CN106135239B - 细胞分裂素在调控水稻对纹枯病的抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞分裂素在调控水稻对纹枯病的抗性中的应用。本发明所提供的应用具体为细胞分裂素或者具有调控植物中细胞分裂素含量功能的物质在调控植物对纹枯病抗性中的应用。本发明研究发现体外喷施CK类物质或者提高水稻内源性CK的含量，可增强水稻对纹枯病的抗性。本发明为进一步探讨CK在植物抗病防卫反应中的信号机制提供依据，同时也为水稻抗纹枯病分子育种开辟一条新的思路。

Description

细胞分裂素在调控水稻对纹枯病的抗性中的应用
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，涉及一种细胞分裂素在调控水稻对纹枯病的抗性中的应用。
背景技术
细胞分裂素(Cytokinins，CKs)是一类嘌呤衍生的植物激素，最早作为植物激素被发现是其具有促进细胞分裂的作用(Miller CO,Skoog F,Von Saltza MH,Strong FM(1955)Kinetin,a cell division factor from deoxyribonucleic acid1.J AmericanChem Soci77:1392-1392)，参与调节植物生理过程的多个方面，包括种子萌发、顶端优势、叶片扩展、生殖发育以及延缓衰老等(Mok MC(1994)Cytokinins and plantdevelopment.Cytokinins:chemistry,activity and function,155-166)。细胞分裂素主要以核苷酸、核苷和核苷碱基的形式存在，核苷碱基中的反式-、顺式-、二氢-玉米素(Z)和异戊烯基腺嘌呤(iP)是可识别CK受体的活性细胞分裂素(Sukbong H,Radomira V,KazukoYS,Kazuo S,Lam-Son Phan T(2012)Cytokinins:metabolism and function in plantadaptation to environmental stresses.Trends in plant science 17:172-179)。在分子水平上，CK含量是由生物合成和分解代谢进行时空调控的。CK的生物合成是由异戊烯基转移酶(IPT)催化，它是CK合成的关键限速酶；而CK代谢则主要是由CK氧化酶/脱氢酶(CKX)催化，并不可逆地降低CK(Kudo T,Kiba T,Sakakibara H(2010)Metabolism and long‐distance translocation of cytokinins.Journal of Integrative Plant Biology 52:53-60；Sakakibara H(2006)Cytokinins:activity,biosynthesis,andtranslocation.Annual Review of Plant Biology 57:431-449)。研究显示，在多种植物中通过基因工程策略调节IPT基因的表达，均可提高植物的CK含量，从而延缓叶片衰老(YiX,Burgess P,Zhang XZ,Huang BR(2016)Enhancing cytokinin synthesis byoverexpressing ipt alleviated drought inhibition of root growth throughactivating ROS-scavenging systems in Agrostis stolonifera.Journal ofExperimental Botany 67:1979-1992)。相反，过量表达CKX基因则被发现显著促进CK的降解(Ireen Novák,Miroslav Strnad,Schmülling T(2014)Overexpression of the cytosolic cytokinin oxidase/dehydrogenase(CKX7)fromArabidopsis causes specific changes in root growth and xylemdifferentiation.Plant Journal78:359-371)。降低OsCKX2表达的转基因水稻植株和野生型相比，表现出叶色变绿、生命力旺盛，并且延缓衰老(Yeh SY,Chen HW,Ng CY,Lin CY,Tseng TH,Li WH,Ku MSB(2015)Down-regulation of cytokinin oxidase 2expressionincreases tiller number and improves rice yield.Rice 8:1-13)。
细胞分裂素除了在控制植物生长和形态发育方面发挥重要作用，越来越多的研究表明，其在防御病原菌侵染反应中也起着重要的作用。植物病原菌一般分为三类：死体营养型病原菌(腐生型病原菌)、活体营养型病原菌及少量的半活体营养型病原菌。死体营养型病原菌先杀死寄主细胞，然后从死亡细胞中获取养分；而活体营养型病原菌则与寄主建立寄生关系，从活的细胞中获取养分；至于半活体营养型病原菌，其早期是活体营养型以满足自身生长需要，后期则杀死寄主细胞转为死体营养型以实现其侵染。已有报道表明，在许多植物-病原菌互作过程中都存在CK含量和CK信号通路方面的变化。例如，一些活体营养型病原菌被发现能够分泌CK类似物或激活植物产生CK，将宿主营养转移至侵染部位，从而形成“绿岛”或根瘤结构，延缓植株衰老并增强库活性(Pertry et al.2009；Pertry etal.2010；Robert-Seilaniantz et al.2007；Walters and McRoberts 2006；Walters etal.2008)。这些“绿岛”和CK介导的库强度的增强，可使活体营养型病原菌从中获取更多的养分以促进其侵染。
纹枯病(Sheath blight，SB)是水稻的三大病害之一，在适宜条件下通过侵染或破坏水稻叶鞘、叶片可造成大量的产量损失和品质下降。随着半矮秆、高氮及高产水稻品种的推广种植，纹枯病的发生日趋严重，在一些地区，已成为第一大病害。水稻纹枯病的致病菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn，R.solani)，它是一种强腐生性土传真菌，寄主范围广。立枯丝核菌在自然条件及人工条件下均很难发现其有性态瓜亡革菌(T.cucumeris)，其侵染危害水稻主要以无性态菌丝为主。在自然界中，其主要以营养菌丝和菌核的状态存在。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状，由多基因控制，致使通过传统育种手段难以改良水稻的纹枯病抗性(Chen ZX,Zhang YF,Feng F,Feng MH,Jiang W,MaYY,Pan CH,Hua HL,Li GS,Pan XB(2014)Improvement of japonica rice resistance tosheath blight by pyramiding qSB-9TQ and qSB-7TQ.Field Crops Research 161:118-127)。