CN103788189A - 水稻衰老控制基因OsCDC48E及其编码的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻衰老相关控制基因OsCDC48E序列，及其编码翻译的蛋白质和氨基酸序列。本发明通过图位克隆技术从水稻早衰突变体W95中克隆得到一个控制水稻叶片衰老的基因OsCDC48E，通过功能互补实验验证OsCDC48E是控制水稻生长发育、叶片衰老相关的基因。通过透射电镜观察,光合速率以及光反应和暗反应检测技术的分析，证明了本发明克隆的早衰基因对于水稻的生长发育，叶绿体中类囊体的完整性和内质网细胞器结构等均具有明显的调节作用。利用基因工程技术可以把衰老基因的一些特异标记性状应用于水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。

Description

水稻衰老控制基因OsCDC48E及其编码的蛋白质

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻OsCDC48E基因，以及可利用该基因来调控水稻叶片衰老相关途径和植物生长发育过程中细胞分裂的调控机制，以此来进行水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。本发明的衰老控制基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。 

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，稻米的总产量占世界粮食作物产量第三位，仅低于玉米和小麦，但它加工简单，食用方便，可以维持较多人口的生活。全球约有35亿人，有一半的人口食用稻米，主要分布在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区，就我国而言就有60%以上的人口以稻米为主食。 

植物的衰老是植物生长发育过程中最后阶段，是一种细胞有序降解死亡的过程，而细胞程序性死亡则是由很多相关因子一起作用的结果，其中包括植物本身基因的调控和外界环境的影响。植物本身基因如衰老相关基因SAG的调控，叶绿体和线粒体等其他细胞器相关基因的突变，还有一些氧化还原酶或过氧化氢酶调控基因的变异，均可导致衰老的产生。而外界环境可能是由于干旱的胁迫，高盐或者是高温等外界环境，还有一些病虫害的影响等都可以直接或者是间接的引起植物衰老。目前植物衰老的主要内容包括：(1)植物在生理生化途径中发生的一系列直接或者是间接的衰退过程；(2)在细胞组织器官中，植物本身经过长期进化和自然选择，最终导致衰老；(3)最主要也是最直接的导致植物体产生衰老的机制，是由于受到一些衰老相关基因（SAG）的控制，出现衰老相关基因上调或抑制衰老基因的下调。 

植物的衰老一般最开始，也是最显著的变化是发生在叶片叶绿体中的，同时也导致线粒体、细胞核和其他细胞器出现衰老，致使植物寿命减短，严重影响植物尤其是水稻、小麦和玉米等谷物的产量。水稻作为模式植物，是世界上最重要的粮食作物之一，其基因组学研究一直走在其他作物的前列。同时水稻T-DNA插入获得的突变群体、水稻全长cDNA完全测序、基因芯片的发展和多基因转化体系的建立等方面也取得了重要进展, 克隆和鉴定了多个重要的水稻功能基因。因此，利用水稻功能基因组研究的知识，开展水稻叶片衰老相关基因的克隆和功能分析，可以为培育水稻超高产新品种提供强大的技术支撑。 

目前只有少数的水稻衰老基因被鉴定，仍有大量的植物衰老相关的基因有待鉴定。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻衰老基因，具有调控水稻细胞分裂控制植株衰老的功能，可以利用该基因来调控水稻叶片衰老相关途径和植物生长发育过程中细胞分裂的调控机制，以此来进行水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。 

本发明的第一方面，提供一种分离的水稻OsCDC48E编码的蛋白质。 

一种水稻衰老控制基因OsCDC48E编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有控制水稻衰老的功能。 

进一步地，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。 

优选地，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

在本发明的第二方面，提供一种分离的编码上述蛋白质的多核苷酸。 

所述基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。 

所述基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。 

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明还提供了含有上述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。 

所述植物表达载体为pCAMBIA1300-OsCDC48E。 

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。宿主细胞含有上述载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。 

本发明通过图位克隆技术从水稻早衰突变体W95中克隆控制水稻衰老基因OsCDC48E，功能互补实验证明OsCDC48E是控制水稻衰老相关基因。通过透射电镜和光合速率，以及光反应和暗反应检测技术的观察，证明了本发明克隆的早衰基因对于水稻的生长发育，叶绿体中类囊体的完整性等均具有明显的调节作用。利用基因工程技术可以把衰老基因的一些特异标记性状应用于水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。 

