KR20200063569A - 고온 내성 관련 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온 스트레스 저항성 관련 유전자 및 저항성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 BrNAC25 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 식물세포를 형질전환하여 BrNAC25 유전자를 발현시켜 고온 스트레스에 저항성을 가지는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 식물체를 이용하면 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.

Description

고온 내성 관련 유전자 및 이의 용도{Gene implicated in high temperature stress tolerance and use thereof}

본 발명은 고온 내성 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

농업은 타산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성을 가지고 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물이 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 고온, 냉해, 한발 및 염에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다. 고온, 냉해, 한발 및 염은 수분스트레스에 의해 유발되고 상호관련 되어 있으며, 저온에 의하여 발현이 유도되는 유전자는 종종 고온, 삼투 및 염에 의해서도 그 발현이 야기되기도 한다.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(‘95～’04)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천ha로, 우리나라 총경지면적 1,836 천ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 작물의 고온 내성 증진방법에 관해 연구를 하던 중, 배추 유래 한 유전자가 식물체의 내고온성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허공개공보 10-2013-0113035 A (2013.10.15)

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 고온 스트레스 저항성 유전자 및 이를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질을 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 고온 스트레스 저항성 식물체의 제조방법 및 식물체의 고온 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 고온 스트레스 저항성 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 배추(Brassica rapa) 유래의 NAC transcription factor 25 (BrNAC25) 유전자를 의미할 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrNAC25 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrNAC25 단백질로 발현될 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질이 식물체 내에서 고온 스트레스 저항성을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 구체적으로 식물체의 고온 스트레스 저항성을 증진시키는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrNAC25 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것이 바람직하며, 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시발현(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시발현 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시발현 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 CaMV 35S 프로모터가 포함된 벡터 pB2GW7에 BrNAC25 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 "식물체"는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 고온 스트레스 저항성 식물체를 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 고온 스트레스 저항성 식물체는 BrNAC25 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, BrNAC25 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 꽃에 분사시켜 형질전환시켰다. 그 다음, 제초제에 살아남는 개체를 선발하여 고온 스트레스 저항성 식물체를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrNAC25 단백질의 세포 내 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 BrNAC25 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 BrNAC25 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 BrNAC25 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 발현시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.

상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함999된다.

상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 BrNAC25 유전자 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrNAC25 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 BrNAC25 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.

상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 고온 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrNAC25의 활성에 직접관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrNAC25의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과의 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrNAC25 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 배추 유래 BrNAC25 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.

또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 단백질의 활성, 즉, 고온 스트레스에 대한 저항성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 제조한 고온 스트레스 저항성이 증진된 BrNAC25 유전자 발현 형질전환 개체는 비형질전환체(야생형)와 비교하여 비정상적 성장 또는 발달이 관찰되지 않았으므로, 기타 형질에는 변화 없이 고온 스트레스 저항성만이 증진된 식물체를 얻을 수 있어 유용하다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따라 제조한 BrNAC25 발현 애기장대 식물체에 대하여 고온 스트레스 조건에서의 생존률을 측정하였다. 검정 결과, BrNAC25 발현 애기장대에서 대조군과 비교하여 생존률이 증가한 것으로 보아, BrNAC25 유전자는 고온에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서, 식물체 방어 시스템에서 BrNAC25 의 기능을 실험하기 위하여, BrNAC25 발현 애기장대 식물체에 RT-PCR을 수행하고, 식물체 저항성 관련 유전자의 발현 패턴에 대한 BrNAC25 발현의 효과를 검정하였다. 그 결과, BrNAC25 발현 개체에서 스트레스-반응성 유전자들의 발현이 강력하게 유도되었으므로, BrNAC25 은 스트레스 저항성 마커 유전자의 발현과 관련이 있음을 확인하였다.

본 발명은 식물체에서 고온 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 이상 기후로 인한 고온에 적응하는 작물재배로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.

