CN104450744B - 一种水稻SBP‑box转录因子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻SBP‑box转录因子基因及其应用。本发明具体涉及包含具有SEQ ID NO.1核苷酸序列及SEQ ID NO.2氨基酸序列；该转录因子的编码序列及包含该编码序列的载体或宿主。本发明还涉及提高植物耐盐性的方法和筛选具有高耐盐性植物的方法。本发明提供了改善和研究植物耐盐性的新方法，具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻SBP-box转录因子基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及水稻SBP-box蛋白转录因子基因及其编码的蛋白或多肽在增强植物耐盐性中的应用，以及通过抑制所述基因或其表达的蛋白来改进植物对盐胁迫的抗性的方法及转基因植物。

背景技术

全球粮食需求的增加和耕地面积的不断减少对各国粮食安全形成持续的压力。在粮食生产中，盐碱是主要的非生物胁迫，每年造成农作物大量减产及品质下降。

有资料表明，中国农田的盐碱化也是减产、低产的主要原因之一。盐碱已成为我国农业面临的严重问题。

因此，如何提高作物对盐碱的抗性能力对于提高产量，解决中国乃至世界的粮食问题具有重大的意义，对于这些非生物逆境的研究是植物研究领域最迫切且最具挑战性的工作之一。

目前已经有一部分耐盐相关基因包括一些转录因子被克隆，而且通过基因工程技术获得一些抗逆植物或作物品系。抗逆基因工程就是通过调控基因的转录表达来改善植物的抗逆能力，而在转录水平的调控中，转录因子起着关键作用。

目前，已发现一些参与胁迫应答基因表达的转录因子。但是，由于有众多的转录因子参与复杂的植物逆境响应过程，现在所发现的参与胁迫应答基因表达的转录因子只是一小部分，尚有大量转录因子有待发现和研究、并进一步应用于作物抗逆分子育种。

因此，本领域迫切需要对参与胁迫应答基因表达的转录因子进行研究，开发出可用于作物抗逆育种的新方法和新品种，从而提高作物产量和品质。

发明内容

本发明的目的之一正是提供一种与植物（尤其是作物）耐盐性密切相关的基因——水稻SBP-box蛋白转录因子SST，明确了该转录因子是植物耐盐性的负调控因子。本发明的另一目的是为增强植物对盐碱胁迫的抗性提供了一种途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种水稻SBP-box转录因子基因，所述基因命名为SST基因，其序列选自如下一组：

1）至少含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2）任一种与SEQ ID NO.1互补的核苷酸序列；或

3）在SEQ ID NO.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，且编码具有相同功能蛋白质的序列。

其编码如下蛋白质：

（a）具有SEQ ID NO.2氨基酸序列；

（b）将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽，且具有提高植物感盐性的由（c）衍生的多肽；

（c）具有SBP结构域，且具有提高植物感盐性的（a）或（b）中所述多肽的同源多肽。

在一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。

在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选禾本科植物。

在另一个优选例中，所述植物选自：水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉花或油菜，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗或高粱。

在另一优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。

在本发明的第二方面中，提供了一种载体，它含有本发明的所述基因。

在一个优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，优选pCAMBIA1300、pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301或pHB，更优选pCAMBIA1300。

在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的载体或基因组。

在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆菌，所述农杆菌包括但不限于：EHA105、SOUP1301或C58，优选EHA105。

在本发明的第四方面，提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括抑制本发明的SBP-box转录因子、抑制本发明的多核苷酸的表达。

在一个优选例中，所述抑制包括使得本发明转录因子或本发明的多核苷酸序列发生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加，从而使得所述植株具有提高的耐盐性。

在另一优选例中，所述方法还包括使得通过上述方法获得的具有提高耐盐性的植株与非转基因植物或其它转基因植物杂交。

在另一优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。

在本发明的第五方面，提供了本发明的SBP-box转录因子或核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列在提高植物耐盐性中的用途。

在另一优选例中，所述非保守性突变序列使得包含所述非保守性突变序列的植株中本发明锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的翻译或表达受到抑制，从而使其耐盐性优于不包含所述非保守性突变的野生型植株。