已有研究显示，导入抗病QTLs的渐渗系可提高水稻对纹枯病的数量抗性(Chen ZX,Zhang YF,Feng F,Feng MH,Jiang W,Ma YY,Pan CH,Hua HL,Li GS,Pan XB(2014)Improvement of japonica rice resistance to sheath blight by pyramiding qSB-9TQand qSB-7TQ.Field Crops Research 161:118-127)，但是，由于各QTLs和不同水稻背景间复杂的互作，使通过利用抗性QTLs来培育抗纹枯病水稻品种的进展非常缓慢(Chen ZX,Zhang YF,Feng F,Feng MH,Jiang W,Ma YY,Pan CH,Hua HL,Li GS,Pan XB(2014)Improvement of japonica rice resistance to sheath blight by pyramiding qSB-9TQand qSB-7TQ.Field Crops Research 161:118-127)。
转基因技术作为改良作物优良性状的有效途径，已被用于培育抗纹枯病水稻新品种。已有几个基因被证实可提高水稻对纹枯病的抗性。然而，至今未见有关调节CK含量提高水稻纹枯病抗性方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞分裂素(CK)的新用途。
本发明所提供的新用途，具体为细胞分裂素或者具有调控植物中细胞分裂素含量功能的物质在调控植物对纹枯病抗性中的应用。
所述调控具体体现为：当所述植物中的细胞分裂素含量增加时，所述植物对纹枯病的抗性相应增强；当所述植物中的细胞分裂素含量降低时，所述植物对纹枯病的抗性相应减弱。
进一步，所述应用可为如下(I)或(II)：
(I)细胞分裂素或者具有提高植物中细胞分裂素含量功能的物质在提高植物对纹枯病抗性中的应用；
(II)具有降低植物中细胞分裂素含量功能的物质在降低植物对纹枯病抗性中的应用。
本发明还保护一种提高植物对纹枯病抗性的方法。
本发明所提供的提高植物对纹枯病抗性的方法(记为“方法甲”)，可包括如下步骤：通过向待处理的植物外源喷施细胞分裂素，从而实现提高所述植物对纹枯病的抗性。
在本发明中，所述细胞分裂素具体为激动素(kinetin,KT)。
更加具体的，所述方法中是向所述待处理的植物喷施含有激动素(kinetin,KT)的溶液；所述含有激动素(kinetin,KT)的溶液中激动素(kinetin,KT)的含量为50μM。进一步，所述含有激动素(kinetin,KT)的溶液是按照如下方法制备获得的：将激动素(kinetin,KT)固体粉末溶于少量蒸馏水中，逐滴加入1M的盐酸直至激动素(kinetin,KT)固体粉末刚好完全溶解，然后加入蒸馏水和Tween 20，使得溶液中激动素(kinetin,KT)的终浓度为50μM，Tween 20的终浓度为0.1％(体积百分含量)。喷施用量为所述含有激动素(kinetin,KT)的溶液刚好可以从所述待处理的植物的叶片上滴落。
本发明所提供的提高植物对纹枯病抗性的方法(记为“方法乙”)，也可包括如下步骤：通过提高待处理的植物内源细胞分裂素的含量，从而实现提高所述植物对纹枯病的抗性。
其中，所述提高待处理的植物内源细胞分裂素的含量可通过如下(A)或(B)实现：
(A)向所述待处理的植物中导入能够促进植物中所述细胞分裂素合成的基因；
(B)抑制所述待处理的植物中能够促进所述细胞分裂素降解的基因的表达。
在本发明中，(A)中所述“能够促进植物中所述细胞分裂素合成的基因”具体为IPT基因(催化CK合成的限速酶——异戊烯基转移酶基因，isopentenyl transferases)。进一步，所述IPT基因为来自于根癌农杆菌的IPT基因，其编码序列为序列表中序列1。更加具体的，所述IPT基因是通过表达载体PSAG39:ipt导入所述待处理的植物中的；所述表达载体PSAG39:ipt记载于“Liu L,Zhou Y,Szczerba MW,Li XH,Lin YJ(2010)Identification andapplication of a rice senescence-associated promoter.Plant Physiology153:1239-1249”一文。
本发明还保护一种降低植物对纹枯病抗性的方法。
本发明所提供的降低植物对纹枯病抗性的方法(记为“方法丙”)，可包括如下步骤：通过降低待处理的植物内源细胞分裂素的含量，从而实现降低所述植物对纹枯病的抗性。
其中，所述降低待处理的植物内源细胞分裂素的含量可通过如下(C)或(D)实现：
(C)向所述待处理的植物中导入能够促进植物中所述细胞分裂素降解的基因；
(D)抑制所述待处理的植物中能够促进所述细胞分裂素合成的基因的表达。
该方法中，所述“能够促进植物中所述细胞分裂素降解的基因”具体可为CKX基因(细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因，cytokinin oxidase/dehydrogenases)。进一步，所述CKX基因具体为OsCKX4(参考基因组位点为Os01g0940000)，其编码区核苷酸序列为序列表中序列2。
上述的应用或方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。
所述育种具体可为培育对纹枯病抗性增强的植物新品种。
在本发明中，所述植物具体为水稻。相应的，所述纹枯病具体为水稻纹枯病。
相应的，在本发明的实施例中，对应所述“方法甲”，所述植物具体为高感纹枯病粳稻品种Lemont(引自美国路易斯安娜州)或抗纹枯病新种质YSBR1(选自籼粳交后代群体)，这两个品种记载于“左示敏,王子斌,陈夕军,顾芳,张亚芳,陈宗祥,潘学彪.(2009)水稻纹枯病改良新抗源YSBR1的抗性评价.作物学报35(4):608-614”一文。对应所述“方法乙”的(A)中，所述植物具体为感纹枯病中熟中粳稻品种徐稻3号(XD3，江苏省主栽品种之一)。对应所述“方法丙”的(C)中，向所述待处理的植物中导入所述CKX基因后的转基因株系具体为CKX4过表达(CKX4ox)转基因系，该转基因株系记载于“Gao SP,Fang J,Xu F,Wang W,SunXH,Chu JF,Cai BD,Feng YQ,Chu CC(2014)CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE4Integrates Cytokinin and Auxin Signaling to Control Rice CrownRoot Formation.Plant Physiology.165:1035–1046”一文，该转基因株系的具体构建方法参见该文献第1044页右栏第二段。
