CN102971427A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 - Google Patents

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CN102971427A CN2011800243436A CN201180024343A CN102971427A CN 102971427 A CN102971427 A CN 102971427A CN 2011800243436 A CN2011800243436 A CN 2011800243436A CN 201180024343 A CN201180024343 A CN 201180024343A CN 102971427 A CN102971427 A CN 102971427A
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Abstract

本发明提供了核酸和编码的果糖磷酸激酶（PFK）。本发明还提供了用于在植物中通过调节编码果糖磷酸激酶的核酸分子的表达而增强产量相关性状的方法。具有编码果糖磷酸激酶的核酸的受调节表达的植物相对于对照植物具有增加的产量相关性状。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
以下优先申请：US 61/315437、EP 10157064.6、US 61/382936、EP10176777.0引入作为参考。
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码果糖磷酸激酶(PFK)的核酸在植物中的表达而增强产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码果糖磷酸激酶(PFK，EC：2.7.1.11)之核酸的表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。
具有特殊经济意义的性状涉及增加的产量。产量通常定义为作物生产的可测量的经济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子生产，以及叶衰老等等。根发育、养分摄入量、胁迫耐性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。因此，优化前述因素可以对增加作物产量有贡献。
在田间条件下，植物性能，例如就生长、发育、生物量积累和种子生产而言，取决于植物对大量环境条件、改变和胁迫的耐受性和适应性能力。
农业生物技术人员使用几种参数的测量，其指示转基因对作物产量的可能影响。对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于谷物作物，已经将其他参数用于估计产量，例如植物大小，如通过植物总干重和鲜重、地上和地下干重和鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、叶长、根长、分蘖数和叶数所测量。早期发育阶段的植物大小通常将与晚期发育阶段的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多。植物大小和生长速率存在着强遗传组分，因此，种种多样化基因型植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关。以这种方式，可以将标准环境用于模拟(approximate)田地中作物所遭遇的多样化动态环境。表现出一种非生物胁迫耐受性的植物通常表现出另一种环境胁迫耐受性。在机制水平还不能理解这种交叉耐受的现象。然而，合理的期望是由于转基因的表达，表现出对低温，例如寒冷温度和/或冰冻温度增强的耐受性的植物还表现出对干旱和/或盐和/或其他非生物胁迫的耐受。已经表征了植物中参与胁迫应答、水使用和/或生物量的一些基因，但到目前为止，研发具有改进产量的转基因作物植物的成功还是受限的。
因此，存在鉴定在最佳和/或亚最佳培育条件下，当过表达或下调时，赋予对多种胁迫增加的耐受性和/或改进产量的基因的需求。
目前发现，可以通过调节植物中编码果糖磷酸激酶(PFK)多肽之核酸的表达而增加产量和改进植物的多种产量相关性状。
发明概述
目前已令人惊讶地发现，调节编码果糖磷酸激酶(PFK)之核酸的表达产生相对于对照植物具有增强的产量和改进的产量相关性状，特别是增加的种子生物量、饱满种子数和枝条生物量的植物，优选在低氮条件下产生这样的植物。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物改进植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码果糖磷酸激酶(PFK)之核酸的表达。
因此，根据本发明，此处鉴定的基因可以相对于对照植物用于增强产量相关性状，例如增加的种子生物量、饱满种子数和枝条生物量，优选在低氮条件下。可以在转基因植物及其合适的对照植物的田间试验中测定增加的产量。备选地，可以在最佳的可控生长条件下在模式植物中测定转基因增加产量的能力。可以通过与对照植物比较，测量以下表型的任意之一或者任意组合，来测定增加的产量性状：植物的干可收获部分的产量、植物的地上干可收获部分的产量、植物的地下干可收获部分的产量、植物的鲜重可收获部分的产量、植物的地上鲜重可收获部分的产量、植物的地下鲜重可收获部分的产量、植物的果实(鲜的和干的二者)的产量、种子(鲜的和干的)的产量、粒干重等。可以通过改善的种子产量、固有生长和发育的修饰来证明植物增加的固有生产力，改善的种子产量例如是增加的种子/粒大小、增加的穗数、每穗增加的种子数、改善的种子饱满/改善的种子组分等，固有生长和发育例如是植物高度、植物生长速率、荚数、节间数、开花时间、炸荚性(podshattering)、结瘤和氮固定的效率、碳同化的效率、幼苗萌发势/早期萌发势的改善、增强的萌发效率、植物结构的改善、细胞周期修饰等。
产量相关性状还可以被改善以增加植物对非生物环境胁迫的耐受性。非生物胁迫包括干旱、低温、盐度、渗透胁迫、遮光、高植物密度、机械胁迫和氧化胁迫。可以监测以测定对非生物环境胁迫增强的耐受的其他表型，包括但不限于枯萎；叶变褐；涨压；叶或针状叶下垂和/或脱落；叶或针状叶早衰；叶或针状叶中叶绿素的丢失和/或叶变黄。可以在田间试验中的作物植物中或者在可控培育条件下的模式植物中监测上述任一产量相关的表型，以证明转基因植物具有对非生物环境胁迫增加的耐受性。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指通过肽键连接在一起的处于任意长度的氨基酸聚合形式。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指任意长度聚合无分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure BDA00002414173300041
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束，并且可以在1-10个氨基酸的范围内；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸替换的例子
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的经改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然的经改变的氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然存在形式蛋白质与标签肽(如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白)的融合体(标签肽的综述参阅Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因先祖关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来源于共同的先祖基因。
结构域，基序/共有序列/特征序列
术语“结构域”指依据进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”或“特征序列”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专门数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes 30，242-244)，InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)，Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conferenceon Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)或者Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。用于计算机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASy蛋白组服务器(Swiss Institute ofBioinformatics(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。还可以使用常规技术(如通过序列比对)来鉴定结构域或基序。
比对序列以进行比较的方法为本领域所众所周知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol 48：443-453)的算法来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)在两序列间计算百分比序列同一性并进行相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information(NCBI))向公众提供。可以使用例如默认配对比对参数的ClustalW多重序列比对算法(1.83版)(采用默认配对比对参数)和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用MatGAT软件包(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003 Jul 10；4：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequence)中提供的方法之一来确定全局的相似性和同一性百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动编辑以优化保守性基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替使用全长序列来鉴定同源物。序列同一性值可以是采用上述程序使用默认参数在完整的核酸或氨基酸序列上或在所选择的结构域或保守的基序上测定的。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
交互BLAST
通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例章节表A中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列来源的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列来源的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。
高排名的命中是那些E值低的命中。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其它树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。
术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃，高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上有所偏差但因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30至45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)oligo-DNA或oligo-RNAd杂交分子：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。
cL＝双链体的长度(以碱基对计)。
d oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，如例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物活性的变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex，(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因，位于相同染色体位置内的替代形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中序列变体的最大集合。
内源基因
本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中发现的以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式随后(再)引入植物中的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可从生物体分离，或可人工制造(例如通过化学合成)。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由如下构成：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有修饰的生物学活性的蛋白质之核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
构建体
其它调节元件可包括转录及翻译增强子。本领域技术人员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。如在定义部分所述，也可将内含子序列添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制需要的复制起点序列。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于去除标记基因的技术是本领域已知的，有用的技术在上文“定义”部分中描述。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用，并且在广义上意指能够影响与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3′调节区(如终止子)或远离ORF的其它3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活性的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至合适的启动子或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水平和模式。合适的公知报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子强度和/或表达模式与参考启动子(如用于本发明方法中的)进行比较。备选地，可以通过定量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域众所周知的技术，如通过放射自显影的光密度测定分析进行的Northern印迹、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 GenomeMethods 6：986-994)。通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细胞中约1/10,000的转录物至约1/100,000的转录物至约1/500,0000的转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约1/100的转录物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35SCaMV启动子控制时获得的水平表达。
