KR20060132442A

KR20060132442A - 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20060132442A
Application number: KR1020060043408A
Authority: KR
Inventors: 김민균; 정진욱; 원소윤
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2006-12-21
Also published as: WO2006135151A1; US7982098B2; US20100186112A1; KR100742193B1

Abstract

본 발명은 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 보리에서 분리한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 상기 전사인자를 포함하는 벡터를 식물체에 도입함으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 전사인자는 다양한 환경 스트레스 저항성 관련 유전자의 발현을 유도함으로써 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성 저하를 억제하거나 지연시키는 효과가 있다.

환경 스트레스, 전사인자

Description

신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법{Novel environmental stress resistance transcription factor and method for enhancing the environmental stress resistance of plants using the same}

도 1은 본 발명에 따른 보리 유래 HvRAF 유전자의 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열과 벼의 추정적인 AP2/ERF 전사인자(GenBank accession no: AAK92635)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

도 2는 보리 BAC 클론(Bacterial artificial clone) 라이브러리에서 서던블롯 분석에 의해 선발된 양성클론을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 프로모터 염기서열에서 주요 시스 엘리먼트들을 나타낸 것이다.

분홍색: WUN 엘리먼트(wounding responsive element)

노란색: TCA 엘리먼트(Salicylic acid responsive element)

파란색: 뿌리 특이적 발현과 관련이 있는 시스 엘리먼트

회색: MeJA 반응성 엘리먼트(methyl jasmonic acid responsive element)

보라색: 엘리시터 반응성 엘리먼트(Elicitor responsive element)

하늘색: 에틸렌 반응성 엘리먼트(Ethylene responsive element)

녹색: ABA 반응성 엘리먼트(ABA responsive element)

검정색: MYB 결합 엘리먼트(MYB binding element)

갈색글자: CAAT box

녹색글자: TATA box

도 4는 보리 유묘로부터 분리한 게놈 DNA를 서던 블롯으로 분석하여 HvRAF 유전자의 카피수를 결정한 결과이다.

도 5는 보리 조직별 발현 패턴을 분석하기 위해 사용한 보리 조직 절편을 도시한 그림과(A) 본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 보리 조직별 발현 패턴을 노던 블롯으로 분석한 결과이다(B). 로딩 대조군으로는 rRNA를 이용하였다.

도 6은 본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 생육조건별 발현 패턴을 노던 블롯으로 분석한 결과이다(CL: 장일조건, CLD: 장일조건 후 암조건, CD: 암조건, CDL: 암조건 후 장일조건). 로딩 대조군으로는 Hv18S를 이용하였다.

도 7a는 본 발명에 따른 HvRAF 유전자와 리포터 유전자를 포함한 벡터를 애기장대의 원형질체 내로 도입시켜 세포내 소기관별 분석법(subcellular localization assay)에 의해 HvRAF 단백질의 핵 이동성 여부를 확인한 결과이다.

도 7b는 본 발명에 따른 HvRAF 유전자를 포함하지 않고 리포터 유전자만을 포함한 벡터를 애기장대의 원형질체 내로 도입시켜 세포내 소기관별 분석법에 의해 핵 이동성 여부를 확인한 결과이다.

도 8은 일련의 HvRAF 유전자의 결실 돌연변이체(a)를 GAL4 DNA 결합 벡터에 삽입한 다음 효모에 형질전환하고 상기 결실 돌연변이체들의 β-갈락토시다제 활성을 ONPG를 기질로 사용하는 측정방법(b)과 콜로니-리프트 필터(colony-lift filter) 측정방법(c)으로 측정함으로써 전사활성 영역을 분석한 결과이다.

도 9a는 메틸 자스몬산, 에테폰, 살리신산과 같은 식물 호르몬의 처리에 따른 보리에서 HvRAF 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과이다(Mock: 대조군, SA:살리신산 처리, MeJA: 메틸 자스몬산 처리, Ethephon: 에테폰 처리, wound: 상처 처리).

도 9b는 셀룰라제(celluase), 물 및 MV(methyl vilogen; paraquat)의 처리에 따른 보리에서 HvRAF 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과이다.

도 10은 HvRAF 유전자가 과다발현된 형질전환체를 노던블롯에 의해 선발한 결과이다. 로딩 대조군으로는 rRNA를 이용하였다.

도 11a는 무름병균을 접종한지 6일경 된 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대의 사진이다.

도 11b는 무름병균을 접종한 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대의 시간의 경과에 따른 질병 인덱스를 나타낸 그래프이다(WT: 야생형 애기장대).

도 12a는 50mM 또는 100mM NaCl를 함유한 MS 배지에서 14일간 배양한 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대의 사진이다.

도 12b는 50mM 또는 100mM NaCl를 함유한 MS 배지에서 14일간 배양한 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대의 뿌리길이를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(WT: 야생형 애기장대).

도 13은 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대에서 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자의 발현이 유도되는지 여부를 노던 블롯으로 분석한 결과이다(WT: 야생형 애기장대).

도 14a는 고농도의 ABA가 함유된 배지에서 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대 종자의 발아력을 측정한 결과이다.

도 14b는 고농도의 염이 함유된 배지에서 HvRAF 유전자 과다발현 애기장대 종자의 발아력을 측정한 결과이다.

식물 병원균, 한발, 고농도의 염, 저온 및 고온과 같은 다양한 환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소 중 하나로 작용한다.

식물 병원균 중 하나인 무름병 원인균(Ralstonia solanacearum)은 식물의 뿌리로 침투하여 도관을 막음으로써 수분공급을 억제하여 숙주인 식물체의 잎을 말라 죽이는 것으로 알려져 있다(Vasse et al., Mol. Plant-Microbe Interact, 8:241-251, 1995; Wallis et al., Physiol. Plant Pathol, 13:307-31, 1978). 상기 무름병의 주요 숙주 식물체로는 토마토, 감자, 담배, 바나나 및 올리브를 포함하는 열대작물, 아열대 작물 및 곡물 등의 약 450여 종의 중요 작물이 알려져 있다(Hayward, Annu. Rev. Phytopathol, 29:65-87, 1991).

또한, 식물은 고농도의 염, 고온, 저온 및 한발 등의 환경 스트레스에 노출되게 되면, 세포 내 삼투압 불균형과 이온 불균형이 발생하게 되어 식물의 생장과 광합성이 저해되게 된다.

한편, 식물은 이러한 환경 스트레스에 대한 방어기작을 진화적으로 발달시켜 왔다. 대표적인 예로서 식물 병원균에 대한 방어기작으로 살리실산(salicylic acid), 자스몬산(jasmonic acid) 및 에틸렌과 같은 식물 호르몬의 합성, 피토알렉신(phytoallexin)과 같은 항균 화합물의 합성, 세포벽 강화(cell wall enforcement) 및 다양한 병 저항성 유전자의 발현이 있다. 또한, 고농도 염 스트레스에 대한 방어기작으로는 식물의 세포막에 위치한 몇몇 전달자들(transporters)에 의한 이온 항상성(ion homeostasis) 유지 및 고농도 염 스트레스에 저항성을 가지는 SOS(Salt overly Sensitive) 신호 전달체계의 활성화 등이 있다(Zhu, J.K., Curr. Opin. Plant Biol, 6:441-445, 2003). 한발 및 저온 등과 같은 스트레스에 대한 방어기작으로는 ABA 의존성 신호전달 경로 또는 ABA 비의존성 신호전달 경로를 통한 방법이 있다(Zhu, J.K., Annu Rev Plant Biol, 53:247-273, 2002).

그러나 상기와 같은 병 저항성 단백질, 전달자 및 다양한 카이네이즈(kinase)에 의한 환경 스트레스에 대한 방어기작은 종 특이적이거나 환경 특이적인 특성을 가지고 있기 때문에 넓은 범위(broad spectrum)의 저항성을 유도하지 못하는 단점이 있다(Bent, A.F., Plant Cell, 8:1757-1771, 1996).

따라서 최근에는 식물들이 자체적으로 가지고 있는 환경 스트레스 저항성 유전자들을 개별적으로 발현시키기 보다는 관련 유전자군을 동시에 발현시킬 수 있는 방법에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 이러한 방법 중에서 환경 스트레스 저항성 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자에 대한 연구가 주목받고 있다. 예를 들면, 내냉성 유전자군 또는 내염성 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자 CBF 및 Alfin1에 대한 효능이 검증된 바 있으며 병 저항성 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자로서 EREBP(Ethylene response element biding protein)가 알려져 있다. 또 다른 예로서, 애기장대의 AP2 계열의 전사인자가 있다. 상기 AP2 계열의 단백질들은 에틸렌 반응 인자(ERF), 탈수-반응 요소-결합(DREB)/C-반복(CRT)/DRE-결합인자(CBF) 및 RAV 등과 같은 몇몇의 그룹으로 분류된다. 상기 ERF-타입의 전사인자는 GCC 박스에 결합하여 스트레스 반응 유전자의 발현을 조절한다.

이에 본 발명자들은 식물의 환경 스트레스 저항성을 증가시킬 수 있는 방법 을 연구하던 중, 보리로부터 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자를 분리하고 상기 전사인자를 식물체에 도입하여 발현시키면 식물체의 환경 스트레스 저항성이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 환경 스트레스 저항성 전사인자 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 전사인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 전사인자 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조되고 조직배양을 통해 재분화시킨 환경 스트레스 저항성 식물체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환경 스트레스 저항성 전사인자 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사인자 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조되고 조직배양을 통해 재분화시킨 환경 스트레스 저항성 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 저온 및 산화 스트레스 등이 포함된다.

"환경 스트레스 저항성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

"환경 스트레스 저항성 전사인자"란 상술한 바와 같은 환경 스트레스에 의해 그 발현이 유도되어 환경 스트레스에 대한 방어기작과 관련된 유전자의 발현을 유도하는 활성을 가진 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 말한다. 상기 환경 스트레스에 대한 방어 기작과 관련된 유전자로는 생물학적 스트레스 저항성 유전자군으로서 R(resistance) 유전자, PDF(plant defensin) 유전자, PR(pathogen related) 유전자가 있다. 비생물학적 스트레스 저항성 유전자군으로서 COR(cold related) 유전자, GSH(γ-Glu-Cys synthetase) 유전자 등이 있다. 상기에서 생물학적 스트 레스 저항성 유전자군인 PDF 유전자의 예로는 PDF1.2이 있으며 PR 유전자의 예로는 PR1 및 PR5가 있다. 또한, 비생물학적 스트레스 저항성 유전자군인 COR 유전자의 예로는 COR6.6이 있으며 GSH 유전자의 예로는 GSH1이 있다.

본 발명은 보리 cDNA 라이브러리로부터 추정적인 AP2/ERF 전사인자 계열의 단백질을 암호화하는 신규의 유전자 HvRAF를 분리하고 그 특성을 규명한 사실에 기초한다.

본 발명자들은 환경 스트레스에 의해 발현이 유도되는 AP2/ERF 계열의 유전자를 분리하기 위해 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 보리 유전자 데이터베이스(www.tigr.org)로부터 EST 클론을 선발하고 이것을 탐침으로 이용하여 보리 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 그 결과, 734bp 크기의 부분 유전자를 선발하고 보리유묘의 총 RNA를 주형으로 하여 보리 EST의 5'말단과 일치하는 정방향 프라이머와 부분 유전자의 3'말단과 일치하는 역방향 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행함으로써 전장 cDNA를 제조하였다(실시예 <1-1> 참조).