本发明研究发现体外喷施CK类物质可增强水稻幼苗对纹枯病的抗性。利用衰老诱导启动子驱动CK合成途径中的关键基因IPT的表达可明显提高转基因水稻尤其是其生育后期的CK含量，导致转基因系衰老延缓、呈现滞绿表型；在大田和室内离体纹枯病菌接种试验中，内源CK含量提高的转基因系均显著增强了对纹枯病的抗性。研究还发现，超表达CK代谢途径中的CK脱氢酶基因4(cytokinin oxidase/dehydrogenases 4，CKX4)可显著降低水稻叶绿素和细胞分裂素含量，显著降低水稻对纹枯病的抗性。此外，本研究在水稻自然品种中发现一个叶色持绿突变体YD8-sgr，其成熟后期的CK降解受阻，导致CK含量不降低，从而呈现持绿表型；在大田和室内离体纹枯病菌接种试验中，持绿突变体YD8-sgr对纹枯病的抗性显著提高。以上表明CK在调节水稻对纹枯病菌的抗性中具有重要作用，本发明为进一步探讨CK在植物抗病防卫反应中的信号机制提供依据，同时也为水稻抗纹枯病分子育种开辟一条新的思路。
附图说明
图1为苗期试验接种纹枯病菌的方法。A：接种物。B：接种物紧贴水稻幼苗基部两侧。C：接种后12小时纹枯病菌丝生长情况。
图2为外源细胞分裂素(KT)处理可减轻水稻纹枯病病情。A：50μM KT处理后，Lemont和YSBR1中细胞分裂素响应调节因子(OsRR2)的表达模式。总RNA从等量叶片中提取。β-actin作为内参基因。B：经对照(内含溶剂)和KT处理后的Lemont和YSBR1在纹枯病菌接种后7天(DAI)的病级。C：经模拟条件(内含溶剂)和KT处理后的Lemont和YSBR1在纹枯病菌接种后7天(DAI)的病叶率。D：经模拟条件(内含溶剂)和KT处理后的Lemont(上一行)和YSBR1(下一行)在纹枯病菌侵染后7天(DAI)的表型。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图3为通过增强细胞分裂素合成基因IPT的表达获得内源细胞分裂素含量提高的转基因系。A：WT和7个转PSAG39:ipt株系(P348-P354)在抽穗后30天(30DAH)和抽穗后50天(50DAH)IPT的表达水平。总RNA从成株期剑叶中提取。β-actin作为内参基因。B：WT和7个转PSAG39:ipt株系(P348-P354)在抽穗后30天(30DAH)和抽穗后50天叶片中trans-zeatin(tZ)的含量。C：WT和7个转PSAG39:ipt株系(P348-P354)在抽穗后30天(30DAH)和抽穗后50天叶片中isopentenyladenine(iP)的含量。D：在30DAH和50DAH剑叶中叶的绿素含量(SPAD值)。E：WT和3个转基因系(P350、P351和P353)的表型。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图4为内源细胞分裂素含量的增加的转基因系对纹枯病抗性的抗性显著增强。A：田间WT和各转基因系的纹枯病病级。在分蘖末期接种，在30DAH和50DAH采用“0-9”病级标准分别调查纹枯病病级。在30DAH，田间WT和转基因系P350和P351的纹枯病差异表型。B：离体叶片接种试验。WT和各转基因系的离体叶片在25DAH接种，在5DAI和10DAI分别调查叶片病斑面积。C：WT和转基因系P350和P351的叶片在24HAI进行台盼蓝染色，然后在光学显微镜下放大40倍观察在离接种部位0.5cm处的组织并拍照。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图5为细胞分裂素含量降低的转基因水稻对纹枯病的感病性增强。A：WT和CKX4ox株系在抽穗后30天(30DAH)叶片中trans-zeatin(tZ)和isopentenyladenine(iP)的含量。B：在30DAH，WT和CKX4ox叶片中的叶绿素含量(SPAD值)，FL、PL和AL分别表示剑叶、倒二叶和倒三叶。C：在30DAH，田间WT和CKX4ox的纹枯病病级。在分蘖末期接种，在30DAH采用‘0-9’病级标准分别调查纹枯病病级。D：在30DAH，田间WT和CKX4ox的纹枯病差异表型。E：WT和CKX4ox的叶片在24HAI进行台盼蓝染色，然后在光学显微镜下放大40倍观察在离接种部位0.5cm处的组织并拍照。D和E中的“ZH11”表示对照“中花11”。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图6为持绿突变体YD8-sgr与野生型的表型及叶绿素和CK含量差异。A、B、C分别表示农艺和籽粒表型。农艺表型于50DAH拍摄。籽粒表现于60DAH拍摄。D：在30和50DAH，WT和YD8-sgr叶片中的叶绿素含量(或SAPD值)，FL、PL和AL分别表示剑叶、倒二叶和倒三叶。E：WT和YD8-sgr在抽穗后30和50DAH叶片中trans-zeatin(tZ)的含量。F：WT和YD8-sgr在在30和50DAH叶片中isopentenyladenine(iP)的含量。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图7为YD8-sgr突变体对纹枯病的抗性显著增强。A：田间WT和YD8-sgr的纹枯病病级。在分蘖末期接种，在30DAH和50DAH采用‘0-9’病级标准分别调查纹枯病病级。B：在50DAH，田间WT和YD8-sgr的纹枯病差异表型。C：离体叶片接种试验。WT和YD8-sgr的离体叶片在25DAH接种，在5DAI和10DAI分别调查叶片病斑面积。D：WT和YD8-sgr的叶片在24HAI进行台盼蓝染色，然后在光学显微镜下放大40倍观察在离接种部位0.5cm处的组织并拍照。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
图8为YD8-sgr突变体中CK合成与代谢相关基因的表达分析。A：在30DAH和50DAH，WT和YD8-sgr中7个IPT基因(OsIPT1-OsIPT8，除OsIPT6)的表达水平。B：在30DAH和50DAH，WT和YD8-sgr中11个CKX基因(OsCKX1-OsCKX11)的表达水平。总RAN从成株期剑叶中提取。β-actin作为内参基因。每个bar值代表平均值和标准差，实验至少重复3次。“*”和“**”分别表示5％水平的显著差异和1％水平的极显著差异。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，所有田间试验均采用EXCEL软件进行数据录入和整理，用SPSS16.0软件进行相关表型数据的方差分析和多重比较。
实施例1、外源喷施细胞分裂素类物质可减轻水稻纹枯病病情
为了研究CK在调节水稻对纹枯病抗性方面的作用，本发明的发明人首先分析了外源喷施细胞分裂素类物质——激动素kinetin(KT)是否增强水稻对纹枯病的抗性。具体如下：
1、供试水稻材料
高感纹枯病粳稻品种Lemont(引自美国路易斯安娜州)、抗纹枯病新种质YSBR1(选自籼粳交后代群体)。这两个品种记载于“左示敏,王子斌,陈夕军,顾芳,张亚芳,陈宗祥,潘学彪.(2009)水稻纹枯病改良新抗源YSBR1的抗性评价.作物学报35(4):608-614”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
