CN101235381A - 小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1序列及其克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新发现的小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1的克隆、重组方法及功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。利用聚合酶链式反应(PCR)、反向聚合酶链式反应(IPCR)、巢式聚合酶链式反应以及反转录聚合酶链式反应(RT－PCR)等技术，获得了一个小麦全长细胞分裂素氧化酶cDNA序列，命名为TaCKX1。进一步利用TaCKX1的全长cDNA序列构建植物反义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥与对照野生型相比，表现出丛生症状，抽薹增多。因此，该基因转化小麦、水稻等农作物中，将会改变内源细胞分裂素的含量，改变株型，对其产量和育种能够产生重大影响，具有重要的经济效益和社会效应。

Description

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1序列及其克隆与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于小麦(Triticum aestivum L.)的细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX，EC 1.5.99.12)，命名为TaCKX1。本发明还涉及编码该细胞分裂素氧化酶的基因，含有这类基因的载体，和利用这类基因改变植物株型的方法，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

细胞分裂素调控着细胞分裂，参与大量的发育过程，如茎、根的伸长，叶片扩展，叶绿体成熟等(Mok，1994，Boca Raton，pp155-166.)。细胞内细胞分裂素的动态平衡依赖于从头合成的速率、细胞分裂素接合(主要是糖苷键)的断裂和最终的输出及分解速率(Mok&Mok，2001，Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol，52，89-118.)。而植物组织中细胞分裂素的分解，在很大程度上是依赖于细胞分裂素氧化(脱氢)酶(cytokin oxidase/dehydrogenase，CKX)(EC1.5.99.12)的作用而实现的(Galuszka，等，2001，Eur JBiochem，268，450-461.)。由于组织中细胞分裂素氧化酶活性的变化可改变细胞分裂素的含量，所以细胞分裂素氧化酶是控制细胞分裂素水平、参与细胞分裂素依赖的发育过程的重要因素。细胞分裂素氧化酶首先是在玉米中发现的，能特异地降解细胞分裂素类异戊二烯侧链的不饱和键，该反应是一个不可逆反应(Houba-Herin，等，1999，Plant J.，17，615-626；Morris，等，1999，BiochemBiophys Res Comm，255，328-333；Bilyeu，等，2001，Plant Physiology，125，378-386.)。

在石斛兰(Dendrobium orchid)或拟南芥中过量表达兰花DSCKX1基因，导致内源细胞分裂素的含量显著下降，从而产生了细胞分裂素缺失表型，如茎生长延迟，而根的生长加速(Yang，等，2003，Plant Molecular Biology，51，237-248.)。相反地，反义转基因植物则表现茎的快速增生和根的生长受抑，相对于野生型来说，具有更多的内源细胞分裂素含量。过量表达AtCKX1-4基因的拟南芥植株中，内源细胞分裂素的含量显著下降，表现多种细胞分裂素缺失表型，促使胚乳细胞分裂与生长，导致转基因种子明显增大(Werner，等，2003，The Plant Cell，15，2532-2550.)。在OsCKX2基因功能缺失的水稻植株中，内源细胞分裂素含量比对照增加，特别是在分生组织与生殖器官中增加更为显著，并且小穗数和小穗中籽粒数显著增加(Ashikari，等，2005，Science，309，741-745.)。因此细胞分裂素对提高农作物产量有着潜在价值。

小麦是世界上重要粮食作物之一，人口的增长迫切需要通过小麦改良来提高产量。目前尚无小麦全长细胞分裂素氧化酶基因的报道。本发明人根据其它植物中发表的细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列，设计简并引物，利用聚合酶链式反应(PCR)、反向聚合酶链式反应(IPCR)、反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)等技术，从小麦(Triticum aestivum)中分离出编码细胞分裂素氧化酶的基因序列TaGCKX1、cDNA序列TaCKX1。进一步构建反义表达载体，转化模式植物拟南芥。与野生型植物相比，转基因植物株型改变，表现丛生症状，分枝增多。

(三)发明内容

本发明首次从小麦中分离出了编码细胞分裂素氧化酶的基因序列和全长cDNA序列，命名为TaCKX1，并将TaCKX1全长cDNA反向连接到植物表达载体pROKII的CaMV35S启动子下游，利用农杆菌侵染转化拟南芥，转基因植株表型改变，出现丛生症状。