도 1은 BrNAC25 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 배추 BrNAC25와 NAC25 유전자를 포함하는 다른 작물의 아미노산 서열의 상동성 분석 결과이다. B343: B. rapa NAC25 (XP_009113148.1), BnNAC25: B. napus NAC25 (XP_022573783.1), BoNAC25: B. oleracea NAC25 (XP_013631916.1), RsNAC25: R. sativus NAC25 (XP_018478475.1), EsNAC25: E. salsugineum NAC25 (XP_006405598.1), CaNAC25: C. sativa NAC25 (XP_010473311.1), AlNAC25: A. lyrata NAC25 (XP_020872961.1), AtNAC25: A. thaliana NAC25 (OAO93865.1).
도 3은 배추 BrNAC25 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터의 모식도이다. 35SP: CaMV 35S 프로모터, B343: BrNAC25, T35S: CaMV 35S 터미네이터, Bar: 제초제 저항성 유전자
도 4는 형질전환체에서 Genomic DNA PCR로 유전자 도입을 확인한 결과이다. M: 마커, Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 5는 BrNAC25 형질전환 애기장대 고온 내성을 검정한 결과이다. Wt: 비형질전환체, #2-1-1, #3-4-2, #5-4-1: 형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 6은 고온 내성을 나타내는 형질전환체에서 온도 관련 유전자 발현을 확인한 결과이다. B343: BrNAC25, CYP71B: cytochrome P450 cytochrome P450 family 71 subfamily B polypeptide 21, HSP18.1: heat shock protein 18.1 TCH4: touch-induced 4, UK39: Unknown39, DREB2C: dehydration-responsive element-binding protein 2C, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실시예 1> 배추 유래 BrNAC25 유전자 분리 및 발현 벡터의 제작

<1-1> 배추 유래 BrNAC25 유전자 분리

배추 생장발달 및 환경, 스트레스 처리 후에 유전자 은행을 제작하였다. 이로부터 구축된 EST 정보로부터 cDNA 클론이 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며 특이적 발현을 나타내고 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 약 300개의 배추 고유 유전자 중에서 BrNAC25 을 선발하였다.

선발된 배추 유전자의 아미노산 서열을 분석하여 본 결과 단백질 합성을 위한 ATG 시작 코돈부터 TAA 종결코돈까지 약 969개의 염기로부터 번역된 322개의 폴리펩티드로 구성된 구조를 가지고 있으며 NAC domain을 갖고 있는 NAC25 유전자 (Genebank ID XP_009113148.1)로 확인되었다(도 1). 다른 식물 7종의 NAC25 아미노산 서열들을 비교 분석한 결과 94.1-99.7%의 높은 상동성을 나타내고 있으며 NAC (NAM-no apical meristem, ATAF1/2 and CUC2) domain이 잘 보존되어 있었다(도 2).

<1-2> 배추 BrNAC25 유전자의 발현 벡터의 제작

게이트웨이 시스템을 이용해서 선발된 BrNAC25 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다. 최종운반체 (pB2GW7)에 삽입하기 위해 필요한 특정 서열(attB sequence)은 PCR을 통해서 얻었다. 위치 특이 재조합(site-specific recombination)을 위해 유전자에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 29bp로 PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부(12bp)만을 gene specific sequence (GSP)에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 시행하였다. 첫 번째 PCR은 B343B1 프라이머(5‘- AAAAAGCAGGCTATGGAAAACATGGGGGA-3’; 서열번호 3) 및 B343B2 프라이머 (5‘-AGAAAGCTGGGTTTATGGGTGCCAGTTCA-3’; 서열번호 4)를 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 68℃ 1분의 10회; 및 68℃ 10분의 조건으로 수행하였다. 이 PCR 반응액의 1/10을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 attB1(5‘-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’; 서열번호 5) 과 attB2(5‘-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3’; 서열번호 6)를 프라이머로 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 1분의 5회; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분의 25회; 및 68℃ 10분의 조건으로 두 번째 PCR을 하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제하여 사용하였다. 따라서 이 PCR 산물은 attB 서열을 모두 갖게 되어 이것을 형질전환용 벡터 제작에 사용했다. 게이트웨이 시스템은 크게 BP 반응과 LR 반응으로 나눌 수 있는데, attB 서열을 가지고 있는 BrNAC25 유전자의 PCR 산물을 pDNOR 벡터(invitrogen)와 먼저 BP 반응을 시켜 중간 벡터를 만들었고, 이 산물을 최종 운반체와 LR 반응을 하여 원하는 최종 형질전환용 벡터를 얻었다(도 3).