2、激素处理
50μM KT溶液：将激动素(kinetin,KT)固体粉末溶于少量蒸馏水中，逐滴加入1M的盐酸直至激动素(kinetin,KT)固体粉末刚好完全溶解，然后加入蒸馏水和Tween20，使得溶液中激动素(kinetin,KT)的终浓度为50μM，Tween 20的终浓度为0.1％(体积百分含量)。
供试水稻的种子在温室播种，待长至四叶一心，分别喷施50μM KT溶液，同时设置对照组Mock(喷施与“50μM KT溶液”配方相比除去KT后的溶液)，喷施直至溶液从叶片上滴落(De Vleesschauwer D(2008)Unraveling rhizobacteria-and abscisic acid-inducedpathogen resistance in rice(Oryza sativa L.).Ghent University,Belgium；DeVleesschauwer D,Yang Y,Cruz CV,M(2010)Abscisic acid-induced resistanceagainst the brown spot pathogen Cochliobolus miyabeanus in rice involves MAPkinase-mediated repression of ethylene signaling.Plant Physiol 152:2036-2052；Ito Y,Kurata N(2006)Identification and characterization of cytokinin-signalling gene families in rice.Gene 382:57-65；Penninckx I,Eggermont K,Terras F,Thomma B,De Samblanx GW,Buchala A,Métraux JP,Manners JM,Broekaert WF(1996)Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene inArabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway.The Plant Cell 8:2309-2323；Xie DX,Feys BF,James S,Nieto-Rostro M,Turner JG(1998)COI1:anArabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense andfertility.Science 280:1091-1094)。试验设置9重复，每重复至少8株苗。其中3重复喷施处理后0天、1天、2天、3天、4天和5天分别取样提取RNA，qRT-PCR检测细胞分裂素响应调节因子OsRR2的表达情况；另3重复喷施处理2天后进行苗期纹枯病接种试验；其余3重复作为未接种对照。
3、病原菌接种
水稻纹枯病的致病菌株：水稻纹枯病中强致病菌株YN-7，该菌株已在先前的多次试验中被采用，具体参见如下文献：Chen XJ,Chen Y,Zhang LN,Xu B,Zhang JH,Chen ZX,Tong YH,Zuo SM,Xu JY(2015)Overexpression of OsPGIP1enhances rice resistanceto sheath blight.Plant Dis；Chen ZX,Zhang YF,Feng F,Feng MH,Jiang W,Ma YY,PanCH,Hua HL,Li GS,Pan XB,Zuo SM(2014)Improvement of japonica rice resistance tosheath blight by pyramiding qSB-9TQ and qSB-7TQ.Field Crops Research 161:118–127。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
利用水稻纹枯病的中强致病菌株YN-7进行接种。菌株YN-7的培养方法简言之如下：将去顶端的火柴杆切成0.8-1.0cm长的短棍，均匀平铺在培养皿中，缓缓加入PDB(Potato dextrose broth)培养液，122℃灭菌25min，冷却后在超净台中将YN-7菌种接于正中间，28℃黑暗条件培养3-5天。此时，含有纹枯病菌定殖的火材杆即为接种物。
接种一般于4叶期进行，将接种物置于幼苗基部(图1)。接种后，立即用塑料薄膜覆盖进行保湿，湿度控制在85-95％，温度控制在25-31℃。接种后0、12、24、48和72小时分别取样进行RNA提取。接种后7天左右调查纹枯病病级。病级＝病斑长度/苗挺高×9。感病叶片率(％)＝感病叶片数/整株叶片总数×100％。
4、RNA提取、反转录和qRT-PCR分析
RNA提取、反转录和qRT-PCR检测细胞分裂素响应调节因子OsRR2的表达情况。具体如下：
采用Trizol法提取水稻总RNA。然后，以oligo(dT)为引物用逆转录酶合成第一链cDNA。在qRT-PCR实验中，依据SYBR PrimeScrpit RT-PCR Kit(TaKaRa)配制反应体系，用Actin引物扩增内参基因β-actin，用特异引物扩增目的基因OsRR2。用Applied Bio-system7900HT实时PCR系统附带的软件设定荧光阈值。以实验重复间的标准误计算实验误差。
用于扩增内参基因β-actin的引物：
Actin-q-F：5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’；
Actin-q-R：5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’。
用于扩增目的基因OsRR2的引物：
RR2-q-F：5’-CGGTGCCGAGGATTTCA-3’；
RR2-q-R：5’-CTGCCAGGTGCGACGAT-3’。
5、结果
结果显示：水稻中的CK信号标志基因OsRR2在KT处理后表达明显提高，处理后2天(DAA)达到表达高峰，表明喷施KT后确实激活了CK相关信号(图2中A)。为了分析CK信号充分启动后是否影响水稻对纹枯病的抗性，本发明的发明人在KT处理后2天(DAA)进行纹枯病菌接种，然后在接种后7天(DAI)调查每个植株的纹枯病病情指数及病叶率。发现，相对于对照，KT处理后可明显降低纹枯病病情指数和病叶率(P<0.05，图2中B、C、D)，这表明外源喷施KT可激活CK信号，并有利于增强水稻对纹枯病的抗性。
实施例2、提高內源细胞分裂素含量可显著增强水稻对纹枯病的抗性
一、内源细胞分裂素含量显著提高的转基因系水稻的获得及鉴定
表达载体PSAG39:ipt：记载于“Liu L,Zhou Y,Szczerba MW,Li XH,Lin YJ(2010)Identification and application of a rice senescence-associated promoter.PlantPhysiology153:1239-1249”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。该载体上含有的IPT基因，来自根癌农杆菌，具体序列为序列表中序列1。
