CN110819602B

CN110819602B - 水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用

Info

Publication number: CN110819602B
Application number: CN201911099967.9A
Authority: CN
Inventors: 何光存; 郭建平; 杜波; 陈荣智; 祝莉莉
Original assignee: Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd; Wuhan University WHU
Current assignee: YUAN LONGPING HIGH-TECH AGRICULTURE Co.,Ltd.; Wuhan University WHU
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110819602A

Abstract

本发明公开了水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用。属于植物基因工程技术领域。OsIPT9具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其ORF序列如SEQ ID No.3所示。通过农杆菌介导的遗传转化，将OsIPT9转入到对褐飞虱表现为感性的日本晴中，过表达的植株对褐飞虱的抗性增强；同时，在抗性材料NIP‑Bph6‑NIL中利用CRISPR/Cas9技术敲除OsIPT9，导致植株对褐飞虱的抗性显著下调。本发明的基因为研究水稻与褐飞虱基因互作提供了很好的理论基础，对于研究基因分子功能和育种具有借鉴意义。

Description

水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是我国最重要的粮食作物之一，水稻生产直接关系到我国粮食安全、农民增收和农村稳定。稻飞虱是水稻生产中发生和为害面积最大的首要害虫。危害水稻的稻飞虱主要有褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱三种，其中主要是褐飞虱。褐飞虱(BPH；Nilaparvata

)是典型的刺吸式昆虫类型。褐飞虱对水稻可造成直接为害和间接为害，直接为害是以针状口器刺吸水稻韧皮部汁液造成的危害(Wang et al.,2008；Chenget al.,2012)。褐飞虱的成虫或若虫群集于稻丛基部，剌吸韧皮部的汁液，消耗稻株养分。当褐飞虱大爆发时，每个稻蔸底部聚集有数千头虫，引起稻株下部变黑，瘫痪倒伏，稻田成片枯萎，减产甚至失收。这种现象称为“飞虱火烧”(hopper burn)。间接危害是指褐飞虱传播或诱发各种水稻病害如水稻锯齿叶矮缩病、草状矮缩病而造成危害。上个世纪60年代矮化高产水稻的推广导致褐飞虱为害开始严重起来。据统计，2006-2015年这十年内，我国每年因褐飞虱危害，发生面积3.87亩次，损失稻谷120吨，占水稻各种病虫害总损失的29.5％，是我国水稻生产中的头号害虫(刘万才等，2016)。褐飞虱也是亚洲水稻生产中的头号害虫，常常使各国水稻损失惨重。尤其是进入21世纪整个亚洲水稻产区飞虱爆发的频率和规模有逐渐扩大的趋势,目前已经成为了水稻生产上最大的威胁，被认为是水稻的第一大害虫(Heong&Hardy,2009；IRRI,Annual report 2011)。因此，遏制褐飞虱的发展和危害，是保障水稻生产安全的重大需求。

传统的褐飞虱防治依赖农药。一方面增加成本，损害了生态环境；另一方面，诱导褐飞虱产生抗药性，引起害虫再猖獗。因此，依靠特效农药已经不能有效的防治褐飞虱(娄永根和程家安，2011)。发掘和利用水稻抗褐飞虱基因，阐明抗虫机理，培育抗褐飞虱水稻品种在生产中推广应用，是防治褐飞虱这一重大农业害虫的最经济、有效、环境友好和生态安全的首选措施。

细胞分裂素(cytokinin,CK)除了能促进细胞分裂和分化、与生长素协同调节植物愈伤组织的分化外，CK在植物的生长和发育、细胞的分裂和分化、顶端优势、器官的衰老调控、谷物的产量、非生物逆境的耐受、氮的代谢和介导对病原菌和昆虫的抗性中也有重要作用(Junko et al.,2007；Ferguson&Beveridge,2009；Calderini et al.,2007；王三根，2000；Ashikari et al.,2005；Huynh et al.,2005)。CK在植物防御反应中的作用越来越受到研究者的青睐，然而却没有直接的遗传证据表明CK在水稻抗褐飞虱中的作用。