有效连接
如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
Figure BDA00002414173300141
Figure BDA00002414173300151
遍在启动子
遍在启动子在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某些发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答于化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导型”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导型”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性”。
根特异性启动子的例子列于下表2b中：
表2b：根特异性启动子的例子
Figure BDA00002414173300161
种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不一定仅在种子组织中有(泄漏表达的情况)。种子特异性启动子可在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。种子特异性启动子的实例(胚乳/糊粉/胚特异性的)在下表2c至表2f中显示。种子特异性启动子的其它实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，其公开内容通过引用整体并入本文作为参考。
表2c：种子特异性启动子的例子
Figure BDA00002414173300172
Figure BDA00002414173300181
Figure BDA00002414173300191
表2d：胚乳特异性启动子的例子
Figure BDA00002414173300192
Figure BDA00002414173300201
表2e：胚特异性启动子的例子：
基因来源 参考文献
稻OSH1 Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子的例子：
Figure BDA00002414173300211
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的例子在下表2g中显示。
表2g：绿色组织特异性启动的例子
Figure BDA00002414173300212
组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。可用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的例子示于下列的表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的例子
Figure BDA00002414173300221
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单元末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。
可选择标记(基因)/报告基因
“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。可选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin，G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供
Figure BDA00002414173300231
抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。视觉标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码可选择标记(如上文所述的那些)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码可选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的可选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。
因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体与导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于已知的重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则在已经成功发生转化时，通过重组酶表达去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有那些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码可用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中或存在于基因组文库中的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义——在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如例如诱变处理)修饰后，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中该核酸的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
在本发明的一个实施方案中，“分离的”核酸序列位于非天然的染色体周围。
调节
术语“调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加或减少。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”或者术语“调节表达”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
表达
术语“表达”或“基因表达”指转录一个或多个特定基因或特定的遗传构建体。特别地，术语“表达”或“基因表达”指将一个或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，包括或者不包括后者随后翻译成蛋白质。该过程包括转录DNA和加工所得的mRNA产物。
增加的表达/过表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。
在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。
如果期望表达多肽，一般期望在多核苷酸编码区的3’末端包含多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可来自该天然基因，来自多种其它植物基因，或者来自T-DNA。待被加入的3’末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因，或者较不优选地来自任何其它真核基因。
内含子序列也可添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。已经显示可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单元5′端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或者“降低或基本去除”的表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。
为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是通过在植物中引入和表达遗传构建体，将被间隔物(非编码DNA)分隔的核酸作为反向重复序列(部分地或完全地)克隆入此构建体中(在此情况下该核酸是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码任何目的蛋白质之一的直向同源物、旁系同源物或同源物)。
在这样的优选方法中，通过RNA介导的沉默降低或基本去除内源基因表达，其中使用核酸或其部分的反向重复序列(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)，优选能够形成发夹结构。反向重复序列克隆在含有控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔物，例如基质结合区片段(MAR)、内含子、聚合接头等等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成带有自身互补结构(部分或完全的)的嵌合RNA。这个双链RNA结构被称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，其整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切割mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。对于更多一般性细节见例如，Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明方法的实施不依赖于在植物中引入和表达遗传构建体(核酸作为反向重复序列克隆至该构建体中)，也可使用数个众所周知的“基因沉默”方法中的任何一个或多个达到相同效果。
用于减少内源基因表达的一个此类方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在此情况下，沉默由植物中的双链RNA序列(dsRNA)引发，该双链RNA序列与内源靶基因基本相似。这个dsRNA由植物进一步加工成约20至约26个核苷酸，被称为短干扰RNA(siRNA)。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个例子包括以有义方向引入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录本同源的DNA序列。因此引入植物的将至少是核酸序列的一个拷贝。附加的核酸序列将减少内源基因的表达，引起通常所说的共抑制现象。因为高转录本水平和共抑制的引发之间正相关，如果数个附加拷贝的核酸序列引入植物中，基因表达的减少将更显著。
RNA沉默方法的另一个例子包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补的核苷酸序列，也就是，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录本序列互补。反义核酸序列优选与将被沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指含有翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语“非编码区”指位于编码区侧翼的5′和3′序列，其将被转录却不被翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。
反义核酸序列可根据Watson和Crick碱基配对的规则进行设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在这种情况下，基本上连续的核苷酸片段可以来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸)，也可以是寡核苷酸，其仅与核酸序列(包括mRNA 5’和3’UTR)的一部分是反义的。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录本的翻译起始位点周围的区域互补。适合的反义寡核苷酸序列长度在本领域是已知的，可从约50、45、40、35、30、25、20、15或10核苷酸长度或更少起始。本发明的反义核酸序列可使用化学合成以及酶连接反应通过本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或各种改进的核苷酸(为增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双螺旋的物理稳定性而设计)进行化学合成，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本领域众所周知可用于产生反义核酸序列的改进的核苷酸实例。已知的核苷酸改进包括甲基化、环化和‘帽’和一个或多个天然存在核苷酸用类似物如肌苷替换。核苷酸的其它改进是本领域众所周知的。
可使用表达载体生物学产生反义核酸序列，其中核酸序列以反义方向亚克隆进入该表达载体(即，转录自插入核酸的RNA与目的靶核酸是反义方向的)。优选地，植物中反义核酸序列通过稳定整合的核酸构建体(包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子)产生。
本发明方法中用于沉默的核酸分子(无论引入植物或在原位产生)与mRNA转录本和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，由此抑制蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规的核苷酸互补形成稳定的双螺旋，或例如，就结合至DNA双螺旋的反义核酸序列而言，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。反义核酸序列可通过转化或在特异组织位点直接注射引入植物中。备选地，可改进反义核酸序列以靶向被选细胞，随后全身性施用。例如，对于全身施用，可改进反义核酸序列，使它们与表达于被选细胞表面上的受体或抗原特异性结合，例如通过将反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。也可使用本文所述的载体将反义核酸序列输送至细胞。
另一方面，反义核酸序列是一种a-异头物核酸序列。a-异头物核酸序列与互补的RNA形成特异性双链杂交，其中(与常见的b-单位相反)链相互之间平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核列也可包含2′-o-甲基核糖核苷(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本消除也可使用核酶实施。核酶是有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，能切割单链的核酸序列，如mRNA，它们与切割的单链核酸序列具有互补区。因此，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录本，由此基本上减少将要被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录本可用于从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。使用核酶用于植物中基因沉默是本领域已知的。(例如，Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。
如果内源基因上有突变，和/或在随后引入植物中的分离的基因/核酸上有突变，也可以发生基因沉默。降低或基本上消除可由非功能性多肽引起。例如，多肽可结合至多种相互作用的蛋白质；因此一个或多个突变和/或截断可提供一种多肽，该多肽仍能结合至相互作用的蛋白质(如受体蛋白质)，但不可显示其正常功能(如信号配体)。