本发明提供的小麦TaCKX1基因的开放阅读框架为1575bp，编码524aa。将这个基因编码的氨基酸序列在GenBank里进行检索发现，这个基因与玉米细胞分裂素氧化酶(ZmCKX，CAA77151)、水稻细胞分裂素氧化酶(OsCKX，EAY72836)有较高的同源性(见附图1)，其数值为70％和66％的氨基酸同源性。该结果表明这个基因为细胞分裂素氧化酶基因在小麦中的同源基因。

本发明的再一个目的是提供一种改变植株形态的方法，但也包括与细胞分裂素参与调控的其它生物学性状的改变。该方法包括用本发明的细胞分裂素氧化酶基因的反义表达载体转化植物。所述转化是通过农杆菌介导的方法进行，但也可以用基因枪法进行。所用表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、电穿孔等导入植物细胞。

序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO 1的信息

(a)序列特征

*长度：2367碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：小麦

(f)序列描述：SEQ.ID.NO 1

tcatcatcgc attaacgcac ccagctagct aaacgcgagg cgctaatggc gatcgtttac     60

gtgcttctgg tggcgctgat caccgccgcg tctcatgcgc cgcacggcgc gcacggccag    120

acgtggcacg gcgacctcgc ggcgctcgcc gcggcgggca agccccgcag cgaccccaac     180

gccaccctgg cggcctccac ggacttcggc aacatcacgg cggcgctccc ggcggccgtg     240

ctgttcccgt cgtccccggc ggacgtggcc gcgctcctcc gcggcgcgca caccaccgtg     300

gcgtggccct acaccatctc cttccgcggg cgcgggcact ccctgatggg gcaggccctg     360

gccccgggcg gcgtggtcgt ggacatgccg tccctgggcg gcccgtcctc cgcggcgcgc     420

atcaacgtgt cggcggacgg ccagtacgtg gacgccggcg gcgagcagat gtggatcgac     480

gtgctgcgcg cgacgctgga gcgcggcgtg gcgccgcgct cgtggacgga ctacctccac     540

ctgaccgtcg gcggcacgct ctcgaacgcc ggcatcagcg gccagaccta ccggcacggc     600

ccccagattt ccaacgtcct ggagctggac gtcatcaccg gtacgtacgt acgcgcgcac     660

gatatgggca agcaccagca tgcaccacgc tcacaagcaa ctccctctcg caaagtagtt     720

acgtacccca cactgcaatg ctgcaaaaat agctataact tgtttcggtg caactcgcaa     780

ctcgctcatc ttctacgtac gcacacggca gtctcagaag gtgccggtaa aaaaatggca     840

gctagttacc acagctgacc agctggcggc cggctgctgg gccggccggg cagccggcgt     900

cgacgtcttt caaatttcaa tagatttgcc ggcggccaac gacgcgttga ctttgacatt     960

tcccttctgt gttaaattac tactccatta ctccacccgg cccggccgca tgtacctttg    1020

cgttgacacg gtgcaattaa cgcgcgtgca ggctacggcg agatggtgac gtgctccaag    1080

tcgctcagcg cggacctgtt cgacgcggtg ctgggcgggc tcggccagtt cggcgtgatc    1140

gtgcgcgccc ggatcgcgct cgagccagcg ccgacgcggg cgcggtgggc gcggctcgtc    1200

tacaccgact tcgccgcctt ctccgccgac caggagcggc tcgccgcgcc cgggacccga    1260

cggcgcgttc gggccgatga gctacctcga gggcgcggtc tacgtgaacc acagcctggc    1320

cgccgggctg aggaactcgg gcgggttctt caccgacgcc gacgtcgcag gatcgtcgcc    1380

gtcgccgcgg cgaggaacgc caccaccgtg tacgtcatcg agacgacgct caactacgac    1440

agcgccacgg ccgcgtccgt ggaccaggag ctcagcccgg tgctggcgac gctgaggcac    1500

gaggaggggc tcgcgttcgt gcgggacgcg tcgtacctgg agttcctgga ccgggtgcac    1560

ggcgaggagg tggcgctgga caagatcggg ctgtggcgcg tcccgcaccc ctggctcaac    1620

gtgctcgtgc cccgctcccg catcgccgac ttcgacagcg gcgtcttcaa gggcatcctc    1680

caggacaccg acatcgccgg gcctctcgtc gtctacccgc tcaacaaatc caagtacgta    1740