异戊烯基转移酶基因(IPT)是细胞分裂素合成的限速基因。异戊烯基转移酶基因最初是从黏菌(Dictyostelium discoideum)中鉴定出的一种酶。该酶可催化腺苷酸(AMP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)转化成有活性的细胞分裂素-异戊烯基腺苷-5'-磷酸(isopentenyladenosine-5'-monophosphate,iPMP)。该步骤是细胞分裂素生物合成的一个限速步骤(Taya et al.,1978)。随后,在致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的致瘤Ti质粒上克隆的异戊烯基转移酶基因(IPT)是第一个被克隆的编码细胞分裂素合成酶的基因。在农杆菌的致瘤Ti质粒上有Tmr和Tzs两个IPT基因(Akiyoshi et al.,1984；Barry et al.,1984)。在拟南芥全基因组序列完成后,两个研究小组独立发现拟南芥中共有9个IPT-类似基因，分别命名为AtIPT1到AtIPT9。生物信息学分析表明AtIPT2和AtIPT9在序列上与tRNA-IPT更相似，而其它7种AtIPTs与细菌IPT基因结构相似(Kakimoto,2001；Takei et al.,2001)。研究表明，AtIPT8作为一个有功能的IPT在植物体内直接催化了iPMP的生物合成，PGA22/IPT8基因的过量表达导致典型的细胞分裂素反应,例如根变短,下胚轴变粗,子叶深绿色等(Sun et al.,2003)。同一生物中不同的IPT或者不同生物的IPT蛋白催化合成的CKs存在差异，研究表明，拟南芥AtIPT1、AtIPT3-AtIPT8催化合成的是tZ类CKs，而AtIPT2和AtIPT9主要合成cZ类CKs(Miyawaki et al.，2006)。

tRNA异戊烯基转移酶是cZ生物合成的限速酶。tRNA-IPT是一种对tRNA起修饰作用的酶，它能够催化tRNA分子中反密码子附近的腺嘌呤(A)异戊烯基化，异戊烯基化tRNA在降解后生成具有细胞分裂素活性的cZ。研究表明，AtIPT2在体外表现tRNA-IPT活性；AtIPT2和AtIPT9的双突变体内未能检测出cZ(Miyawaki et al.，2006)。因此，cZ是由tRNA-IPT催化合成的。另外，在tRNA-IPT缺失型酿酒酵母株系MT-8中表达小立碗藓PpIPT1能使酿酒酵母的生长恢复正常，从其中分离的tRNA降解后的产物表现出细胞分裂素活性(Yevdakova etal.,2007)。在水稻中，OsIPT9和OsIPT10是tRNA异戊烯基转移酶基因，是水稻cZ合成的限速酶基因(Jain et al,2006；Tsai et al,2012)。然而OsIPT9在水稻抗褐飞虱中所起的作用还不得而知。

发明内容

为克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中起到的作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻育种中的应用，所述的OsIPT9基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，提供水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用，所述的OsIPT9基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本领域技术人员应该理解为，在不影响OsIPT9蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

优选的，所述OsIPT9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其ORF序列如SEQ IDNO.3所示。

本领域技术人员应当理解根据SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，对其替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，可获得具有相同功能的氨基酸序列，例如，在不同水稻背景下的序列，替换或者缺失一个或几个核苷酸，编码的氨基酸序列没有移码突变，仅仅出现部分氨基酸的缺失或者点突变。因此，本发明所述的基因还包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。

第三方面，提供一种提高水稻抗褐飞虱性能的方法，通过分子育种方法或基因工程的方法，提高权利要求1所述的OsIPT9基因的表达量从而提高水稻抗褐飞虱性状。

水稻抗褐飞虱基因Bph6是一种新型抗虫基因，编码一种前人从未研究的蛋白(Guoetal.,2018)。Bph6具有广谱抗虫性，高抗褐飞虱所有生物型和白背飞虱同时对农艺性状没有负效应。因此Bph6基因在水稻抗褐飞虱育种中具有重要的应用价值。在本申请发明人的研究中发现细胞分裂素(CK)尤其是顺式玉米素(cis-zeatin，cZ)在Bph6介导的抗虫中有很重要的作用，同时还发现CK和Bph6可通过诱导植保素的产生来发挥抗虫性(未发表)。然而，Bph6调控cZ的分子机理以及cZ调控植保素合成的分子机理并不清楚。通过对抗褐飞虱蛋白BPH6在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9，对其进行了研究：

(1)OsIPT9基因过表达：将OsIPT9的ORF全长连入到含有ubi启动子的载体PCXUN中，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将过表达载体导入日本晴NIP(对褐飞虱表现为感性)中，最后获得OsIPT9转基因植株20株。