基因沉默的另一种方法是通过靶向与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成三重螺旋结构，该结构防止基因在靶细胞中转录。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。特别地，可预见人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能或用于干扰靶多肽参与的信号通路。
备选地，可以设立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可用于例如实施同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微RNA(miRNA)与它们的靶序列具有完全或近乎完全的互补性。然而，有的天然靶标具有可多达五个错配。它们通过Dicer家族双链特异性核糖核酸酶从更长的非编码RNA(带有特征性折回结构)加工。加工后，通过结合到其主要组分(Argonaute蛋白质)将它们整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。由于它们与细胞质中的靶核酸(主要是mRNA)进行碱基配对，MiRNA用作RISC的特异性组分。随后的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的影响常常反映在靶基因减少的mRNA水平中。
通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等，Dev.Cell 8：517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，Plant Cell 18：1121-1133，2006)。
为优化性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待引入的核酸序列起源于与该核酸序列将要引入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待引入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的例子。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现在整株植物或在其部分中降低内源基因的表达。
转化
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。或者，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的显微注射(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；包被有DNA或RNA的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniquesfor Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物如，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由
Figure BDA00002414173300341
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet.208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.WordScientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座中心中的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改进的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染”法的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)ThePlant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同可选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastidtransformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。备选地，针对转化的植物筛选可选择标记(如上文所述标记)的存在。
DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选地或额外地，可用Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗上)。
在本申请通篇中，应将用构建体转化(或者可互换地通过构建体转化)的或者用/通过核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞理解为携带作为转基因的所述构建体或者所述核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞，所述构建体或者所述核酸作为转基因是因为通过生物技术方法引入了所述构建体或所述核酸的结果。因此，该植物、植物部分、种子或植物细胞包含所述重组的构建体或所述重组的核酸。将在之前引入后而不再含有所述重组的构建体或所述重组的核酸的任一植物、植物部分、种子或植物细胞称为失效分离子、失效合子或失效对照，但并不在本申请的含义内将其考虑为转化有所述构建体或者所述核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞。
T-DNA激活标签化
T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子，也可以是翻译增强子或内含子)，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的经修饰的表达。因靠近所引入启动子的基因的经修饰的表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写，指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面经修饰的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，ChuaNH，Schell J编辑，Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harb或Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在JMartinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体在汇集物中的存在检测为色谱图之一额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等，(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且不论何种目标生物，都存在一般可用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量相关性状
产量相关性状包括下述一项或多项：产量、生物量、种子产量、早期萌发势、绿度指数、增加的生长速率、改进的农学性状(如改进的水利用效率(WUE)、氮利用效率(NUE)等)。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物而言一年内每平方米的产量，这通过总产量(包括收获的和评价的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以与该植物的营养体生物量(根和/或枝条生物量)、繁殖器官和/或繁殖体(例如种子)有关。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每平方米中已建立植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径的增加、种子饱满率的增加(其是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其它。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物圆锥花序(panicle)数、圆锥花序长度、每圆锥花序的小穗数、每圆锥花序的花(小花)数、种子饱满率的增加(其是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其它。在稻中，浸没耐受性也可以产生增加的产量。
早期萌发势
“早期萌发势”或“早期生长萌发势”或“出芽萌发势(emergencevigour)”或“枝条萌发势(seedling vigour)”指活跃、健康、良好平衡的生长(特别是在植物生长早期期间)，并可以因植物适合度增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和枝条与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的枝条存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。
增加的生长速率
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如发芽的速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期之一或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许再播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其它稻植物，全部均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其它合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物而言在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)，等等。
胁迫抗性
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，温和胁迫在本文中定义为植物暴露于其的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，温和胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％、30％或25％，优选小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由温和胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。温和胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在温和干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“交叉(crosstalk)”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。最佳生长下生长的植物(在非胁迫条件下生长)一般出产以递增优选顺序至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的给定环境下这样植物的平均生产。平均生产可以收获和/或季节为基础进行计算。本领域技术人员清楚作物的平均产量生产。
养分缺乏可以由养分(例如氮、磷和其它含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁或者硼以及其它)缺少引起。
术语盐胁迫不限于常见盐(NaCl)，可以为以下一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。
增加/改进/增强
术语“增加”、“改进”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
根
如本文中所用的术语根包括植物的全部‘地面以下’或‘地下’部分，并且其充当支持、从周围土壤中汲取矿物质和水，和/或储存养分储备。其包括鳞茎、球茎、块茎、块根、根状茎和肉质根。增加的根产量本身可以表现为下列一种或多种指标：根生物量(总重量)增加，这可以基于单个根和/或每株植物和/或每平方米进行；增加的收获指数，其表述为可收获部分(如根)产量除以总生物量的比率。
根产量的增加也可以表现为根大小和/或根体积的增加。此外，根产量的增加本身也可以表现为根面积和/或根长度和/或根宽度和/或根周长的增加。增加的产量还可以产生改进的结构，或可以因改进的结构而出现。
种子产量
增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数除以种子总数的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量除以总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的种子产量也可以产生改进的结构，或可以因改进的结构而出现。
绿度指数
如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、及在养分利用度下降的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。
生物量
如本文中所用的术语“生物量”意图指植物的总重量。在生物量的定义中，在植物的一个或多个部分的生物量之间可以进行区分，所述植物的一个或多个部分可以包括下述的一种或多种：
-地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等；
-地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等；
-地下部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等；
-地下可收获部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等；
-部分插入地面或者与地面接触的可收获部分，例如但不限于甜菜根(beet)和植物的其他下胚轴面积、根状茎、匍匐茎或蔓延的根茎；
-营养体生物量例如根生物量、枝条生物量等等；
-繁殖器官，和
-繁殖体，例如种子。
标记辅助的育种
这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非故意引起的所谓“自然”起源的等位变体集合开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论序列的优选等位变体且其导致增加的产量的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其它任选步骤包括将鉴定到有优选等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
探 针在(遗传作图)中的用途
编码目的蛋白质的核酸用于遗传和物理作图，该基因仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，ALaboratory Manual)可以用编码目的蛋白质的核酸序列来探测。产生的条带图谱随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码目的蛋白质的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改进方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、近等基因系和其它个体的组可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改进可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。例子包括等位基因特异的扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic AcidRes.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的整个区域内作图亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