徐稻3号(XD3)：江苏省主栽品种之一。记载于“翟超群,张洪程,谢正荣等.播期和移栽密度对徐稻3号产量及品质的影响.中国农学通报,2008年02期”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
1、转基因系水稻的获得及IPT基因表达情况的鉴定
植株内源CK含量主要受CK合成和代谢途径中的相关基因的表达调控，IPTs是催化CK合成的限速酶(Sakakibara H(2006)Cytokinins:activity,biosynthesis,andtranslocation.Annual Review of Plant Biology 57:431-449)。本发明的发明人从华中农业大学林拥军教授研究组引进了农杆菌IPT基因的诱导表达载体PSAG39:ipt，其中PSAG39为水稻衰老诱导表达启动子。通过农杆菌介导的遗传转化方法，本发明的发明人将PSAG39:ipt转入感纹枯病粳稻品种徐稻3号(XD3)的愈伤组织中，具体转化方法参见“Hiei Y,OhtaS,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal for Cell&Molecular Biology 6:271-282”一文。然后从转化后株系中通过Southern Blot筛选单拷贝独立转化系，并通过qRT-PCR检测各转基因系在抽穗后30天(30DAH)和50天(50DAH)的IPT转录水平。其中，RNA提取、反转录和qRT-PCR分析的方法参见实施例1步骤4进行，不同之处在于：
用于扩增目的基因IPT的引物：
IPT-q-F：5’-TATTGGAGTGCGGATTTTCGTT-3’；
IPT-q-R：5’-GGATGTGATCTGGTTCTGGCTA-3’。
实验同时设置未经转化的粳稻品种徐稻3号作为对照。
结果显示：共获得了7个单拷贝独立转化系(分别记为P348、P349、P350、P351、P352、P353和P354)。通过qRT-PCR，分别检测了各转基因系在抽穗后30天(30DAH)和50天(50DAH)的IPT转录水平(图3中A)。与未转化对照相比，绝大多数转基因系中的IPT表达水平得到显著提高。转基系P348和P354的IPT表达水平在30DAH和50DAH间几乎处于相同水平，其它转基因系在50DAH的IPT转录水平均明显高于30DAH的，特别是P350和P351。
2、转基因系水稻中的反式玉米素(tZ)和异戊烯基腺嘌呤(iP)的含量测定
为了进一步证实外源IPT基因是否可提高水稻內源CK含量，本发明的发明人分别在抽穗后30和50天测定了转基因系中的反式玉米素(tZ)和异戊烯基腺嘌呤(iP)的含量。在高等植物中CKs的主要类型是tZ和iP(Sakakibara H(2006)Cytokinins:activity,biosynthesis,and translocation.Annual Review of Plant Biology 57:431-449)。tZ和iP含量的测定方法具体如下：
水稻叶片中tZ和iP这2种细胞分裂素组分的提取参照王若仲等(王若仲,萧浪涛,蔺万煌,曹庸,卜晓英(2002)亚种间杂交稻内源激素的高效液相色谱测定法.色谱)的方法并加以改进。分别称取抽穗后30天、50天的剑叶鲜样1g，分3次(5ml、2ml、1ml)加入已预冷的80％甲醇，在弱光下冰浴中研磨成匀浆，转入离心管于4℃冰箱中浸提过夜，并不定时搅拌；4℃下5000rpm离心15min，取出上清液，残渣用5ml 80％甲醇浸提12h，离心，取出上清液，再重复1次；合并3次上清液，旋转蒸发浓缩至5-10ml转移到10ml离心管，加0.1g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，于4℃下250rpm振荡1h，置于-70℃冰箱冻结；4℃融化后，4℃下10000rpm离心15min，将上清转移至50ml离心管，置于-70℃冰箱冻结；真空冷冻浓缩至干，甲醇溶解定容至4ml，将上清过C18Sep-pak小柱收集样品中的细胞分裂素组分，再用4ml甲醇将C18Sep-pak柱内的细胞分裂素组分洗脱下来，真空冷冻离心浓缩至干，1ml甲醇定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，待高效液相色谱分析。
其中，用高效液相色谱(HPLC，Waters，USA)分析滤液中tZ和iP含量的具体大致如下：色谱条件：Dubhe C184.6×250，5μm；流动相：乙氰-甲醇-0.6％乙酸(体积比5:50:45)，流速：1.0ml·min-1，梯度洗脱；检测波长254nm；柱温30℃，进样量10μl。样品回收率为96.5±2.6％，每一个样品至少重复4次。采用外标法定量，用tZ、iP标准品绘制混合标样的标准曲线。根据标样中各组分的保留时间确定样品中各组分的种类，根据峰面积计量各组分含量。
结果发现：除了转基因株系P348和P354，其余转基因系中tZ和iP的含量均明显高于野生型对照，尤其是P350和P351(图3中B和C)。
3、转基因系水稻中叶绿素含量(SPAD值表示)的测定
前人研究发现，CK含量提高的典型特征是延缓衰老和滞绿表型(Mok MC(1994)Cytokinins and plant development.Cytokinins:chemistry,activity and function,155-166)。为此，本发明的发明人在抽穗后30和50天分别测定了转基因系中的叶绿素含量(SPAD值表示)。同时以未转基因的粳稻品种徐稻3号作为对照。具体如下：分别调查了水稻抽穗后30天或50天的剑叶的SPAD值。叶片SPAD测值是用叶绿素测定仪SPAD-502测定(MinoltaCameraCo.，JaPan)。分别对每一测定叶的纵向中部以及距中部1-2cm的纵向两侧各测取一值，然后按自动平均键求算均值作为该叶片代表值。一个株系每次测定5株，每株测定三片剑叶。
结果如图3中D所示，有4个系(P350、P351、P352和P353)在两个时间点的SPAD值均显著高于对照，而P349只在抽穗后50天表现出显著高于对照的SPAD值。这可能由于转基因系P349中衰老诱导启动子更多在后期被启动表达有关，而P350、P351、P352和P353中的启动子可能被较早启动。通过表型观察，本发明的发明人发现转基因系P350、P351和P353出现明显的滞绿表型，抽穗后50天叶色仍然十分浓绿，未见衰老特征，尤其是P351，而此时的野生型对照叶片已明显呈现衰老表型(图3中E)。此外，本发明的发明人还注意到，除了P353的剑叶变长，其余所有转基因株系的农艺性状几乎与未转化对照相同。
以上1-3的结果表明，本发明获得的7个PSAG39:ipt转基因系中有5个系(P349、P350、P351、P352和P353)的內源CK含量得到了明显增加，与对照相比，转基因系除了叶色深绿以外基本未见其他性状的变化。
二、内源细胞分裂素含量显著提高的转基因系水稻对纹枯病的抗性的分析