상기 cDNA의 서열을 분석한 결과, 328개의 아미노산(서열번호 4)을 암호화하는 984개의 뉴클레오타이드(서열번호 3)를 가지고 있음을 알 수 있었다. 상기 보리 유래의 cDNA는 벼로부터 유래한 추정적인 AP2/ERF 전사인자와 45%의 상동성을 나타냈으며 보존된 AP2/ERF DNA 결합 도메인 부분은 약 90%의 상동성을 나타냈다(실시예 <1-2> 및 도 1 참조). 따라서 상기에서 제조된 cDNA는 AP2/ERF 계열의 신규한 전사인자일 것으로 추정되었다.

또한, 본 발명자들은 상기 보리에서 분리한 유전자를 조절하는 프로모터를 선발하기 위해 이 유전자를 탐침으로 하여 보리 BAC 클론 라이브러리 스크리닝 및 염색체 워킹 방법을 통해 전체 게놈 유전자의 염기서열(서열번호 23)을 수득하였으며, 시작 개시코돈의 상류 부분에 위치한 프로모터 서열(서열번호 24)을 수득하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명자들은 보리에서 게놈 DNA를 추출하여 서던블럿 분석법을 수행함으로써(실시예 3 참조) 이 유전자가 단일 카피로 존재함을 확인하였으며(도 4 참조), 노던블롯 분석법으로 유전자의 발현패턴을 조사한(실시예 4 참조) 결과, 본 발명에 따른 유전자는 다른 조직에 비해 뿌리에서 상대적으로 과량 발현되는 특성이 있음을 확인하였다(도 5 참조). 이에 본 발명자들은 상기 유전자를 HvRAF( H ordeum v ulgare R oot A bundant AP2/ERF Transcription F actor)라 명명하였다. 또한, 상기 HvRAF 유전자는 장일조건에 비해 암 조건의 생육 조건에서 더 많이 발현되는 특징이 있음을 확인하였다(도 6 참조).

나아가, 본 발명자들은 상기 유전자가 실제로 전사인자로서 기능을 수행하는지를 확인하기 위하여 애기장대 원형질체에서의 핵 이동성 실험을 통해 상기 유전자의 핵 이동성을 확인하였고(실시예 5 및 도 7a 참조), 상기 유전자의 결실 돌연변이체를 제조하여 전사활성에 관여하는 영역(아미노산 서열: 서열번호 35, 염기서 열: 서열번호 36)을 규명하였다(실시예 6 및 도 8 참조).

본 발명자들은 HvRAF 유전자의 기능을 확인하기 위하여 다양한 환경 스트레스에 의해 상기 유전자의 발현이 유도되는지 여부를 조사하였다(실시예 7 참조).

그 결과, 본 발명의 HvRAF 유전자는 식물 병원균에 의해 유도되는 식물 호르몬, 상처 및 병원균이 침투할 때 분비되는 셀룰라제 및 산화스트레스(oxidative stress)를 유도하는 살충제 성분인 MV(methyl viologen; Paraquat)의 처리 및 상처에 의해 그 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다(도 9a 및 9b 참조). 이로부터 본 발명에 따른 HvRAF 유전자는 다양한 스트레스에 의해 유도되는 특징이 있으므로 식물체에서 스트레스를 방어하기 위한 작용과 관련이 있을 것으로 사료되었다.

상기와 같은 추정을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HvRAF 유전자가 과다발현되는 애기장대를 제조하고 상기 애기장대의 병 저항성 및 고농도 염과 같은 환경 스트레스에 대한 저항성을 조사하였다. 또한, 애기장대에서 HvRAF 유전자의 과다발현이 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자의 발현을 유도하는지를 조사하였다(실시예 8 참조).

그 결과, 단자엽 식물인 보리로부터 분리된 HvRAF 유전자가 쌍자엽 식물인 애기장대 내에서도 병원균 및 고농도 염에 대한 방어기작을 수행함을 확인할 수 있었으며(도 11a, 11b, 12a 및 12b 참조), 애기장대에서 과발현된 HvRAF 유전자가 병 저항성 유전자와 저온 저항성 유전자의 발현을 유도함을 확인할 수 있었다(도 13 참조).

또한, 본 발명자들은 HvRAF 유전자가 과다발현되는 애기장대로부터 회수한 종자를 고농도의 ABA(abscisic acid) 또는 염이 함유된 배지에 파종하고 발아력을 측정하였다(실시예 9 참조). 상기 ABA와 염은 종자 내에서 일어나는 다양한 생리작용 및 신호전달기작에 영향을 주어 발아를 억제하는 대표적인 인자들이다. 그 결과, HvRAF 유전자가 과다발현된 종자의 경우 고농도의 ABA 및 염에 의해 발아가 억제되지 않음을 확인할 수 있었다(도 14a 및 도 14b 참조). 상기 실험 결과로부터 본 발명의 HvRAF 유전자는 식물 종자의 환경 스트레스 저항성도 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명은 환경 스트레스 저항성 전사인자 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 전사인자 단백질은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 전사인자 단백질로는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 환경 스트레스에 의해 그 발현이 유도되어 환경 스트레스 저항성과 관련된 유전자의 발현을 유도함으로써 식물이 환경 스트레스 저항성을 갖도록 하는 활성을 의미한다. 본 발명에 따른 단백질은 자연(예컨대, 식물 세포)으로부터 분리하거나 또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의한 유전공학적 방법 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 특히 바람직하게는, 보리로부터 분리될 수 있다.

예를 들면, 상기 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자 서열 또는 그의 단편을 상기 유전자 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 유전자 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

재조합 단백질의 분리 및 정제방법으로는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역상), 전기영동, 역류 분배법등의 당분야에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피가 가장 효과적이다. 고체상법의 장점은 각 단계에서 생성되는 생성물이 비드에 결합되어 있기 때문에, 중간물질의 정제가 필요하지 않다는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 전사활성을 나타내는 영역인 서열번호 36으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 유전자는 전장 cDNA 서열인 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자는 프로모터 영역과 코딩 영역을 모두 포함하는 게놈 유전자인 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 따른 유전자는 전형적인 AP2/ERF 전사인자의 DNA 결합 도메인을 함유하고 있는 클래스 IV(Class IV) 하위계열의 전사인자를 암호화한다(Tournier et al., FEBS Lett, 550:149-154, 2003). 본 발명에 따른 유전자는 다른 조직에 비해 식물 뿌리에서 상대적으로 높게 발현되는 조직 특이성을 가지고 있으며 장일조건에 비해 암조건에서 그 발현이 보다 높게 유도되는 특징이 있다.

또한, 본 발명은 상기 HvRAF 유전자의 발현을 조절하는 4kb 가량의 프로모터를 제공한다. 상기 프로모터는 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 프로모터에는 다양한 스트레스 유도 시스-엘리먼트(cis-element)들이 존재한다.

상기 본 발명에 따른 유전자는 적합한 발현 벡터 내로 삽입되어 식물세포를 형질전환 할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명의 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있 으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 핵산이 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 식물 세포 내로 본 발명의 유전자를 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드, 뿌리 유도성(Ri) 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 발명에 따른 유전자의 핵산 서열을 도입시키는 데 적합한 벡터를 선택할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 유전자를 CaMV 35S 프로모터를 포함하는 식물 바이너리 벡터 pBI111L의 XabI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 재조합 벡터의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스 커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움-매개에 의한 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 애기장대를 형질전환하였다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포로는 박테리아가 바람직하며, 그 예로는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법은 HvRAF 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 포함하고 있지 않은 식물체 내로 HvRAF 유전자를 도입함으로써 식물체가 환경 스트레스를 받게 되는 경우 상기 유전자의 발현이 유도되어 환경 스트레스 방어 기작과 관련된 유전자군의 발현이 유도되도록 함으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성 형질을 증가시키거나 또는 환경 스트레스 저항성 형질이 새롭게 부여되도록 하는 방법이다.

식물체내로 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로 모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 보리로부터 분리된 HvRAF 유전자의 프로모터(서열번호 24)를 사용하거나 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터, 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 유전자를 과다발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 환경 스트레스 저항성 식물체를 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 환경 스트레스 저항성 식물체는 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전화된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 환경 스트레스 저항성 식물체를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 환경 스트레스 식물체로부터 수득될 수 있는 식물 세포 또는 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 클로닝

<1-1> 보리로부터 환경 스트레스에 의해 유도되는 HvRAF 유전자의 cDNA 제조

환경스트레스에 의해 유도되는 AP2/ERF 유전자를 분리하기 위하여, GCC- 또는 C-반복/DRE-결합 인자를 코딩하는 EST 클론을 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 보리 유전자 데이터베이스(www.tigr.org)로부터 검색하였다. 몇 개의 후보군 중에서 TC131838이 AP2-도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자와 높은 서열 유사성을 보였다. 상기 TC131838은 Genbank의 BF256780(846bp, 보리 유묘의 뿌리로부터 분리됨)과 일치하며, TC131838에 비해 3'말단 영역이 141bp 더 긴 서열을 포함한다.

전장 cDNA를 분리하기 위하여, 상기 BF256780의 DNA 단편을 클로닝하고 이를 7일된 보리 유묘의 폴리(A)⁺ RNA로부터 제조된 보리 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 탐침으로 사용하였다. 상기 보리 cDNA 라이브러리는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 외부 환경 스트레스에 의해 유도되는 유전자의 탐색을 위해 버미큘라이트 토양에서 7일간 생육시킨 보리 유묘(seedling)에 200μM 농도의 카드뮴(CdCl₂)을 6시간 동안 처리하여 환경 스트레스에 내성을 가진 mRNA의 생성을 유도하고 상기 mRNA를 조직으로부터 분리하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 즉, 카드뮴을 처리한 상기 보리 유묘 조직으로부터 전체 RNA(total RNA)를 알엔이지 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant Mini kit: Qiagen)를 이용하여 추출한 다음 상기 전체 RNA로부터 프로메가(promega) mRNA 분리 키트를 이용하여 mRNA를 추출하였다. 이렇게 추출된 mRNA를 주형으로 하고 cDNA 합성 키트(stratagene)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 제조하였다. 그 다음 상기 cDNA에 제한효소 EcoRI 사이트를 포함하는 어뎁터(adaptor)를 라이게이션한 후 동일 제한효소로 절단하여 GAL4 활성 프로모터를 포함하는 pGAD424 벡터(clontech)의 동일한 부위에 융합시키고 이를 효모 YM4271에 (PEG)방법으로 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 효모를 200μM의 카드뮴이 함유된 배지에 플레이팅한 후 카드뮴에 저항성을 보이는 몇 개의 콜로니를 선별하였다. 효모에서 재조합 플라스미드 선발을 위해 선별된 콜로니를 200μM 카드뮴이 포함된 SD/-Leu 배지(clontech)에 접종한 후 30℃에서 250rpm으로 20시간 정도 배양하였다. 현탁배지를 3000rpm에서 5분간 원심분리한 후 남아 있는 펠릿 (pellet)을 200㎕의 용해 버퍼(2% triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)와 혼합한 후, 동일량의 산-세척 글래스 비드(acid-washed glass bead)와 페놀을 첨가하여 강하게 보르텍스(vortex)하였다. 상기 혼합물을 10분간 14000rpm으로 원심분리한 후 에탄올 침전법으로 재조합 플라스미드를 분리하고 이를 다시 E.coli에 전기천공법으로 형질전환시킨 후 배양하여 항생제 저항성을 나타내는 E. coli로부터 재조합 플라스미드를 추출키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다.