植物
如本文中所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别有用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[低芥酸油菜(canola)、油菜(oilseed rape)、蔓青(turniprape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、天麻苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusinecoracana)、Eragrostis tef、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotryajaponica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycinespp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersiconesculentum)、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetumsp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleumpratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Tripsacum dactyloides、黑小麦物种(Triticale sp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、Triticum monococcum或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
对于本发明的序列，植物来源的核酸或多肽序列分别具有下述特征：经优化用于在植物中表达的密码子使用，以及使用在植物中通常的氨基酸和调节位点的。植物的来源可以是任一植物，但优选地是那些在前面的段落中所描述的植物。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设置的常规部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评价植物属于相同的植物物种或甚至是相同的品种。对照植物也可以是待评价植物的失效合子。失效合子(也称为失效对照植物)是通过分离丢失转基因的个体。此外，在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育对照植物。通常，在相同的培育条件下，并因此在本发明植物的附近及在同时培育对照植物。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。在允许与根据本发明产生的植物比较的条件下(例如在类似的的条件下培育对照植物和根据本发明方法产生的植物，优选在相同的条件下)评价对照植物的表型或性状。
发明详述
现在发现调节编码果糖磷酸激酶之核酸在植物中的表达产生相对于对照植物而言具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物而言增强产量和/或产量相关性状的方法，其中所述方法包括用重组的构建体转化植物以增加果糖磷酸激酶在植物中的活性或表达，和任选地选择具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。优选地，在低氮条件下观察到增加的产量和/或增强的产量相关性状。
用于调节果糖磷酸激酶在植物中的表达和活性的优选的方法是通过引入和表达编码该果糖磷酸激酶的核酸分子。
下文中任何地方提到“用于本发明方法的蛋白质”均指本文所定义的果糖磷酸激酶。下文中任何地方提到“可用于本发明方法的核酸”均指能够编码此果糖磷酸激酶的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任何核酸，下文也称为“果糖磷酸激酶核酸”或“果糖磷酸激酶基因”。
优选地，如本文所定义的本发明的“果糖磷酸激酶”(即果糖磷酸激酶多肽)指包含含有至少一个短结构域的氨基酸序列的任何多肽，所述短结构域如Interpro结构域IPR000023或Interpro结构域IPR012004。
在优选的实施方案中，氨基酸序列含有至少Interpro结构域IPR000023和Interpro结构域IPR012004之一，更优选地含有至少Interpro结构域IPR000023和Interpro结构域IPR012004二者。
在另一个实施方案中，氨基酸序列含有至少Interpro结构域IPR000023和Interpro结构域IPR012004之一，更优选地含有至少Interpro结构域IPR000023和Interpro结构域IPR012004二者，并还包含如下所述的SAT区。在另外的实施方案中，在本发明中使用的PFK氨基酸序列包含如在2011年2月28日所定义的PFAM结构域PF00365(参见http://pfam.sanger.ac.uk/family？acc＝PF00365)和如下所定义的SAT区。
此外，如本文所定义的本发明的“果糖磷酸激酶”(即果糖磷酸激酶多肽)指任何包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有如下所述的氨基端SAT区和结构域(如Interpro结构域IPR000023和/或Interpro结构域IPR012004)，或者包含在SEQ ID NO.：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76及其同源物(如本文中所述)，优选SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76及其同源物(如本文中所述)中所示的多肽序列或者由包含如在SEQ IDNO.：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75，优选地SEQ ID NO.：80、1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中所示的核酸分子的多核苷酸编码的多肽及其同源物(如本文中所述)的任意之一的氨基酸序列及其同源物(如本文中所述)和/或包含基序1至6，优选地4至6中的至少任意之一。
优选地，果糖磷酸激酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列含有短基序(如Interpro结构域IPR000023和/或Interpro结构域IPR012004)以及与SEQ ID NO.：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76中所示的多肽序列的任意之一或者与由包含如在SEQ ID NO.：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中所示的核酸分子的多核苷酸编码的多肽具有35％或以上同一性的氨基酸序列，和甚至更优选地，还包含基序1至6的至少任意之一，优选地4至6中的至少任意之一。
优选地，果糖磷酸激酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列含有短基序(如Interpro结构域IPR000023和/或Interpro结构域IPR012004)，以及与SEQ ID NO.：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76中所示的多肽序列的任意之一或者与由包含如在SEQ ID NO.：80、1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中所示的核酸分子的多核苷酸编码的多肽具有35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者以上同一性的氨基酸序列，和甚至更优选地，还包含基序1至6中的至少任意之一，优选地4至6中的至少任意之一，以及最优选地还包含如下所定义的SAT区。
在一个实施方案中，果糖磷酸激酶的特征在于包含以下MEME基序的一种或多种：
基序1(SEQ ID NO：82)
PKTIDNDI[LPA][VL]ID[KR][ST]FGFDTAVEEAQRAIN[AS]A[HY][VI]EAE
基序2(SEQ ID NO：83)
A[VI][PR][SA]NASDN[VI][YL]CT[LV]L[AG][QH][SN]A[VI]HGA[MF]AG[YF][TS]G[FI]T
基序3(SEQ ID NO：84)
A[AC]IVTCGGLCPGLN[TD]VIRE[IL]V
更优选的，果糖磷酸激酶特征在于包含下述MEME基序亚群的一种或多种：
基序4(SEQ ID NO：85)
PKTIDNDILL[MI]DKTFGFDTAVEEAQ[RK]AIN[SA]A[YK][IV]EA[HR]SAY[HN]G
基序5(SEQ ID NO：86)
[AS][CV]R[AT]NASD[AGR]I[LY]CT[VI]LGQNAVH[GA]AFAG[FY][ST]GITVG[IL][CV]NTHY[VA]
基序6(SEQ ID NO：87)
RAGPR[KE][EK]IY[FY][ED]PEEVKAAIVTCGGLCPGLNDV[IV]RQ[IL]V[IF]TLE
基序1至6是使用MEME算法(Bailey和Elkan，Proceedings of theSecond International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology，pp.28-36，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)获得的。在MEME基序中的每个位置上，显示出在序列的查询集合中以高于0.2的频率存在的残基。方括号内的残基代表备选。更优选地，用于本发明方法的多肽包含基序4至6中的至少之一。
在优选的实施方案中，将基序4的位置10处的氨基酸从亮氨酸改变成甲硫氨酸。在另一优选的实施方案中，基序6的位置11处的氨基酸可以备选地为赖氨酸。
在其他优选的实施方案中，PFK多肽包含选自基序4、基序5和基序6的一种或多种基序。优选地，PFK多肽包含基序4和5、或者基序5和6、或者基序4或6，或者更优选地基序4、5和6。
另外地，本发明涉及果糖磷酸激酶多肽的同源物及其在本发明的方法和构建体中的用途。果糖磷酸激酶多肽的同源物以递增的优先顺序与由SEQ ID NO：81和/或2和/或由SEQ ID NO.：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76所示的其直向同源物和旁系同源物表示的，优选在SEQ ID NO.：4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76中所示的那些的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性，并且优选地只要同源蛋白质包括如上所述的任意一种或多种基序或结构域和/或如下所定义的SAT区。整体序列同一性使用全局比对算法来进行确定，如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数并优选的使用成熟蛋白质的序列(即，不考虑分泌信号或转运肽)。
与整体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常较高。优选地，果糖磷酸激酶多肽中的基序以递增的优先顺序与由基序1至6(SEQ ID NO：82至87)，优选4至6(SEQ ID NO：85至87)中任意一种或多种具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
术语“结构域”、“特征序列”和“基序”在本文“定义”章节中定义。
在一个实施方案中，序列同一性水平通过SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76的序列的全长上比较多肽序列测定。在另一个实施方案中，核酸序列的序列同一性水平通过在SEQ ID NO：80、1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的序列的编码序列的全长上比较核酸序列测定。
在一个实施方案中，在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品中使用的果糖磷酸激酶多肽是果糖磷酸激酶，但不包括在
WO 2009/009142的SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或者WO 2009/009142的表8中WO 2009/009142的SEQ IDNO：401的直向同源物；或
WO 2006/076423的SEQ ID NO：314、15153、13760或2541或者WO 2006/076423的表2中WO 2006/076423的SEQ ID NO：314的直向同源物
中所公开的序列的果糖磷酸激酶。
在本发明的一个实施方案中，在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品中使用的果糖磷酸激酶多肽的同源物以递增的优先顺序与由SEQ ID NO：81和/或2表示的氨基酸具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性，并且包含如下所述的SAT区，优选地只要同源蛋白质也包含如上所述的任意一种或多种基序或结构域。在一个实施方案中，序列同一性水平通过在SEQ ID NO：81或2的序列的全长上比较多肽序列测定。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品使用编码果糖磷酸激酶蛋白质的序列，所述蛋白质的特征在于在多肽的氨基端部分具有不常见的高丰度的脂肪族氨基酸和脂肪族羟基氨基酸的序列片段。称此种在氨基端具有增加的丰度的例如(但不限于)丝氨酸、苏氨酸和/或丙氨酸的序列片段为SAT区。
在另外的实施方案中，SAT区见于在本发明方法、构建体、植物、植物部分、种子和产品中使用的多肽序列的起始甲硫氨酸之后(包括起始甲硫氨酸)的40个氨基酸残基内。在一个实施方案中，SAT区见于在多肽序列的氨基末端的35、30、25或20个氨基酸残基中，即起始甲硫氨酸之后(包括起始甲硫氨酸)的氨基酸残基。
通常，将氨基酸残基理解为这样的氨基酸，其是氨基酸聚合后，通过肽键连接氨基酸的多肽链的一部分。
在另一个实施方案中，SAT区含有至少25、26、27、28、29或30％的脂肪族氨基酸残基。
又在另一个实施方案中，SAT区在至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25％的SAT区的位置中包含脂肪族羟基氨基酸残基。在另外的实施方案中，SAT区为25或20个残基长度，并且包含至少25、26、27、28、29或30％脂肪族羟基氨基酸残基。在另一个实施方案中，SAT区的最多或第二最多丰度，优选地最多丰度的单个氨基酸残基是丝氨酸。
在另一个实施方案中，SAT区跨位置1处的甲硫氨酸至位置20处的残基，并且具有至少40％的脂肪族氨基酸残基和至少30％的脂肪族羟基残基。
在本发明的一个实施方案中，所使用的多肽序列的SAT区的特征在于脂肪族氨基酸残基和脂肪族羟基氨基酸残基一起占存在的氨基酸残基的至少40、50、53、55、56、58或60％。脂肪族氨基酸残基通常是那些疏水性氨基酸残基(甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和脯氨酸)。在一个实施方案中，SAT区的脂肪族氨基酸残基选自G、A、V、L和I。脂肪族羟基氨基酸残基通常是丝氨酸和苏氨酸残基。