1、田间接种纹枯病菌分析转基因系水稻对纹枯病的抗性
对步骤一获得的7个转基因系(P348、P349、P350、P351、P352、P353和P354)和未转化对照品种在田间进行纹枯病菌(水稻纹枯病中强致病菌株YN-7)接种，抽穗后30和50天分别调查纹枯病病级。
其中，大田成株期纹枯病菌接种具体如下：接种于水稻分蘖末期至拔节初期进行，采用牙签嵌入法接种(Zuo SM,Yin YJ,Pan CH,Chen ZX,Zhang YF,Gu SL,Zhu LH,Pan XB(2013)Fine mapping of qSB-11LE,the QTL that confers partial resistance to ricesheath blight.Theor Appl Genet 126:1257-1272)。每个株系设置3次重复，每系3行，每行12株，中间1行的中间10株为接种调查单株，每株水稻接种3个主茎秆，每茎秆以镊子将接种物嵌入自上而下第3叶鞘内侧。由于此时倒2叶鞘不再伸长，因此接种物可以固定在第3叶鞘内侧。病级调查以左示敏等(左示敏,张亚芳,殷跃军,陈宗祥,潘学彪(2006)田间水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立与完善.扬州大学学报(农业与生命科学版).27(4):57-61)改进的纹枯病病级“0-9”级划分标准。
结果如图4中A所示，可见：与对照相比，发现有4个转基因系(P350、P351、P352和P353)对纹枯病的抗性显著增强；P348和P354的抗性未见变化，这可能与其CK含量未增加有关；转基因系P349在抽穗后30天的病级与对照无显著差异，但在抽穗后50天，其病级显著低于对照；总体而言，P350和P351在田间的抗病效果最好。
2、离体叶片接种纹枯病菌分析转基因系水稻对纹枯病的抗性
由于持绿表型主要反映在叶片上，因此本发明的发明人进一步采用了离体叶片接种方法接种了水稻纹枯病中强致病菌株YN-7，测定了转基因系对纹枯病的抗性。同时以未转基因的粳稻品种徐稻3号作为对照。
其中，纹枯病菌离体接种具体如下：取抽穗后25天左右植株的生长部位一致、大小一致的叶片(从叶尖起15cm左右长)至实验室进行纹枯病接种。将取好的叶片置于铺有湿润的2层纱布和1层滤纸的15cm×15cm×1cm的透明带盖有机玻璃方盒中。接种时，将接种物置于叶片上表面的中间或叶鞘的内表面，并立即将盖子盖好以便保湿。每个株系设置3次重复，每系5张叶片或5个叶鞘。试验在28±1℃、12h光照12h黑暗条件下进行。接种后5天或10天，测量叶片的病斑面积或叶鞘的病斑长度。叶片的病斑面积(Disease leaf area，DLA)可分成4级：I为DLA<25％、II为25％<DLA<50％、III为50％<DLA<75％、IV为DLA>75％(Harkenrider M,Sharma R,De Vleesschauwer D,Tsao L,Zhang X,Chern M,Canlas P,Zuo S,Ronald PC(2015)Overexpression of Rice Wall-Associated Kinase 25(OsWAK25)Alters Resistance to Bacterial and Fungal Pathogens.pp e0147310-e0147310)。
结果如图4中B所示，可见：接种后5天(5DAI)，发现转基因系P350、P351和P353的病情症状明显低于对照，其次是P349和P352，而P348和P354则与对照相似，均呈现明显感病性。接种后10天，各株系坏死斑点和表面褐变程度明显加重，但与对照相比，各转基因系(除P348和P354之外)的受害症状仍然明显轻于对照，尤其是P350和P351。总体而言，叶片离体鉴定结果与田间鉴定比较一致。
3、台盼蓝染色分析转基因系水稻离体叶片接种纹枯病菌24小时的叶片受害情况
本发明的发明人进一步观察了两个抗病效果最好的转基因系(P350和P351)及对照在离体叶片接种纹枯病菌后24小时(24HAI)时的叶片受害情况，具体为进行台盼蓝染色。具体如下：取接种后24小时的水稻叶片，置于乳酸酚(乳酸，甘油，苯酚和灭菌水等体积混合)配制的含1mg/ml台盼蓝(Trypan Blue)染液中，煮半分钟。迅速转移至2:1(体积比)的95％乙醇:乳酸酚中煮1分钟，以使其彻底脱色。然后置于50％的乙醇中室温漂洗2分钟后，转入水中短期保存，或50％的甘油中长期保存。最后将叶片组织压片置于光学显微镜明场下镜检。实验重复三次。参考文献：Swain S,Roy S,Shah J,Van Wees S,Pieterse CM,Nandi AK(2011)Arabidopsis thaliana cdd1mutant uncouples the constitutiveactivation of salicylic acid signalling from growth defects.t pathology 12:855-865。
结果如图4中C所示，可见：这2个转基因系(P350和P351)叶片接种点附近的细胞死亡症状明显轻于对照，表明转基因系有更强的抑制纹枯病菌诱导的细胞死亡的能力。
综合本实施例的研究结果，可见：提高内源CK含量可明显减轻纹枯病菌侵染引起的细胞死亡症状，从而提高水稻对纹枯病的抗性。
实施例3、降低内源细胞分裂素含量可显著降低水稻对纹枯病的抗性
CK代谢主要是由细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(cytokinin oxidase/dehydrogenases，CKX)催化，并且不可逆地降解CK(Sakakibara H(2006)Cytokinins:activity,biosynthesis,and translocation.Annual Review of Plant Biology 57:431-449)。本发明的发明人从中科院遗传与发育生物学研究所储成才研究员课题组引进了CKX4过表达(CKX4ox)转基因系，该转基因株系的转基因受体为水稻品种“中花11”，该转基因株系记载于“Gao SP,Fang J,Xu F,Wang W,Sun XH,Chu JF,Cai BD,Feng YQ,Chu CC(2014)CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE4Integrates Cytokinin and AuxinSignaling to Control Rice Crown Root Formation.Plant Physiology.165:1035–1046”一文，该转基因株系的具体构建方法参见该文献第1044页右栏第二段，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。该转基因株系中外源导入的CKX基因具体为OsCKX4(参考基因组位点为Os01g0940000)，其编码区核苷酸序列为序列表中序列2。