<실시예 2> 배추 BrNAC25 유전자 발현 형질전환체 제작 및 발현 검정

본 발명자들은 실시예 1-2에서 제작한 벡터의 식물에서의 발현을 확인하기 위하여 애기장대에 형질전환하였다.

구체적으로, 제작된 벡터를 애기장대에 도입하기 위하여 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉동/해동을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열 쇼크(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 스펙티노마이신(spectinomycin) 50 ㎎/ℓ, 리팜피신(rifampicin) 50 ㎎/ℓ, 젠타마이신(gentamycin) 25 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28 ℃에서 3-4일 정도 배양하였다. 형성된 콜로니 중 형질전환된 콜로니를 애기장대 형질전환에 사용하였다. 상기에서 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101를 아그로박테리움 GV3101:pB343로 명명하였다.

제조한 pB343 재조합 발현벡터를 포함한 아그로박테리움 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 23℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시킨다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도한다. pB343 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주를 항생제가 포함된 5㎖의 LB배지에서 48시간 동안 배양한 후 5% sucrose와 0.05% silwet L-77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조한다. 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 동일한 방법으로 2회 형질전환을 반복한다. 이 후, 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 파종하여 생육 2주째 1차, 4주째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 형질전환체를 선발하여 같은 조건으로 생육시킨 후 후대종자를 확보하였다. 수확한 형질전환 애기장대 종자를 25㎍/㎖ 포스피노트리신 (DL-phophinothricin)이 포함된 MS배지에 파종하여 멘델의 유전법칙에 의한 잡종 제 2대의 분리비가 약 3 (항생제 저항): 1 (항생제 민감)로 나타나는 형질전환체를 선발하여 다음의 실험에 사용하였다.

Genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해 BrNAC25 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다. 형질전환 애기장대 식물체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였다(DNeasy Plant Kit, Qiagene). 분리된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 유전자 특이 프라이머B343F (5'- ATGGAAAACATGGGGGATTCGACC-3 ; 서열번호 7) 및 프라이머 B343R (5'- TTATGGGTGCCAGTTCATGTTAGGG-3' ; 서열번호 8)을 이용하여 PCR(95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 35 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다.

형질전환체에 도입된 유전자 발현을 확인하기 위해 3 주간 재배한 형질전환 식물체의 잎을 채취한 후 즉시 액체질소에 얼려 막자사발로 마쇄하였다. 마쇄한 시료로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해서 total RNA를 분리 하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석을 위해 역전사 효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo)를 이용하여 total RNA 2 μg을 cDNA 라이브러리로 제작하고 3배 희석하여 2 μl를 PCR 증폭에 사용하였다. 유전자 특이 프라이머 B343F(서열번호 7)와 B343R(서열번호 8)를 이용하여 PCR (95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 25 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 유전자 발현을 확인하였고 DNA 염기서열 분석을 통해 도입된 유전자의 발현을 최종 확인 하였다. Actin 유전자 발현 수준은 정량적 대조군으로 사용되었으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.

그 결과, 비형질전환체에서는 BrNAC25 이 발현되지 않는 반면에, 형질전환체에서는 BrNAC25가 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 4).

<실시예 3> BrNAC25 발현 형질전환체의 고온 스트레스 저항성 검정

본 발명자들은 실시예 2에서 제작한 BrNAC25 유전자 발현 애기장대의 고온 스트레스에 대한 저항성을 확인하였다.

표면 살균한 형질전환 애기장대 종자를 1/2 MS 배지(MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite)에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파를 위해 저온처리를 하였다. 저온처리 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 4일간 배양하였다. 4일 자란 유묘가 포함된 Petri-dish를 45℃ 수조에 담구고 90분간 열처리를 하였다. 열처리한 Petri-dish를 23℃ 생장상으로 옮겨 10일 동안 회복시킨 후 생존비율을 측정하였다.