cgcctccatc gtacatgcat gcatgcgatc ctgcatctgc atggtatata ctcacgcact    1800

taactgacac cggctctggc tcggtcgtcg tttcaggtgg gacgacggca tgtcggcggt    1860

gacgccggcg gagaaggtgt tctacgcggt gtcgctgctc ttctcgtcgg tggccgacga  1920

cctgaagcgg ctggaggcgc agaaccagaa gatactgcgg ttctgcgacc tcgccgggat  1980

agggtacaag gagtacctgg cgcactacac ggcccacggc gactgggtcc gacacttcgg  2040

cggcaagtgg aaccgcttcg tggagatgaa ggacaagtac gaccccaaga ggctgctctc  2100

ccctggccaa gacatcttca acctggtcct ttgagtagat gcaattacta ctagttgtta  2160

ctacttgtgg attaactcgt gtggacagta acacatcagt ttaacttcaa tttttcgatt  2220

ttactcatgc aatagcaaat ttgatagtag gtggtacggt aataatatgc tctgtcgagc  2280

ttggatctcc acatgtatcc gttactatat agcagtagta cggggtgcaa ctccgaggag  2340

caaaacacca caggataatt acccagc                                      2367

(2)SEQ.ID.NO 2的信息

(b)序列特征

*长度：1575碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：小麦

(f)序列描述：SEQ.ID.NO 2

atggcgatcg tttacgtgct tctggtggcg ctgatcaccg ccgcgtctca tgcgccgcac   60

ggcgcgcacg gccagacgtg gcacggcgac ctcgcggcgc tcgccgcggc gggcaagccc  120

cgcagcgacc ccaacgccac cctggcggcc tccacggact tcggcaacat cacggcggcg  180

ctcccggcgg ccgtgctgtt cccgtcgtcc ccggcggacg tggccgcgct cctccgcggc  240

gcgcacacca ccgtggcgtg gccctacacc atctccttcc gcgggcgcgg gcactccctg  300

atggggcagg ccctggcccc gggcggcgtg gtcgtggaca tgccgtccct gggcggcccg  360

tcctccgcgg cgcgcatcaa cgtgtcggcg gacggccagt acgtggacgc cggcggcgag  420

cagatgtgga tcgacgtgct gcgcgcgacg ctggagcgcg gcgtggcgcc gcgctcgtgg  480

acggactacc tccacctgac cgtcggcggc acgctctcga acgccggcat cagcggccag  540

acctaccggc acggccccca gatttccaac gtcctggagc tggacgtcat caccggctac     600

ggcgagatgg tgacgtgctc caagtcgctc agcgcggacc tgttcgacgc ggtgctgggc     660

gggctcggcc agttcggcgt gatcgtgcgc gcccggatcg cgctcgagcc agcgccgacg     720

cgggcgcggt gggcgcggct cgtctacacc gacttcgccg ccttctccgc cgaccaggag     780

cggctcgccg cgcccgggac ccgacggcgc gttcgggccg atgagctacc tcgagggcgc     840

ggtctacgtg aaccacagcc tggccgccgg gctgaggaac tcgggcgggt tcttcaccga     900

cgccgacgtc gcaggatcgt cgccgtcgcc gcggcgagga acgccaccac cgtgtacgtc     960

atcgagacga cgctcaacta cgacagcgcc acggccgcgt ccgtggacca ggagctcagc    1020

ccggtgctgg cgacgctgag gcacgaggag gggctcgcgt tcgtgcggga cgcgtcgtac    1080

ctggagttcc tggaccgggt gcacggcgag gaggtggcgc tggacaagat cgggctgtgg    1140

cgcgtcccgc acccctggct caacgtgctc gtgccccgct cccgcatcgc cgacttcgac    1200

agcggcgtct tcaagggcat cctccaggac accgacatcg ccgggcctct cgtcgtctac    1260

ccgctcaaca aatccaagtg ggacgacggc atgtcggcgg tgacgccggc ggagaaggtg    1320

ttctacgcgg tgtcgctgct cttctcgtcg gtggccgacg acctgaagcg gctggaggcg    1380

cagaaccaga agatactgcg gttctgcgac ctcgccggga tagggtacaa ggagtacctg    1440

gcgcactaca cggcccacgg cgactgggtc cgacacttcg gcggcaagtg gaaccgcttc    1500