그 결과, N-말단 영역이 상기 EST의 C-말단과 186bp가 일치하는 것으로 나타난 폴리아데닐화 서열을 포함하는 734bp 크기의 부분 cDNA가 선발되었다.

상기 부분 유전자의 전장(full-length) cDNA를 제조하기 위하여 보리 유래의 총 RNA 500ng을 주형으로 하고 원-스텝 RT-PCR 키트(Qiagne, Hilden, Germany)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR은 보리 EST(BF256780)에 위치한 정방향 프라이머(서열번호 1)와 상기에서 분리한 부분 유전자에 위치한 역방향 프라이머(서열번호 2)를 이용하여 수행하였다. PCR 증폭 조건으로는 50℃에서 30분간 역전사 반응을 수행하고, 95℃에서 15분간 역전사 효소의 비활성화와 taq 중합효소의 활성화 반응을 거친 후 94℃에서 30초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 1분씩 총 35회 반복하였다.

정방향 프라이머 HvAP2-F(서열번호 1)

5'-CAGGAAGATAAAACAATGTGT-3'

역방향 프라이머 HvAP2-R(서열번호 2)

5'-GATCAATTCGTAGGACTATTG-3'

상기에서 수득한 PCR 증폭산물을 1% 아가로스 겔로 분리하고 어큐프렙 겔 정제 키트(Bioneer, Yunsung, Korea)로 용출하여 시작 코돈을 포함하는 전장 cDNA를 수득하였다.

<1-2> 보리에서 분리한 cDNA의 염기서열 결정 및 서열 상동성 분석

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 cDNA의 염기서열을 퍼킨-엘머사(Perkin-Elmer, USA)의 DNA 자동 서열 결정기 및 DNA 서열 결정 키트(Big dye terminator sequencing kit)를 이용하여 결정하였다. 결정된 DNA의 염기서열을 서열분석 프로그램(http://kr.expasy.org/tools/dna.html)으로 분석하고 상기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였다. 또한, 분석된 본 발명에 따른 유전자의 염기서열과 공지된 다른 종류의 보리 유래 유전자의 염기서열과의 서열 상동성을 BLAST 프로그램(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)과 CLUSTALW 프로그램(www.ebi.ac.uk/clust alw/) 을 이용하여 조사하였다.

실험 결과, 본 발명에서 제조한 cDNA는 984개의 뉴클레오타이드(서열번호 3)를 가지며 328개의 아미노산(서열번호 4)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 것으로 나타났다. 또한, 상기 cDNA의 아미노산 서열은 벼로부터 유래된 추정적인 AP2/ERF 전사인자(GenBank accession no: AAK92635)와 45%의 상동성을 보였으며, 보존적인 AP2/ERF DNA 결합 도메인 부분과는 약 90%의 상동성을 보이는 것으로 나타났다(도 1). 따라서, 본 발명의 HvRAF 유전자는 AP2/ERF 계열의 전사인자일 것으로 추정되었다.

<실시예 2>

본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 프로모터 분리 및 특성 확인

<2-1> HvRAF 유전자의 프로모터 분리

상기 실시예 1에서 분리한 HvRAF 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 분리하기 위하여 HvRAF 유전자를 탐침으로 하여 보리 BAC 클론(Bacterial artificial clone) 라이브러리를 스크리닝하였다(Yu et al. Theor. Appl. Genet. 101: 1093-1099, 2000). 스크리닝에 사용한 HvRAF 유전자 탐침은 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 전장 HvRAF cDNA(서열번호 3)를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 이용하여 94℃에서 3분간 변성시키는 과정과 94℃에서 30초, 51℃에서 30초 및 72℃에서 30 초를 36회 반복한 후 72℃에서 10분간 신장시키는 과정을 거쳐 제조하였으며 제조된 탐침은 동위원소 [α-³²P]dCTP로 표지하였다.

정방향 프라이머 HvAP2-F2(서열번호 5)

5'-ACACGATGCCGAGGGT-3'

역방향 프라이머 HvAP2-R2(서열번호 6)

5'-AGTACAGAGAGGTACCG-3'

스크리닝 결과, BAC 클론 HV_MBa0154O14, Hv_MBa0283M03, HV_MBa0277E06, HV_MBa0527P04, HV_MBa0604L12, HV_MBa0673O09, HV_MBa0811I08 및 HV_MBa0811I09의 총 8개의 후보 클론이 선발되었다. 상기 후보 클론들을 대상으로 하여 서던 블럿을 수행하였다. 상기에서 선발된 8개의 BAC 클론을 12.5㎍/ml의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 포함된 LB 배지에 접종한 후 37℃, 250rpm조건으로 하루 동안 배양하였다. 각 배양액으로부터 플라스미드 맥시 키트(Plasmid maxi kit, Qiagen, Hilden)를 이용하여 클론을 분리하였으며, 분리한 클론 20㎍을 제한효소 SalI으로 20시간 동안 절단한 후 0.8% 아가로즈젤에 로딩하였다. 로딩이 완료된 아가로즈젤을 변성 용액(1.5M NaCl, 0.5N NaOH)에 넣어 30분간 침전시킨 후 이차증류수로 세척하고 다시 중화용액(1M Tris-HCl,pH7.5, 1.5M NaCl)에 넣고 30분간 침전시켰다. 미리 20ㅧSSC 용액에 적신 3M 페이퍼에 아가로즈젤을 거꾸로 올린 후 나일론 막(N⁺ nylon membrane, Amersham)을 올리고 그 위에 3M paper 2장과 종이 타올 10cm 정도를 쌓아 올린 후 1kg 중량의 병을 올려 놓은 후 하루 동안 블롯팅을 하였다. 클론을 함유한 나일론 막을 상기 HvRAF 유전자 탐침과 65℃에서 하룻밤 동안 혼성화하였다. 혼성화가 완료된 다음 나일론막을 55℃에서 1차 세척버퍼(2ㅧSSC와 0.1% SDS)로 5분간 세척한 후 2차 세척버퍼(0.1×SSC)를 이용한 5분간 더 세척하고 -70℃에서 하루 동안 감광한 후 현상액을 이용하여 결과를 확인하였다.

그 결과, 상기 8개의 클론 중에서 최종적으로 5개의 양성 클론(HV_MBa0154O14, HV_MBa0527P04, HV_MBa0604L12, HV_MBa0811I08 및 HV_MBa0811I09)을 선발하였으며(도 2), 이 중에서 HV_MBa0811I08 클론을 주형으로 사용하여 HvRAF 유전자를 포함하는 프로모터 부분을 키트(universal genome walker kit)(Clontech)를 이용하여 선발하였다.

보다 구체적으로, BAC 클론 HV_MBa0811I08를 EcoRV로 자른 후 T4 DNA 리가제를 이용하여 상기 주형에 어댑터(adaptor)를 연결하였다. 이를 주형으로 하여 정방향 프라이머 AP1(서열번호 7)과 역방향 프라이머 GSP1(서열번호 8)으로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 증폭 조건으로는 95℃에서 5분간 변성한 후 95℃에서 30초, 70℃에서 4분간 7회 반복한 후 다시 95℃에서 30초, 65℃에서 4분간 총 30회 반복하였으며 65℃에서 7분간 신장시켰다. 상기 PCR 증폭 산물을 전기영동한 결과 2개의 밴드를 확인하였다.

상기 PCR 증폭산물을 50배로 희석하여 주형으로 사용하고 정방향 프라이머 AP2(서열번호 9)와 역방향 프라이머 GSP2(서열번호 10)를 사용하여 2차 PCR(nested PCR)을 수행하였다. PCR 증폭산물을 전기영동한 후 나타난 PCR 밴드를 겔 용출하고 pGEMT-easy 벡터(promega)에 라이게이션 한 후 E. coli에 형질전환시켰다. 항생제 암피실린을 함유한 LB배지에서 상기 형질전환된 E. coli를 배양하고 내성을 보이는 균주를 선발하였다.

상기에서 선발된 E. coli를 이용하여 콜로니 픽킹(colony picking) PCR을 수행하였다. 이때 정방향 프라이머로는 T7 프라이머(서열번호 11)를 사용하였고, 역방향 프라이머로는 SP6 프라이머(서열번호 12)를 사용하였다. PCR 증폭 조건으로는 95℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 4분간 총 30회를 반복한 후 72℃에서 7분간 신장시켰다. 상기 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과, 2kb 정도의 밴드를 확인할 수 있었으며 상기 밴드의 염기서열을 퍼킨-엘머사(Perkin-Elmer, USA)의 DNA 자동 서열 결정기 및 DNA 서열 결정 키트(Big dye terminator sequencing kit)를 이용하여 결정한 후 염기서열 분석프로그램을 이용한 결과 HvRAF 유전자 서열이 포함되어 있음을 확인하였다.

나아가, HvRAF 유전자를 포함하는 좀더 긴 염기서열을 확인하기 위하여, 보리 게놈 DNA를 pvuII 제한효소로 자른 후 어뎁터를 라이게이션시키고 PCR 증폭을 수행하였다. 1차 PCR은 정방향 프라이머 AP1(서열번호 7)과 역방향 프라이머 GSP3(서열번호 13)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 상기 1차 PCR 증폭산물을 50배 희석하여 정방향 프라이머 AP2(서열번호 9)와 역방항 프라이머 GSP4(서열번호 14)로 2차 PCR 증폭을 수행하였다.

상기에서 수득한 PCR 증폭산물을 주형으로 하고 프라이머 Prom-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8(서열번호 15 내지 서열번호 22)을 이용하여 PCR 증폭한 후 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 HvRAF 유전자의 코딩 영역을 포함하는 5658bp 크기의 게놈 유전자(서열번호 23)를 수득하였으며 번역 개시 코돈 상류에 위치해 있는 4279bp 크기의 프로모터 서열(서열번호 24)을 수득하였다.

HvRAF 유전자의 프로모터 분리를 위해 사용한 프라이머

프라이머	염기서열	서열번호
AP1 프라이머	5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'	7
GSP1 프라이머	5'-TGGAGAGAAGGCAGGCTTGGATGCAAA-3'	8
AP2 프라이머	5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'	9
GSP2 프라이머	5'-CCCGCAGGTCGAAGTGGTCATCGAAGT-3'	10
T7 프라이머	5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'	11
SP6 프라이머	5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'	12
GSP-3 프라이머	5'-TACGTGGCAAGGAGGAACACACAATT-3'	13
GSP-4 프라이머	5'-ACATGAACTTGTCGCAGCCACTTGGCT-3'	14
Prom-1 프라이머	5'-CACATTTTGCACGACCCGT-3'	15
Prom-2 프라이머	5'-AGTCGTCCAATGTACCGGTT-3'	16
Prom-3 프라이머	5'-CTACCTGCACATTGTAGGGCT-3'	17
Prom-4 프라이머	5'-CCATTACTTGTGTTAACCTGCA-3'	18
Prom-5 프라이머	5'-CTCCTACAACTTGATGATTTGT-3'	19
Prom-6 프라이머	5'-CCCTTCGTTAATAAACTTGAACA-3'	20
Prom-7 프라이머	5'-AACTGCAGTTGCTGGTGCA-3'	21
Prom-8 프라이머	5'-AACCACACGACACACACGAT-3'	22

<2-2> HvRAF 유전자 프로모터의 특성 확인

상기 실시예 <2-1>에서 분리된 프로모터를 PLANTCARE 및 PLACE 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 상기 프로모터 서열에서 뿌리 특이적 발현에 관여하는 시스-엘리먼트(cis-element)외에 다양한 호르몬 반응 엘리먼트들이 발견되었다(도 3).