意想不到的是，与其他果糖磷酸激酶多肽比较，可以将包含SAT区和/或如上所述的基序1至6的任意一种或多种的果糖磷酸激酶多肽有利地用于本发明的方法、植物、构建体和产品。特别有利地是将包含SAT区和/或如上所述的基序4、5或6的任意一种或多种的果糖磷酸激酶多肽用于本发明的方法、构建体、植物和产品。
优选地，当多肽序列(即本发明方法、植物、植物部分、可收获部分、产品和构建体的那些多肽序列)用于构建系统发生树时，例如图1中描述的，与进化枝A成簇，优选地与偏离毛果杨(Populus trichocarpa)(P.trichocarpa_PFK_A)的氨基酸序列的不超过4、3或2个分层分支点(即包含由SEQ ID NO：2和/或SEQ ID 81，优选地SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶的群)，而不与任何其他群或序列成簇。
此外，通常将果糖磷酸激酶多肽(至少以其天然形态)描述为果糖磷酸激酶。SEQ ID NO.：80编码毛果杨的果糖磷酸激酶。果糖磷酸激酶(PFK)使用ATP作为底物，催化果糖-6-磷酸至果糖-1，6-磷酸的产生(Mustroph等人，2007)。PFK酶参与植物中胞质溶胶和叶绿体二者中发生的糖酵解途径(Plaxton等人，1996)。
因此，果糖磷酸激酶优选地是ATP依赖的果糖磷酸激酶(PFK)。
在一个实施方案中，目的多肽可以是在叶绿体内和/或外有活性的。例如，其定位与叶绿体内。因此，在一个实施方案中，用于本发明方法的果糖磷酸激酶包含如本文中所述的叶绿体靶向信号或者在叶绿体中表达，例如作为用编码目的多肽的表达构建体稳定转化叶绿体的结果。对于本发明核酸序列的产品，由于在转基因生物的背景下其天然存在的序列特性，术语“细胞质的”或“在叶绿体中”应当不排除靶向定位于任意的细胞组分。对于生物(植物)，通过使用软件工具例如TargetP(Emanuelsson等人，(2000)，Predicting sub-cellular localization ofproteins based on their N-terminal amino acid sequenc.，J.Mol.Biol.300，1005-1016。)、ChloroP(Emanuelsson等人(1999)，ChloroP，aneural network-based method for predicting chloroplast transit peptidesand their cleavage sites.，Protein Science，8：978-984。)或者其他预测软件工具(Emanuelsson等人(2007)，Locating proteins in the cell usingTargetP，SignalP，and related tools.，Nature Protocols 2，953-971)，技术人员可以预测来源于包封序列(enclosed sequences)的成熟多肽的亚细胞定位。例如，果糖磷酸激酶可以与指导果糖磷酸激酶进入叶绿体的信号，例如“转运肽”有效连接。理论上，可以从每一生物例如微生物如藻类或者含有质体(优选叶绿体)的植物中分离编码转运肽的核酸序列。“转运肽”是这样的氨基酸序列，其的编码核酸序列与相应的结构基因一起翻译。这意为转运肽是翻译的蛋白质的整体的一部分，并且形成了蛋白质的氨基端延伸。二者都翻译为所谓的“前蛋白质”。一般而言，在蛋白质输入到正确的细胞器例如质体期间或者刚刚在蛋白质输入到正确的细胞器例如质体之后，转运肽从前蛋白质中切割下来以产生成熟蛋白质。通过帮助蛋白质通过胞内膜的运输，转运肽确保成熟蛋白质的正确定位。von Heijne等人(Plant Molecular Biology Reporter，9(2)，104，(1991))公开了编码转运肽的核酸序列，所述文献在此处引用作为参考。
例如根据如在实施例6和7中所述的本发明方法，当在植物中表达时，果糖磷酸激酶多肽的表达或活性的增加产生了相对于对照植物而言具有增加的产量，特别地种子产量(如通过总种子重量和饱满种子数所测量)和改进的产量相关性状，特别是增加的枝条生物量的植物，例如在低氮条件下相对于在低氮条件下的对照植物而言。
本发明通过用SEQ ID NO：80表示的核酸序列转化植物进行了示例，上述核酸序列编码SEQ ID NO：81的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可有利的通过使用本文定义的任何果糖磷酸激酶编码核酸或果糖磷酸激酶多肽(例如如在表A中所列)，以及作为在SEQ ID No.：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76中所示的多肽及其同源物、直向同源物或旁系同源物，优选那些在SEQ ID No.：4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76中所示的多肽及其同源物、直向同源物或旁系同源物所列出的序列来实施，只要他们不是SEQ IDNO：8、40、42、44或46表示的序列。
编码果糖磷酸激酶的核酸的实例在本文实施例章节表A中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例章节表A中给出的氨基酸序列为SEQ ID NO：81或2所示果糖磷酸激酶多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行如在定义章节中所述的所谓的交互blast检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是例如SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：81，二次BLAST(反向BLAST)应当针对原始序列数据库，例如杨树数据库进行。
本发明还提供了用于相对于对照植物而言在植物中赋予增强的产量相关性状的迄今为止未知的果糖磷酸激酶编码核酸分子和果糖磷酸激酶多肽。
根据本发明其他的实施方案，因此提供了分离的核酸分子，所述核酸分子选自：
(i)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸的互补序列；
(iii)编码SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽的核酸，优选地，由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以衍生自SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽序列，并且另外相对于对照植物而言优选地赋予增强的产量相关性状；
(iv)核酸，所述核酸以递增的优先顺序与SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的任一核酸序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且另外优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(v)核酸分子，其在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子杂交并且优选赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(vi)编码果糖磷酸激酶的核酸，所述果糖磷酸激酶以递增的优先顺序与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)表示的氨基酸序列或者表A中的任一其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且另外相对于对照植物而言优选地赋予增加的产量(例如增加的总种子重量和饱满种子数)和/或增强的产量相关性状(例如增加的枝条生物量)，例如在低氮条件下相对于对照植物而言优选地赋予增加的产量(例如增加的总种子重量和饱满种子数)和/或增强的产量相关性状(例如增加的枝条生物量)；
(vii)根据上文(i)至(iv)中任一项的核酸，其中所编码的果糖磷酸激酶多肽序列不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的多肽序列；
(viii)根据上文(i)至(vii)中任一项的核酸，其中所编码的果糖磷酸激酶多肽包含如上所定义的SAT区；
(ix)根据上述(i)至(viii)中任一项编码多肽的核酸，其中所编码的多肽不是在WO 2009/009142中作为SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或者作为在WO 2009/009142的表8中WO2009/009142的SEQ ID NO：401的直向同源物公开的或者在WO2006/076423中作为SEQ ID NO：314、15153、13760或2541或者作为在WO 2006/076423的表2中WO 2006/076423的SEQ ID NO：314的直向同源物公开的任一多肽序列的多肽。
根据本发明其他的实施方案，还提供了分离的多肽，所述多肽选自：
(i)SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所述的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其以递增的优先顺序与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的氨基酸序列或者表A中的任一其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(iii)上文(i)或(ii)给出的任一氨基酸序列的衍生物；或
(iv)本发明核酸所编码的氨基酸序列；
(v)根据上文(i)至(iv)中任一项的氨基酸序列，其中果糖磷酸激酶多肽序列不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的任一多肽序列；
(vi)根据上文(i)至(v)中任一项的氨基酸序列，其中所编码的果糖磷酸激酶多肽包含如上所定义的SAT区；
(vii)根据上述(i)至(vi)中任一项的氨基酸序列，其中多肽不是在WO 2009/009142中作为SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或者作为在WO 2009/009142的表8中WO 2009/009142的SEQID NO：401的直向同源物公开的或者在WO 2006/076423中作为SEQ IDNO：314、15153、13760或2541或者作为在WO 2006/076423的表2中WO 2006/076423的SEQ ID NO：314的直向同源物公开的任一多肽序列的多肽。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的核酸分子或者赋予本发明的果糖磷酸激酶多肽表达的表达构建体。
核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类核酸变体的例子包括编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸序列，其中术语“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是这样的变体，其中已经优化了密码子使用或者其中移除了miRNA靶向位点。
可用于实施本发明方法的其它核酸变体包括编码果糖磷酸激酶(PFK)的核酸的部分，与编码果糖磷酸激酶(PFK)的核酸杂交的核酸，编码果糖磷酸激酶的核酸的剪接变体，编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的等位变体，以及通过基因改组获得的果糖磷酸激酶多肽编码核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。
在本发明的一个实施方案中，本发明核酸序列的功能是当本发明核酸序列在活的植物细胞中转录和翻译时，赋予增加产量或产量相关性状的蛋白质的信息。
编码果糖磷酸激酶多肽的核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例章节表A中给出的任一核酸序列的部分、或者编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分，并且所述任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物具有与实施例章节A中给出的氨基酸序列，特别是包含SEQ ID No.：2的多肽基本上相同的生物学活性。
例如，可以通过对核酸序列进行一个或多个缺失来制备所述核酸序列的部分。部分可以以分离的形式使用，或者可将其与其它编码(或非编码)序列融合，以便例如，产生组合了若干活性的蛋白质。当与其它编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分所预测到的要大。
可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的果糖磷酸激酶多肽，并与实施例章节表A中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选部分是实施例章节表A中给出的任一核酸的部分，或是编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选该部分长度为至少100、200、300、400、500、550、600、700、800或900个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例章节表A中给出的任一核酸序列或者编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸。优选该部分是核酸SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的一部分。最优选该部分是核酸SEQ ID NO：80或1，优选SEQ ID NO：80的一部分。优选该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇和/或包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种和/或具有果糖磷酸激酶的生物学活性，和/或包含本发明的核酸分子，例如其与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少50％的序列同一性或者其是它们的直向同源物或旁系同源物。例如，该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ IDNO：81和/或SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1或2的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81和/或SEQ IDNO：2，优选地与SEQ ID NO：81具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述片段与包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81具有至少60、70或80％的序列同一性。
可用于本发明方法中的另一种核酸变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如本文中所定义的果糖磷酸激酶多肽的核酸序列杂交，或与如本文中所定义的部分进行杂交的核酸序列。
根据本发明，提供用于在植物中增加产量和增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入并表达能够与实施例章节表A中给出的任何一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达这样的核酸序列，其能够与编码在实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列杂交。