筛选引物分别是

Hyg-L：GCTCCATACAAGCCAACCAC(5'-3')

Hyg-R：GAAAAAGCCTGAACTCACCG(5'-3')

(2)OsIPT9基因敲除：同样的，将OsIPT9的CRISPR/Cas9载体转化NIP-Bph6-NIL(Bph6在日本晴背景下的近等基因系)，得到转基因植株18株。

扩增测序引物是

IPT9/Cas9-F:AGAAGGGGCTGAGGAAGGTGGTGG(5'-3')

IPT9/Cas9-R：AGGCCGCCACGATCCAATATA(5'-3')

对T2代的转基因植株进行抗虫鉴定，发现OsIPT9敲除植株对褐飞虱的抗性显著下调。OsIPT9过表达植株对褐飞虱的抗性微弱上调。

本发明的优点和效果：

1、本发明首次确定OsIPT9基因在水稻中过表达可以使水稻对褐飞虱的抗性提高。是tRNA异戊烯基转移酶参与水稻抗褐飞虱的一个很好的实例，这对理解tRNA异戊烯基转移酶的功能以及对抗性的调控具有一定的参考价值。

2.OSIPT9基因的研究为水稻抗褐飞虱基因的下游分子机理提供很好的理论基础，对于分子育种有重要意义。

附图说明

图1为亚细胞定位，定位在细胞质中。

图2为转基因植株苗期集团法抗虫鉴定。

(a)OsIPT9过表达转基因植株和受体材料的抗虫表型；(b)OsIPT9-Cas9转基因植株和受体材料的抗虫表型；均为BPH取食七天后拍照。IPT9OE-2和IPT9OE-4代表单独的OsIPT9过表达转基因植株；ipt9-1、ipt9-10、ipt9-18和ipt9-22代表单独的OsIPT9-Cas9转基因敲除植株；Nipponbare或者Nip代表感性对照和过表达的转基因受体；Nip-Bph6-NIL代表Bph6在日本晴背景下的近等基因系、抗虫对照和CRISPR/Cas9转基因受体。

图3为转基因植株褐飞虱蜜露及虫增重法抗虫鉴定。

(a)OsIPT9过表达转基因植株和受体材料的蜜露量、虫增重和虫增重百分比；(b)OsIPT9-Cas9转基因植株和受体材料的蜜露量、虫增重和虫增重百分比；均为BPH取食两天后进行数据收集。数值以平均值±标准差来表示。IPT9OE-2和IPT9OE-4代表单独的OsIPT9过表达转基因植株；ipt9-1、ipt9-10、ipt9-18和ipt9-22代表单独的OsIPT9-Cas9转基因敲除植株；Nipponbare代表感性对照和过表达的转基因受体；Nip-Bph6-NIL代表Bph6在日本晴背景下的近等基因系，抗虫对照和CRISPR/Cas9转基因受体。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述得重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

【实施例1】水稻OsIPT9基因的获得

通过对抗褐飞虱基因Bph6在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个tRNA异戊烯基转移酶OsIPT9，通过设计引物在日本晴的cDNA中扩增得到基因的ORF序列和基因组序列。

【实施例2】水稻OsIPT9基因的亚细胞定位

将OsIPT9基因全长ORF两端设计引物，加入BamHI的酶切位点和保护碱基，扩增片段回收后用BamHI酶进行酶切，连入到用同样酶酶切的载体PCXUN::GFP中，将阳性克隆送测序，确定是没有突变的正向连接的进行提质粒，将质粒转化到原生质体中。具体流程如下：

将水稻种子播在1/2MS培养基中，28℃暗培养箱培养10至12天。取100颗左右的幼苗，用刀片将茎切成约为0.5mm的小段，在0.6M的甘露醇中平衡10min后转移到酶解液中，28℃，80rpm暗培养4-5h。向酶解液中加入10ml的W5溶液终止反应，过滤得到原生质体悬液。滤液1,500rpm离心3min得到原生质体沉淀，用W5溶液悬浮沉淀，1,500rpm离心3min。吸去上清，加入适量的MMG溶液悬浮沉淀。在2ml离心管中依次加入10μg质粒、100μl原生质体和110μl PEG溶液，轻弹混匀，置于28℃暗培养，转化15至20min。向离心管中加入440μl的W5溶液来终止转化反应，1,500g离心3min，吸去上清。每管加入1ml的W5溶液，置于28℃培养箱中暗培养16-20h。将培养过夜的细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。IPT9-GFP的GFP信号位于整个细胞内，并且与细胞核bZIP63-RFP没有重叠信号，表明IPT9不定位于细胞核，而是定位于细胞质中(图1)。