在本发明的第六方面，提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括：

（A） 提供本发明的SBP-box转录因子或核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列；（B）对植物进行选自下组的一种或多种处理：（i）将所述非保守性突变序列导入植物；或（ii）设计针对所述非保守性突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含所述非保守性突变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述非保守性突变序列的个体。

在本发明的一个优选例中，所述分子标记为序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的引物对，和序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。

在本发明的第七方面，提供了一种制备转基因植物的方法，所述方法包括：

（1）用含有本发明SBP-box转录因子的非保守性突变序列或本发明多核苷酸的非保守性突变序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

（2）选择转入所述非保守性突变序列的植物细胞、组织或器官；和

（3）将步骤（2）中的植物细胞、组织或器官再生成植株，

其中，所得的转基因植物的耐盐性较未转化的植物有所增强。

在另一优选例中，所述方法还包括使所得的转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交，从而获得包含所述非保守性突变序列的杂交后代，所述杂交后代的耐盐性较未转化的植物有所增强，优选所述杂交后代具有稳定的遗传性状。

在另一优选例中，所述方法还包括用设计针对所述非保守性突变序列的分子标记对转基因植物的杂交后代进行筛选，以获得具有改良的耐盐性的植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本申请人通过长期而深入的研究，发现了一种水稻SBP-box转录因子基因SST，苗期耐盐相关基因SST（Seedling Salt Tolerance gene），并证明了该基因为耐盐的负调控因子，可控制植物耐盐性，其表达抑制可增强植物对盐胁迫的抗性，因而在植物的耐盐等抗逆性的分子育种中起重要作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。

具体而言，本发明人通过在盐胁迫下大规模筛选水稻突变体库（伽马射线诱变）和图位克隆技术克隆了控制水稻耐盐的基因SST。SST基因的基因组长度为2172 bp，有两个内含子，全长ORF（open reading-frame）长度为1281 bp。该基因编码426个氨基酸、约44 KDa的具有保守SBP-box结构域的蛋白，该蛋白为一个转录因子。

表型鉴定结果表明该基因的突变体（例如SST基因存在1个碱基缺失，引起移码突变，且提前终止）表现耐盐。

通过上述研究表明：SST基因为耐盐的负调控因子，其表达抑制可增强植物对盐胁迫的抗性，该特性可用于生产对盐胁迫抗性明显提高的转基因植物。因此，SST基因在提高作物对盐等逆境胁迫能力方面具有较大的应用潜力。

并且，数据库搜索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）发现，在短花药野生稻（Oryza brachyantha）、谷子（Setaria italica）、高粱（Sorghum bicolor）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、节节麦（Aegilops tauschii）等基因组中都有同源基因。蛋白的相似性从81.2%—56.5%。这些同源基因都具有保守的SBP-box结构域，推测其它植物（优选禾本科植物）的SST同源基因具有与水稻SST基因相似的功能。

SST蛋白或多肽及其编码序列

在本发明中，术语“SST蛋白或多肽”、“SST基因编码的蛋白质或多肽”或“SBP-box蛋白转录因子”是指由本发明的SST基因编码的蛋白质或多肽，该定义中也包括所述蛋白质或多肽的保守性变异多肽、或其同源多肽。它们均具有SBP-domain结构域，且所述蛋白或多肽表达受到抑制后，可提高植物盐胁迫抗性。

所述SST蛋白质或多肽的序列可选自：（a）具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽；（b）将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物感盐性的由（a）衍生的多肽；或（c）具有SBP-domain结构域，且具有提高植物感盐性的（a）或（b）中所述多肽的同源多肽。

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。本发明中SST蛋白或多肽优选由禾本科植物（优选水稻）SST基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括（但并不限于）：一个或多个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的SST蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有增强植物重金属或盐胁迫抗性的活性。本领域技术人员可根据本领域常识和/或常规试验很容易地确定这些变异方式，而不会影响蛋白或多肽的活性。

在本发明中，“保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生：

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述（b）中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物的性状是否发生变化来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SST蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗SST蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含SST蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了SST蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有SST蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30 个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括SST蛋白的活性片段和活性衍生物。