可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的果糖磷酸激酶多肽，与实施例章节表A中给出的氨基酸序列，优选地包含SEQ ID No.：81或2，优选地SEQ ID No.：81的多肽具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够在严格杂交条件下与实施例章节表A中给出的任一核酸序列的互补序列杂交、或与任一这些序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者杂交序列能够在严格杂交条件下与编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选杂交序列是在根据标准的杂交技术在严格杂交条件下进行杂交时，能够与SEQ ID NO：80或1所示核酸的互补序列或其部分，优选地与SEQ ID NO：80或其部分杂交。
在一个实施方案中，对于DNA与DNA印迹的杂交，术语“严格条件”指在60℃在10X Denhart’s溶液、6X SSC、0.5％SDS和100g/ml变性的鲑鱼精子DNA中过夜杂交。在62℃，在3X SSC/0.1％SDS，然后1X SSC/0.1％SDS和最后0.1X SSC/0.1％SDS中连续洗涤印迹，每次30分钟。使用标准杂交方法，将SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列在这些严格条件下与SEQ ID NO：80所示的序列杂交。
在优选的实施方案中，短语“严格条件”指在65℃在6X SSC溶液中杂交。在另一个实施方案中，“高度严格条件”指在65℃在10XDenhart’s溶液、6X SSC、0.5％SDS和100g/ml变性的鲑鱼精子DNA中过夜杂交。在65℃，在3X SSC/0.1％SDS，然后1X SSC/0.1％SDS和最后0.1X SSC/0.1％SDS中连续洗涤印迹，每次30分钟。用于执行核酸杂交的方法是本领域公知的。使用标准杂交方法，将SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列在这些严格条件下与SEQ ID NO：80所示的多核苷酸序列杂交。
在一个实施方案中，杂交序列能在如上所定义的中等或高度严格条件，优选高度严格条件下与SEQ ID NO：80所示的核酸的互补序列或与其一部分杂交。在另一个实施方案中，杂交序列能在严格条件下与SEQID NO：80所示的核酸的互补序列杂交。
优选的，杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列当全长用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，与包含SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇和/或包含基序1至6(优选4至6)的任意一种或多种和/或具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性和/或与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少50％的序列同一性或者其是它们的直向同源物或旁系同源物。例如，该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ ID NO：81和/或SEQID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6(优选4至6)的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81和/或SEQ IDNO：2，优选地与SEQ ID NO：81具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述片段与包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与任何其他群聚簇，并包含基序1至6，(优选4至6)的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81具有至少60、70或80％的序列同一性。
可用于本发明方法中的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义的果糖磷酸激酶多肽的剪接变体，剪接变体如本文所定义。
根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入并表达在实施例章节表A中给出的任何一种核酸序列的剪接变体，或下述核酸的剪接变体，其中所述的核酸编码在实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物。
优选剪接变体是SEQ ID NO：80或1所示核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇和/或包含基序1至6(优选4至6)的任意一种或多种和/或具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性和/或与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地与SEQ IDNO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少50％的序列同一性，或者其是它们的直向同源物或旁系同源物。例如，该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2，优选地与SEQ ID NO：81具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述片段与包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6(优选4至6)的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81具有至少60、70或80％的序列同一性。
可用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的果糖磷酸激酶多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文所定义。
根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入并表达在实施例章节表A中给出的任何一种核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达下述核酸的等位变体，其中所述的核酸编码在实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物。
可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2的果糖磷酸激酶多肽及实施例章节表A中所示任一氨基酸，优选地与SEQ ID NO：81的果糖磷酸激酶多肽具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选地，等位变体是SEQ ID NO：80的等位变体，或编码SEQ ID NO：81之直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由等位变体编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，与包含SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇和/或包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种和/或具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性和/或与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少50％的序列同一性或者其是它们的直向同源物或旁系同源物。例如，该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ IDNO：81和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2，优选地与SEQ ID NO：81具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述片段与包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81具有至少60、70或80％的序列同一性。
基因改组或定向进化也可用于产生上文所定义的果糖磷酸激酶多肽的编码核酸的变体；其中术语“基因改组”如本文所定义。
根据本发明，提供了在植物中改进产量和增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例章节表A中给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
优选通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇和/或包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种和/或具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性和/或与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，优选地与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少50％的序列同一性或者其是它们的直向同源物或旁系同源物。例如，该部分编码这样的氨基酸序列的片段，当用于构建系统发生树(例如图1所示的系统发生树)时，其与包含SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：2，优选地与SEQ IDNO：81具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述片段与包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的果糖磷酸激酶多肽的群聚簇，而非与其他群聚簇，并包含基序1至6，优选地4至6的任意一种或多种，并具有果糖磷酸激酶(PFK)的生物学活性，并与SEQ ID NO：81具有至少60、70或80％的序列同一性。
此外，还可利用定点诱变获得核酸变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley编辑)。
编码果糖磷酸激酶多肽的核酸可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。优选果糖磷酸激酶多肽编码核酸选自表A中所示的生物，优选地选自植物。
例如，可以通过改变若干个核苷酸，从编码SEQ ID NO：81的果糖磷酸激酶多肽的核酸产生编码SEQ ID NO：2的果糖磷酸激酶多肽的核酸。例如，通过位点定向诱变法，使用基于PCR的方法(参见CurrentProtocols in Molecular Biology。Wiley编辑)，通过将位置732处的核酸从G改变成A并将位置838和839处的核酸从GC改变成AG，从SEQID NO：80衍生了SEQ ID NO：1。可以将与SEQ ID NO：81的序列差异一个或多个氨基酸的果糖磷酸激酶多肽用于在本发明方法和构建体和植物中增加植物的产量。
在另一个实施方案中，本发明延及包含用于本发明方法的核酸序列的重组染色体DNA，其中作为重组方法的结果，所述核酸存在于染色体DNA中，即所述核酸并不以其天然环境存在于染色体DNA中。所述重组染色体DNA可以是天然来源的染色体，其中所述核酸通过重组方法插入，或者其可以是微染色体或者非天然染色体结构，例如或者人工染色体。染色体DNA的性质是可以改变的，只要其允许本发明方法所用的重组核酸能稳定地传递给连续后代，并允许在活的植物细胞中表达所述核酸，导致该植物细胞或者包含该植物细胞的植物增加的产量或者增加的产量相关性状。
在另外的实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含于植物细胞中。
本发明方法的实施产生具有改进的产量和增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言具有增加的产量，尤其是增加的种子产量和/或增加的枝条生物量的植物，例如在低氮条件下产生所述植物。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“产量”和“种子产量”。
在本文中对增强的产量相关性状的提及意指植物的一个或多个部分的早期萌发势和/或生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子和/或根，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物而言具有增加的种子饱满率、根和枝条生物量的植物。
本发明提供了相对于无效对照植物而言增加产量、特别是增加如通过总种子重量和饱满种子数测量的种子产量，以及相对于对照植物而言改进产量相关性状，特别是枝条生物量的方法。该方法包括调节植物中果糖磷酸激酶多肽的表达或活性，优选增加植物中果糖磷酸激酶多肽的表达或活性，例如调节或增加如本文所定义的编码果糖磷酸激酶多肽的核酸在植物中的表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，例如产量相关性状(如增加的枝条生物量和/或增强的早期生长萌发势)，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现出增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。例如，在低氮条件下，相对于在其生活周期中的对应阶段上的对照植物的生长速率，这些植物表现出增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节如本文中所定义的编码果糖磷酸激酶多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明方法产生在养分缺乏条件下，特别是氮缺乏条件下相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供增加在养分缺乏条件下培育的植物的产量的方法，该方法包括在植物中调节编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达。
实施本发明方法产生在盐胁迫下相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了增加在盐胁迫条件下培育的植物的产量的方法，该方法包括在植物中调节编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达。
实施本发明方法产生在非胁迫下相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了增加在非胁迫条件下培育的植物的产量的方法，该方法包括在植物中调节编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达。
实施本发明方法产生在温和干旱下相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了增加在温和干旱条件下培育的植物的产量的方法，该方法包括在植物中调节编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达。
