CN109402078B

CN109402078B - 一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用

Info

Publication number: CN109402078B
Application number: CN201811432986.4A
Authority: CN
Inventors: 张可伟; 崔付斌; 赵江哲; 章薇; 彭凯轩; 张艳军
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CN109402078A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11及其应用，水稻叶片衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性。本发明通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX11，分析其突变体表型变化发现，该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰；在一些早衰的栽培品种中，利用基因工程技术敲除OsCKX11可以有目的地调控植物的衰老进程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值。

Description

一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用。本发明使用反向遗传学技术鉴定OsCKX11的生物学功能，还涉及该基因突变后抑制水稻叶片早衰从而调节植株的发育影响水稻的产量。

背景技术

叶片衰老是叶片生长发育的最后一个阶段，叶片衰老是一个复杂的生理活动，一部分蛋白被激活表达的同时也有一部分蛋白被降解[1]。当叶片衰老时，随着叶绿素被降解以及体内水分的减少，光合速率逐渐降低，营养物质被运输到果实或者种子中储存。相关研究表明，当叶片处于衰老状态时，其内源细胞分裂素含量明显下降[3]；而当用外源细胞分裂素处理叶片时，对叶片的衰老有明显的抑制作用[4]。细胞分裂素在抑制植物叶片衰老时主要体现在以下几点：影响营养物质运输；影响脂质过氧化反应；影响植物体内其他激素的含量；在衰老后期抑制叶绿素的降解；抑制植物体内源L-丝氨酸的积累，降低丝氨酸对植物衰老的启动等[5,6,7]。

细胞分裂素含量在植物体内的动态平衡需要细胞分裂素氧化酶(Cytokininoxidase/dehydrogenase，CKX)维持，CKX能断裂细胞分裂素侧链使其失活，这个反应是不可逆的[8]。编码细胞分裂素氧化酶的是一个多基因家族，水稻体内有11种细胞分裂素氧化酶，不同细胞分裂素氧化酶之间的差异主要体现在它们的催化性能、亚细胞定位以及表达特征上[9]。

近些年来培育的一些超级稻品种，其生育后期会受逆境胁迫，如极端温度、干旱、养分匮乏等，使功能叶片发生早衰。在农业生产中，叶片过早衰老常使植株光合速率迅速下降，光合产物的减少导致水稻结实率低，空秕率高，品质下降[10]。严重影响了超级稻产量潜力的发挥。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除OsCKX11后，突变体出现了叶片晚衰的现象。根据理论上的推算，如果水稻的功能叶片衰老推迟1天，可以使水稻增产约2％，如果将这项发明应用于农业生产中，可以有效抑制超级稻的早衰，提高超级稻的产量。

上文中涉及的参考文献如下：

[1]Becker W,Apel K.Differences in gene expression between naturalandartificially induced leafsenescence[J].Planta,1993,189(1):74-79.

[2]Lee R H,Wang C H,Huang L T,et al.Leaf senescence in rice plants:cloning and characterization of senescence up-regulated genes.[J].JournalofExperimental Botany,2001,52(358):1117.

[3]Zwack P J,Rashotte A M.Cytokinin inhibition of leaf senescence[J].Plant Signaling&Behavior,2013,8(7):-.

[4]Chang H,Jones M L,Banowetz G M,et al.Overproduction ofcytokininsin petunia flowers transformed with P(SAG12)-IPT delays corollasenescenceand decreases sensitivity to ethylene.[J].PlantPhysiology,2003,132(4):2174-83.

[5]Gan S,Amasino R M.Cytokinins inplant senescence:From sprayandprayto clone andplay[J].Bioessays,1996,18(7):557–565.

[6]Zhu Y R,Tao H L,Lv X Y,et al.High level ofendogenous L-serineinitiates senescence in Spirodelapolyrrhiza.[J].Plant Science,2004,166(5):1159-1166.

[7]Greenboimwainberg Y,Maymon I,Borochov R,et al.Cross talkbetweengibberellin and cytokinin:the Arabidopsis GA response inhibitorSPINDLY playsapositive role in cytokinin signaling.[J].Plant Cell,2005,17(1):92-102.