gtggagatga aggacaagta cgaccccaag aggctgctct cccctggcca agacatcttc    1560

aacctggtcc tttga                                                     1575

(3)SEQ.ID.NO 3的信息

(c)序列特征

*长度：524氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO 3

MAIVYVLLVA LITAASHAPH GAHGQTWHGD LAALAAAGKP RSDPNATLAA STDFGNITAA     60

LPAAVLFPSS PADVAALLRG AHTTVAWPYT ISFRGRGHSL MGQALAPGGV VVDMPSLGGP    120

SSAARINVSA DGQYVDAGGE QMWIDVLRAT LERGVAPRSW TDYLHLTVGG TLSNAGISGQ    180

TYRHGPQISN VLELDVITGY GEMVTCSKSL SADLFDAVLG GLGQFGVIVR ARIALEPAPT    240

RARWARLVYT DFAAFSADQE RLAAPGTRRR VRADELPRGR GLREPQPGRR AEELGRVLHR    300

RRRRRIVAVA AARNATTVYV IETTLNYDSA TAASVDQELS PVLATLRHEE GLAFVRDASY    360

LEFLDRVHGE EVALDKIGLW RVPHPWLNVL VPRSRIADFD SGVFKGILQD TDIAGPLVVY    420

PLNKSKWDDG MSAVTPAEKV FYAVSLLFSS VADDLKRLEA QNQKILRFCD LAGIGYKEYL    480

AHYTAHGDWV RHFGGKWNRF VEMKDKYDPK RLLSPGQDIF NLVL                     524

从小麦的叶片中提取DNA，根据ZmCKX(玉米)和OsCKX(水稻)中保守的氨基酸序列，设计一对简并引物，进行常规的聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，获得TaCKX1基因的部分序列。然后根据获得的序列信息，设计一对反向聚合酶链式反应(IPCR)引物，用经限制性内切酶XbaI酶切并经T₄DNA连接酶连接的小麦DNA为模板进行反向扩增，所获产物同样如上所述进行重组和测序。根据获得的序列信息，设计一对用于扩增全长细胞分裂素氧化酶编码基因的特异引物。用小麦基因组DNA为模板，利用上述的一对特异引物进行常规扩增，获得含有内含子序列的小麦TaCKX1基因序列，命名为TaGCKX1。从小麦叶片中提取总RNA，1然后反转录成cDNA，利用上述的一对特异引物进行常规扩增，获得了一个全长cDNA，命名为TaCKX1。进一步利用TaCKX1的全长cDNA序列构建植物反义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥与对照野生型相比，表现出丛生症状，抽薹增多。因此，该基因转化小麦、水稻等农作物中，将会改变内源细胞分裂素的含量，改变株型，对其产量和育种能够产生重大影响，具有重要的经济效益和社会效应。

(四)附图说明：

图1小麦TaCKX1与玉米中ZmCKX和水稻中OsCKX的氨基酸同源性比较；

图2表示构建的小麦细胞分裂素氧化酶基因反义植物表达载体pR-AntiTaCKX1；

图3常规聚合酶链式反应鉴定转基因植物。M为DNA分子量标准，是λDNA经限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切的产物；+为重组质粒的扩增；-为未转基因的野生型拟南芥；1-8为转基因的抗性拟南芥。

图4表示转基因拟南芥与对照的形态区别。左为野生型对照；右为转基因植株，示丛生芽。

(五)实施实施方式：

实施方式1：小麦TaCKX1基因的克隆、序列分析

(1)小麦幼苗DNA的提取：采用CTAB法从小麦的幼苗叶片中提取DNA。

(2)设计引物：根据ZmCKX1(玉米)和OsCKX1(水稻)中保守的氨基酸序列，设计一对简并引物，进行常规的聚合酶链式反应(PCR)。

(3)基因克隆：扩增完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，得到约1.7kb片段。用凝胶回收试剂盒回收DNA片断，将其与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按大连宝生物公司说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。

(4)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

(5)序列测定：本工作在上海Invitrogen公司进行。

(6)侧翼序列的分离：根据上述(5)所测定的序列结果，设计两对巢式反向PCR引物，准备做下一步的反向聚合酶链式反应(IPCR)。利用限制性内切酶XbaI酶切小麦的基因组DNA，然后用T₄DNA连接酶连接，用此连接产物作为扩增的模板。以经上述处理的DNA为模板，先用第一对引物对进行扩增，再从扩增产物中取出1微升作为第二次扩增的模板，用第二次引物进行巢式扩增。扩增产物经电泳分离并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并筛选、鉴定和测序，步骤同上述(3)、(4)和(5)。

(7)小麦细胞分裂素氧化酶基因TaGCKX1的克隆

根据反向聚合酶链式反应的测序结果，设计一对用于扩增全长TaGCKX1基因的引物对。用(1)提取的小麦叶片DNA做模板，进行常规聚合酶链式反应。扩增产物经电泳分离并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并筛选、鉴定和测序，步骤同上述(3)、(4)和(5)。经过扩增，得到细胞分裂素氧化酶全长序列TaGCKX1，共2367bp。通过GenBank网站的软件，对序列进行分析，预测该序列内有两个内含子序列。