【实施例3】OSIPT9基因过表达、CRISPR/Cas9载体的构建和农杆菌介导的遗传转化

1、OsIPT9过表达载体构建

发明人将OsIPT9的ORF两端各截取一段设计引物，序列如下：

OEV-F:ATGGCCCACCTCGCGGCCTCTG(5'-3')

OEV-R:CTATAATGATATCACTGTACTAGCC(5'-3')

所用载体为pCXUN(由美国Ohio State University的王国梁教授提供)，采用XcmI酶切pCXUN载体，将外源片段加A后可以直接连入。根据SEQ ID No.2的系列情况，采用PCR的方法直接扩增ORF，经加A后连入载体。测序验证无误后，所得载体即为OsIPT9基因过表达载体，将其电转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，-80℃保存备用。

2、OsIPT9的CRISPR/Cas9表达载体构建

找到目的基因上特异的靶标，设计引物，分别扩增出sgRNA和U6a启动子。引物序列如下：

gRT-IPT9：ACTCCATGCAAGTCTACGGgttttagagctagaaat(5'-3')

OsU6a-IPT9：CCGTAGACTTGCATGGAGTCggcagccaagccagca(5'-3')

利用重叠PCR的方法将带有靶标片段的sgRNA和U6a片段扩增在一起，两端的片段能够反向互补配对。PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果是单一条带可以直接将产物回收，如果有杂带就需要切胶，然后进行凝胶回收。回收后的片段即为sgRNA表达盒。按照以下连接体系将sgRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9质粒。

用变温循环进行酶切连接约10-15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min，37℃5min，10-15cycles；65℃20min，16℃1min后产物直接转化。将测序正确的阳性克隆提取质粒，电转转入农杆菌EHA105α，用于后续的遗传转化实验。

3、遗传转化

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282)将上述OsIPT9基因过表达载体导入日本晴，将CRISPR/Cas9表达载体导入NIP-Bph6-NIL(Bph6在日本晴背景下的近等基因系)。

用潮霉素引物Hyg-L和Hyg-R对转基因后代进行检测，得到超量表达转基因植株20株。

用IPT9/Cas9-F和IPT9/Cas9-R对CRISPR/Cas9转基因的T1代进行扩增和测序检测，确定突变位点，得到敲除转基因植株18株。

【实施例4】OsIPT9基因过表达及CRISPR/Cas9敲除植株的表型分析

1、苗期集团法

将待鉴定材料(OsIPT9过表达植株、CRISPR/Cas9敲除植株、日本晴和NIP-Bph6-NIL(Bph6在日本晴背景下的近等基因系)清出约60粒种子，浸种催芽后播种于直径10cm的塑料杯，每杯播20粒左右的种子，每份材料播三杯。待幼苗长到三叶期时，去生长状态不好的苗子，每杯材料分别套上纱网袋，按照每棵苗子8头褐飞虱的数量向袋中接入2-3龄褐飞虱若虫。当感性对照有90％以上的死亡时，读取每杯材料的抗性等级。

当感性对照日本晴已经死亡时，IPTOE-2和IPT9OE-4还依然存活，表明OsIPT9过表达增加了日本晴(转基因受体)的抗性(图2a)。当感性对照日本晴已经死亡时，与转基因受体NIP-Bph6-NIL(Bph6在日本晴背景下的近等基因系)相比，ipt-1、ipt9-10、ipt9-18和ipt-22也已经死亡，表明敲除OsIPT9的表达降低了NIP-Bph6-NIL的抗性(图2b)。以上结果从正反两个方面说明了OsIPT9具有抗虫性。