[8]Ashikari M；Sakakibara H；Lin S；Yamamoto T；Takashi T；NishimuraA；Angeles ER；Qian Q；Kitano H；Matsuoka M.Cytokinin oxidase regulates ricegrainproduction.[J].Science,2005,309(5735):741.

[9]Gao S,Chu C.CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE4IntegratesCytokininandAuxin Signaling to Control Rice Crown Root Formation.[J].PlantPhysiology,2014,165(3):1035-1046.

[10]徐庆国.超级稻的研究现状与发展对策探讨[J].作物研究,2006,20(1):13-16.

综上所述，现有技术存在的问题是：在当前农业生产中的常规稻育种、超级稻育种以及杂交育种的过程中，存在叶片早衰的现象，严重影响种子的灌浆，进而影响水稻的产量和品质。而通过改良水稻细胞分裂素含量的方法来抑制水稻叶片衰老的方法尚未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11及其应用。

本发明是这样实现的，一种水稻叶片衰老控制基因OsCKX11，所述水稻衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少30％的同源性。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述水稻衰老控制基因OsCKX11衍生的衍生物，衍生物的氨基酸序列为在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失或多个氨基酸生成。

本发明的另一目的在于提供一种编码所述水稻衰老控制基因OsCKX11的基因。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述基因衍生的核苷酸序列衍生物。

本发明的另一目的在于提供一种基因构建的质粒。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述质粒构建的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述的表达载体的核苷酸序列的转化子。

进一步，转化子的细胞为大肠杆菌。

进一步，转化子的细胞为农杆菌。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX11，分析其突变体表型变化发现，该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰。在一些早衰的栽培品种中，利用基因工程技术敲除OsCKX11可以有目的地调控植物的衰老进程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值。

本发明从定点突变OsCKX11基因能抑制水稻叶片的早衰，提出利用OsCKX11基因进行生育后期延缓超级稻衰老的水稻育种的改良方法，达到提高超级稻产量，改善品质的目的。利用基因工程技术改良超级稻，不仅可以稳定地抑制其叶片早衰，还可以降低肥料使用，增加效益。

本发明对OsCKX11突变体的表型分析：

将鉴定得到的OsCKX11的纯合突变体种植于人工智能培养室以及大田(浙江金华和海南陵水)，均表现出一致的表型性状。不论是植株的正常衰老还是在离体状态下，突变体叶片均晚衰(图3)，抽穗后叶绿素含量以及灌浆期光合速率也比野生型高(图4)。OsCKX11突变后，抽穗后水稻叶片的叶绿素含量增加约10％，灌浆期光合速率升高约20％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的靶点位置及突变方式示意图；CX11-1,CX11-2,CX11-3代表三个独立的转基因株系。

图2是本发明实施例提供的鉴定突变体的酶切电泳图；纯合突变体酶切后只有一条带，杂合突变体有三条带。

图3是本发明实施例提供的突变体叶片晚衰图。

图中：A、大田间自然衰老的突变体及野生型整株表型对比；B、孕穗期剑叶离体黑暗处理4天后的表型。

图4是本发明实施例提供的田间植株的叶绿素含量及光合速率图。

图中：A、抽穗后植株的叶绿素含量，横轴代表抽穗后时间(天)；B、灌浆期实时光合速率。每个株系检测20株植物，每株植物检测三个主穗剑叶的叶绿素含量及光合速率；***p<0.001(student’s t-test)；Bar代表SE。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX11，分析其突变体表型变化发现，该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰。在一些早衰的栽培品种中，利用基因工程技术敲除OsCKX11可以有目的地调控植物的叶片衰老进程，调整植物群体发育时期以达到增产的目的，有非常重要的应用价值。

本发明实施例提供的水稻衰老控制基因OsCKX11，水稻衰老控制基因OsCKX11氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少30％的同源性。

本发明提供一种利用所述水稻衰老控制基因OsCKX11衍生的衍生物，衍生物的氨基酸序列为在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失或多个氨基酸生成。