(8)小麦细胞分裂素氧化酶cDNA序列TaCKX1的克隆

为了获得细胞分裂素氧化酶的cDNA序列并鉴定内含子区，进行了RT-PCR扩增。首先用Roche Applied Science公司Tripure Isolation Reagent总RNA提取试剂盒提取小麦叶片总RNA，按Invitrogen公司的ThermoScript^TM RT-PCRSystem反转录试剂盒说明书进行单链cDNA序列的合成，以小麦第一链cDNA为模板进行PCR扩增。50μl反应体系中含第一链cDNA产物4μl、25μl的LA GCTaq DNA聚合酶缓冲液GC buffer I、1μl 10mmol/L的dNTP、分别加1μl 50μmol/L的上游引物和下游引物、0.5μl LA GC Taq DNA聚合酶，其余用灭菌双蒸水补齐。反应条件为95℃预变性3min；然后两步法循环35次：94℃变性1min，68℃退火及延伸4min；最后68℃延伸10min。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收和按照TaKaRa DNA片段凝胶回收试剂盒纯化回收后，以E.coliDH5α为宿主菌，克隆于PM18-T载体上，经蓝白斑筛选后，对每个阳性克隆用通用引物进行PCR鉴定和提取质粒进行酶切鉴定后，送上海Invitrogen公司测序。从每个培养大肠杆菌的平皿测序3个独立的阳性克隆，序列完全一致方可采用。推导氨基酸序列并用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、DNAMAN软件等进行序列分析。

以上克隆TaCKX1序列的方法也适应于克隆小麦或其它植物的细胞分裂素氧化酶家族基因序列，也可参考发明内容所述的SEQ NO.3设计简并引物进行扩增。而对于TaCKX1编码序列的克隆，也可以直接根据发明内容所述的SEQ NO.1和SEQ NO.2设计引物进行扩增。

(9)同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与GenBank中的序列进行比较。

实施方式2：小麦细胞分裂素氧化酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别见“发明内容”部分。

实施方式3：反义表达载体的构建

(1)根据分离的TaCKX1基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5’-ACGCGAGGCGCTAATGGC-3’；

反向引物：5’-TTGCATCTACTCAAAGGACCAGG-3’。

以叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

(2)PCR产物竟琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶中回收扩增片断并与pMD18-T载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。碱法提取质粒DNA。进行序列测定。

(3)用HincII和BamHI双酶切将该基因从pMD18-T载体上切下，与经SmaI和BamHI双酶切的pROKII连接，构建反义表达载体pR-AntiTaCKX1(见附图2)。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。然后将转化的大肠杆菌在含卡那霉素的LB固体平皿上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404.

实施方式4：基因功能分析

(1)种植拟南芥。

(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50微克/毫升卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养。

(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl₂，0.5％SilwetL-77)悬浮，菌液OD₆₀₀在0.8左右。

(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。

(5)将收获的种子在筛选培养基(1/2MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素40微克/毫升)筛选，得到抗性植株。

(5)根据CaMV35S启动子序列和反向的TaCKX1序列设计一对引物：正向引物5’-TCACAAACCAAGGCAAGTAA-3’；反向引物5’-AGACGACGCTCAACTACGA-3’。提取野生型及抗性植株的基因组DNA，进行常规聚合酶链式反应，结果见附图3。

