物对盐的耐受性。

1.本发明所述HuERF1基因基因的成功克隆进一步证明了植物的乙烯响应因子ERF是应答盐胁迫的关键蛋白，对于全面理解植物中乙烯响应因子ERF的生物学功能具有重要的意义。

2.通过转基因的方法对HuERF1基因进行过表达，伴随着HuERF1基因的表达量的提高，拟南芥对盐的抗性提高。因此本发明可应用于农作物的基因工程遗传育种，培育抗盐的作物品种，降低盐对粮食作物带来的安全危害。

3.盐碱化严重影响了作物的生长和产量，HuERF1基因的克隆和生物学功能的验证，对于其它作物的盐耐受性的研究具有重要的参考意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 火龙果耐盐基因HuERF1基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> HuERF1基因(HuERF1 gene)

<400> 1

atgtgtggcg gtgcaatctt agctgatctt atacctcgaa accaaggtcg atgggtttct 60

gactctgact tctggcctag tgctttcttc gctaagtcca atcagtttgc caaggaagac 120

gctgctgttc ctgtcaaacg tacacttccc tcttcaggtg gtgtgcaatc ggagaagcgc 180

cccaagaagc agaggaagac gcagtacaga gggatccggc agcgaccctg gggcaaatgg 240

gctgcggaga tccgagaccc gaggaaaggg gtccgcgtct ggctgggtac tttcaatacc 300

cctgaagaag ctgcccgagc ttatgacaga gaggcccgta aaattcgggg aaagaaagcc 360

aaggtgaact tccccaatga agaggacgac gtcgtttacc cctcgcaaaa ccaccagaag 420

catcgtgttc caagttcaac tccgccatat caaccctttt actcctcctc catccccgaa 480

aatctgagtt tcgggtaccc aacttatctg aaccaagtcc agcaatttcc ttcaaatggg 540

ttagccttaa atgaggaaaa tccatctggg tttgcctcag aatgtggtta taacgttccg 600

aatttgatgg ggcctgtgac ccagcaagtg aaggaggagg tgagagaaag ctcggaggag 660

gaggaggtga ggagagagaa agaggaggtg gctatggtgg aaaatgcgtt agacgaggag 720

aatgaagtgc agaagctttc agaagagcta atggcgtatg aaaactacat gaaattctac 780

gaacttccct atctggatgg gcagtctgcc accgctcccg cggcggcgtg ttgtcaggac 840

ggcggagcca ccttggatct atggagcttc gaagatgttc cttcttctgc tgcttaa 897

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> HuERF1 蛋白(HuERF1 protein)

<400> 2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Asp Leu Ile Pro Arg Asn Gln Gly

1 5 10 15

Arg Trp Val Ser Asp Ser Asp Phe Trp Pro Ser Ala Phe Phe Ala Lys

20 25 30

Ser Asn Gln Phe Ala Lys Glu Asp Ala Ala Val Pro Val Lys Arg Thr

35 40 45

Leu Pro Ser Ser Gly Gly Val Gln Ser Glu Lys Arg Pro Lys Lys Gln

50 55 60

Arg Lys Thr Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp

65 70 75 80

Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly

85 90 95

Thr Phe Asn Thr Pro Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Arg Glu Ala

100 105 110

Arg Lys Ile Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asn Glu Glu

115 120 125

Asp Asp Val Val Tyr Pro Ser Gln Asn His Gln Lys His Arg Val Pro

130 135 140

Ser Ser Thr Pro Pro Tyr Gln Pro Phe Tyr Ser Ser Ser Ile Pro Glu

145 150 155 160

Asn Leu Ser Phe Gly Tyr Pro Thr Tyr Leu Asn Gln Val Gln Gln Phe

165 170 175

Pro Ser Asn Gly Leu Ala Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Gly Phe Ala