그 결과 비형질전환체는 거의 살아남지 못했으나 형질전환체는 생존율이 90%였다(도 5).

<실시예 4> BrNAC25 유전자의 발현에 따른 형질전환체 내 고온 내성 관련 유전자의 발현 분석

21일 생장한 형질전환 애기장대 5번째 잎에서 total RNA분리 후 애기장대 내부 고온 내성 관련 유전자들의 발현양상을 RT-PCR로 분석 하였다.

구체적으로, 형질전환 식물체에서 고온 스트레스 관련 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 21일 자란 형질전환 식물체의 5번째 잎으로부터 Trizol을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 (앞의 방법과 동일) 고온 내성 관련 유전자 특이 프라이머들(표 1)을 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. Semi-quantitative RT-PCR 결과로부터 Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html)을 이용하여 상대적 발현 수준을 측정하였으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.

내 고온성 관련 유전자 특이 프라이머 서열

유전자	AGI No.	프리이머 서열	예상 size (bp)
CYP71B2-1	At1g13080	5’-ATGACGATCTTGCTCTGTTTCTTC-3’(서열번호 9) 정방향	509
		5’-TCAATAACGTTGAACAGGCACAAG-3’(서열번호 10) 역방향
HSP18.1	At5g59720	5’-TCTCCCGAAAAGCAACGAA-3’(서열번호 11) 정방향	366
		5’-CATAAACTTCCCACTAGCTC-3’(서열번호 12) 역방향
TCH4	At5g57560	5’-ATGGCGATCACTTACTTGCTTCCTC-3’(서열번호 13) 정방향	864
		5’-TTACTCTCTCTATGCAGCTAAGCAC-3’(서열번호 14) 역방향
Unknown39	At3g60520	5’-ATGGTGGATCTTGAAAGAAGAGTG-3’서열번호 15)정방향	390
		5’-CTAACACATAACATCCTTGAGAAG-3’(서열번호 16) 역방향
DREB2C	At2g40340	5’-GGAGACTTTGGATGCTTG-3’(서열번호 17) 정방향	367
		5’-TTATGTAGATCCATGAACATCTTTG-3’(서열번호 18) 역방향

그 결과, 고온 스트레스 반응 경로에서 고온에서 세포내 단백질을 보호하는 기능을 가진 HSP18 .1 (heat shock protein 18.1) 유전자와 세포내 산화환원 효소 활성 기능을 가지는 CYP71B (cytochrome P450 cytochrome P450 family 71 subfamily B polypeptide 21) 유전자 발현이 증가하였다(도 6).

이 결과로 부터 배추 BrNAC25 유전자는 고온 스트레스에서 세포내 단백질의 보호 및 산화환원 효소 활성 관련 유전자의 발현 조절을 통해 내고온성을 증가시키는 것으로 예측 되었다.