(6)将T3代纯合株系种子于1/2MS培养基上培养，同时种植野生型作对照。观察植株表型变化，结果见附图4。

序列表

<110>山东农业大学

<120>小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1序列及其克隆与应用

<160>3

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>2367

SequenceName：TaGCKX1

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<221>1-2367

<400>1

tcatcatcgc attaacgcac ccagctagct aaacgcgagg cgctaatggc gatcgtttac     60

gtgcttctgg tggcgctgat caccgccgcg tctcatgcgc cgcacggcgc gcacggccag    120

acgtggcacg gcgacctcgc ggcgctcgcc gcggcgggca agccccgcag cgaccccaac    180

gccaccctgg cggcctccac ggacttcggc aacatcacgg cggcgctccc ggcggccgtg    240

ctgttcccgt cgtccccggc ggacgtggcc gcgctcctcc gcggcgcgca caccaccgtg    300

gcgtggccct acaccatctc cttccgcggg cgcgggcact ccctgatggg gcaggccctg    360

gccccgggcg gcgtggtcgt ggacatgccg tccctgggcg gcccgtcctc cgcggcgcgc    420

atcaacgtgt cggcggacgg ccagtacgtg gacgccggcg gcgagcagat gtggatcgac    480

gtgctgcgcg cgacgctgga gcgcggcgtg gcgccgcgct cgtggacgga ctacctccac    540

ctgaccgtcg gcggcacgct ctcgaacgcc ggcatcagcg gccagaccta ccggcacggc    600

ccccagattt ccaacgtcct ggagctggac gtcatcaccg gtacgtacgt acgcgcgcac    660

gatatgggca agcaccagca tgcaccacgc tcacaagcaa ctccctctcg caaagtagtt    720

acgtacccca cactgcaatg ctgcaaaaat agctataact tgtttcggtg caactcgcaa    780

ctcgctcatc ttctacgtac gcacacggca gtctcagaag gtgccggtaa aaaaatggca    840

gctagttacc acagctgacc agctggcggc cggctgctgg gccggccggg cagccggcgt    900

cgacgtcttt caaatttcaa tagatttgcc ggcggccaac gacgcgttga ctttgacatt    960

tcccttctgt gttaaattac tactccatta ctccacccgg cccggccgca tgtacctttg    1020

cgttgacacg gtgcaattaa cgcgcgtgca ggctacggcg agatggtgac gtgctccaag    1080

tcgctcagcg cggacctgtt cgacgcggtg ctgggcgggc tcggccagtt cggcgtgatc    1140

gtgcgcgccc ggatcgcgct cgagccagcg ccgacgcggg cgcggtgggc gcggctcgtc    1200

tacaccgact tcgccgcctt ctccgccgac caggagcggc tcgccgcgcc cgggacccga    1260

cggcgcgttc gggccgatga gctacctcga gggcgcggtc tacgtgaacc acagcctggc    1320

cgccgggctg aggaactcgg gcgggttctt caccgacgcc gacgtcgcag gatcgtcgcc    1380

gtcgccgcgg cgaggaacgc caccaccgtg tacgtcatcg agacgacgct caactacgac    1440

agcgccacgg ccgcgtccgt ggaccaggag ctcagcccgg tgctggcgac gctgaggcac    1500

gaggaggggc tcgcgttcgt gcgggacgcg tcgtacctgg agttcctgga ccgggtgcac    1560

ggcgaggagg tggcgctgga caagatcggg ctgtggcgcg tcccgcaccc ctggctcaac    1620

gtgctcgtgc cccgctcccg catcgccgac ttcgacagcg gcgtcttcaa gggcatcctc    1680

caggacaccg acatcgccgg gcctctcgtc gtctacccgc tcaacaaatc caagtacgta    1740

cgcctccatc gtacatgcat gcatgcgatc ctgcatctgc atggtatata ctcacgcact    1800

taactgacac cggctctggc tcggtcgtcg tttcaggtgg gacgacggca tgtcggcggt    1860

gacgccggcg gagaaggtgt tctacgcggt gtcgctgctc ttctcgtcgg tggccgacga    1920

cctgaagcgg ctggaggcgc agaaccagaa gatactgcgg ttctgcgacc tcgccgggat    1980

agggtacaag gagtacctgg cgcactacac ggcccacggc gactgggtcc gacacttcgg    2040

cggcaagtgg aaccgcttcg tggagatgaa ggacaagtac gaccccaaga ggctgctctc    2100

ccctggccaa gacatcttca acctggtcct ttgagtagat gcaattacta ctagttgtta    2160

ctacttgtgg attaactcgt gtggacagta acacatcagt ttaacttcaa tttttcgatt    2220

ttactcatgc aatagcaaat ttgatagtag gtggtacggt aataatatgc tctgtcgagc    2280