<실시예 3>

보리에 존재하는 HvRAF 유전자 분석

상기 실시예 1에서 클로닝한 HvRAF 유전자가 전체 염기서열이 알려져 있지 않은 보리 유전체에서 실제로 존재하는지 여부 및 그 카피수를 분석하기 위해 서던블롯을 실시하였다. 버미큘라이트 토양에서 7일간 생육시킨 보리 유묘를 액체질소에 넣고 분쇄한 다음 60℃의 CTAB 버퍼(2% CTAB, 100mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1.4M NaCl 및 1% 폴리비닐피롤리돈(분자량 40,000, pH 8.0)에 넣어 3시간 동안 방치하였다. 여기에 동일한 부피의 클로로폼(chloroform)을 넣고 천천히 혼합한 후 3000rpm에서 50분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 2/3가량의 이소프로판올을 첨가한 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 70% 에타올로 세척하고 RNA를 변성시키기 위해 RNase A를 최종농도가 10㎍/ml가 되도록 첨가한 후 37℃에서 30분간 배양하였다. 상기 배양물로부터 에탄올 침전법을 이용하여 게놈 DNA를 분리한 다음 제한효소 BamHI과 HindⅢ 10㎍씩을 사용하여 20시간 절단한 후 0.8% 아가로즈젤에 로딩하였다. 블롯팅 및 혼성화반응은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 본 발명의 HvRAF 유전자는 보리 유전체에서 단일 카피(single copy)로 존재함을 확인할 수 있었다(도 4).

<실시예 4>

본 발명에 따른 HvRAF 유전자의 발현패턴 분석

<4-1> 보리 조직에 따른 발현패턴

보리에서 HvRAF 유전자의 조직별 발현패턴을 노던블롯 분석법으로 조사하였다. 이를 위해 먼저, 버미큘라이트 토양에서 7일간 생육시킨 보리 유묘의 뿌리, 유아초(coleoptile) 및 잎으로부터 전체 RNA를 염화리튬(LiCl) 침전법으로 추출하였다. 뿌리 부분의 경우 말단과 중간의 2 부분, 잎의 경우에는 3 부분으로 나누어 각 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다(도 5의 A 참조). 상기에서 추출한 전체 RNA를 10㎍씩 RNA용 아가로즈젤(1.2% 아가로스, 1×MOPS, 1.1% 포름알데히드)에 로딩하여 분리한 다음 나일론 막으로 이동시킨 후 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 탐침과 혼성화하였다.

실험 결과, HvRAF 유전자는 보리의 잎이나 유아초에 비해 뿌리에서 많이 발현되는 것으로 나타났으며 특히, 뿌리에서도 생장이 왕성한 뿌리 끝(root tip)에서 발현이 높게 나타났다(도 5의 B 참조). 상기 결과로부터 HvRAF 유전자의 발현은 조직 특이적임을 알 수 있었다.

<4-2> 생육조건에 따른 발현패턴

생육조건에 따른 HvRAF 유전자의 발현패턴을 노던블롯 분석법으로 조사하였다. 버미큘라이트 토양에서 보리 유묘를 장일조건으로 5일간 생육, 장일조건으로 5일간 생육시킨 후 암조건으로 1일간 생육, 암조건으로 5일간 생육, 암조건으로 5일간 생육시킨 후 장일조건으로 1일간 생육시키는 방법으로 생육조건을 각각 달리하여 생육시킨 다음 각각의 보리 유묘의 뿌리로부터 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하고 노던 블롯을 수행하였다.

실험 결과, HvRAF 유전자는 장일조건에 비해 암 조건에서 생육시킨 유묘의 뿌리에서 더 많이 발현되는 것으로 나타났다. 또한, 장일조건 후 암조건 하에서 생육시킨 경우에 비해 암조건 후 장일조건 하에서 생육시킨 경우에 더 많이 발현되는 것으로 나타났다(도 6).

<실시예 5>

HvRAF 유전자의 핵 이동성 조사

전사인자는 생체 내에서 관련 유전자의 프로모터를 인식하여 RNA 중합효소의 기능을 돕는 단백질이다. 보리에서 분리한 HvRAF 유전자로부터 발현된 단백질이 핵으로 이동하여 전사인자로서 기능을 하는지 확인하기 위하여 HvRAF 유전자를 애기장대의 원형질체 내로 형질전환시키고 세포내 소기관별 분석(subcellular localization assay)을 실시하였다.

이를 위해 먼저, 애기장대로부터 원형질체를 분리하였다. 5주 동안 생육시킨 애기장대의 잎을 0.5∼1mm 크기로 자른 후 셀룰라제 및 마세로자임이 포함된 용액에 침전시키고 2시간 동안 회전배양하였다. 그 다음 나일론 매쉬(53㎛)를 통해 여과하고 W5 용액(154mM NaCl, 125mM CaCl₂, 5mM KCl, 2mM MES, pH5.7)을 동일한 양으로 혼합한 후 100ㅧg로 원심분리하여 원형질체를 침전시킨 다음 MMg 용액(0.4M mannitol, 15mM MgCl₂, 4mM MES, pH5.7)에 혼합하였다.

상기 원형질체 내로 HvRAF 유전자를 도입하기 위하여 HvRAF 유전자와 smgfp(soluble modified green floresence protein) 리포터 유전자가 융합된 재조합 벡터를 제조하였다. 이를 위해 먼저, 상기 실시예 1에서 제조한 HvRAF 유전자의 cDNA(서열번호 3)를 주형으로 하고 하기와 같은 제한효소 BamHI 사이트를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

정방향 프라이머 HvAP2-gfp-F3(Bam) (서열번호 25)

5'-GGATCCAATGTGTGGCGGCGCCATCCTA-3'

역방향 프라이머 HvAP2-gfp-R3(Bam) (서열번호 26)

5'-GGATCCGCGAAGATGCTGTCGGCGGATTC-3'

PCR 증폭 조건으로는 94℃에서 3분 동안 변성시킨 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 5회 반복하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 30회 반복하였다. PCR 증폭 산물을 아가로스젤 1%에 로딩한 후 약 1kb 위치의 밴드를 나이프로 잘라내고 젤익스트랙션 키트(Accuprep Gel extraction kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 분리한 후 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균(DH10B)에 형질전환한 후 플라스미드를 분리하였다. 상기 플라스미드에 제한효소 BamH1을 처리하고 수득된 단편을 smgfp 벡터에 클로닝하여 HvRAF 유전자와 리포터 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 재조합 벡터 20㎍을 상기에서 분리한 원형질체 200㎕에 첨가한 후 조심스럽게 혼합하고 여기에 PEG/Ca 40%(v/v) 용액(PEG4000 4g, H₂O 3ml, 0.8M 만니톨 2.5ml 및 1M CaCl₂ 1ml) 220㎕를 첨가하여 혼합하였다. 그 다음 1분 동안 145ㅧg로 원심분리하여 PEG를 제거하였다. 이들을 암조건 상태에서 하루 정도 배양한 후 광초점 형광현미경을 이용하여 HvRAF 단백질이 원형질체 내의 핵 내로 이동하는지 여부를 관찰하였다. 이때 대조군으로는 HvRAF 유전자가 포함되지 않은 smgfp 벡터로 원형질체를 형질전환한 것을 사용하였다.

실험 결과, HvRAF 유전자와 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환한 원형질체의 경우 HvRAF::smgfp 융합 단백질이 핵으로 이동함을 확인할 수 있었다(도 7a). 반면, HvRAF 유전자를 포함하지 않고 리포터 유전자만을 포함하는 벡터로 형질전환한 원형질체의 경우에는 smgfp 단백질이 핵을 포함하여 세포질 전반에 걸쳐 퍼져 있는 것이 관찰되었다(도 7b).

상기 실험 결과로부터 본 발명에 따른 HvRAF 유전자는 핵으로 이동하는 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 6>

HvRAF 단백질의 전사활성 영역 분석

HvRAF 단백질이 실제로 유전자의 발현을 활성화시키는지 여부를 확인하기 위하여 효모 시스템에서 일련의 HvRAF 유전자의 결실 돌연변이체를 제작하여 전사활성을 분석하였다.

이를 위해 HvRAF 전체 서열(아미노산 1-328)을 암호화하는 유전자(서열번호 3), 상기 HvRAF 유전자의 N 말단을 순차적으로 결실시킨 유전자 단편(HvRAFΔN1: 59-328번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편, HvRAFΔN2: 217-328번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편, HvRAFΔN3: 303-328번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편) 및 C 말단을 순차적으로 결실시킨 유전자 단편(HvRAFΔC1: 1-316번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편, HvRAFΔC2: 1-294번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편, HvRAFΔC3: 1-67번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편)을 하기의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭함으로써 제조하였다.

HvRAF 단백질의 전사활성 분석을 위한 부분단백질제조에 사용된 프라이머

프라이머	염기서열	서열번호
HvAP2-acti-Full-F(EcoI)	5'-GAATTCATGTGTGGCGGCGCCATCCTAG-3'	27
HvAP2-acti-Full-R(PstI)	5'-CTGCAGTCAGAAAATGGCGCTGTCC-3'	28
HvAP2-acti-C1(PstI)	5'-CTGCAGCAGAGGCTGACGGCGTCCAT-3'	29
HvAP2-acti-C2(PstI)	5'-CTGCAGGAAGATGCTGTCGGCGGATTC-3'	30
HvAP2-acti-C3(PstI)	5'-CTGCAGGCAGGTCGAAGTGGTCATCG-3'	31
HvAP2-acti-N1(EcoI)	5'-GAATTCGAGGACTTCGATGACCACTT-3'	32
HvAP2-acti-N2(Eco1)	5'-GAATTCGAGCTGATGGAGTTTTTCAA-3'	33
HvAP2-acti-N3(EcoI)	5'-GAATTCGCCCTCAGCGTGGACAGTG-3'	34

상기에서 제조된 각각의 유전자 단편을 GAL4 DNA 결합 벡터인 pGBKT7(Clontech)에 EcoRI과 PStl 제한효소 절단위치에 각각 삽입함으로써 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터를 효모 AH109(clontech)에 형질전환시켰다. 전사활성은 상기 형질전환 효모를 액체 배양하면서 콜로니 리프트 필터 방법(colony lift filter assay) 및 ONPG(o-nitrophenyl β-D-galactopyronosid)를 기질로 이용하는 방법을 사용하여 β-갈락토시데이즈 활성을 측정함으로써 결정하였다. 구체적인 실험방법은 클론텍(Clontech)사의 효모 프로토콜 핸드북(PT3024-1)을 참고로 하였다.

실험 결과, 완전한 길이의 HvRAF 단백질은 GAL4 DNA 결합 부위와 융합하여 β-갈락토시다제의 발현을 강력하게 유도하는 것으로 나타났다. 이는 상기 HvRAF 강력한 전사 조절 인자임을 의미한다. 한편, N-말단을 제거한 유전자 단편의 경우에는 전사 촉진 활성에 큰 영향을 주지 않았으나, C-말단으로부터 34개의 아미노산을 제거한 유전자 단편(HvRAFΔC2, 1-294번 아미노산)의 경우에는 β-갈락토시다제 활성이 나타나지 않았다. 반면, C-말단으로부터 12개의 아미노산을 제거한 유전자 단편(HvRAFΔC1, 1-316번 아미노산)의 경우 β-갈락토시다제 활성이 유지되는 것으로 나타났다. 따라서 HvRAF 단백질의 317-328번 아미노산은 전사활성과는 관련이 없음을 확인할 수 있었다. 한편, 303-328번 아미노산을 암호화하는 유전자 단편의 경우(HvRAFΔN3)에는 β-갈락토시다제 활성이 유지되는 것으로 나타났다(도 8). 따라서, 상기 실험 결과로부터 303-316번의 14개의 아미노산이 HvRAF 단백질에서 전사활성에 중요한 역할을 수행하는 부분임을 알 수 있었다. 상기 14개의 아미노산(Ala-Leu-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Met-Asp-Ala-Val-Ser-Leu-Trp)을 암호화하는 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 35 및 서열번호 36에 나타낸 바와 같다.