本发明还提供遗传构建体和载体，以利于在植物中引入和/或表达编码果糖磷酸激酶多肽的核酸。可以将遗传构建体插入适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中，该载体可以是可商购的载体。本发明还提供了如本文所定义的遗传构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供这样的构建体，其含有：
(a)编码如上文所定义的果糖磷酸激酶多肽的核酸；
(b)一个或多个能够驱动(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选的
(c)转录终止序列。
优选地，编码果糖磷酸激酶多肽的核酸是如上文所定义的。术语“控制序列”和“终止序列”是如本文所定义的。
本发明还提供了用如上所述的构建体转化的植物。特别地，本发明提供了用如上所述的构建体转化的植物，所述植物具有上文中所述的增强的产量和/或增加的产量相关性状。
可以使用含有任何上述核酸的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于本发明载体中的一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。
在一个实施方案中，用含有任何上述核酸的表达盒转化本发明的植物。技术人员充分知晓表达盒中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。在本发明的表达盒中，将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。该表达盒中的启动子可以是上述核酸的非天然启动子，即在其天然环境中并不调节所述核酸表达的启动子。
在其他的实施方案中，本发明的表达盒，当将它们引入到植物细胞中并导致包含在所述表达盒中的如上所定义的核酸表达时，赋予包含该表达盒的活的所述植物细胞增加的产量或产量相关性状。
本发明的表达盒可以包含于宿主细胞、植物细胞、种子、农业产品或植物中。
有利地，任何类型的启动子，不论天然的或合成的，均可用于驱动核酸序列的表达，但是优选启动子是植物来源的。组成型启动子在方法中是特别有用的。优选组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。多种启动子类型的定义参见本文的“定义”部分。也在本发明中有用的是根特异性启动子。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35S CaMV启动子控制时获得的水平的水平进行表达。
应该明白，本发明的适用范围不限于SEQ ID NO：80所示果糖磷酸激酶多肽的编码核酸，本发明的适用范围也不限于由组成型启动子驱动时，或者由根特异性启动子驱动时编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达。
组成型启动子优选是中等强度的启动子，更优选的选自植物来源的启动子，例如植物染色体来源的启动子如GOS2启动子，更优选来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是由与SEQ ID NO：77基本相似的核酸序列所表示的，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：77所示。组成型启动子的其它实例见本文“定义”部分。
任选地，可在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选的，构建体包括包含GOS2启动子和编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达盒。此外，可在引入植物的构建体上存在一个或多个编码选择标记的序列。
根据本发明优选的特征，调节的表达是增加的表达或活性，例如过表达编码果糖磷酸激酶多肽的核酸分子，例如过表达编码如在表A中所示的SEQ ID NO.：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75或其旁系同源物或直向同源物的核酸分子。用于增加核酸或基因或基因产品之表达的方法均已详细记载于本领域中，并且在定义部分提供了实例。
如上所述，用于调节编码果糖磷酸激酶多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码果糖磷酸激酶多肽的核酸；然而实施该方法的效果(也就是增强产量并改进产量相关性状)也可使用其它众所周知技术来实现，包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组。在定义部分提供了这些技术的描述。
本发明还提供产生与对照植物相比具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达编码上文所定义果糖磷酸激酶多肽的任何核酸序列。
更具体地，本发明提供了产生与无效对照植物比较具有增强的产量相关性状(特别是增加的种子产量、种子饱满率、根和枝条生物量)的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入和表达果糖磷酸激酶多肽的编码核酸或者包含果糖磷酸激酶多肽编码核酸的遗传构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养该植物细胞。
(i)的核酸可以是任何能编码如本文所定义的果糖磷酸激酶多肽的核酸序列。
可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入植物的组织、器官或任何其它部分)。根据本发明优选的特征，优选通过转化将核酸引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。
在一个实施方案中，本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还包括通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。植物或其部分包括编码由如上所定义的果糖磷酸激酶多肽的核酸转基因。本发明还延及包含由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，唯一的要求是所述后代呈现出与本发明方法中的亲本产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。
在另一个实施方案中，本发明还延及转基因植物细胞和种子，其包含植物表达盒或植物表达构建体中的本发明核酸分子。
在另外的实施方案中，本发明的种子重组地包含本发明的表达盒、本发明的(表达)构建体、上述核酸和/或由上述核酸编码的蛋白质。
本发明的另外的实施方案延及植物细胞，其包含重组植物表达盒中的上述核酸。
又在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖细胞，例如使用标准细胞培养技术(即细胞培养方法，但不包括体外核、细胞器或染色体转移法)，不能将细胞作为整体用于从该细胞中再生整株植物。尽管植物细胞通常具有全能性的特征，但一些植物细胞不能用于从所述细胞中再生或者繁殖完整的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。
在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是这样的植物细胞，其不能借助光合作用，以水、二氧化碳和矿物盐等无机物质合成碳水化合物和蛋白质来维系生存，即所述植物细胞不能被认为是植物品种。在另外的实施方案中，本发明的植物细胞并不是植物品种且不能繁殖。
本发明也包括含有编码如上文所定义的果糖磷酸激酶多肽的经分离的核酸的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞，例如大肠杆菌或土壤杆菌属(Agrobacterium)物种细胞、酵母细胞、海藻的或蓝藻细胞(cyanobacterial cell)或者植物细胞的任何细胞。在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是植物细胞。对于用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，其宿主植物原则上有利地为能够合成在本发明方法中使用的多肽的所有植物。
在一个实施方案中，本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。
本发明还包括用于生产产品的方法，包括a)培育本发明的植物和b)从本发明的植物或这些植物的部分(包括种子)中生产或者通过本发明的植物或这些植物的部分(包括种子)生产所述产品。在本方法的另外的实施方案中，所述方法包括步骤a)培育本发明的植物和b)从植物中去除如上所定义的可收获部分和c)从本发明的可收获部分中生产或者通过本发明的可收获部分生产所述产品。
此类方法的实例是培育本发明的玉米植物，收获玉米穗并去除籽粒。可以将这些用作为饲料或者加工成淀粉和油作为农业产品。
可以在培育植物的位置处生产产品，或者可以从培育植物的位置处移除植物或其部分以生产产品。通常，培育植物，从植物中(如果可行，以重复的循环)移除期望的可收获部分，并从植物的可收获部分中制备产品。每次实行本发明方法可以仅实行一次培育植物步的骤，而允许重复多次产品生产的步骤，例如通过重复移除本发明植物的可收获部分，并根据需要进一步加工这些部分以成为产品。还可以重复本发明的培育植物的步骤，并储存植物或可收获部分，直到对积累的植物或植物部分实行一次产品的生产。此外，可以在时间上重叠，甚至在很大程度上同时，或者顺次实行培育植物和生产产品的步骤。通常，在生产产品之前一段时间培育植物。
有利地，本发明方法比已知的方法更有效，因为本发明植物与采用可比较方法的对照植物比较，具有增加的产量和/或对环境胁迫增加的胁迫耐受性。
在一个实施方案中，通过本发明的所述方法生产的产品是植物产品，例如但不限于食品、饲料、食物添加剂、饲料添加剂、纤维、美容剂或药物。认为食品是作为用于营养或者用于补充营养的组合物。特别地，将动物饲料和动物饲料添加剂认为是食品。
在另一个实施方案中，将用于生产的本发明方法用于制备农业产品，例如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。
植物产品在很大程度上可以由一种或多种农业产品组成。
又在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸序列或多肽序列包含于农业产品中。
在另外的实施方案中，可以将本发明的核酸序列和蛋白质序列用作为产品标记，例如用于通过本发明方法生产的农业产品。可以将此类标记用于鉴定通过有利方法生产的产品，所述有利的方法不仅导致了方法更高的效率，并且还由于增加了用于该方法的植物材料和可收获部分的品质，所以改进了产品的品质。可以通过多种本领域已知的方法检测此类标记，例如但不限于用于核酸检测的基于PCR的方法或者用于蛋白质检测的基于抗体的方法。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括大豆、甜菜、糖萝卜(sugar beet)、向日葵、低芥酸油菜、菊苣、胡箩卜、木薯、苜蓿、三叶草、油菜(rapeseed)、亚麻子、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦(emmer)、德国小麦(spelt)、黑麦属、一粒系小麦(einkorn)、teff、蜀黍(milo)和燕麦。
在一个实施方案中，用于本发明方法的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油料油菜(oilseed rape)包括低芥酸油菜、甘蔗、糖萝卜和苜蓿。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的植物和用于本发明方法的植物是具有增加生物量和/或增加的甜菜糖含量的糖萝卜植物。
本发明也延及植物的可收获部分，该植物可收获部分包含编码果糖磷酸激酶多肽的重组核酸，这样的可收获部分包括，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和鳞茎。本发明进一步涉及来自(优选直接来自)或者产生自(优选直接来自或直接产生自)该植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明也包括编码如本文中所述的果糖磷酸激酶多肽的核酸的用途和这些果糖磷酸激酶多肽的用途，用于增强植物中的任何前述的产量相关性状。例如，编码本文中所述果糖磷酸激酶多肽的核酸、或果糖磷酸激酶多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与果糖磷酸激酶多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述核酸/基因或果糖磷酸激酶多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。此外，编码果糖磷酸激酶多肽的基因/核酸的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码果糖磷酸激酶多肽的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图和物理作图，所述探针作为所述基因的一部分，及用作与那些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。
在一个实施方案中，在以下情况下进行了测定序列同一性百分比的任意比较
-在SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：1，优选SEQ ID NO：80的完整编码区上比较核酸的情况下，或
-在SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：2，优选SEQ ID NO：81的全长上比较多肽序列的情况下。
例如，在该实施方案中，50％序列同一性的序列同一性意为在SEQID NO：80的完全编码区上，所有碱基的50％在SEQ ID NO：80的序列及相关序列之间是相同的。类似地，在该实施方案中，多肽序列与SEQID NO：81的多肽序列是50％相同的，即当从起始甲硫氨酸开始一直比较到SEQ ID NO：81的序列结束时，在所测试的多肽中可见在SEQ ID NO：81中所示序列的氨基酸残基的50％。
在一个实施方案中，在本方法、构建体、植物、可收获部分和产品中所使用的核酸序列是编码果糖磷酸激酶的序列，但不包括编码以下公开的多肽序列的那些核酸的任意一种或多种：
1.表3；或
2.表4；或
3.表5；或
4.到2011年3月1日时的UniProtKB/TrEMBL数据库中的B9HFR9(参见http://www.uniprot.org/uniprot/)，或
5.WO 2009/009142的SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或WO 2009/009142的表8中WO 2009/009142的SEQ IDNO：401的直向同源物；或
6.WO 2006/076423的SEQ ID NO：314、15153、13760或2541或WO 2006/076423的表2中WO 2006/076423的SEQ ID NO：314的直向同源物。
表3：到2010年8月17日时，国家生物技术信息中心(NCBINational Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可得到的选定蛋白质序列的列表
Figure BDA00002414173300791
Figure BDA00002414173300801
表4：国际申请中相关蛋白质的蛋白质序列
Figure BDA00002414173300831
Figure BDA00002414173300841
Figure BDA00002414173300851
Figure BDA00002414173300861
Figure BDA00002414173300871
表5：在2010年8月17日，通过检索号取自GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)的专利部分的选定蛋白质序列
Figure BDA00002414173300872
Figure BDA00002414173300881
Figure BDA00002414173300891