附图说明

图1为水稻早衰突变体表型；其中，1—分蘖期野生型IR64；2—分蘖期突变体W95；3—抽穗期野生型IR64；4—抽穗期突变体W95。 

图2为OsCDC48E基因在水稻第3染色体上的精细定位。 

图3-a、图3-b为表达载体pCAMBIA1300-OsCDC48E图谱。 

图4为功能互补实验T0代转基因水稻的表型示意图；其中，1—IR64；2—W95；3—W95-OsCDC48E。 

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。 

实施例1：突变体的分离与遗传分析

通过对EMS诱变的水稻（IR64）突变体库的筛选，分离获得了一个水稻早衰突变体W95，其表型能稳定遗传，在分蘖期开始出现早衰表型如图1所示1、2），到抽穗期早衰表型十分明显（如图1所示3、4）。利用突变体W95与Moroberekan杂交获得F1，F1植株具有正常的叶片表型和生育期，F2代中的野生型和突变体表型的分离比符合孟德尔单隐性突变的分离比，说明突变体W95的早衰表型由单隐性基因控制。 

实施例2：突变基因的精细定位

根据已公布的粳稻和籼稻的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行多态性检测及初步定位分析，将突变体W95与Moroberekan杂交获得的F2群体中具有突变体表型的单株作为定位群体，共鉴定3429株具有突变体表型的F2个体，其中的1192株作为初定位群体。初定位结果表明该突变基因位于第3染色体短臂RM14394和RM14408之间。 

筛选获得RM14394和RM14408之间在亲本间有多态性的引物RM6829、HQN195、HQN32、RM14395和HQN141，并用这7对引物分析2237个F2群体中的突变个体，利用获得的信息构建物理图谱。最终将突变基因精细定位于第3染色体BAC克隆OSJNBa0038D20上RM14395和HQN141标记之间17.6kb范围内（如图2所示）。 

实施例3：基因预测和序列比对分析

       根据上述结果，对该区间3个预测基因进行测序分析。发现编码cell division control protein 48 homolog E蛋白的基因与野生型相比，突变体W95中该基因CDS核苷酸系列的第2347位由C变成了T，导致该核苷酸编码的蛋白质提前终止，使得该蛋白的功能受到影响，因此将该基因定为候选基因并命名为OsCDC48E。

实施例4： OsCDC48E 基因功能互补验证

构建包含OsCDC48E基因全长编码区（SEQ ID NO.1）及自身启动子的互补载体pCAMBIA1300-OsCDC48E（图3-a,图3-b），转化到农杆菌EHA105,以农杆菌介导法转化突变体W95。转基因植株表现为正常叶片表型和生育期，通过测序发现其在突变位点呈双峰，实验结果表明互补载体能够完全恢复W95的早衰突变表型（图4）。如图3-a和3-b所示的pCAMBIA1300-OsCDC48E,该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

序列表

<110>  中国水稻研究所

<120>  水稻衰老控制基因OsCDC48E及其编码的蛋白质

<130>  2013

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  2850

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  1

ggcgaattgg gcccgacgtc gcatgctccc ggccgccatg gcggccgcgg gaattcgatt       60

 

acacccaaca acccaaaacc tagcgcctct gcgctcgagg cccccccgaa tccgcgaatc      120

 

cgccgactcc catggcgagc cagggagagc cctcctcctc ctccgatccg aaggggaaga      180

 

aggatttctc gacggcgatc ctcgagagga agaagtcgcc gaaccggctg gtggtcgacg      240

 

aggccaccaa cgatgataac tccgtcatcg ggatgcaccc cgacaccatg gagaagctcc      300

 

agcttttccg cggcgacact gtgctgctca agggtaagaa gagaaaagac accatctgca      360

 

ttgttcttgc tgatgacacc tgcgaggagc cgaagatcag aatgaacaag gttgtcagga      420

 