本发明提供一种编码所述水稻衰老控制基因OsCKX11的基因。

本发明提供一种利用所述基因衍生的核苷酸序列衍生物。

本发明提供一种利用所述基因构建的质粒。

本发明提供一种利用所述质粒构建的表达载体。

本发明提供一种含有所述的表达载体的核苷酸序列的转化子。

转化子的细胞为大肠杆菌。

转化子的细胞为农杆菌。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

如图1所示的基因模式，在外显子处设计CRISPR靶点，定点编辑该基因，插入或缺失一个碱基使该基因失活，而生成突变体。通过在人工智能培养室和大田间(浙江金华及海南陵水)种植该突变体，观察统计其农艺性状变化情况。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

一转基因水稻的获取

OsCKX11的CDS序列全长共1557bp，本发明根据CRISPR-PLANT(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)网站上提供的该基因可用的gRNA靶点序列，挑选了CAS9蛋白作用位点含有SmaⅠ酶切位点的序列，该靶点位于334bp-353bp处。合成该gRNA靶点序列后，将两段序列稀释至浓度为100μM,将前后引物等体积混匀后，100℃5min处理，室温静置冷却退火，然后连接到酶切回收的中间载体SK-gRNA上，挑取阳性克隆提质粒验证正确后，选择合适的酶切位点，酶切回收含有靶点序列的片段，与酶切后的线性终载体pC1300-CAS9连接，利用载体序列PC1300-F和靶点序列的反向引物做PCR验证该gRNA连接到目的载体上，然后测序确认目的载体上确实存在该靶点。

将构建好的载体转化进入日本晴的愈伤组织，经潮霉素筛选后的转基因幼苗进一步鉴定突变体。

二鉴定转基因水稻获取纯合突变体

得到转基因水稻后，本发明将幼苗用水稻营养液水培，待缓苗后提取DNA，鉴定其突变方式。

本发明在gRNA的前端150bp，后端450bp处分别设计正反向引物，用于PCR扩增包含gRNA在内的600bp左右的片段，将PCR产物送到擎科测序公司测序。分析测序结果，本发明发现，大部分T0代转基因植物为杂合突变体。本发明继续播种T1代突变体，然后从T1代鉴定出纯合突变体，用于观察表型及统计性状。提取T1代突变体的DNA，利用鉴定突变体引物扩增含有靶点序列的片段，用对应的限制性内切酶酶切PCR产物，如果该位点没发生突变，则PCR产物被完全切开，如果该幼苗为杂合突变体，则PCR产物被部分酶切为两段，如果该幼苗为纯合突变体，则PCR产物不能被切开(如图2)。

三OsCKX11突变体的表型分析

本发明将鉴定得到的OsCKX11的纯合突变体种植于人工智能培养室以及大田(浙江金华和海南陵水)，均表现出一致的表型性状。不论是植株的正常衰老还是在离体状态下，突变体叶片均晚衰(图3)，抽穗后叶绿素含量以及灌浆期光合速率也比野生型高(图4)。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

原始野生型材料为日本晴(NIP)，三个独立株系突变体分别为cx11-1、cx11-2和cx11-3。

植物种植：

取适量水稻种子置于牛皮纸袋内，将牛皮纸袋浸于室温水中48小时后，将牛皮纸袋从水中取出，包裹在湿润毛巾中，毛巾置于开口的塑料袋内，放置到35℃培养箱，36小时后，水稻芽长0.5cm左右后，播种到土里。待水稻苗长到15cm左右进行插秧或者移栽到装满土的塑料方盆。

离体叶片处理：

选取处于孕穗期且穗长相等的主穗的剑叶，将叶片中间部分剪成长约3cm的片段，置于水中在室温下黑暗处理3天后，取出叶片观察叶色。

叶绿素含量测定：

当水稻剑叶开始抽穗后，每间隔10天测定主穗剑叶的叶绿素含量，使用CCM-200plus(美国OPTI-sciences)分别在叶片的叶尖、中间和基部测定3个数值，取其平均值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 浙江师范大学