<실시예 7>

다양한 환경스트레스에 의한 HvRAF 유전자의 발현 유도

상기 실시예 1에서 분리된 HvRAF 유전자의 기능을 확인하기 위하여 다양한 환경 스트레스에 의해 상기 유전자의 발현이 유도되는지 여부를 조사하였다. 상기 환경 스트레스로는 숙주인 식물에 병원체가 침투하는 경우 합성되어 다양한 신호전달체계에 의한 방어 시스템을 구축하는 작용을 하는 것으로 알려진 살리실산, 에테폰(ethephon), 메틸자스몬산(methyl jasmonic acid) 및 ABA(abscisic acid)와 같은 식물 호르몬을 처리하는 방법, 상처가 나거나 병원균이 숙주 식물에 침투할 때 분비되는 세포벽 파괴 효소인 셀룰라아제(cellulase)를 처리하는 방법, 식물체에서 활성 산소종을 유발하여 산화 스트레스를 유도하는 것으로 알려진 MV(methyl vilogen; Paraquat)를 처리하는 방법 및 기계적 상처를 가하는 방법을 사용하였다.

보다 구체적으로, 버미큘라이트 토양에서 보리를 7일간 생육시킨 다음 5mM 살리실산, 2mM 에테폰, 0.1mM 메틸자스몬산 및 0.1mM ABA를 살포하고 1시간, 3시간, 6시간 및 18시간 후에 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 각각의 유묘로부터 전체 RNA를 추출한 다음 노던블롯 분석을 수행하였다.

또한, 상기 14일간 생육시킨 보리 뿌리에 셀룰라제와 MV를 각각 0.01% 및 10mM의 농도로 처리하고 6시간 후에 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 각각의 유묘의 잎 또는 뿌리로부터 전체 RNA를 추출한 다음 노던블롯 분석을 수행하였다. 이때 대조군에는 셀룰라제 또는 MV를 대신하여 물을 처리하였다.

실험 결과, 본 발명의 HvRAF 유전자는 살리실산, 에테폰 및 메틸자스몬산과 같은 식물 호르몬과 상처에 의해 그 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다. 반면, 대조군과 ABA를 처리한 경우에는 유전자 발현이 거의 유도되지 않았다(도 9a).

또한, 셀룰라제 또는 MV를 처리한 경우에는 HvRAF 유전자의 발현이 뿌리 부분에서 유도됨을 확인할 수 있었다(도 9b).

상기 실험결과로부터 본 발명에 따른 HvRAF 유전자는 다양한 스트레스에 의해 유도되는 특징이 있으므로 식물체에서 스트레스를 방어하기 위한 작용과 관련이 있을 것으로 사료되었다.

<실시예 8>

HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대의 환경 스트레스 저항성 조사

본 발명에 따른 HvRAF 유전자가 식물체의 환경 스트레스 저항성과 관련이 있는지를 확인하기 위하여 HvRAF 유전자가 과다발현되는 애기장대를 제조하고 상기 애기장대의 병 저항성 및 고농도 염과 같은 환경 스트레스에 대한 저항성을 조사하였다. 또한, 애기장대에서 HvRAF 유전자의 과다발현이 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자의 발현을 유도하는지를 조사하였다.

<8-1> HvRAF 유전자 과다발현 애기장대 제조

상기 실시예 1에서 제조한 HvRAF 유전자의 전장 cDNA(서열번호 3)를 양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터를 포함하는 식물 바이너리 벡터 pBI111L의 XabI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 C58C1 균주에 전기 천공법으로 도입한 후 카나마이신, 젠타마이신 및 리팜피신이 최종농도로 각각 30㎍/ml, 100㎍/ml 및 100/ml씩 포함된 YEP 배지(배지 1L당 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g)에 접종하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음 항생제에 저항성을 나타내는 균주를 선발하고 선발된 균주를 이용하여 플로랄 딥 방법(floral dip method)으로 야생형 애기장대(Col-0)에 형질전환시켰다. 즉, 선발된 아그로박테리움 콜로니를 동일한 농도의 항생제가 포함된 YEP 액체배지 5ml에 접종한 후 하루 동안 배양하고 500㎕를 취하여 YEP 배지 500ml에 접종한 다음 600nm에서 흡광도가 2.0 이상이 되도록 배양하였다. 이를 튜브로 옮긴 후 4℃에서 5000rpm으로 원심분리하고 인필터레이션 버퍼(버퍼 1L 당 MS 염 2.2g, 수크로즈 50g, MES 0.5g, 벤질아미노퓨린 0.044M 및 Silwet L-77 200㎕, pH 5.7)에 침전물을 현탁하였다. 꽃대가 5∼10cm 정도 올라온 야생형 애기장대를 상기 현탁액에 거꾸로 뒤집어 5∼7초 동안 3회 침수시켰다. 접종 3∼4주 후 종자를 수확하여 카나마이신이 포함된 배지에 파종한 다음 저항성을 나타내는 형질전환체를 선발하고 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 RNA를 추출하여 노던블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, HvRAF 유전자를 과다발현하는 2개의 형질전환체(HvRAF 과다발현 #4, HvRAF 과다발현 #6)를 선발하였다(도 10).

<8-2> HvRAF 유전자 과다발현 형질전환체의 병 저항성 조사

상기 실시예 <8-1>의 형질전환된 애기장대를 토양에서 4주 정도 생육시킨 다음 뿌리 끝 2cm 정도를 절단하였다.

무름병 병원균(Ralstonia solanacearum GMI 1000) 10⁸cfu 정도가 현탁된 10mM MgCl₂에 상기 식물체를 2시간 동안 담근 후 토양으로 다시 옮겨서 23℃에서 생육시켰다. 대조군으로는 야생형 애기장대를 사용하였다. 병원균을 접종한지 2일 후부터 병징(symptom)의 상태를 질병 인덱스(disease index) 방법으로 조사하였다. 상기 방법은 전체 잎의 무름병 징후의 정도에 따라 그 감염정도를 1∼4로 표시하는 방법이다. 즉, 전체 잎이 무름병 징후를 나타내지 않는 경우 0, 전체 잎 중 25% 이하의 병징은 1, 26∼50%의 경우 2, 51∼75%의 경우 3, 76∼100%의 경우 4로 표시하는 방법이다. 각 실험은 독자적으로 3회 반복실험을 수행하였다.

실험 결과, 상기 무름병 병원균을 접종한지 6일경이 되면 야생형 애기장대의 경우 60% 이상이 병징(질병 인덱스 3)을 나타낸 반면 HvRAF 과다발현 형질전환체는 그 절반가량인 30% 정도의 병징(질병 인덱스 2)을 나타냈다. 병원균을 접종한지 8일째에는 야생형의 경우 90% 이상의 병징(질병 인덱스 4)을 나타냈으며, 형질전환체는 60% 정도의 병징(질병 인덱스 3)을 나타냈다(도 11a 및 도 11b).

따라서, HvRAF 과다발현 형질전환체의 병징속도가 야생형에 비해 느린 것을 알 수 있었으며 이로부터 외떡잎 식물인 보리로부터 분리된 HvRAF 유전자가 쌍떡잎 식물인 애기장대 내에서도 병원균에 대한 방어 기작을 수행함을 알 수 있었다.

<8-3> HvRAF 유전자 과다발현 형질전환체의 고농도 염 저항성 조사

50mM 또는 100mM NaCl를 함유한 MS 배지에 상기 실시예 <8-1>의 형질전환된 애기장대를 접종하여 14일간 배양한 다음 전체 식물의 생육정도 및 뿌리 길이를 측정하였다. 이때 야생형 애기장대를 대조군으로 사용하였다.

실험 결과, 50mM NaCl를 함유한 배지에서 야생형과 형질전환체의 생육정도 및 뿌리 길이는 큰 차이를 나타내지 않았으나 100mM NaCl를 함유한 배지에서 형질전환체의 생육정도 및 뿌리 길이가 야생형에 비해 2배 이상 긴 것으로 나타났다(도 12a 및 도 12b).

따라서, 고농도의 염 환경 하에서 HvRAF 과다발현 형질전환체의 생육이 야생형에 비해 강한 것을 알 수 있었으며 이로부터 외떡잎 식물인 보리로부터 분리된 HvRAF 유전자가 쌍떡잎 식물인 애기장대 내에서도 고농도 염 스트레스에 대한 방어 기작을 수행함을 알 수 있었다.

<8-4> HvRAF 유전자 과다발현 애기장대에서 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자의 발현 유도

본 발명의 HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대에서 병 저항성 유전자(pathogen resistance gene) 및 저온 저항성 유전자(cold responsive gene)의 발현이 유도되는지를 조사하였다.

이를 위해 상기 실시예 <8-1>의 형질전환체(T₁)의 T₃ 세대 중 두개의 라인(4-2, 4-8, 6-4, 6-6)를 MS 배지에 파종하여 비스트레스 환경 하에서 2주간 생육시킨 다음 병 저항성 유전자인 PDF1.2, PR1 및 PR5와 저온 저항성 유전자인 COR6.6 및 GSH1 유전자의 발현이 유도되었는지 여부를 노던 블롯 분석법으로 조사하였다. 대조군으로는 야생형 애기장대를 사용하였다.

노던블롯 분석은 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 수행하되 형질전환체 및 야생형 애기장대로부터 RNA를 분리한 다음 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자에 대한 탐침을 제조하여 사용하였다. 즉, 노던블롯에 사용한 탐침은 상기 병 저항성 유전자 및 저온 저항성 유전자의 공지된 유전자 염기서열을 주형으로 하여 하기 표 3에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제조하였다.

노던 블롯 분석을 위한 탐침의 제조를 위한 프라이머

염기서열			서열번호
PDF1.2 (AY133787)	정방향	5'-ATGGCTAAGTTTGCTTCCATC-3'	37
PDF1.2 (AY133787)	역방향	5'-AATACACACCATTTAGCACCA-3'	38
PR1 (AY117187)	정방향	5'-ATGAATTTTACTGGCTATTCT-3'	39
PR1 (AY117187)	역방향	5'-GTATGGCTTCTCGTTCACATA-3'	40
AtRP5 (ATU83490)	정방향	5'-CCAGTATTCACATTCTCTTCTTCGT-3'	41
AtRP5 (ATU83490)	역방향	5'-GTGGTTTTATCCCCATCTTTACATT-3'	42
COR6.6 (X62281)	정방향	5'-TGAGAGGAGAAGAGCAATGT-3'	43
COR6.6 (X62281)	역방향	5'-TGTCCTTCACGAAGTTAACAC-3'	44
GSH1 (AF068229)	정방향	5'-GAATGGGAAAAAGTAATGGAAGGTG-3'	45
GSH1 (AF068229)	역방향	5'-CTCTGGGAATATTGTTGTCAGATGG-3'	46

실험 결과, HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대의 경우 병 저항성 유전자인 PDF1.2, PR1 및 PR5 뿐만 아니라 저온 저항성 유전자인 COR6.6, GSH1 유전자의 발현이 야생형에 비해 보다 높게 유도됨을 확인할 수 있었다(도 13).