如本文所用，术语“SST基因”、“植物SST基因”或“本发明转录因子的编码序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的SST蛋白或多肽的序列，其与水稻SST基因序列（参见SEQ ID NO.1）可高度同源或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因表达受到抑制对植物盐胁迫抗性具有一定的改善作用。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸是：（a）具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；（b）具有与SEQ ID NO.1互补的核苷酸序列。

如本文所用，术语“严格条件”是指：（1）在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％ SDS，60℃；或（2）杂交时加有变性剂，如50％（v/v）甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或（3）仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为（a）中所限定序列的互补序列。

本发明的SST基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR 扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的SST基因优选获自水稻，获自其它植物的与水稻SST基因高度同源（如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性）的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

植物及其对盐胁迫的抗性

如本文所用，所述的“植物”包括（但不限于）：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物等，优选所述植物为禾本科植物，更优选为禾本科作物。例如，所述植物可选自：水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉花或油菜，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗或高粱。

如本文所用，术语“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物，其经济价值可体现在该植物的种子、果实、根、茎、叶等有用部位上。作物包括但不限于：双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于：锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优选棉花、油菜等。

如本文所用，术语“盐胁迫”是指：指植物在含有高浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成盐属胁迫的盐类包括（但不限于） ：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。本发明的SST基因或其编码的蛋白质或多肽可增强植物对盐胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在高浓度盐分存在下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在更高的盐浓度下存活。

载体、宿主及转基因植物

本发明还涉及包含SST基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达SST的转基因植物。

通过常规的重组DNA 技术（Science，1984；224：1431），可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的SST蛋白。一般来说有以下步骤：

（1）用本发明的编码SST蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

（2）在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

（3）从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SST编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301或pHB。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白（GFP），或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用农杆菌作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐盐性提高的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

提高植物耐盐性的方法

如本文所述，本发明的SST蛋白、其编码序列与植物的耐盐性有密切的联系：SST蛋白、其编码序列受到抑制，则植物的耐盐性有所提高。

因此，本发明还提供了通过抑制SST蛋白、其编码序列来提高植物耐盐性的方法。

如本发明所用，术语“非保守性突变”是指使得本发明的SST蛋白或其编码序列发生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加（优选为非保守），从而使得所述植株具有提高的耐盐性。

在本发明的另一个实施方式中，可通过本领域已知的方法使得本发明的SST蛋白或其编码序列发生非保守性突变。例如，可通过SST蛋白编码序列中核苷酸的突变，使得具有SEQ ID NO.2的SST蛋白中的氨基酸序列发生非保守突变，从而使得含有该突变序列的植株具有提高的耐盐性。

筛选耐盐性植株的方法

根据本发明SST蛋白及其编码蛋白的特性，本发明还进一步包括筛选耐盐性植株的方法。

在一个实施方式中，可运用本领域已知的分子标记选择技术将耐盐SST基因导入其它品种中以筛选和培育耐盐新品种，该方法通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价，因此具有优势。所述方法可包括：设计针对所述缺失突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含本发明缺失突变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述缺失突变序列的个体。

本发明的主要优点在于：

（1） 鉴别了SST基因及其编码的蛋白质或多肽，并明确了其与植物耐盐性之间的关系，从而为研究植物的耐盐性提供了一种新的方法；

（2） 提供了具有改良盐胁迫抗性的转基因植物，为粮、棉、油等生产和加工提供了优良原料和产品；

（3） 提供了利用分子标记对耐盐杂交后代的选择方法，可实现通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价。

本发明提供了改善植物盐胁迫抗性的新途径，因而具有巨大的应用前景。

附图说明

图1：水稻SST基因的突变体sst与野生型在盐碱条件下的表型比较。A图为盐胁迫处理前，B图为盐胁迫处理后。

图2：野生型、通过互补转基因转入SST基因的sst突变体T₁代植株在盐碱条件下的表型比较。A图为盐胁迫处理前，B图为盐胁迫处理后。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件（例如可参照如Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第三版，英文名称为《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》（2001，Cold Spring Harbor Laboratory press）或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例部分中使用的各种培养基（YEB液体培养基、AB液体培养基、AAM液体培养基、N6D2培养基、N6D2C培养基、共培养培养基、选择培养基N6D2S1、N6D2S2、预分化培养基、分化培养基、1/2 MSOH培养基、水稻培养液、SD培养基等）按照相关文献的记载配制（分子克隆：实验室指南（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Hiei，Y.等，Plant J.，1994，6，271-282）。