agaacctgag agtacgactt ggtgatgtcg tgtctgttca tcaatgccca gatgtcaaat      480

 

acggcaagcg tgtgcacata cttccaattg atgatactgt tgagggcatc accggaaact      540

 

tgtttgatgc cttcctgaaa ccgtacttcc ttgaagcata ccgtcctttg aggaaaggag      600

 

accttttcct tgttaggggt gggatgagaa gtgttgaatt caaagttata gagactgacc      660

 

ctgcagagta ctgcattgtt gcacctgata cggagatatt ctgtgatggt gagcctatta      720

 

agagggagga tgaggaaaga cttgatgaag ttggttacga tgatgttggt ggagttagga      780

 

agcagatggc ccaaatcaga gaacttgttg agctcccatt gcgccatccc caacttttca      840

 

agtctattgg tgtgaagcct ccaaagggca tactgcttta tggaccccct ggctctggaa      900

 

agaccctcat tgctagagct gttgctaatg aaacaggtgc tttcttcttt ctgattaatg      960

 

gcccggagat tatgtcaaag ctagcaggag aaagtgagag taatctcagg aaggcatttg     1020

 

aagaagctga gaagaatgca ccatcaatca ttttcatcga tgagatagac tccatagcac     1080

 

caaagagaga gaagacccat ggagaagttg agaggcgcat cgtttcacag ctgttgactc     1140

 

ttatggatgg gctcaaagct cgttcccatg tcattgtcat gggtgctaca aaccggccaa     1200

 

acagtattga tcctgctctc agaaggtttg gtaggttcga tcgggagatt gacattggtg     1260

 

ttcctgatga agttgggcgg cttgaagttc ttcggattca caccaaaaac atgaagctgg     1320

 

ctgaagatgt tgacctggaa cacattgcca aagacactca tgggtatgtg ggtgctgatc     1380

 

ttgctgctct ttgcactgag gctgctctcc aatgcatccg tgagaagatg gatattatag     1440

 

atcttgagga tgagaccata gatgctgaga tacttaactc gatggctgtt acaaatgatc     1500

 

acttcaagac tgcactaggg acaagcaacc cgtctgctct ccgtgaaact gttgttgaag     1560

 

ttccaaatgt ctcttgggag gatattggtg gactggagaa tgtcaaacgg gagctgcagg     1620

 

agactgtcca atatccagtg gagcatcctg agaaatttga gaagtttggc atgtctccgt     1680

 

ccaaaggtgt tctgttctat ggccctcctg gctgtggtaa gactttgttg gccaaggcaa     1740

 

ttgctaacga gtgccaggct aacttcatta gtgtcaaggg acctgagctg cttaccatgt     1800

 

ggtttggtga gagtgaggcc aatgtgcgtg agatttttga caaggctagg cagtcagctc     1860

 

cttgtgtcct cttctttgat gagcttgact caattgctac ccagagagga agcagtgttg     1920

 

gtgatgccgg aggtgctgct gatagagtgc tgaaccagtt gttgactgag atggacggca     1980

 

tgaacgcgaa gaaaaccgtt ttcattattg gtgctactaa caggccagat atcattgacc     2040

 

ctgccttgct aaggccaggg cgtcttgatc agcttatcta cattcctctg cctgatgatc     2100

 

aatctaggct gcagatcttc aaagcttgcc tccggaagtc acctgtggcc aaggatgtag     2160

 

acctgaatgc tcttgccaaa tacacccaag gtttcagtgg tgctgatatt acagaaatct     2220

 

gccagcgtgc atgcaaatac gccatcagag agaacattga aaaggacatc gagatggaga     2280

 

agcggaggaa ggacaaccct gaagccatgg aggaggacga ggttgatgat attgctgaga     2340

 

tcaaggcggc tcacttcgag gagtcgatga agtacgcacg ccggagtgtg agtgacgccg     2400

 

acatccgcaa gtaccaggcc ttcgcccaga ctctgcagca gtctcgtggg ttcggcaccg     2460

 

agtttaggtt cgctgaccag ccagcgtctg gcgccggcgc cgccgctgac cccttcgcat     2520

 

ccgctgccgc cgcagctgac gatgatgatt tatatagtta gatcgctgtg ctatttatat     2580

 

ttaacctccg tgcttttgtt cagtatgtct atttcgcttt ggtaaacttt atcatatgta     2640

 

acatacgggg aaacagtgta ctatttttaa gttaatattc tgagaggtac tgaaccgaat     2700

 

tgcatgtttc tgtatggatg tgtcgtggat gagcatggtt gcgggttgta ttcatcaaat     2760

 

cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc aacgcgttgg     2820

 

atgcatagct tgagtattct atagtgtcac                                      2850

 