<실시예 9>

HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대 종자의 발아력 검정

본 발명에 따른 HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대 종자가 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖는지 확인하기 위하여 상기 실시예 <8-1>에서 제조한 HvRAF 유전자가 과다발현된 애기장대로부터 종자를 회수하고 발아를 억제하는 대표적인 인자인 식물 호르몬인 ABA(1μM) 또는 고농도의 NaCl이 함유된 MS 배지에 파종하고 발아력을 측정하였다. 이때 대조군으로는 야생형 애기장대로부터 회수한 종자 또는 HvRAF 유전자를 포함하지 않은 빈 벡터로 형질전환한 애기장대로부터 회수한 종자를 동일한 조건으로 파종하여 발아력을 측정하였다. 발아력은 어린뿌리(radicle)가 종피를 뚫고 1mm 이상 나온 종자의 수를 백분율로 나타내었다.

실험 결과, ABA가 함유된 배지에서 HvRAF 과다발현 애기장대 종자의 경우 파종 후 하루 만에 거의 발아가 되는 반면, 야생형 애기장대 및 빈 벡터로 형질전환된 애기장대 종자의 경우에는 각각 8일과 4일이 지난 후에야 발아가 완성되었다(도 14a).

또한, 고농도의 염을 함유한 배지에서 파종한 경우 HvRAF 과다발현 애기장대 종자의 경우 5일 정도가 지나면 발아가 완성되는 반면 야생형과 빈 벡터로 형질전환된 애기장대 종자의 경우에는 전혀 발아가 되지 않았다(도 14b).