2、褐飞虱蜜露量以及增重测定

将封口膜制成合适大小的袋子，对每一个蜡袋进行编号并用天平称重，将蜡袋绑在水稻茎干上。同时抓取刚羽化的褐飞虱雌成虫，编号并用天平称重，然后放入对应编号的蜡袋中。待褐飞虱取食48小时后，分别将褐飞虱和蜡袋用天平称重。蜡袋两次称重重量的差值被记录为褐飞虱的蜜露量，褐飞虱若虫的两次称重重量的差值被记录为褐飞虱增重。每份材料进行30次独立的生物学重复。

褐飞虱的取食量与水稻抗性成负相关，取食量越大，抗性越弱。褐飞虱取食越多，排泄的蜜露量就越多，体重增加就越多，体重百分比也越高。与转基因受体日本晴相比，IPTOE-2和IPT9OE-4的蜜露量、虫增重和虫增重百分比有显著性降低，表明OsIPT9过表达增加了日本晴(转基因受体)的抗性(图3a)。与转基因受体NIP-Bph6-NIL(Bph6在日本晴背景下的近等基因系)相比，ipt-1、ipt9-10、ipt9-18和ipt-22的蜜露量、虫增重和虫增重百分比有显著性升高，表明敲除OsIPT9的表达降低了NIP-Bph6-NIL的抗性(图3b)。以上结果从正反两个方面说明OsIPT9具有抗虫性。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在水稻抗褐飞虱中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Ala His Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Pro Ser Ala Asp Pro

1 5 10 15

Asp Ala Gly Glu Glu Ser Ser His Ser Pro Pro Pro Pro Glu Lys Gly

20 25 30

Leu Arg Lys Val Val Val Val Met Gly Ala Thr Gly Ala Gly Lys Ser

35 40 45

Arg Leu Ala Val Asp Leu Ala Ser His Phe Ala Gly Val Glu Val Val

50 55 60

Ser Ala Asp Ser Met Gln Val Tyr Gly Gly Leu Asp Val Leu Thr Asn

65 70 75 80

Lys Val Pro Leu His Glu Gln Lys Gly Val Pro His His Leu Leu Ser

85 90 95

Val Ile Asp Pro Ser Val Glu Phe Thr Cys Arg Asp Phe Arg Asp His

100 105 110

Ala Val Pro Ile Ile Glu Gly Ile Leu Asp Arg Gly Gly Leu Pro Val

115 120 125

Ile Val Gly Gly Thr Asn Phe Tyr Ile Gln Ala Leu Val Ser Pro Phe

130 135 140

Leu Phe Asp Asp Met Ala Gln Asp Ile Glu Gly Leu Thr Leu Asn Asp

145 150 155 160

His Leu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Asn Asp Asp Glu Ala Gly Leu Tyr

165 170 175

Glu His Leu Lys Lys Ile Asp Pro Val Ala Ala Gln Arg Ile His Pro

180 185 190

Asn Asn His Arg Lys Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Leu Tyr Glu Ser Thr

195 200 205

Gly Ala Leu Pro Ser Asp Leu Phe Gln Gly Gln Ala Thr Glu Lys Trp

210 215 220

Gly Arg Pro Ser Asn Ser Arg Phe Asp Cys Cys Phe Leu Trp Leu Asp

225 230 235 240

Ala Asp Leu His Val Leu Asp Arg Tyr Val Asn Glu Arg Val Asp Cys

245 250 255

Met Ile Asp Asp Gly Leu Leu Asp Glu Val Cys Asn Ile Tyr Asp Arg

260 265 270

Glu Ala Thr Tyr Thr Gln Gly Leu Arg Gln Ala Ile Gly Val Arg Glu

275 280 285

Phe Asp Glu Phe Phe Arg Phe Tyr Phe Ala Arg Lys Glu Thr Gly Glu

290 295 300

Ile Lys Met Asp Ser Cys Thr Thr Met Ala Gly Leu His Asp Asp Asn

305 310 315 320

Leu Lys Gly Leu Leu Asp Glu Ala Val Ser Gln Leu Lys Ala Asn Thr

325 330 335

Arg Arg Leu Val Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu His Arg Leu Asn Lys

340 345 350

Tyr Phe Glu Trp Asn Leu Arg His Ile Asp Ala Thr Glu Ala Phe Tyr

355 360 365

Gly Ala Thr Ala Asp Ser Trp Asn Met Lys Val Val Lys Pro Cys Val

370 375 380

Asp Ile Val Arg Asp Phe Leu Ser Asp Asp Thr Ile Leu Ala Ser Arg

385 390 395 400

Asp Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser Pro Arg Met Ser Ser Arg Glu Leu