实施例1：SST的水稻转基因实验

1. 高耐盐的sst突变体的获得和性状

用伽马射线处理水稻种子构建包含有约1000个株系的水稻突变体库。在150 mM氯化钠浓度的盐胁迫下大规模筛选水稻突变体库，经过多次用150 mM氯化钠浓度的盐胁迫对候选突变体进行验证、观察耐盐表型，获得一份表现高度耐盐的突变体sst。

用分子标记将SST基因初定位在水稻第六号染色体上。用sst突变体与感盐品种杂交构建大规模F₂群体，用分子标记从该群体中筛选交换个体并结合交换个体的基因型和表型，开展图位克隆，成功克隆了SST基因。该SST基因编码一个具有保守的SBP-domain结构域的功能未知SBP-box转录因子，在水稻基因组中没有找到SST的同源拷贝，在植物拟南芥基因组中没有发现同源基因。该基因序列如SEQ ID NO.1所示，基因组长度为2172 bp，有两个内含子，全长ORF（open reading-frame）长度为1281 bp，编码426个氨基酸，蛋白产物分子量估计为44 KDa。通过序列比较分析表明，在突变体中sst基因在第一外显子的编码区的第232位碱基缺失，引起了移码突变，且导致终止密码子的提前出现，产生耐盐表型，这表明SST为耐盐的负调控因子。

2. SST基因组片段的转基因质粒构建：

植物表达双元载体pCAMBIA1300用BamhI和Hind Ⅲ酶切后，与上述回收片段进行连接， 以Nipponbare基因组DNA为模板扩增SST基因的全长序列（包含启动子区、编码区及终止子区，共4667 bp)，PCR扩增产物与载体PMDT18-T连接，转化大肠杆菌DH5α，然后测序。测序准确的PMDT18-T-SST(t)质粒，用BamhI和Hind Ⅲ酶切后的插入片段与酶切后的载体pCAMBIA1300连接，转化大肠杆菌DH5α，从而成功构建p1300-SST质粒，用于转化突变体，进行互补实验。所用工具酶均购自Takara。

3. SST转化水稻：

将上述重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105。在每200 μl EHA105感受态细胞中加入0.5-1 μg（约10μl）质粒DNA，混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5 分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4 小时；取200μl 涂布于含抗生素Kan（50μg/ml）的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含Kan（50 μg/ml）的YEB平板上划单菌，连续划3 次。从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml 含50μg/ml Kan抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜。第2 天，按1％接种量转接入50ml含抗生素50 μg/ml Kan的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000 rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实验采用常规的农杆菌转化方法转化它的突变体的幼胚愈伤组织。取授粉后12-15天的突变体sst未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中（与水1∶3混合，加2-3滴吐温20）消毒20分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。

将如上获得的幼胚愈伤组织浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到铺有无菌滤纸的N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir 基因活化物，使用浓度为100 μmol/L。

3 天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1（含30 mg/l Hyg的N6D2培养基）进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2（含50mg/l Hyg的N6D2培养基）选择培养基上继续筛选。

10-12天后，将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化（12小时光照/天）。再生的小苗在1/2 MSOH培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。

获得的再生植株移栽成活后，用本领域已知的方法，通过提取阳性植株叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。

在后继的试验中，用上述方法获得的转基因植物的T₁代进行盐胁迫（100 mMNaCl） 处理，观察耐盐性表型，验证SST基因的功能。

实施例2：转基因植物的培养及盐胁迫试验

取实施例1中获得的转基因水稻的种子，于45℃烘箱内打破休眠一周后，播种于培养皿中，用室温自来水浸种2天，37℃催芽1天。等萌发后移入光照培养箱，28℃培养，每天光照11小时。1天后，温度逐步降低到26℃再培养一天。等幼苗基本出齐后自来水换成水稻培养液培养。