상기 실험 결과로부터 본 발명의 HvRAF 유전자는 종자의 환경 스트레스 저항성도 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 전사인자는 다양한 환경 스트레스 저항성 관련 유전자의 발현을 유도함으로써 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성 저하를 억제하거나 지연시키는 효과가 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Novel environmental stress resistance transcription factor and method for enhancing environmental stress resistance of plant using the same <130> NP06-1007 <150> KR10-2005-0052321 <151> 2005-06-17 <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer HvAP2-F <400> 1 caggaagata aaacaatgtg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer HvAP2-R <400> 2 gatcaattcg taggactatt g 21 <210> 3 <211> 987 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220> <221> CDS <222> (1)..(984) <223> HvRAF cDNA <400> 3 atg tgt ggc ggc gcc atc cta gcg cag ctg atc ccg ccg tcg gcg ggc 48 Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Gln Leu Ile Pro Pro Ser Ala Gly 1 5 10 15 cgt ccg tcg aag cag gcg gca gcg ggc ggc cgg gcc ccg ccc acg agc 96 Arg Pro Ser Lys Gln Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ala Pro Pro Thr Ser 20 25 30 tcc aag aag ggc ggc gtg agc aag agc cgc cac agc agc acc cca gat 144 Ser Lys Lys Gly Gly Val Ser Lys Ser Arg His Ser Ser Thr Pro Asp 35 40 45 gcc gac gac gac gtc ttc gag gcc gcc ttc gag gac ttc gat gac cac 192 Ala Asp Asp Asp Val Phe Glu Ala Ala Phe Glu Asp Phe Asp Asp His 50 55 60 ttc gac ctg cgg gcg gag gag gac ggc ggc gac gac cat gtc gtc ttt 240 Phe Asp Leu Arg Ala Glu Glu Asp Gly Gly Asp Asp His Val Val Phe 65 70 75 80 gca tcc aag cct gcc ttc tct cca cgt ccg gcc tac gac ggt ggc cgc 288 Ala Ser Lys Pro Ala Phe Ser Pro Arg Pro Ala Tyr Asp Gly Gly Arg 85 90 95 gcg gcg cat gcg gcg agc agg aag aag cgc acc ggc cac ctc cat ggc 336 Ala Ala His Ala Ala Ser Arg Lys Lys Arg Thr Gly His Leu His Gly 100 105 110 atc cgg cag cgg ccg tgg ggc aag tgg gcg gcg gag atc cgc gac ccg 384 Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro 115 120 125 cac aag ggc acc cgc gtc tgg ctc ggc acg ttc gac acg gcc gat gat 432 His Lys Gly Thr Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Asp Asp 130 135 140 gcc gcc cgg gcc tac gac gtc gcc gcc cgt cgc ctc cgt ggc agc aag 480 Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Val Ala Ala Arg Arg Leu Arg Gly Ser Lys 145 150 155 160 gcc aag gtc aac ttc ccc gac gcg gcc agg acc ggg gct cgc ccg cgc 528 Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Ala Ala Arg Thr Gly Ala Arg Pro Arg 165 170 175 cgc gcc agc cgt aga acc gcg cag aaa ccg caa tgc ccc cct gcg cgg 576 Arg Ala Ser Arg Arg Thr Ala Gln Lys Pro Gln Cys Pro Pro Ala Arg 180 185 190 acg acg gcg tac tct gcc acc gca gca gca cgc gca cag ccg gag cag 624 Thr Thr Ala Tyr Ser Ala Thr Ala Ala Ala Arg Ala Gln Pro Glu Gln 195 200 205 gac gct atg atg gtc aaa ccc gag ctg atg gag ttt ttc aac gtg gac 672 Asp Ala Met Met Val Lys Pro Glu Leu Met Glu Phe Phe Asn Val Asp 210 215 220 gcc atc gtc cac ctg acc act gcc gtc gcc gcg cta ccg cct gtc acg 720 Ala Ile Val His Leu Thr Thr Ala Val Ala Ala Leu Pro Pro Val Thr 225 230 235 240 gcg agc acc ttc gcc gac acg atg ccg agg gtc gac gag gac tct tct 768 Ala Ser Thr Phe Ala Asp Thr Met Pro Arg Val Asp Glu Asp Ser Ser 245 250 255 gtg ggg agc ggc ggc ggc gcc atg ctg ggg ttc gcc gac gag ctt ggg 816 Val Gly Ser Gly Gly Gly Ala Met Leu Gly Phe Ala Asp Glu Leu Gly 260 265 270 ttc gat ccg ttc atg atg ttc cag cta ccc tgc tcg gac atg tac gaa 864 Phe Asp Pro Phe Met Met Phe Gln Leu Pro Cys Ser Asp Met Tyr Glu 275 280 285 tcc gcc gac agc atc ttc gcc gga gac gct gtc atc ccg gat gcc ctc 912 Ser Ala Asp Ser Ile Phe Ala Gly Asp Ala Val Ile Pro Asp Ala Leu 290 295 300 agc gtg gac agt ggc atg gac gcc gtc agc ctc tgg agc ttc gac gag 960 Ser Val Asp Ser Gly Met Asp Ala Val Ser Leu Trp Ser Phe Asp Glu 305 310 315 320 ttc ccc atg gac agc gcc att ttc tga 987 Phe Pro Met Asp Ser Ala Ile Phe 325 <210> 4 <211> 328 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 4 Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Gln Leu Ile Pro Pro Ser Ala Gly 1 5 10 15 Arg Pro Ser Lys Gln Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ala Pro Pro Thr Ser 20 25 30 Ser Lys Lys Gly Gly Val Ser Lys Ser Arg His Ser Ser Thr Pro Asp 35 40 45 Ala Asp Asp Asp Val Phe Glu Ala Ala Phe Glu Asp Phe Asp Asp His 50 55 60 Phe Asp Leu Arg Ala Glu Glu Asp Gly Gly Asp Asp His Val Val Phe 65 70 75 80 Ala Ser Lys Pro Ala Phe Ser Pro Arg Pro Ala Tyr Asp Gly Gly Arg 85 90 95 Ala Ala His Ala Ala Ser Arg Lys Lys Arg Thr Gly His Leu His Gly 100 105 110 Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro 115 120 125 His Lys Gly Thr Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Asp Asp 130 135 140 Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Val Ala Ala Arg Arg Leu Arg Gly Ser Lys 145 150 155 160 Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Ala Ala Arg Thr Gly Ala Arg Pro Arg 165 170 175 Arg Ala Ser Arg Arg Thr Ala Gln Lys Pro Gln Cys Pro Pro Ala Arg 180 185 190 Thr Thr Ala Tyr Ser Ala Thr Ala Ala Ala Arg Ala Gln Pro Glu Gln 195 200 205 Asp Ala Met Met Val Lys Pro Glu Leu Met Glu Phe Phe Asn Val Asp 210 215 220 Ala Ile Val His Leu Thr Thr Ala Val Ala Ala Leu Pro Pro Val Thr 225 230 235 240 Ala Ser Thr Phe Ala Asp Thr Met Pro Arg Val Asp Glu Asp Ser Ser 245 250 255 Val Gly Ser Gly Gly Gly Ala Met Leu Gly Phe Ala Asp Glu Leu Gly 260 265 270 Phe Asp Pro Phe Met Met Phe Gln Leu Pro Cys Ser Asp Met Tyr Glu 275 280 285 Ser Ala Asp Ser Ile Phe Ala Gly Asp Ala Val Ile Pro Asp Ala Leu 290 295 300 Ser Val Asp Ser Gly Met Asp Ala Val Ser Leu Trp Ser Phe Asp Glu 305 310 315 320 Phe Pro Met Asp Ser Ala Ile Phe 325 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer HvAP2-F2 <400> 5 acacgatgcc gagggt 16 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer HvAP2-R2 <400> 6 agtacagaga ggtaccg 17 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer AP1 <400> 7 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer GSP1 <400> 8 tggagagaag gcaggcttgg atgcaaa 27 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer AP2 <400> 9 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer GSP2 <400> 10 cccgcaggtc gaagtggtca tcgaagt 27 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer T7 <400> 11 taatacgact cactataggg 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer SP6 <400> 12 gatttaggtg acactatag 19 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer GSP3 <400> 13 tacgtggcaa ggaggaacac acaatt 26 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer GSP4 <400> 14 acatgaactt gtcgcagcca cttggct 27 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-1 <400> 15 cacattttgc acgacccgt 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-2 <400> 16 agtcgtccaa tgtaccggtt 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-3 <400> 17 ctacctgcac attgtagggc t 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-4 <400> 18 ccattacttg tgttaacctg ca 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-5 <400> 19 ctcctacaac ttgatgattt gt 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-6 <400> 20 cccttcgtta ataaacttga aca 23 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-7 <400> 21 aactgcagtt gctggtgca 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Prom-8 <400> 22 aaccacacga cacacacgat 20 <210> 23 <211> 5658 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220> <221> gene <222> (1)..(5658) <223> HvRAF genomic DNA <400> 23 cctgctcatg catcatttgt gttgttgcat cgtgtggtga atttcgtgta ttgatttgtg 60 tttccggttt gcttcgtctc gatagagttc cgcaagcgtg tcggattgtg tggacccgtt 120 cgactacgtc agttcgtcta cttcacggag gcattcttct tccaagcggg atctcaggca 180 agatgatcat ttccccagat accattacta taattgccat gctagtttta ccgcttctat 240 cgttatgtct cgttcctacc acatgttaaa tatcagcctc tcaacaatgc cttgaaacct 300 tcaacctgtt caacctagca aaccactgat tggctatgtt actgcttgct taaccctgtt 360 gatagcgttg ctagttgcag gtgcagatgc ttccatgtga atacatgtat tccttgttat 420 atcaccatat taaatgctat ttaatttaat gcaactatat acttggtaaa acgtggaagg 480 ctcggccttt ctagcctagt gttttgttcc acctttgccc ccttagtttc ggctaccggt 540 gttatgttcc ataaatgagc gctcctaaca cgatcggggt tgttatgggg acccccttga 600 taattcgttt tagattaaag ctggtctggc aaggcccaac tttggtacta catttgccta 660 ataacctaat aataatgcat agggacccgc cggcacccgc ggactatttt aatcaacccc 720 cgggccagtg ctcctcatga gtgttggtcc cacctgagcg atgtccggca cccctctggt 780 cacccagagg tttagcgatc ccgacgtcta gctcatccgt catgtcctga gaacgaggta 840 cgcgactcct atcgggatcg tcgacacatc gggcggcctt gctggattag ttttaccttt 900 gacgagatat cttgtgcatg gggattccgg tgatgctttg ggtaatctca gagttgaggt 960 tttccactag ggaatccgac gagatcgcga gcttcgtgat ggaggatttc tatgcggctt 1020 gtggtaattt gtgatggact agttggagca cccctgcagg gttaaatctt tcggaaagcc 1080 gtgcccgcgg ttatgtggca acgtggaaac tttgtttaac actggttaaa gataacttga 1140 agttaactta attaaaactt gccaactgtg tgcgtaaccg tgactgtctc cttcgtgagt 1200 tcttactccg atcgaggaca cggtggggtt atgtctgacg taggtaggtg ttcaggatca 1260 gtcatttgat catgagtagt tcacgtccgt tatgcataga tcttccccct cttatttctt 1320 gtactcgtaa gttagccacc aaatatatgc ttagccgctg ttgcaacctc accacttaac 1380 catgcctcac ccattaagct ttgctagtct tgataccttt ggaaatgaga ttgttgagtc 1440 ccctgtggct cacagattac tacaacacca gttgcaggta caggtaaagg ttactcgacg 1500 tgagcgcgtt gattgttcat ttggagttgc ttcttcttct tcttcatcga tctaggatgg 1560 gttccaggcc gacagcctgg gatagcaagg atgaacgtcg ttcttctttt gtcgtttgtg 1620 ttcatccgta gtcggaccct ctcttactct tgatgaatat gtaatgtact gatgtgattc 1680 tgatgtggct tgtggcgagt gtaagccaac cctctattta tatctcttct tttcagtaca 1740 tgtacttgta acgatatcca ttcttgtgac acgacgagat gcgcttctaa ccctgacgag 1800 gccctcgtgc caaatggtta ggagagtggt tatagcccaa gccagtcgca tcccatattt 1860 aatgctctgt gtctcatttc tattgcttat aattttagtg ggcaacaata tcactaatgt 1920 ccctattagt ggtgaggtgt ctacaatgaa tatttccaat cctaaaagac tatgactctg 1980 gtgttcagtg cccattgtgt gtgtatgtga gtaaatggat tagctgatta atgtttgaca 2040 cattttatac acaaggtcaa tctacattgg atcaagaaaa tgttgagaaa gagtaaaacc 2100 caaggcttat gagtgttgtt gttgttgaag caccccatgc atgattagag acaaggagaa 2160 agtgtgttat gaagaagatg atttttttta aaggagatgc atgcttagag aaattaaggt 2220 tagctagccg actaatccta ctaaaagtaa tacttgatta ttgtcgtttc aattaaaaaa 2280 ataccttgat tattgctgtt ccggttcgac gtcattggtc aagtaatcaa tcagtgatat 2340 caattaggtt aggcctaact aatacaagtg gtcgtccatt tctttctggg tctaggctcg 2400 atcatttgcg gagctgagcc aagtggctcg cacaagttca tgtatcagga aaaagttgag 2460 ctattcacgc gccaaattgt gtgttcctcc ttgccacgta gttgtgccgt gtcattcggc 2520 agctgactgt tgtgttcctg gcttcctgcc acctggcatc atgtgatgcc acctcagttg 2580 ttgagtcgtc caatgtaccg gttccctgtc aaccgagaaa atcggctatt tgccactttt 2640 aatattgggc ttctcaaaat tgccactctc aagattggtt tcgtaaaaat gtcatccaac 2700 ccatgtgtac tttgattaca atgccatttc ctctttttca atgctttcct ttttcttttc 2760 ccatttccca acatctgaag ggaccaatat acccctagcc tatgcacatg tactagtttt 2820 ttgcatccaa cttgaaacaa cgccgttgag cgcccgccgt cggccgagat caccgcatac 2880 agttcgccaa gccctcctct ggtcctcccc catgatccat cagctcttct acctgcacat 2940 tgtagggctg ctcctgcttg ccgattgctt ggaagtgggc tgccgattgg ctggacatcg 3000 cgtgtcacag gttgcctgga cgccatgcgc ccacgcgcct cttatcgaca ctctgcgtca 3060 tctatctcta ggtatcgcag tggaatggaa ctcaatcctt ctacacagta ttcttctatc 3120 tgtaccttcg aatatgccat tacttgtgtt aacctgcaca tcagagacaa ctagtagaag 3180 tatacaaggg aaattttaga atatgtaaat tctattctgc atggttcatt tagaatgatg 3240 tcatgttctc ctacaacttg atgatttgtt ctaccttggt ggtgttatgt acatgtcatt 3300 gataccacat tacattcagg caaactgtag cgaatcttct gaatatatgt tcaacaatat 3360 gaaaatgaga agcaacgtgt tcatttcatt gtataacaca catacatgca gacgccttgc 3420 tttcttgttg ggagaggata catcttcaca agcaacaaca acaactacag aggatgtcca 3480 ctacagctcc aacaaagaag ttgactccaa aaagaaagct aaaaattgaa attggatgaa 3540 cgatctctac gaaattgatg ctatagttat ttgaggaagt tgaatactcc cttcgttaat 3600 aaacttgaac atctaggtta cctgcatgtt cctgcctcac ctctctagca tgtcacacga 3660 cgagctgcgc tagcgcacat gcacggatga gctgcggttg ctcgcgggca tggccggcaa 3720 gctatacgac ggctcgtgca aatgtggacg agcaccaacg gcgagctccg ccgtcgcgca 3780 caggcttggg tgagcaacgg tgggtggtgg cgaactgcag ttgctggtgc aggcgttggc 3840 aagctagggc ggcgagctgc gatgcctcgc actggcatca gcgagctacg gcgacgggct 3900 ttggtggaga acgaaacacc tcacagaccc aaccaatcca cacaggcgtg agataaggtt 3960 gaattatcca ggggtatttt ggtcccttca ggtgccagga aatggaaaaa gaaaaagaaa 4020 accaataaaa aagagaaaat ggcatgttaa tcaaagtgca atcaaactga gtggcacttt 4080 tacgcagcca atcttaagag tggcaatttt gagaagccga gtattgaaaa tggtaaataa 4140 ccaattttct