405 410 415

Trp Thr Gln Tyr Val Cys Glu Ala Cys Asp Asn Arg Val Leu Arg Gly

420 425 430

Thr His Glu Trp Glu Gln His Lys Gln Gly Arg Cys His Arg Lys Arg

435 440 445

Val Gln Arg Leu Lys Gln Lys Ala Ser Thr Val Ile Ser Leu

450 455 460

<210> 2

<211> 3254

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

aaggcccaaa gcccacaaca gagaggagag tgggcgacgg ggggctaggg cggcggcggc 60

gcggcgacca gcgacgggcg gcgcgcacct gaccggaatg gcccacctcg cggcctctgc 120

cgccccgctt ccaagcgctg accccgacgc cggcgaggag tcctcccact ctccgccgcc 180

gccggagaag gggctgagga aggtggtggt ggtgatgggc gcgactggcg ccggcaagtc 240

gcggctggcc gtcgacctcg cgagccactt cgccggcgtc gaggtggtca gcgccgactc 300

catgcaagtc tacggtgggc tcgatgtcct caccaacaag gtccccctcc acgagcagaa 360

aggtctcctc ccgggattcc ccagttcttc ttttgaccaa acctgcttca gatcgagctt 420

aacagcgcta tctttgccgt gttaccaggc gttcctcacc atctcctgag cgtgattgat 480

ccctctgtgg agttcacttg ccgcgatttc cgcgaccatg ctgtgccggt gagcctatga 540

tgttgctgct acgactttta gtgctcctag tgtgccatgt ttactgatta gttgatgttt 600

cttagtgctc tgctcaccaa ttatataagg tatattggtt tactgattaa ttgctgtttc 660

tgagtggtca cagattatag aaggtatatt ggatcgtggc ggcctccctg ttattgttgg 720

tggtacaaac ttctacatcc aggttgatac ttaagcgcat gaggattcct gtatattagg 780

ctatttttct tctgaattag actatatctg atttttgtcc ttttaacact tattgtaggc 840

tcttgttagc ccattcctct ttgatgatat ggcacaggat attgagggtc ttactttaaa 900

tgaccaccta gatgagatag gtgaatgatg aaagcttagc acatgtttct tgttgttagc 960

atgttttgat caatggttgt gtccaattag tgtttgactt gttaaacact gcttaacaca 1020

tgccaagcag ggcttgataa tgatgatgaa gccggtctgt atgaacattt gaagaagatt 1080

gatcctgttg ctgcacaaag gatacacccg aacaaccatc gaaaagtaag ggtgttgcac 1140

agttgtgccc ttaacctgtt aggtttcttt ggtagcaatt ggattttcct tgtggtgttg 1200

ccccatttgc cttatccggt tatcctgttc tgcatgcttt tttgttgtgt tgaccagata 1260

aaacgctacc ttgagttgta tgaatccaca ggtgccctac ctagtgatct tttccaaggg 1320

caagccacag aggtgagaaa aaaatgattt cccttttaat taatttcttt attctgactt 1380

gttgctgact ctatagtcca tgtgaaatgt gcaaggactt tatgcatatt atcatgcgca 1440

caacacattt tttgccgtac gagttggacc tcatgcgaac tctaaatgtc ctaatgaggt 1500

catttgttgt caggacagaa gtggggtcga cctagtaact ccagatttga ctgttgtttc 1560

ttgtggttag atgctgatct tcatgttctg gatcgttatg tcaatgaaag ggtcgactgc 1620

atgattgatg atggcctgct agatgaagtg tgtaacatat atgatcgaga ggccacttat 1680

acccaagggc tgcggcaggc cattggtgtt cgtgaatttg atgagttttt cagattttat 1740

tttgcaagga aggaaaccgg tgagataaag atggattcct gtacaactat ggcaggtctc 1800

catgatgata acctgaaggg cttattggat gaagcagtct cacaactaaa agcaaacact 1860

cgcagacttg ttcgacgtca agtaatctcg acactttttt aagtaaataa ttgaaaattg 1920

cattttgtgt gttttatatt cttgcctttc ttcagagacg aaggctgcat cggttgaata 1980

aatattttga gtggaacttg cgtcatattg atgcaacaga agctttctat ggtaatgata 2040

tgtgcatttc atgttttagt tcaaagccaa aagatttcat gtcttacgaa atctaatgtg 2100

tttgcttaac atgtcatgca tatttctagg tgccactgct gactcatgga acatgaaagt 2160