<210>  2

<211>  809

<212>  PRT

<213>  Oryza sativa

 

<400>  2

Met Ala Ser Gln Gly Glu Pro Ser Ser Ser Ser Asp Pro Lys Gly Lys

1               5                   10                  15     

 

Lys Asp Phe Ser Thr Ala Ile Leu Glu Arg Lys Lys Ser Pro Asn Arg

            20                  25                  30         

 

Leu Val Val Asp Glu Ala Thr Asn Asp Asp Asn Ser Val Ile Gly Met

        35                  40                  45             

 

His Pro Asp Thr Met Glu Lys Leu Gln Leu Phe Arg Gly Asp Thr Val

    50                  55                  60                 

 

Leu Leu Lys Gly Lys Lys Arg Lys Asp Thr Ile Cys Ile Val Leu Ala

65                  70                  75                  80 

 

Asp Asp Thr Cys Glu Glu Pro Lys Ile Arg Met Asn Lys Val Val Arg

                85                  90                  95     

 

Lys Asn Leu Arg Val Arg Leu Gly Asp Val Val Ser Val His Gln Cys

            100                 105                 110        

 

Pro Asp Val Lys Tyr Gly Lys Arg Val His Ile Leu Pro Ile Asp Asp

        115                 120                 125            

 

Thr Val Glu Gly Ile Thr Gly Asn Leu Phe Asp Ala Phe Leu Lys Pro

    130                 135                 140                

 

Tyr Phe Leu Glu Ala Tyr Arg Pro Leu Arg Lys Gly Asp Leu Phe Leu

145                 150                 155                 160

 

Val Arg Gly Gly Met Arg Ser Val Glu Phe Lys Val Ile Glu Thr Asp

                165                 170                 175    

 

Pro Ala Glu Tyr Cys Ile Val Ala Pro Asp Thr Glu Ile Phe Cys Asp

            180                 185                 190        

 

Gly Glu Pro Ile Lys Arg Glu Asp Glu Glu Arg Leu Asp Glu Val Gly

        195                 200                 205            

 

Tyr Asp Asp Val Gly Gly Val Arg Lys Gln Met Ala Gln Ile Arg Glu

    210                 215                 220                

 

Leu Val Glu Leu Pro Leu Arg His Pro Gln Leu Phe Lys Ser Ile Gly

225                 230                 235                 240

 

Val Lys Pro Pro Lys Gly Ile Leu Leu Tyr Gly Pro Pro Gly Ser Gly

                245                 250                 255    

 

Lys Thr Leu Ile Ala Arg Ala Val Ala Asn Glu Thr Gly Ala Phe Phe

            260                 265                 270        

 

Phe Leu Ile Asn Gly Pro Glu Ile Met Ser Lys Leu Ala Gly Glu Ser

        275                 280                 285            

 

Glu Ser Asn Leu Arg Lys Ala Phe Glu Glu Ala Glu Lys Asn Ala Pro

    290                 295                 300                

 

Ser Ile Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Ala Pro Lys Arg Glu

305                 310                 315                 320

 

Lys Thr His Gly Glu Val Glu Arg Arg Ile Val Ser Gln Leu Leu Thr

                325                 330                 335    

 

Leu Met Asp Gly Leu Lys Ala Arg Ser His Val Ile Val Met Gly Ala

            340                 345                 350        

 

Thr Asn Arg Pro Asn Ser Ile Asp Pro Ala Leu Arg Arg Phe Gly Arg

        355                 360                 365            

 

Phe Asp Arg Glu Ile Asp Ile Gly Val Pro Asp Glu Val Gly Arg Leu

    370                 375                 380                

 