ttggatctcc acatgtatcc gttactatat agcagtagta cggggtgcaa ctccgaggag    2340

caaaacacca caggataatt acccagc                                        2367

<210>2

<211>1575

SequenceName：TaCKX1

<212>cDNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<221>1-1575

<400>2

atggcgatcg tttacgtgct tctggtggcg ctgatcaccg ccgcgtctca tgcgccgcac      60

ggcgcgcacg gccagacgtg gcacggcgac ctcgcggcgc tcgccgcggc gggcaagccc     120

cgcagcgacc ccaacgccac cctggcggcc tccacggact tcggcaacat cacggcggcg     180

ctcccggcgg ccgtgctgtt cccgtcgtcc ccggcggacg tggccgcgct cctccgcggc     240

gcgcacacca ccgtggcgtg gccctacacc atctccttcc gcgggcgcgg gcactccctg     300

atggggcagg ccctggcccc gggcggcgtg gtcgtggaca tgccgtccct gggcggcccg     360

tcctccgcgg cgcgcatcaa cgtgtcggcg gacggccagt acgtggacgc cggcggcgag     420

cagatgtgga tcgacgtgct gcgcgcgacg ctggagcgcg gcgtggcgcc gcgctcgtgg     480

acggactacc tccacctgac cgtcggcggc acgctctcga acgccggcat cagcggccag     540

acctaccggc acggccccca gatttccaac gtcctggagc tggacgtcat caccggctac     600

ggcgagatgg tgacgtgctc caagtcgctc agcgcggacc tgttcgacgc ggtgctgggc     660

gggctcggcc agttcggcgt gatcgtgcgc gcccggatcg cgctcgagcc agcgccgacg     720

cgggcgcggt gggcgcggct cgtctacacc gacttcgccg ccttctccgc cgaccaggag     780

cggctcgccg cgcccgggac ccgacggcgc gttcgggccg atgagctacc tcgagggcgc     840

ggtctacgtg aaccacagcc tggccgccgg gctgaggaac tcgggcgggt tcttcaccga     900

cgccgacgtc gcaggatcgt cgccgtcgcc gcggcgagga acgccaccac cgtgtacgtc     960

atcgagacga cgctcaacta cgacagcgcc acggccgcgt ccgtggacca ggagctcagc    1020

ccggtgctgg cgacgctgag gcacgaggag gggctcgcgt tcgtgcggga cgcgtcgtac    1080

ctggagttcc tggaccgggt gcacggcgag gaggtggcgc tggacaagat cgggctgtgg    1140

cgcgtcccgc acccctggct caacgtgctc gtgccccgct cccgcatcgc cgacttcgac    1200

agcggcgtct tcaagggcat cctccaggac accgacatcg ccgggcctct cgtcgtctac    1260

ccgctcaaca aatccaagtg ggacgacggc atgtcggcgg tgacgccggc ggagaaggtg    1320

ttctacgcgg tgtcgctgct cttctcgtcg gtggccgacg acctgaagcg gctggaggcg    1380

cagaaccaga agatactgcg gttctgcgac ctcgccggga tagggtacaa ggagtacctg    1440

gcgcactaca cggcccacgg cgactgggtc cgacacttcg gcggcaagtg gaaccgcttc    1500

gtggagatga aggacaagta cgaccccaag aggctgctct cccctggcca agacatcttc    1560

aacctggtcc tttga                                                     1575

<210>3

<211>524

SequenceName：TaCKX1

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<221>1-524

<400>3

MAIVYVLLVA LITAASHAPH GAHGQTWHGD LAALAAAGKP RSDPNATLAA STDFGNITAA     60

LPAAVLFPSS PADVAALLRG AHTTVAWPYT ISFRGRGHSL MGQALAPGGV VVDMPSLGGP    120

SSAARINVSA DGQYVDAGGE QMWIDVLRAT LERGVAPRSW TDYLHLTVGG TLSNAGISGQ    180

TYRHGPQISN VLELDVITGY GEMVTCSKSL SADLFDAVLG GLGQFGVIVR ARIALEPAPT    240

RARWARLVYT DFAAFSADQE RLAAPGTRRR VRADELPRGR GLREPQPGRR AEELGRVLHR    300

RRRRRIVAVA AARNATTVYV IETTLNYDSA TAASVDQELS PVLATLRHEE GLAFVRDASY    360

LEFLDRVHGE EVALDKIGLW RVPHPWLNVL VPRSRIADFD SGVFKGILQD TDIAGPLVVY    420

PLNKSKWDDG MSAVTPAEKV FYAVSLLFSS VADDLKRLEA QNQKILRFCD LAGIGYKEYL    480

AHYTAHGDWV RHFGGKWNRF VEMKDKYDPK RLLSPGQDIF NLVL                     524

Claims (3)