本发明的发明人于CKX4ox转基因系抽穗后30天，测定了植株中反式玉米素(tZ)和异戊烯基腺嘌呤(iP)的含量(具体操作参见实施例2步骤一2)，结果发现CKX4ox转基因植株中的tZ含量显著低于野生型对照“中花11”，iP含量也有所降低，但与对照相比未达显著差异(图5中A)。这表明CKX4的过表达确实降低了植株CK含量。
本发明的发明人于CKX4ox转基因系抽穗后30天，测定了植株的叶片SPAD值(具体操作参见实施例2步骤一3)，结果发现CKX4ox转基因植株的剑叶和倒二叶中的叶绿素含量显著低于野生型对照“中花11”(图5中B)。
另外，本发明的发明人还于CKX4ox转基因系抽穗后30天，对植株进行了田间纹枯病菌接种鉴定(具体操作参见实施例2步骤二1)。结果显示，CKX4ox转基因植株的纹枯病病级显著高于野生型对照“中花11”(图5中C和D)，表明降低CK含量可显著增强水稻对纹枯病的感病性。通过台盼蓝染色观察(具体操作参见实施例2步骤二3)，本发明的发明人还发现在纹枯病菌接种叶片24h后，CKX4ox转基因系的叶片细胞死亡症状明显重于野生型对照(图5中E)。
综合以上各结果，表明：降低CK含量可显著增强水稻对纹枯病的感病性，而这也可能与病原菌侵染后寄主细胞死亡轻重有关。
实施例4、内源细胞分裂素含量提高的水稻持绿突变体对纹枯病的抗性显著增强
CK含量增加的一个典型特征是造成植株延迟衰老，呈现持绿表型。为此，本发明的发明人测定了一个水稻持绿突变体对纹枯病的抗性水平。通过图位克隆，已证实该突变体表型是由于已被克隆的持绿基因SGR被破坏有关(Jiang H,Li M,Liang N,Yan H,Wei Y,XuX,Liu J,Xu Z,Chen F,Wu G(2007)Molecular cloning and function analysis of thestay green gene in rice.pp 197-209)。在田间，突变体(命名为YD8-sgr)除了在抽穗30天后开始出现滞绿表型外，其它性状与野生型对照盐稻8号(江苏推广粳稻品种)间几乎完全一样，在主要农艺性状和产量性状上，突变体与野生型间基本没有差异(图6中A、B和C)。
其中，盐稻8号(YD8)(江苏推广粳稻品种)记载于“何冲霄,孙明法,董晓鸣.中粳稻新品种——盐稻8号.农业科技通讯,2003(10):40-40”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。突变体YD8-sgr中突变的基因是sgr，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
本发明的发明人首先于突变体YD8-sgr抽穗后30天和50天，测定了植株的叶片SPAD值(具体操作参见实施例2步骤一3)，结果发现突变体YD8-sgr植株的剑叶、倒二叶和倒三叶中的叶绿素含量(或SPAD值)均显著高于野生型对照“盐稻8号”(图6中D)，但抽穗后30天，突变体与野生型间的差值明显小于抽穗后50天的。
本发明的发明人还于突变体YD8-sgr抽穗后30天和50天，分别测定了植株中反式玉米素(tZ)和异戊烯基腺嘌呤(iP)的含量(具体操作参见实施例2步骤一2)，结果发现，在抽穗后30天和50天，突变体YD8-sgr中的tZ和iP含量均显著高于对照“盐稻8号”，但就与对照间的差值而言，抽穗后30天的差值明显小于抽穗后50天的(图6中E和F)。这也说明了为何在抽穗后30天前，突变体与野生型间的叶色未出现明显不同有关。
另外，本发明的发明人还于突变体YD8-sgr抽穗后30天和50天，对植株进行了田间纹枯病菌接种鉴定(具体操作参见实施例2步骤二1)和纹枯病菌离体接种(具体操作参见实施例2步骤二2)。田间纹枯病抗性鉴定结果显示，突变体YD8-sgr与对照“盐稻8号”在抽穗后30天的病级上未出现显著差异，然而在抽穗后50天的病级数据上，两者间差异极显著，这表明，抽穗后30天至50天期间，纹枯病菌在野生型对照上的扩展速度明显快于突变体，从而导致突变体和野生型之间的病级差异在抽穗后50天时达到了显著差异(图7中A和B)。离体叶片接种试验中，结果发现接种后5天，突变体YD8-sgr叶片上只出现少数坏死斑点和褐变症状，而野生型对照“盐稻8号”则受害严重；接种后10天，突变体YD8-sgr的病斑面积与5天相比仅略有增加，而野生型对照“盐稻8号”已几乎完全腐坏(图7中C)。通过台盼蓝染色观察(具体操作参见实施例2步骤二3)，本发明的发明人还发现在突变体YD8-sgr中由于纹枯病菌引起的细胞死亡程度明显弱于野生型对照(图7中D)。
综上结果，可见：突变体YD8-sgr对纹枯病的抗性显著提高，其机制可能与突变体显著增强了抑制纹枯病菌引起的细胞死亡能力有关。
为了阐明突变体YD8-sgr提高纹枯病的抗性是否与CK含量增加有关，本发明的发明人进一步分析了抽穗后30天和50天时突变体YD8-sgr中的CK合成和代谢途径中的关键基因转录水平。水稻中共有8个IPTs基因(OsIPT1-OsIPT8，其中OsIPT6是假基因)(Jiang C,Shimono M,Sugano S,Kojima M,Liu X,Inoue H,Sakakibara H,Takatsuji H(2013)Cytokinins act synergistically with salicylic acid to activate defense geneexpression in rice.pp 287-296；Sakamoto T,Sakakibara H,Kojima M,Yamamoto Y,Nagasaki H,Inukai Y,Sato Y,Matsuoka M(2006)Ectopic expression of KNOTTED1-like homeobox protein induces expression of cytokinin biosynthesis genes inrice.pp 54-62)，11个CKXs基因(OsCKX1-OsCKX11)(Ashikari M,Sakakibara H,Lin S,Yamamoto T,Takashi T,Nishimura A,Angeles ER,Qian Q,Kitano H,Matsuoka M(2005)Cytokinin oxidase regulates rice grain production.pp 741-745；Jiang C,ShimonoM,Sugano S,Kojima M,Liu X,Inoue H,Sakakibara H,Takatsuji H(2013)Cytokininsact synergistically with salicylic acid to activate defense gene expressionin rice.pp 287-296)。为此，本发明的发明人通过qRT-PCR分析了7个OsIPTs基因(除OsIPT6)和11个OsCKXs基因的转录水平。其中，RNA提取、反转录和qRT-PCR分析的方法参见实施例1步骤4进行，不同之处在于：
用于扩增目的基因OsIPT1的引物：
OsIPT1-q-F：5’-ACCAAGCCCAAGGTTATCTTCGTGC-3’；
OsIPT1-q-R：5’-TCGTCGGTGACCTTGTTGGTGATGA-3’。
用于扩增目的基因OsIPT2的引物：