<110> Republic of Korea <120> Gene implicated in high temperature stress tolerance and use thereof <130> P18R12C1140 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 atggaaaaca tgggggattc gaccataggg ccgggtcatc cgcatcttcc tcccgggttt 60 cggtttcacc cgaccgacga agaacttgta gttcattacc tcaagaagaa agctgcttct 120 attccactac cggtctcaat catcgccgag attgatcttt acaagtttga tccttgggag 180 cttccaagca aggcgagttt tggagaacaa gagtggtact tctttagtcc tagagatcgg 240 aagtatccca atggggttag gccgaatcgg gcagcaactt ctggttactg gaaagccacg 300 ggaaccgata aaccaatatt tacgtgcaat agtcacaagg ttggggtcaa gaaagcgctt 360 gtgttctatg gtggaaaacc tcctaaaggg attaaaactg attggatcat gcatgaatat 420 cgcctcactg atggtaacct taacaccgct gctaagccac ccgactcaac cacgtcaagg 480 aaaaactcac tacggctaga cgattgggtt ctttgtagga tctataagaa gaatagttca 540 caaagaccaa caatggagag agtattacta agagaagatc tcatggaagg aatgctctca 600 aaatcatctg ctaattcatc ttccacatcg gtcttagaca acaacaacaa caataataat 660 aacgaagaac actttttcga tggtatggcc gtttcttcag acaaacgttc cttgtgtggt 720 cagtatcgta taggtcatga ggcctctgga tcatcttctt tcgggtcctt cttatcgagc 780 aagaggttcc atcatacgag tgatatcaat aatgacaact acaatgtctc atttgtctcg 840 atgcttagtg aaattcctca gagttcaggg tttcatggaa atggagtcat cgatacgatg 900 tcgactctag ctgatcatgg ggttttaaga caggcgtttc agctccctaa catgaactgg 960 cacccataa 969 <210> 2 <211> 322 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Glu Asn Met Gly Asp Ser Thr Ile Gly Pro Gly His Pro His Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His 20 25 30 Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Ala Ser Ile Pro Leu Pro Val Ser Ile Ile 35 40 45 Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Ala Ser Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg 65 70 75 80 Lys Tyr Pro Asn Gly Val Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly Tyr 85 90 95 Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Ile Phe Thr Cys Asn Ser His 100 105 110 Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys Pro Pro 115 120 125 Lys Gly Ile Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Leu Asn Thr Ala Ala Lys Pro Pro Asp Ser Thr Thr Ser Arg 145 150 155 160 Lys Asn Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Lys Asn Ser Ser Gln Arg Pro Thr Met Glu Arg Val Leu Leu Arg Glu 180 185 190 Asp Leu Met Glu Gly Met Leu Ser Lys Ser Ser Ala Asn Ser Ser Ser 195 200 205 Thr Ser Val Leu Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Glu Glu His 210 215 220 Phe Phe Asp Gly Met Ala Val Ser Ser Asp Lys Arg Ser Leu Cys Gly 225 230 235 240 Gln Tyr Arg Ile Gly His Glu Ala Ser Gly Ser Ser Ser Phe Gly Ser 245 250 255 Phe Leu Ser Ser Lys Arg Phe His His Thr Ser Asp Ile Asn Asn Asp 260 265 270 Asn Tyr Asn Val Ser Phe Val Ser Met Leu Ser Glu Ile Pro Gln Ser 275 280 285 Ser Gly Phe His Gly Asn Gly Val Ile Asp Thr Met Ser Thr Leu Ala 290 295 300 Asp His Gly Val Leu Arg Gln Ala Phe Gln Leu Pro Asn Met Asn Trp 305 310 315 320 His Pro <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B343B1 <400> 3 aaaaagcagg ctatggaaaa catggggga 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B343B2 <400> 4 agaaagctgg gtttatgggt gccagttca 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 6 acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B343F <400> 7 atggaaaaca tgggggattc gacc 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B343R <400> 8 ttatgggtgc cagttcatgt taggg 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP71B2-1 F <400> 9 atgacgatct tgctctgttt cttc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP71B2-1 R <400> 10 tcaataacgt tgaacaggca caag 24 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP18.1 F <400> 11 tctcccgaaa agcaacgaa 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP18.1 R <400> 12 cataaacttc ccactagctc 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCH4 F <400> 13 atggcgatca cttacttgct tcctc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCH4 R <400> 14 ttactctctc tatgcagcta agcac 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unknown39 F <400> 15 atggtggatc ttgaaagaag agtg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unknown39 R <400> 16 ctaacacata acatccttga gaag 24 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2C F <400> 17 ggagactttg gatgcttg 18 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2C R <400> 18 ttatgtagat ccatgaacat ctttg 25

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물.
   
2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 식물체의 고온 스트레스 저항성 유도용 조성물.
   
4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 상기 유전자의 발현이 유도된, 고온 스트레스 저항성 형질전환 식물체.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
6. 1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
   2) 상기 1) 단계에서 제조된 벡터로 형질전환된 식물 형질전환세포를 제조하는 단계; 및
   3) 상기 2) 단계에서 제조된 식물 형질전환세포로 식물체를 제조하는 단계; 를 포함하는 고온 스트레스 저항성 식물체의 제조방법.
   
7. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것인 식물체의 고온 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
   

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