1.一种克隆的小麦细胞分裂素氧化酶基因cDNA序列TaCKX1，其特征在于它的核苷酸序列为：

atggcgatcg tttacgtgct tctggtggcg ctgatcaccg ccgcgtctca tgcgccgcac     60

ggcgcgcacg gccagacgtg gcacggcgac ctcgcggcgc tcgccgcggc gggcaagccc     120

cgcagcgacc ccaacgccac cctggcggcc tccacggact tcggcaacat cacggcggcg     180

ctcccggcgg ccgtgctgtt cccgtcgtcc ccggcggacg tggccgcgct cctccgcggc     240

gcgcacacca ccgtggcgtg gccctacacc atctccttcc gcgggcgcgg gcactccctg     300

atggggcagg ccctggcccc gggcggcgtg gtcgtggaca tgccgtccct gggcggcccg     360

tcctccgcgg cgcgcatcaa cgtgtcggcg gacggccagt acgtggacgc cggcggcgag     420

cagatgtgga tcgacgtgct gcgcgcgacg ctggagcgcg gcgtggcgcc gcgctcgtgg     480

acggactacc tccacctgac cgtcggcggc acgctctcga acgccggcat cagcggccag     540

acctaccggc acggccccca gatttccaac gtcctggagc tggacgtcat caccggctac     600

ggcgagatgg tgacgtgctc caagtcgctc agcgcggacc tgttcgacgc ggtgctgggc     660

gggctcggcc agttcggcgt gatcgtgcgc gcccggatcg cgctcgagcc agcgccgacg     720

cgggcgcggt gggcgcggct cgtctacacc gacttcgccg ccttctccgc cgaccaggag     780

cggctcgccg cgcccgggac ccgacggcgc gttcgggccg atgagctacc tcgagggcgc     840

ggtctacgtg aaccacagcc tggccgccgg gctgaggaac tcgggcgggt tcttcaccga     900

cgccgacgtc gcaggatcgt cgccgtcgcc gcggcgagga acgccaccac cgtgtacgtc     960

atcgagacga cgctcaacta cgacagcgcc acggccgcgt ccgtggacca ggagctcagc    1020

ccggtgctgg cgacgctgag gcacgaggag gggctcgcgt tcgtgcggga cgcgtcgtac    1080

ctggagttcc tggaccgggt gcacggcgag gaggtggcgc tggacaagat cgggctgtgg    1140

cgcgtcccgc acccctggct caacgtgctc gtgccccgct cccgcatcgc cgacttcgac    1200

agcggcgtct tcaagggcat cctccaggac accgacatcg ccgggcctct cgtcgtctac    1260

ccgctcaaca aatccaagtg ggacgacggc atgtcggcgg tgacgccggc ggagaaggtg    1320

ttctacgcgg tgtcgctgct cttctcgtcg gtggccgacg acctgaagcg gctggaggcg    1380

cagaaccaga agatactgcg gttctgcgac ctcgccggga tagggtacaa ggagtacctg    1440

gcgcactaca cggcccacgg cgactgggtc cgacacttcg gcggcaagtg gaaccgcttc    1500

gtggagatga aggacaagta cgaccccaag aggctgctct cccctggcca agacatcttc    1560

aacctggtcc tttga                                                     1575

2.根据权利要求1所述的一种克隆的小麦细胞分裂素氧化酶基因cDNA序列TaCKX1，其特征在于该基因编码的氨基酸序列为：

MAIVYVLLVA LITAASHAPH GAHGQTWHGD LAALAAAGKP RSDPNATLAA STDFGNITAA     60

LPAAVLFPSS PADVAALLRG AHTTVAWPYT ISFRGRGHSL MGQALAPGGV VVDMPSLGGP    120

SSAARINVSA DGQYVDAGGE QMWIDVLRAT LERGVAPRSW TDYLHLTVGG TLSNAGISGQ    180

TYRHGPQISN VLELDVITGY GEMVTCSKSL SADLFDAVLG GLGQFGVIVR ARIALEPAPT    240

RARWARLVYT DFAAFSADQE RLAAPGTRRR VRADELPRGR GLREPQPGRR AEELGRVLHR    300

RRRRRIVAVA AARNATTVYV IETTLNYDSA TAASVDQELS PVLATLRHEE GLAFVRDASY    360

LEFLDRVHGE EVALDKIGLW RVPHPWLNVL VPRSRIADFD SGVFKGILQD TDIAGPLVVY    420

PLNKSKWDDG MSAVTPAEKV FYAVSLLFSS VADDLKRLEA QNQKILRFCD LAGIGYKEYL    480

AHYTAHGDWV RHFGGKWNRF VEMKDKYDPK RLLSPGQDIF NLVL                     524

3.根据权利要求1所述的小麦细胞分裂素氧化酶基因cDNA序列TaCKX1在改变植物株型中的用途，其特征在于该基因在转基因拟南芥中反义表达，可使转基因后代分枝增多，株型改变。

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