tgtgaaacct tgcgtggata ttgttagaga tttcttgtct gatgatacaa ttttggcaag 2220

cagagatggt tctagtgtaa ctggaagccc taggatgtct tcaagagagt tgtggactca 2280

atatgtttgt gaggtaattg ggaggctttt cttattctta ccaaaaagaa tgttgataac 2340

tgtatcgtca tttgtgcgtt ttgccacatt ttttgttagt gggacagcaa tcaatctgat 2400

gaaactttct tgcctttcct gctcctattt tacaggcctg tgataaccgg gtacttcggg 2460

gaacgcatga gtgggagcaa cacaagcaag gccgatgcca ccgtaaaaga gtacaacgtt 2520

tgaaacagaa ggctagtaca gtgatatcat tataggcaat tagcactgtt tgcactctcg 2580

gtgttcatga acctttcttc attctctgca actgtcccca tgcatcctgt ttgtcaaatt 2640

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gaatatttgc atatcttggt cttccagatt gcatgatttt tccttcatat gtgactggaa 3000

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atcatgttta ctactgtcgt gttgagacta ctgtacagta gctcgtatgt atttctcgta 3120

tgtttgtgca taagtgaggg gtcgatgaga gtgacttact agacttttct catcctaaat 3180

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atcgaaatat agag 3254

<210> 3

<211> 1389

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atggcccacc tcgcggcctc tgccgccccg cttccaagcg ctgaccccga cgccggcgag 60

gagtcctccc actctccgcc gccgccggag aaggggctga ggaaggtggt ggtggtgatg 120

ggcgcgactg gcgccggcaa gtcgcggctg gccgtcgacc tcgcgagcca cttcgccggc 180

gtcgaggtgg tcagcgccga ctccatgcaa gtctacggtg ggctcgatgt cctcaccaac 240

aaggtccccc tccacgagca gaaaggcgtt cctcaccatc tcctgagcgt gattgatccc 300

tctgtggagt tcacttgccg cgatttccgc gaccatgctg tgccgattat agaaggtata 360

ttggatcgtg gcggcctccc tgttattgtt ggtggtacaa acttctacat ccaggctctt 420

gttagcccat tcctctttga tgatatggca caggatattg agggtcttac tttaaatgac 480

cacctagatg agatagggct tgataatgat gatgaagccg gtctgtatga acatttgaag 540

aagattgatc ctgttgctgc acaaaggata cacccgaaca accatcgaaa aataaaacgc 600

taccttgagt tgtatgaatc cacaggtgcc ctacctagtg atcttttcca agggcaagcc 660

acagagaagt ggggtcgacc tagtaactcc agatttgact gttgtttctt gtggttagat 720

gctgatcttc atgttctgga tcgttatgtc aatgaaaggg tcgactgcat gattgatgat 780

ggcctgctag atgaagtgtg taacatatat gatcgagagg ccacttatac ccaagggctg 840

cggcaggcca ttggtgttcg tgaatttgat gagtttttca gattttattt tgcaaggaag 900

gaaaccggtg agataaagat ggattcctgt acaactatgg caggtctcca tgatgataac 960

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cgacgtcaaa gacgaaggct gcatcggttg aataaatatt ttgagtggaa cttgcgtcat 1080

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aaaccttgcg tggatattgt tagagatttc ttgtctgatg atacaatttt ggcaagcaga 1200

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gtttgtgagg cctgtgataa ccgggtactt cggggaacgc atgagtggga gcaacacaag 1320

caaggccgat gccaccgtaa aagagtacaa cgtttgaaac agaaggctag tacagtgata 1380

tcattatag 1389

Claims

1.水稻tRNA异戊烯基转移酶基因OsIPT9在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用，所述的OsIPT9基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述水稻为不携带抗褐飞虱基因Bph6的水稻。

2.一种提高水稻抗褐飞虱性能的方法，其特征在于，通过分子育种方法或基因工程的方法，提高权利要求1中所述的OsIPT9基因的表达量从而提高水稻抗褐飞虱性状，所述水稻为不携带抗褐飞虱基因Bph6的水稻。