试验结果如图1和图2所示。如图1所示，水稻突变体sst比野生型（R401）明显提高耐盐性。

由图2可见：把野生型（R401）的SST基因组片段通过转基因转入sst突变体中，转基因互补（complemented）株系恢复了野生型的感盐的表型，由于是T₁代植株，所以表型有分离。

该结果表明：成功克隆了SST基因。

实施例3. 不同植物中SST同源基因的存在

数据库搜索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）发现，在短花药野生稻（Oryza brachyantha）、谷子（Setaria italica）、高粱（Sorghum bicolor）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、节节麦（Aegilops tauschii）等基因组中都有同源基因。蛋白的相似性从81.2%—56.5%。

这些同源基因都具有保守的SBP结构域，相似性较高，该序列为RCQAEGCKADLSGAKHYHRRHKVCEYHAKASVVAASGKQQRFCQQCSRFHVLTEFDEAKRSCRKRLAEHN，即SEQID NO.2的第180-249位）。SBP-box转录因子蛋白由SBP结构域与顺式作用元件相结合，因此这些同源基因与顺式作用元件均存在对应关系，这表明其它禾本科作物的SST同源基因具有与水稻SST基因相似的功能。

实施例4. 水稻等农作物SST基因的分子标记辅助选择技术在农作物耐盐育种改 良中的应用

通过物理诱变（伽马射线）使SST基因发生1 个碱基变异（第232位碱基缺失），引起移码突变，产生耐盐表型。在该基因两侧设计如下所示的两对引物ID27101和ID27118（或多对引物，取决于材料间多态性），使得突变基因限制在两个标记之间的区间内，从而应用于分子标记辅助选择育种中。

ID27101f ：TAGCTCCAACTGCATTCTA (SEQ ID NO.3)

ID27101r ：AATCAACCTAAACAGGGAT (SEQ ID NO.4)

ID27118f ：CGACTTGTAAGGGAGTTTGC (SEQ ID NO.5)

ID27118r ：CTGCTTGATTGTATTTTGTTGG (SEQ ID NO.6)

利用该耐盐的sst突变体与水稻推广品种杂交，通过其中一个分子标记或二个分子标记对杂交后代进行选择，选出了携带sst突变基因的个体，从而培育耐盐增强的新品种(系)。

该方法通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价，因此具有优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种水稻SBP-box转录因子基因及其应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatgagcg gtaggatgaa cgcggcgggg gacgagtcgc cgttcccgtt cggggcgatg 60

