CN103361323B - 水稻ssg基因在提高植物耐盐性上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻ssg基因在提高植物耐盐性上的应用。水稻ssg基因编码序列表SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质，其cDNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。水稻ssg基因具有提高植物耐盐性的功能，利用该基因转化模式植物拟南芥，可提高拟南芥幼苗对盐胁迫的耐受性。

Description

水稻ssg基因在提高植物耐盐性上的应用

技术领域

本发明涉及植物耐盐相关基因，特别涉及一个来源于水稻的与耐盐性相关的蛋白激酶相关基因及其在培育耐盐性植物中的应用。

背景技术

随着人口增加、社会经济发展，农业生产日益受到重视。由于自然气候条件变化，水资源短缺、土壤盐碱荒漠化的形势日益加剧，对作物抗逆性的研究备受重视。抗逆性已成为评价优良作物品种的重要指标之一，因此发掘这类基因对于育种改良具有重要意义。

植物在干旱、高盐、低温等逆境胁迫下，会产生复杂的信号传导过程，包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、各种转录因子、Ca²⁺及钙调素等参与的各种信号传导途径，使得植物体内出现一些新合成或合成增强的蛋白质。同时，植物在逆境胁迫下，还会引起渗透胁迫。参与渗透调节有关的小分子有机质包括三类：氨基酸类、糖类和醇类。

其中，蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用是相反的，分别催化蛋白质磷酸化与去磷酸化；而蛋白质的磷酸化与去磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节机制，参与了如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放等等过程，几乎涉及了所有的生理及病理过程。

植物蛋白磷酸化与去磷酸化的研究起步较晚，但随着越来越多蛋白激酶类型的发现，由蛋白激酶所催化的蛋白磷酸化在植物的信号传导过程中的作用显得越来越重要。蛋白激酶是将磷酸基团转移到特定底物蛋白的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化的一类磷酸转移酶；这类酶以ATP或GTP作为磷酸基团的供体，而受体通常是蛋白质中的丝氢酸、苏氨酸或酪氨酸。真核生物蛋白激酶在功能结构域附近的氨基酸序列高度保守，保守序列折叠形成核心催化结构。蛋白激酶对于其作用的底物蛋白中氨基酸残基的磷酸化是有选择性的，往往只使特定的残基磷酸化，这种选择性取决于蛋白激酶可以识别的一个保守序列，蛋白激酶对靶位点的识别由其附近的蛋白质一级结构所决定。真核生物中发现的蛋白激酶很多，根据催化区域氨基酸序列的相似性，植物蛋白激酶可分为5类：蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白组氨酸激酶、蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基/谷氨酰基激酶。目前植物中发现的蛋白激酶以前3类为主。而与逆境信号传递关系最密切的主要有分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶(CDPK)、受体蛋白激酶(RPK)、核糖体蛋白激酶、转录调控蛋白激酶。

蛋白激酶依赖于胞内信使，在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用，协助完成信号传递过程。目前已发现在真核细胞内有400多种蛋白激酶，它们催化多种功能蛋白，如酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等。蛋白激酶和蛋白磷酸酶作为第二信使下游作用的靶分子而与刺激信号引起的特定生理效应密切相关。功能蛋白通过磷酸化和去磷酸化，发生构象互变，导致功能蛋白的活性、性质的改变，从而调节细胞各个生命话动过程。参与环境胁迫信号的传递是蛋白激酶的重要功能之一。

水稻是世界三大重要粮食作物之一，干旱及盐胁迫是水稻的重要危害。因此，进行水稻的抗旱耐盐研究，培育具有抗旱耐盐特性的水稻品种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个与耐盐相关的蛋白及其编码基因，以用于培育耐盐性植物。

本发明所提供的耐盐性相关蛋白命名为Os-SSG，来源于稻属水稻(Oryza sativa)，编码下述氨基酸序列(i)或(ii)所示的蛋白质：

(i)序列表中的SEQ ID NO：1；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐盐性的功能。

序列表中的SEQ ID No：1序列由169个氨基酸残基组成，在第1-75位氨基酸残基范围内具有蛋白激酶的保守结构域，是一个TPK(即酪氨酸蛋白激酶)功能结构域。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白。通过在植物中表达所述蛋白，并测试这些植物的耐盐性，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有提高植物耐盐性的功能。

本发明的耐盐性相关蛋白Os-SSG的编码基因命名为Os-ssg，可以是该基因的cDNA序列，也可以是该基因的基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。序列表中SEQ ID NO：2所示为该基因的cDNA序列。

序列表中的SEQ ID NO：2由510个核苷酸残基组成，编码序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增Os-ssg中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐盐性的方法。

本发明所提供的提高植物耐盐性的方法，是将所述与耐盐性功能相关的基因导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得耐盐性提高的转基因植物。

在上述提高植物耐盐性的方法中，本发明水稻与耐盐性相关基因Os-ssg既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组DNA序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐盐性相关基因Os-ssg或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如GatewayTW系列载体(如pK2GW7等)、pBin系列载体(如pBin 19等)、pJim系列载体(如pJim 19等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明水稻与耐盐性相关基因Os-ssg或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

携带有编码本发明水稻与耐盐性相关的基因Os-ssg或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明水稻与耐盐性相关基因Os-ssg或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的抗逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明提供了一个来源于水稻，与耐盐性相关的蛋白激酶基因Os-ssg。实验证明，将本发明的基因转化模式植物拟南芥，可提高拟南芥幼苗对盐胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物抗逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关的性状改良具有重要的理论及应用意义，将在植物的抗逆基因工程改良中发挥重要作用，有广阔的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中分子生物学相关实验所用方法均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1、基因序列的获得