180 185 190

Ser Glu Cys Gly Tyr Asn Val Pro Asn Leu Met Gly Pro Val Thr Gln

195 200 205

Gln Val Lys Glu Glu Val Arg Glu Ser Ser Glu Glu Glu Glu Val Arg

210 215 220

Arg Glu Lys Glu Glu Val Ala Met Val Glu Asn Ala Leu Asp Glu Glu

225 230 235 240

Asn Glu Val Gln Lys Leu Ser Glu Glu Leu Met Ala Tyr Glu Asn Tyr

245 250 255

Met Lys Phe Tyr Glu Leu Pro Tyr Leu Asp Gly Gln Ser Ala Thr Ala

260 265 270

Pro Ala Ala Ala Cys Cys Gln Asp Gly Gly Ala Thr Leu Asp Leu Trp

275 280 285

Ser Phe Glu Asp Val Pro Ser Ser Ala Ala

290 295

<210> 3

<211> 894

<212> DNA

<213> HuERF1 cDNA(HuERF1 cDNA)

<400> 3

atgtgtggcg gtgcaatctt agctgatctt atacctcgaa accaaggtcg atgggtttct 60

gactctgact tctggcctag tgctttcttc gctaagtcca atcagtttgc caaggaagac 120

gctgctgttc ctgtcaaacg tacacttccc tcttcaggtg gtgtgcaatc ggagaagcgc 180

cccaagaagc agaggaagac gcagtacaga gggatccggc agcgaccctg gggcaaatgg 240

gctgcggaga tccgagaccc gaggaaaggg gtccgcgtct ggctgggtac tttcaatacc 300

cctgaagaag ctgcccgagc ttatgacaga gaggcccgta aaattcgggg aaagaaagcc 360

aaggtgaact tccccaatga agaggacgac gtcgtttacc cctcgcaaaa ccaccagaag 420

catcgtgttc caagttcaac tccgccatat caaccctttt actcctcctc catccccgaa 480

aatctgagtt tcgggtaccc aacttatctg aaccaagtcc agcaatttcc ttcaaatggg 540

ttagccttaa atgaggaaaa tccatctggg tttgcctcag aatgtggtta taacgttccg 600

aatttgatgg ggcctgtgac ccagcaagtg aaggaggagg tgagagaaag ctcggaggag 660

gaggaggtga ggagagagaa agaggaggtg gctatggtgg aaaatgcgtt agacgaggag 720

aatgaagtgc agaagctttc agaagagcta atggcgtatg aaaactacat gaaattctac 780

gaacttccct atctggatgg gcagtctgcc accgctcccg cggcggcgtg ttgtcaggac 840

ggcggagcca ccttggatct atggagcttc gaagatgttc cttcttctgc tgct 894

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaccatggt agatctgatg tgtggcggtg caatctt 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttctccttt actagtagca gcagaagaag gaacatc 37

Claims (10)

1.火龙果盐耐受HuERF1基因，其cDNA阅读框为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

或为含有SEQ ID No.1所示的序列且序列中有一个或几个核苷酸的替换、缺失或增加，但具有相同功能的核苷酸序列；

或为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.火龙果盐耐受HuERF1蛋白，其氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示，或为SEQ ID NO.2所示序列基础上经替换、缺失或增加一个或多个氨基酸，且具有相同功能的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的火龙果盐耐受HuERF1基因的过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

4.权利要求3所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)得到SEQ ID NO.3所示核苷酸片段；

(B)将所述SEQ ID NO.3所示核苷酸片段连接于线性化pCAMBIA-1302载体上，得到连接产物；

(C)把连接产物转化大肠杆菌DH5α，培养，得到所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述SEQ ID NO.3所示核苷酸片段的制备方法包括：以火龙果cDNA的质粒为模板，以上游引物:5’-TGACCATGGTAGATCTGATGTGTGGCGGTGCAATCTT-3’和下游引物5’-CTTCTCCTTTACTAGTAGCAGCAGAAGAAGGAACATC-3’进行扩增，得到所述SEQ ID NO.3所示核苷酸片段。

6.导入有权利要求1所述火龙果盐耐受HuERF1基因或权利要求3所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的植物。

7.根据权利要求6所述的导入有权利要求1所述火龙果盐耐受HuERF1基因或权利要求3所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1的植物，其特征在于，所述植物为拟南芥。

8.权利要求1所述的火龙果盐耐受HuERF1基因在培育耐盐性转基因植物中的应用。

9.权利要求1所述的过表达载体pCAMBIA1302-ERF1在培育耐盐性转基因植物中的应用。

10.一种提高植物对盐的耐受性的方法，其特征在于，包括导入有权利要求1所述火龙果盐耐受HuERF1基因或权利要求3所述过表达载体pCAMBIA1302-ERF1。

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