caggcgccgg ggccgggggc gtacgtcggg ttcgaccatg gcgcggcggc ggtggcggcg 120

gcggctgcgg cggcgcagcg ggcggggatg ctgcagcacc accaccacca catgtacgac 180

ggcttggact tcgcggcggc gatgcagttc ggcggcgggc aggacgcgcc gccgcacccg 240

cagctgctgg cgctgccgcc gagcatggcg gcgccgccgc cgccgcccat gccgatgccg 300

ctgcagatgc ccatgacgat gccgatgccc ggagacgtgt acccggcgct cggcatcgtg 360

aagcgcgagg gcgggggcgg aggtcaggac gccgccgccg ggaggatcgg gctcaacctc 420

ggccgccgga cctacttctc ccccggcgac atgctcgccg tcgaccgcct cctcatgcgc 480

tcccgcctcg gcggcgtgtt cggcctcggc ttcggcggcg cccaccacca gccacctcgc 540

tgccaggccg agggctgcaa ggccgacctc tccggcgcca agcactacca ccgccgccac 600

aaggtctgcg agtaccacgc caaggcctcc gtcgtcgccg cctccggcaa gcagcagcgc 660

ttctgccagc aatgcagcag gtttcacgtg ctcacggagt ttgatgaggc caagaggagc 720

tgccggaagc ggctggcgga gcacaaccgt cgccggcgga agccggcggc ggcggcgacg 780

accgccgtgg cggcggccaa ggacgcggcg gcggcgccgg tagccgccgg gaagaagcct 840

agcggcggcg ccgccacgtc ttacaccggt gacaacaaga acgtggtgtc catgagcgcg 900

gccaagtcgc ccatctcgtc gaacaccagc gtgatcagct gcctgcccga gcagggcaag 960

catgcggcgg cggcggcgag gccgacggcg ctcacgctcg gcggcgcgcc gccgcacgag 1020

agctccgcgc cgcagatcgg cgccatgctc catcaccacc accatcacca gcaagaccac 1080

atgcaggtga gctccctggt ccacatcaat ggcggcggcg gcggcggtag caacaacatc 1140

ttgtcgtgct cgtcggtgtg ctccagcgcg ctgccgtcga cggcgaccaa cggcgaggta 1200

tcagaccaga acaacgacaa cagccacaac aatggcggca acaacaacaa catgcatctg 1260

ttcgaggtcg acttcatgta g 1281

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> 蛋白序列

<400> 2

Met Met Ser Gly Arg Met Asn Ala Ala Gly Asp Glu Ser Pro Phe Pro

1 5 10 15

Phe Gly Ala Met Gln Ala Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Val Gly Phe Asp

20 25 30

His Gly Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Arg Ala

35 40 45

Gly Met Leu Gln His His His His His Met Tyr Asp Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Ala Ala Ala Met Gln Phe Gly Gly Gly Gln Asp Ala Pro Pro His Pro

65 70 75 80

Gln Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Met Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro

85 90 95

Met Pro Met Pro Leu Gln Met Pro Met Thr Met Pro Met Pro Gly Asp

100 105 110

Val Tyr Pro Ala Leu Gly Ile Val Lys Arg Glu Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gln Asp Ala Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Asn Leu Gly Arg Arg Thr

130 135 140

Tyr Phe Ser Pro Gly Asp Met Leu Ala Val Asp Arg Leu Leu Met Arg

145 150 155 160

Ser Arg Leu Gly Gly Val Phe Gly Leu Gly Phe Gly Gly Ala His His

165 170 175

Gln Pro Pro Arg Cys Gln Ala Glu Gly Cys Lys Ala Asp Leu Ser Gly

180 185 190

Ala Lys His Tyr His Arg Arg His Lys Val Cys Glu Tyr His Ala Lys

195 200 205

Ala Ser Val Val Ala Ala Ser Gly Lys Gln Gln Arg Phe Cys Gln Gln

210 215 220

Cys Ser Arg Phe His Val Leu Thr Glu Phe Asp Glu Ala Lys Arg Ser

225 230 235 240

Cys Arg Lys Arg Leu Ala Glu His Asn Arg Arg Arg Arg Lys Pro Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Ala Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Ala

260 265 270

Pro Val Ala Ala Gly Lys Lys Pro Ser Gly Gly Ala Ala Thr Ser Tyr

275 280 285

Thr Gly Asp Asn Lys Asn Val Val Ser Met Ser Ala Ala Lys Ser Pro

290 295 300

Ile Ser Ser Asn Thr Ser Val Ile Ser Cys Leu Pro Glu Gln Gly Lys

305 310 315 320

His Ala Ala Ala Ala Ala Arg Pro Thr Ala Leu Thr Leu Gly Gly Ala

325 330 335

Pro Pro His Glu Ser Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ala Met Leu His His

340 345 350

His His His His Gln Gln Asp His Met Gln Val Ser Ser Leu Val His

355 360 365

Ile Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn Ile Leu Ser Cys Ser

370 375 380

Ser Val Cys Ser Ser Ala Leu Pro Ser Thr Ala Thr Asn Gly Glu Val

385 390 395 400

Ser Asp Gln Asn Asn Asp Asn Ser His Asn Asn Gly Gly Asn Asn Asn

405 410 415

Asn Met His Leu Phe Glu Val Asp Phe Met

420 425

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagctccaac tgcattcta 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatcaaccta aacagggat 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgacttgtaa gggagtttgc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgcttgatt gtattttgtt gg 22

Claims (6)

1.一种水稻SBP-box转录因子基因，其特征在于，所述基因命名为SST基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的水稻SBP-box转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的载体。

4.含有权利要求 3所述载体的宿主细胞。

5.一种权利要求1所述的基因在增强植物耐盐性基因工程中的应用。

6.一种权利要求1所述的基因在增强植物耐盐性分子标记辅助育种中的应用。