Glu Val Leu Arg Ile His Thr Lys Asn Met Lys Leu Ala Glu Asp Val

385                 390                 395                 400

 

Asp Leu Glu His Ile Ala Lys Asp Thr His Gly Tyr Val Gly Ala Asp

                405                 410                 415    

 

Leu Ala Ala Leu Cys Thr Glu Ala Ala Leu Gln Cys Ile Arg Glu Lys

            420                 425                 430        

 

Met Asp Ile Ile Asp Leu Glu Asp Glu Thr Ile Asp Ala Glu Ile Leu

        435                 440                 445            

 

Asn Ser Met Ala Val Thr Asn Asp His Phe Lys Thr Ala Leu Gly Thr

    450                 455                 460                

 

Ser Asn Pro Ser Ala Leu Arg Glu Thr Val Val Glu Val Pro Asn Val

465                 470                 475                 480

 

 

Ser Trp Glu Asp Ile Gly Gly Leu Glu Asn Val Lys Arg Glu Leu Gln

                485                 490                 495    

 

Glu Thr Val Gln Tyr Pro Val Glu His Pro Glu Lys Phe Glu Lys Phe

            500                 505                 510        

 

Gly Met Ser Pro Ser Lys Gly Val Leu Phe Tyr Gly Pro Pro Gly Cys

        515                 520                 525             

 

Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asn Glu Cys Gln Ala Asn

    530                 535                 540                

 

Phe Ile Ser Val Lys Gly Pro Glu Leu Leu Thr Met Trp Phe Gly Glu

545                 550                 555                 560

 

Ser Glu Ala Asn Val Arg Glu Ile Phe Asp Lys Ala Arg Gln Ser Ala

                565                 570                 575    

 

Pro Cys Val Leu Phe Phe Asp Glu Leu Asp Ser Ile Ala Thr Gln Arg

            580                 585                 590        

 

Gly Ser Ser Val Gly Asp Ala Gly Gly Ala Ala Asp Arg Val Leu Asn

        595                 600                 605            

 

Gln Leu Leu Thr Glu Met Asp Gly Met Asn Ala Lys Lys Thr Val Phe

    610                 615                 620                

 

Ile Ile Gly Ala Thr Asn Arg Pro Asp Ile Ile Asp Pro Ala Leu Leu

625                 630                 635                 640

 

Arg Pro Gly Arg Leu Asp Gln Leu Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Asp Asp

                645                 650                 655    

 

Gln Ser Arg Leu Gln Ile Phe Lys Ala Cys Leu Arg Lys Ser Pro Val

            660                 665                 670        

 

Ala Lys Asp Val Asp Leu Asn Ala Leu Ala Lys Tyr Thr Gln Gly Phe

        675                 680                 685            

 

Ser Gly Ala Asp Ile Thr Glu Ile Cys Gln Arg Ala Cys Lys Tyr Ala

    690                 695                 700                

 

Ile Arg Glu Asn Ile Glu Lys Asp Ile Glu Met Glu Lys Arg Arg Lys

705                 710                 715                 720

 

Asp Asn Pro Glu Ala Met Glu Glu Asp Glu Val Asp Asp Ile Ala Glu

                725                 730                 735    

 

Ile Lys Ala Ala His Phe Glu Glu Ser Met Lys Tyr Ala Arg Arg Ser

            740                 745                 750        

 

Val Ser Asp Ala Asp Ile Arg Lys Tyr Gln Ala Phe Ala Gln Thr Leu

        755                 760                 765            

 

Gln Gln Ser Arg Gly Phe Gly Thr Glu Phe Arg Phe Ala Asp Gln Pro

    770                 775                 780                

 

Ala Ser Gly Ala Gly Ala Ala Ala Asp Pro Phe Ala Ser Ala Ala Ala

785                 790                 795                 800

 

Ala Ala Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Ser

                805                

 

Claims (9)

1.一种水稻衰老控制基因OsCDC48E编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有控制水稻衰老的功能。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。

3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。

5.编码权利要求2所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。

6.编码权利要求3所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.一种含有权利要求4-6任一权利要求所述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1300-OsCDC48E。

9.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

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