cctgccaacc acacgacaca cacgatcgtc ttggtcagct agcttgcgtt 4200 tataagtagg cgcagctccg tctctcggtg accaacacaa gacgtgagag aagaaagcgc 4260 gagacaggaa gataaaacaa tgtgtggcgg cgccatccta gcgcagctga tcccgccgtc 4320 ggcgggccgt ccgtcgaagc aggcggcagc gggcggccgg gccccgccca cgagctccaa 4380 gaagggcggc gtgagcaaga gccgccacag cagcacccca gatgccgacg acgacgtctt 4440 cgaggccgcc ttcgaggact tcgatgacca cttcgacctg cgggcggagg aggacggcgg 4500 cgacgaccat gtcgtctttg catccaagcc tgccttctct ccacgtccgg cctacgacgg 4560 tggccgcgcg gcgcatgcgg cgagcaggaa gaagcgcacc ggccacctcc atggcatccg 4620 gcagcggccg tggggcaagt gggcggcgga gatccgcgac ccgcacaagg gcacccgcgt 4680 ctggctcggc acgttcgaca cggccgatga tgccgcccgg gcctacgacg tcgccgcccg 4740 tcgcctccgt ggcagcaagg ccaaggtcaa cttccccgac gcggccagga ccggggctcg 4800 cccgcgccgc gccagccgta gaaccgcgca gaaaccgcaa tgcccccctg cgcggacgac 4860 ggcgtactct gccaccgcag cagcacgcgc acagccggag caggacgcta tgatggtcaa 4920 acccgagctg atggagtttt tcaacgtgga cgccatcgtc cacctgacca ctgccgtcgc 4980 cgcgctaccg cctgtcacgg cgagcacctt cgccgacacg atgccgaggg tcgacgagga 5040 ctcttctgtg gggagcggcg gcggcgccat gctggggttc gccgacgagc ttgggttcga 5100 tccgttcatg atgttccagc taccctgctc ggacatgtac gaatccgccg acagcatctt 5160 cgccggagac gctgtcatcc cggatgccct cagcgtggac agtggcatgg acgccgtcag 5220 cctctggagc ttcgacgagt tccccatgga cagcgccatt ttctgacgct ttccgtgtga 5280 tgcactgcac tctgttggtt gtaagaatct ccacctggcc tctacgtagt tccttgtaaa 5340 tgcccgcgca cagaaccttg ctcagaccag attctgtttc ttggccagga acgaaaggaa 5400 gggttgctgc cgatgcatga ttgcttcctc gatgaacgca gattcgaaat gtattctact 5460 gtttgagttt cttgttcgtc acacactgta ccaaactgta ttgtacccta tcataatttc 5520 tgctcggtac ctctctgtac tgctggtacc aaactgtatt gtactctgtc atgatctgta 5580 ctagtctttg gtactgctgg tcaatagtcc tacgaattga tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5640 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 5658 <210> 24 <211> 4279 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220> <221> promoter <222> (1)..(4279) <223> HvRAF promoter <400> 24 cctgctcatg catcatttgt gttgttgcat cgtgtggtga atttcgtgta ttgatttgtg 60 tttccggttt gcttcgtctc gatagagttc cgcaagcgtg tcggattgtg tggacccgtt 120 cgactacgtc agttcgtcta cttcacggag gcattcttct tccaagcggg atctcaggca 180 agatgatcat ttccccagat accattacta taattgccat gctagtttta ccgcttctat 240 cgttatgtct cgttcctacc acatgttaaa tatcagcctc tcaacaatgc cttgaaacct 300 tcaacctgtt caacctagca aaccactgat tggctatgtt actgcttgct taaccctgtt 360 gatagcgttg ctagttgcag gtgcagatgc ttccatgtga atacatgtat tccttgttat 420 atcaccatat taaatgctat ttaatttaat gcaactatat acttggtaaa acgtggaagg 480 ctcggccttt ctagcctagt gttttgttcc acctttgccc ccttagtttc ggctaccggt 540 gttatgttcc ataaatgagc gctcctaaca cgatcggggt tgttatgggg acccccttga 600 taattcgttt tagattaaag ctggtctggc aaggcccaac tttggtacta catttgccta 660 ataacctaat aataatgcat agggacccgc cggcacccgc ggactatttt aatcaacccc 720 cgggccagtg ctcctcatga gtgttggtcc cacctgagcg atgtccggca cccctctggt 780 cacccagagg tttagcgatc ccgacgtcta gctcatccgt catgtcctga gaacgaggta 840 cgcgactcct atcgggatcg tcgacacatc gggcggcctt gctggattag ttttaccttt 900 gacgagatat cttgtgcatg gggattccgg tgatgctttg ggtaatctca gagttgaggt 960 tttccactag ggaatccgac gagatcgcga gcttcgtgat ggaggatttc tatgcggctt 1020 gtggtaattt gtgatggact agttggagca cccctgcagg gttaaatctt tcggaaagcc 1080 gtgcccgcgg ttatgtggca acgtggaaac tttgtttaac actggttaaa gataacttga 1140 agttaactta attaaaactt gccaactgtg tgcgtaaccg tgactgtctc cttcgtgagt 1200 tcttactccg atcgaggaca cggtggggtt atgtctgacg taggtaggtg ttcaggatca 1260 gtcatttgat catgagtagt tcacgtccgt tatgcataga tcttccccct cttatttctt 1320 gtactcgtaa gttagccacc aaatatatgc ttagccgctg ttgcaacctc accacttaac 1380 catgcctcac ccattaagct ttgctagtct tgataccttt ggaaatgaga ttgttgagtc 1440 ccctgtggct cacagattac tacaacacca gttgcaggta caggtaaagg ttactcgacg 1500 tgagcgcgtt gattgttcat ttggagttgc ttcttcttct tcttcatcga tctaggatgg 1560 gttccaggcc gacagcctgg gatagcaagg atgaacgtcg ttcttctttt gtcgtttgtg 1620 ttcatccgta gtcggaccct ctcttactct tgatgaatat gtaatgtact gatgtgattc 1680 tgatgtggct tgtggcgagt gtaagccaac cctctattta tatctcttct tttcagtaca 1740 tgtacttgta acgatatcca ttcttgtgac acgacgagat gcgcttctaa ccctgacgag 1800 gccctcgtgc caaatggtta ggagagtggt tatagcccaa gccagtcgca tcccatattt 1860 aatgctctgt gtctcatttc tattgcttat aattttagtg ggcaacaata tcactaatgt 1920 ccctattagt ggtgaggtgt ctacaatgaa tatttccaat cctaaaagac tatgactctg 1980 gtgttcagtg cccattgtgt gtgtatgtga gtaaatggat tagctgatta atgtttgaca 2040 cattttatac acaaggtcaa tctacattgg atcaagaaaa tgttgagaaa gagtaaaacc 2100 caaggcttat gagtgttgtt gttgttgaag caccccatgc atgattagag acaaggagaa 2160 agtgtgttat gaagaagatg atttttttta aaggagatgc atgcttagag aaattaaggt 2220 tagctagccg actaatccta ctaaaagtaa tacttgatta ttgtcgtttc aattaaaaaa 2280 ataccttgat tattgctgtt ccggttcgac gtcattggtc aagtaatcaa tcagtgatat 2340 caattaggtt aggcctaact aatacaagtg gtcgtccatt tctttctggg tctaggctcg 2400 atcatttgcg gagctgagcc aagtggctcg cacaagttca tgtatcagga aaaagttgag 2460 ctattcacgc gccaaattgt gtgttcctcc ttgccacgta gttgtgccgt gtcattcggc 2520 agctgactgt tgtgttcctg gcttcctgcc acctggcatc atgtgatgcc acctcagttg 2580 ttgagtcgtc caatgtaccg gttccctgtc aaccgagaaa atcggctatt tgccactttt 2640 aatattgggc ttctcaaaat tgccactctc aagattggtt tcgtaaaaat gtcatccaac 2700 ccatgtgtac tttgattaca atgccatttc ctctttttca atgctttcct ttttcttttc 2760 ccatttccca acatctgaag ggaccaatat acccctagcc tatgcacatg tactagtttt 2820 ttgcatccaa cttgaaacaa cgccgttgag cgcccgccgt cggccgagat caccgcatac 2880 agttcgccaa gccctcctct ggtcctcccc catgatccat cagctcttct acctgcacat 2940 tgtagggctg ctcctgcttg ccgattgctt ggaagtgggc tgccgattgg ctggacatcg 3000 cgtgtcacag gttgcctgga cgccatgcgc ccacgcgcct cttatcgaca ctctgcgtca 3060 tctatctcta ggtatcgcag tggaatggaa ctcaatcctt ctacacagta ttcttctatc 3120 tgtaccttcg aatatgccat tacttgtgtt aacctgcaca tcagagacaa ctagtagaag 3180 tatacaaggg aaattttaga atatgtaaat tctattctgc atggttcatt tagaatgatg 3240 tcatgttctc ctacaacttg atgatttgtt ctaccttggt ggtgttatgt acatgtcatt 3300 gataccacat tacattcagg caaactgtag cgaatcttct gaatatatgt tcaacaatat 3360 gaaaatgaga agcaacgtgt tcatttcatt gtataacaca catacatgca gacgccttgc 3420 tttcttgttg ggagaggata catcttcaca agcaacaaca acaactacag aggatgtcca 3480 ctacagctcc aacaaagaag ttgactccaa aaagaaagct aaaaattgaa attggatgaa 3540 cgatctctac gaaattgatg ctatagttat ttgaggaagt tgaatactcc cttcgttaat 3600 aaacttgaac atctaggtta cctgcatgtt cctgcctcac ctctctagca tgtcacacga 3660 cgagctgcgc tagcgcacat gcacggatga gctgcggttg ctcgcgggca tggccggcaa 3720 gctatacgac ggctcgtgca aatgtggacg agcaccaacg gcgagctccg ccgtcgcgca 3780 caggcttggg tgagcaacgg tgggtggtgg cgaactgcag ttgctggtgc aggcgttggc 3840 aagctagggc ggcgagctgc gatgcctcgc actggcatca gcgagctacg gcgacgggct 3900 ttggtggaga acgaaacacc tcacagaccc aaccaatcca cacaggcgtg agataaggtt 3960 gaattatcca ggggtatttt ggtcccttca ggtgccagga aatggaaaaa gaaaaagaaa 4020 accaataaaa aagagaaaat ggcatgttaa tcaaagtgca atcaaactga gtggcacttt 4080 tacgcagcca atcttaagag tggcaatttt gagaagccga gtattgaaaa tggtaaataa 4140 ccaattttct cctgccaacc acacgacaca cacgatcgtc ttggtcagct agcttgcgtt 4200 tataagtagg cgcagctccg tctctcggtg accaacacaa gacgtgagag aagaaagcgc 4260 gagacaggaa gataaaaca 4279 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer HvAP2-gfp-F3(Bam) <400> 25 ggatccaatg tgtggcggcg ccatccta 28 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer HvAP2-gfp-R3(Bam) <400> 26 ggatccgcga agatgctgtc ggcggattc 29 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-Full-F <400> 27 gaattcatgt gtggcggcgc catcctag 28 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-Full-R <400> 28 ctgcagtcag aaaatggcgc tgtcc 25 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-C1 <400> 29 ctgcagcaga ggctgacggc gtccat 26 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-C2 <400> 30 ctgcaggaag atgctgtcgg cggattc 27 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-C3 <400> 31 ctgcaggcag gtcgaagtgg tcatcg 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-N1 <400> 32 gaattcgagg acttcgatga ccactt 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-N2 <400> 33 gaattcgagc tgatggagtt tttcaa 26 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HvAP2-acti-N3 <400> 34 gaattcgccc tcagcgtgga cagtg 25 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(14) <223> transcriptional activation domain <400> 35 Ala Leu Ser Val Asp Ser Gly Met Asp Ala Val Ser Leu Trp 1 5 10 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 36 gccctcagcg tggacagtgg catggacgcc gtcagcctct gg 42 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer PDF1.2 <400> 37 atggctaagt ttgcttccat c 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer PDF1.2 <400> 38 aatacacacc atttagcacc a 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer PR1 <400> 39 atgaatttta ctggctattc t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer PR1 <400> 40 gtatggcttc tcgttcacat a 21 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer AtRP5 <400> 41 ccagtattca cattctcttc ttcgt 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer AtRP5 <400> 42 gtggttttat ccccatcttt acatt 25 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer COR6.6 <400> 43 tgagaggaga agagcaatgt 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisens primer COR6.6 <400> 44 tgtccttcac gaagttaaca c 21 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer GSH1 <400> 45 gaatgggaaa aagtaatgga aggtg 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisens primer GSH1 <400> 46 ctctgggaat attgttgtca gatgg 25 <210> 47 <211> 334 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 47 Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Glu Phe Ile Pro Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Thr Lys Arg Val Thr Ala Ser His Leu Trp Pro Ala 20 25 30 Gly Ser Lys Asn Ala Ala Arg Gly Lys Ser Lys Ser Lys Arg Gln Gln 35 40 45 Arg Ser Phe Ala Asp Val Asp Asp Phe Glu Ala Ala Phe Glu Gln Phe 50 55 60 Asp Asp Asp Ser Asp Phe Asp Asp Ala Glu Glu Glu Asp Glu Gly His 65 70 75 80 Phe Val Phe Ala Ser Lys Ser Arg Val Val Ala Gly His Asp Gly Arg 85 90 95 Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ser Lys Lys Lys Arg Gly Arg His Phe Arg 100 105 110 Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp 115 120 125 Pro His Lys Gly Thr Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Pro Glu 130 135 140 Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Val Glu Ala Arg Arg Leu Arg Gly Ser 145 150 155 160 Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ala Arg Pro Arg 165 170 175 Arg Gly Asn Thr Arg Ala Thr Ala Val Pro Pro Pro Ala Thr Ala Pro 180 185 190 Ala Ala Ala Pro Pro Arg Gly Leu Lys Arg Glu Phe Ser Pro Pro Ala 195 200 205 Glu Thr Ala Leu Pro Phe Phe Thr Asn Gly Phe Val Asp Leu Thr Thr 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Pro Pro Ala Met Met Met Thr Ser Ser Phe Thr Asp 225 230 235 240 Ser Val Ala Thr Ser Glu Ser Gly Gly Ser Pro Ala Lys Lys Ala Arg 245 250 255 Ser Asp Asp Val Asp Ser Ser Glu Gly Ser Val Gly Gly Gly Ser Asp 260 265 270 Thr Leu Gly Phe Thr Asp Glu Leu Glu Phe Asp Pro Phe Met Leu Phe 275 280 285 Gln Leu Pro Tyr Ser Asp Gly Tyr Glu Ser Ile Asp Ser Leu Phe Ala 290 295 300 Ala Gly Asp Ala Asn Ser Ala Asn Thr Asp Met Asn Ala Gly Val Asn 305 310 315 320 Leu Trp Ser Phe Asp Asp Phe Pro Ile Asp Gly Ala Leu Phe 325 330

Claims

서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 환경 스트레스 저항성 전사인자 단백질.
제1항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 전사인자 단백질.
제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스가 병원균, 고농도의 염, 저온 및 산화에 의한 스트레스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 전사인자 단백질.
제1항 또는 제2항의 전사인자 단백질을 암호화하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 23으로 이루어진 유전자.
서열번호 24의 염기서열로 이루어진 제4항의 전사인자 유전자의 프로모터.
제4항의 전사인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 서열번호 24의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아.
제4항의 전사인자 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 방법.
제13항에 있어서, 상기 단자엽 식물이 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물이 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 환경 스트레스가 병원균, 고농도의 염, 저온 및 산화에 의한 스트레스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제4항의 전사인자 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입한 다음 조직배양을 통해 재분화시킨 환경 스트레스 저항성 식물체.
제17항에 있어서, 상기 환경 스트레스가 병원균, 고농도의 염, 저온 및 산화에 의한 스트레스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 식물체.
제17항의 식물로부터 유도된 환경 스트레스 저항성이 증가된 식물 세포 또는 종자.