<120>一种水稻衰老控制基因OsCKX11及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 518

<212> 氨基酸

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Met Leu Ala Tyr Met Asp His Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Asp

1 5 10 15

Ala Gly Ala Glu Pro Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Ala Glu Phe Ala

20 25 30

Ala Ala Met Asp Phe Gly Gly Leu Val Ser Ala Arg Pro Ala Ala Val

35 40 45

Val Arg Pro Ala Ser Ser Asp Asp Val Ala Ser Ala Ile Arg Ala Ala

50 55 60

Ala Arg Thr Ala His Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Asn Gly His Ser

65 70 75 80

Val Ala Gly Gln Ala Met Ala Arg Gly Gly Leu Val Leu Asp Met Arg

85 90 95

Ala Leu Pro Arg Arg Met Gln Leu Val Val Ala Pro Ser Gly Glu Lys

100 105 110

Phe Ala Asp Val Pro Gly Gly Ala Leu Trp Glu Glu Val Leu His Trp

115 120 125

Ala Val Ser Lys His Gly Leu Ala Pro Ala Ser Trp Thr Asp Tyr Leu

130 135 140

Arg Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Gly Gly Val Ser Gly Gln

145 150 155 160

Ser Phe Arg Tyr Gly Pro Gln Val Ser Asn Val Ala Gln Leu Glu Val

165 170 175

Val Thr Gly Asp Gly Glu Cys His Val Cys Ser Arg Ser Ala Asp Pro

180 185 190

Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile

195 200 205

Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu Ser Pro Ala Pro Gln Thr Val Arg Trp

210 215 220

Thr Arg Val Val Tyr Ala Ser Phe Ala Asp Tyr Ala Ala Asp Ala Glu

225 230 235 240

Trp Leu Val Thr Arg Pro Pro His Glu Ala Phe Asp Tyr Val Glu Gly

245 250 255

Phe Ala Phe Val Arg Ser Asp Asp Pro Val Asn Gly Trp Pro Thr Val

260 265 270

Pro Ile Pro Asp Gly Ala His Phe Asp Ala Ser Leu Leu Pro Ala Asn

275 280 285

Ala Gly Pro Val Leu Tyr Cys Leu Glu Val Ala Leu Tyr Gln Arg Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp Asp Met Asp Lys Arg Val Gly Glu

305 310 315 320

Met Met Arg Gln Leu Lys Tyr Val Arg Gly Leu Glu Phe Ala Ala Gly

325 330 335

Val Gly Tyr Val Asp Phe Leu Ser Arg Val Asn Arg Val Glu Asp Glu

340 345 350

Ala Arg Arg Asn Gly Ser Trp Ala Ala Pro His Pro Trp Leu Asn Leu

355 360 365

Phe Ile Ser Ser Arg Asp Ile Ala Ala Phe Asp Arg Ala Val Leu Asn

370 375 380

Gly Met Leu Ala Asp Gly Val Asp Gly Pro Met Leu Ile Tyr Pro Met

385 390 395 400

Leu Lys Ser Lys Trp Asp Pro Ala Thr Ser Val Ala Leu Pro Asn Gly

405 410 415

Glu Ile Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Phe Cys Arg Pro Tyr Pro

420 425 430

Gly Gly Gly Pro Pro Val Asp Glu Leu Val Ala Gln Asn Asn Ala Ile

435 440 445

Ile Asp Ala Cys Arg Ser Asn Gly Tyr Asp Tyr Lys Ile Tyr Phe Pro

450 455 460

Ser Tyr His Ala Gln Ser Asp Trp Ser Arg His Phe Gly Ala Lys Trp

465 470 475 480

Ser Arg Phe Val Asp Arg Lys Ala Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu

485 490 495

Ala Pro Gly Gln Asn Ile Phe Ala Arg Thr Pro Ser Ser Val Ala Ala

500 505 510

Ala Ala Ala Val Ile Val

515

Claims

1.一种OsCKX11基因在抑制水稻叶片衰老中的用途，其特征在于，定点敲除OsCKX11，OsCKX11基因的氨基酸序列为SEQ ID No.1。