从日本RIKEN BioResource Center(BRC)购得含有编号为AK060019序列的DNA，该段DNA含有SEQ ID No.2所述序列，命名为Os-ssg-s。

2、Os-ssg-s基因序列的扩增及序列分析

根据RIKEN BioResource Center(BRC)提供的序列的编码区设计引物，通过PCR方法扩增获得Os-ssg-s，引物序列如下

正向引物：5’-caccaagctt-atgtacgggaaggtg-3’(SEQ IDNo.3)

反向引物：5’-cgcactagt-tcaatcgaagctgga-3’(SEQ IDNo.4)

具体条件为25μL PCR反应体系中：正反向引物(10uM)各1μl，模板1μl，2×Pfu PCRMaster Mix 12.5μl，H₂O 9.5μl。PCR反应条件为：预热95℃预变性4min，然后95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小为529bp的DNA片段。上述2×Pfu PCR Master Mix购买于天根生化科技(北京)有限公司。

回收并纯化上述PCR产物，将其连接到Gateway入门载体pENTER-TOPO中，再将连接产物用热激法转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，用含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并用前述引物进行PCR鉴定。鉴定后的阳性单菌落加入到3mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pENTER-TOPO-Os-ssg-s。对上述质粒进行测序，结果与RIKEN BioResource Center(BRC)发布的序列一致。上述pENTER-TOPO载体购买自Invitrogen公司。

3、Os-ssg-s基因转基因拟南芥的获得

通过gateway技术的LR反应将上述重组质粒pENTER-TOPO-Os-ssg-s中的Os-ssg-s片段亚克隆到植物表达载体pK2WG7(购买自比利时Ghent大学)中。LR反应体系为LRCLONASE ENZYME MIX 2μl、pK2WG7质粒DNA 2μl(约200ng)、pENTER-TOPO-Os-ssg-s质粒2μl(约200ng)、4μl H₂O，LR反应条件为室温放置3-4小时。然后，通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含有50mg/L壮观霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并用前述引物进行PCR鉴定。鉴定后的阳性单菌落加入到3mL含50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pK2GW7-OsS。

将植物表达载体pK2GW7-OsS通过冻融法转入到农杆菌Agrobacterium tumefaciensGV3101中，该农杆菌具有庆大霉素和利福平抗性。其步骤是：约1μg pK2GW7-OsS质粒加入农杆菌GV3101感受态中，冰浴5min，37℃水浴5min，置入液氮中5min，然后放入加入1mL LB液体培养基，放入28℃摇床中，220rpm恢复培养3-4h后，涂在含有10mg/L利福平、50mg/L庆大霉素、50mg/L壮观霉素的的LB固体培养基上，28℃温箱中生长2天以筛选阳性克隆，并用前述引物进行PCR鉴定。鉴定得到的阳性菌株可用于植物转化。

用花序浸染法(Floral Dip)将植物表达载体pK2GW7-OsS转化到拟南芥Columbia生态型的野生型植株中，得到转基因拟南芥植株。具体步骤如下：

1)挑取含有pK2GW7-OsS质粒的农杆菌单克隆，用10mL含有10mg/L利福平、50mg/L庆大霉素、50mg/L壮观霉素的液体LB培养基28℃、220rpm培养2天；

2)按1∶100的比例转接到200mL含相同抗生素的液体LB培养基中，28℃继续培养24小时；

3)在浸染前24小时，剪去拟南芥的长角果和已开放的花，只留下未开放的花苞，停止浇水；

4)3000rpm，室温离心10分钟，收集农杆菌菌体，倒掉上清，用100mL侵染培养基(MS粉2.2g，蔗糖50g和SillwetL-77 250μL，定容1L)重新悬浮；

5)将植物花序部分浸入农杆菌侵染液中，尽可能的让花苞浸入液面之下，侵染10min，在黑暗中放置24小时；

6)将植株正常放置，置于温室中16小时光照/8小时黑暗，温度22±2℃培养，直至结实。

收获的转基因种子经过消毒灭菌，铺在含有相应抗生素的1/2MS培养基上，筛选得到的抗性苗(T1代)移入土中继续生长。

4、转Os-ssg-s基因拟南芥幼苗耐盐性的测定

上述T1代小苗提取染色体DNA，进行外源基因Os-ssg-s的鉴定，鉴定有外源基因Os-ssg-s插入的小苗培养至结实，收集种子进行耐盐性的鉴定。将拟南芥种子消毒后铺在1/2MS培养基(MS粉2.2g，蔗糖10g，琼脂粉7g，pH5.7，定容1L)上，培养基中分别加入0mM、50mM、100mM NaCl，4℃春化2天后，16小时光照/8小时黑暗，温度22±2℃培养，培养9天后，观察幼苗萌发状况。

实验结果表明，在含有100mM NaCl的1/2MS培养基中，转基因拟南芥幼苗萌发率为89％，野生型(WT)为72％，转基因拟南芥幼苗萌发率大于野生型，说明水稻ssg基因在种子萌发期有一定抗盐作用。

Claims (8)

1.水稻ssg基因在提高植物耐盐性中的应用，所述水稻ssg基因编码氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示的蛋白质，所述植物为拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻ssg基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：2所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将所述水稻ssg基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐盐性提高的转基因植物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻ssg基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是pK2WG7。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，用所述水稻ssg基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，用所述水稻ssg基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述植物表达载体中加入选择性标记基因。