OsIPT2-q-F：5’-AAGTCCAAGCTCGCCATCTC-3’；
OsIPT2-q-R：5’-GGTGACCTTGTTCGTGATGAT-3’。
用于扩增目的基因OsIPT3的引物：
OsIPT3-q-F：5’-AGGCGAACACGTGGAGTCTG-3’；
OsIPT3-q-R：5’-CCACCTTCAACTCCAGCACTCT-3’。
用于扩增目的基因OsIPT4的引物：
OsIPT4-q-F：5’-GTACGAGTGCTGCTTCCTCTG-3’；
OsIPT4-q-R：5’-CCAGATGCCCCTGGAGTAGT-3’。
用于扩增目的基因OsIPT5的引物：
OsIPT5-q-F：5’-CAGCGTCAGCAGGAGCAT-3’；
OsIPT5-q-R：5’-CGCGGCCGTGAACTCC-3’。
用于扩增目的基因OsIPT7的引物：
OsIPT7-q-F：5’-AGGATACGAGGATGGTGGTGAT-3’；
OsIPT7-q-R：5’-CCGTCATAGAGCTGAATCTTGTC-3’。
用于扩增目的基因OsIPT8的引物：
OsIPT8-q-F：5’-CGAGGAGCTCGAGGAATACTT-3’；
OsIPT8-q-R：5’-GTTGGCCTTGATCTCGTCTATC-3’。
用于扩增目的基因OsCKX1的引物：
OsCKX1-q-F：5’-ACACATTGACATTATCGCCG-3’；
OsCKX1-q-R：5’-CACCTACACCCACCCACATA-3’。
用于扩增目的基因OsCKX2的引物：
OsCKX2-q-F：5’-CCTTCATATGCATGTCGATCTC-3’；
OsCKX2-q-R：5’-TTACACCCACAAGACGACGA-3’。
用于扩增目的基因OsCKX3的引物：
OsCKX3-q-F：5’-GCAGTGTAGTGCTGTGCTG-3’；
OsCKX3-q-R：5’-GCCTATCCTATGTCCCCCTC-3’。
用于扩增目的基因OsCKX4的引物：
OsCKX4-q-F：5’-GCTTAAAGAACACAGCGGGG-3’；
OsCKX4-q-R：5’-GCTGCTTCGCTTTGAAGTCT-3’。
用于扩增目的基因OsCKX5的引物：
OsCKX5-q-F：5’-GGCTAGCTAGGCGCATGTAA-3’；
OsCKX5-q-R：5’-GGGCGAGGAATCTACACATC-3’。
用于扩增目的基因OsCKX6的引物：
OsCKX6-q-F：5’-CCACATCCATGGCTAAACCT-3’；
OsCKX6-q-R：5’-GCACCAACAAAAACACCCTT-3’。
用于扩增目的基因OsCKX7的引物：
OsCKX7-q-F：5’-CGGCAGTTATTGGTGATGTG-3’；
OsCKX7-q-R：5’-GCACCCGATGTCCTCATTAT-3’。
用于扩增目的基因OsCKX8的引物：
OsCKX8-q-F：5’-GTAAAGGGGAGGTGGTGACA-3’；
OsCKX8-q-R：5’-GCCCTTGTTATAATGCCGAA-3’。
用于扩增目的基因OsCKX9的引物：
OsCKX9-q-F：5’-CACCATGCATGTGCCTAAAC-3’；
OsCKX9-q-R：5’-GACACATCGTGGAAGCTGAA-3’。
用于扩增目的基因OsCKX10的引物：
OsCKX10-q-F：5’-TCGGACTTTGGCCATATTGT-3’；
OsCKX10-q-R：5’-GTGATAAGCGGATTAGGGCA-3’。
用于扩增目的基因OsCKX11的引物：
OsCKX11-q-F：5’-GGACGAGCACAATGATGATG-3’；
OsCKX11-q-R：5’-GAACCGAAACCTCCCTCTTT-3’。
结果显示，突变体YD8-sgr中只有OsIPT3和OsIPT4在抽穗后50天上的表达水平显著低于对照“盐稻8号”，而其他OsIPT基因的表达水平均与对照相近(图8中A)。相反，在11个CKX基因表达中，发现除了OsCKX5，其余所有CKX基因的表达水平在抽穗后30天或在50天，在突变体YD8-sgr中明显低于对照“盐稻8号”(图8中B)。结合前面的CK含量测定结果“抽穗后30和50天，突变体中的CK含量均高于对照，尤其是在抽穗后50天(图6中E和F)”。可见，突变体YD8-sgr在成熟后期的CK降解延缓是其叶片持绿的主要原因。再进一步结合纹枯病抗性鉴定结果，可认为突变体YD8-sgr后期对纹枯病抗性的增强与其较高的CK含量有关。
另外，本发明的发明人还测定了突变体YD8-sgr和野生型“盐稻8号”的产量相关性状，结果发现它们之间不存在差异(表2)。这也说明该突变体虽然没有增产，但也没有减产。而且，由于突变体YD8-sgr还能够增强对纹枯病的抗性，因此，在水稻抗纹枯病育种中具有潜在的应用价值。
表2 YD8-sgr和野生型对照农艺和产量相关性状的考查
注：PH:株高；PL；穗长；NFB:一次枝梗数；GL:籽粒长；GW:籽粒宽；GT:籽粒厚；1000GW:千粒重。

Claims (9)

1.一种提高植物对纹枯病抗性的方法，包括如下步骤：通过向待处理的植物外源喷施细胞分裂素，从而实现提高所述植物对纹枯病的抗性；
所述细胞分裂素为激动素。
2.一种提高植物对纹枯病抗性的方法，包括如下步骤：通过提高待处理的植物内源细胞分裂素的含量，从而实现提高所述植物对纹枯病的抗性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述提高待处理的植物内源细胞分裂素的含量是通过如下(A)或(B)实现的：
(A)向所述待处理的植物中导入能够促进植物中所述细胞分裂素合成的基因；
(B)抑制所述待处理的植物中能够促进所述细胞分裂素降解的基因的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“能够促进植物中所述细胞分裂素合成的基因”为IPT基因；所述“能够促进植物中所述细胞分裂素降解的基因”为CKX基因。
5.一种降低植物对纹枯病抗性的方法，包括如下步骤：通过降低待处理的植物内源细胞分裂素的含量，从而实现降低所述植物对纹枯病的抗性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低待处理的植物内源细胞分裂素的含量是通过如下(C)或(D)实现的：
(C)向所述待处理的植物中导入能够促进植物中所述细胞分裂素降解的基因；
(D)抑制所述待处理的植物中能够促进所述细胞分裂素合成的基因的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“能够促进植物中所述细胞分裂素合成的基因”为IPT基因；所述“能够促进植物中所述细胞分裂素降解的基因”为CKX基因。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻；所述纹枯病为水稻纹枯病。
9.权利要求1-8中任一所述方法在植物育种中的应用。
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