Figure BDA00002414173300901
Figure BDA00002414173300911
在另外的实施方案中，在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品中使用的核酸序列并不是编码选自表A中所列的蛋白质的蛋白质之编码多核苷酸的那些序列，以及也不是当与表A中所列的蛋白质的编码序列最佳比对时，那些具有至少60、70、75、80、85、90、93、95、98或99％核苷酸同一性的序列。
其他实施方案
项目1至项目22
1.用于在植物中相对于对照植物增强产量的方法，包括调节编码多肽的核酸在植物中的表达，其中所述多肽包含至少一个Interpro结构域IPR000023或Interpro结构域IPR012004结构域，优选地含有二者。
2.项目1的方法，其中所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序1：PKTIDNDI[LPA][VL]ID[KR][ST]FGFDTAVEEAQRAIN[AS]A[HY][VI]EAE；
基序2：A[VI][PR][SA]NASDN[VI][YL]CT[LV]L[AG][QH][SN]A[VI]HGA[MF]AG[YF][TS]G[FI]T；或
基序3：A[AC]IVTCGGLCPGLN[TD]VIRE[IL]V；
优选地，所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序4：
PKTIDNDILL[MI]DKTFGFDTAVEEAQ[RK]AIN[SA]A[YK][IV]EA[HR]SAY[HN]G；
基序5：
[AS][CV]R[AT]NASD[AGR]I[LY]CT[VI]LGQNAVH[GA]AFAG[FY][ST]GITVG[IL][CV]NTHY[VA]；或
基序6：RAGPR[KE][EK]IY[FY][ED]PEEVKAAIVTCGGLCPGLNDV[IV]RQ[IL]V[IF]TLE。
3.项目1或2的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达果糖磷酸激酶(PFK)之编码核酸分子而实现。
4.项目1-3中任一项的方法，其中所述多肽通过核酸分子编码，所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(i)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸的互补序列；
(iii)SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽的编码核酸，优选地，由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以衍生自SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽序列，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(iv)核酸，其以递增优选顺序与SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的核酸序列的任一具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(v)核酸分子，其在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子杂交，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状；
(vi)编码多肽的核酸，所述多肽以递增优选顺序与SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状。
5.项目1-4中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物而言增加的产量，优选增加的种子产量和/或枝条生物量。
6.项目1-5中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
7.项目1-5中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得的。
8.项目1-7中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选地与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
9.项目1-8中任一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科，更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。
10.通过项目1-9中任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码如在项目1-9中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
11.构建体，包含：
(i)编码如项目1-7中任一项所定义的所述多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
12.项目11的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
13.项目11或12的构建体在用于制造植物的方法中的用途，其中所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的种子产量和/或枝条生物量。
14.用项目11或12的构建体转化的或者通过项目1-9中任一项的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物或其部分包含编码如在项目1-10中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
15.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中引入和表达如项目1-7中任一项所定义的所述多肽之编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
16.相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物或者源于所述转基因植物的转基因植物细胞，获得自所述多肽之编码核酸受调控的表达。
17.项目10、14或16的植物，或源自它的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如糖萝卜、苜蓿、三叶草、菊苣、胡箩卜、木薯、棉花、大豆、低芥酸油菜或者单子叶植物，例如甘蔗或者谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦(emmer)、德国小麦(spelt)、黑麦属、一粒系小麦(einkorn)、teff、蜀黍(milo)和燕麦。
18.项目10的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条和/或根生物量和/或种子。
19.来自项目10的植物和/或项目18的植物的可收获部分的产品。
20.如在项目1-7中任一项所定义的多肽之编码核酸在增加相对于对照植物的产量，特别是增加的种子产量和/或枝条生物量中的用途。
21.项目1-20中的任一项，其中所述核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的任一多肽序列的多肽。
22.项目1-21中的任一项，其中所述核酸编码的多肽不是在WO2009/009142公开为SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或者在WO 2009/009142的表8中公开为WO 2009/009142的SEQID NO：401的直向同源物；或者在WO 2006/076423中公开为SEQ IDNO：314、15153、13760或2541或者在WO 2006/076423的表2中公开为WO 2006/076423的SEQ ID NO：314的直向同源物的任一多肽序列之多肽。
另外的实施方案
项目A-X：
A.用于在植物中相对于对照植物增强产量的方法，包括调节编码多肽的核酸分子在植物中的表达，其中所述多肽包含至少一个Interpro结构域IPR000023和Interpro结构域IPR012004结构域，优选地含有二者，并且其中所述多肽在氨基端氨基酸序列中包含SAT区。
B.项目A的方法，其中所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序1：PKTIDNDI[LPA][VL]ID[KR][ST]FGFDTAVEEAQRAIN[AS]A[HY][VI]EAE；
基序2：A[VI][PR][SA]NASDN[VI][YL]CT[LV]L[AG][QH][SN]A[VI]HGA[MF]AG[YF][TS]G[FI]T；或
基序3：A[AC]IVTCGGLCPGLN[TD]VIRE[IL]V；
优选地，所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序4：
PKTIDNDILL[MI]DKTFGFDTAVEEAQ[RK]AIN[SA]A[YK][IV]EA[HR]SAY[HN]G；
基序5：
[AS][CV]R[AT]NASD[AGR]I[LY]CT[VI]LGQNAVH[GA]AFAG[FY][ST]GITVG[IL][CV]NTHY[VA]；或
基序6：RAGPR[KE][EK]IY[FY][ED]PEEVKAAIVTCGGLCPGLNDV[IV]RQ[IL]V[IF]TLE。
C.项目A或B的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达果糖磷酸激酶(PFK)之编码核酸分子而实现。
D.项目A-C中任一项的方法，其中所述多肽通过核酸分子编码，所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(i)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75(的任意之一)所示的核酸的互补序列；
(iii)SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽的编码核酸，优选地，由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以衍生自SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的多肽序列，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状。
(iv)核酸，其以递增优选顺序与SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的核酸序列的任一具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状，其中所述核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的任一多肽序列的多肽；
(v)第一核酸分子，其在严格杂交条件下与(i)至(iv)的第二核酸分子杂交，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状，其中所述第一核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的任一多肽序列的多肽；
(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽以递增优选顺序与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76(的任意之一)所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状。
E.项目A-D中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物而言增加的产量，优选增加的种子产量和/或枝条生物量和/或植物部分(不是根)的生物量。
F.项目A-E中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
G.项目A-E中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得的。
H.项目A-G中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选地与GOS2启动子，最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。
I.项目A-H中任一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科，更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。
J.通过项目A-I中任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码如在项目A-I中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
K.构建体，包含：
(i)编码如项目A-H中任一项所定义的所述多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
L.项目K的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
M.项目K或L的构建体在用于制造植物的方法中的用途，其中所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的种子产量和/或枝条生物量。
N.用项目K或L的构建体转化的或者通过项目A-9中任一项的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物或其部分包含编码如在项目A-J中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
O.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中引入和表达如项目A-H中任一项所定义的所述多肽之编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
P.相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物或者源于所述转基因植物的转基因植物细胞，获得自所述多肽之编码核酸受调控的表达。
Q.用于生产产品的方法，所述方法包括培养本发明的植物，以及从a.本发明的所述植物；或b.这些植物的部分，包括种子中生产所述产品或者通过a.本发明的所述植物；或b.这些植物的部分，包括种子生产所述产品的步骤。
R.项目J、N或P的植物，或源自它的转基因植物细胞，或项目Q的方法，其中所述植物是作物植物，优选双子叶植物，例如糖萝卜、苜蓿、三叶草、菊苣、胡箩卜、木薯、棉花、大豆、低芥酸油菜或者单子叶植物，例如甘蔗或者谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦(emmer)、德国小麦(spelt)、黑麦属、一粒系小麦(einkorn)、teff、蜀黍(milo)和燕麦。
S.项目J的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条和/或根生物量和/或种子。
T.来自项目J的植物和/或项目R的植物的可收获部分的产品。
U.如在项目A-H中任一项所定义的多肽之编码核酸相对于对照植物在增加产量，特别是增加种子产量和/或枝条生物量和/或植物部分(不是根)的生物量中的用途。
V.项目K或L的构建体，其包含与植物细胞中。
W.前述项目A-U中的任一项，其中所述核酸编码的多肽不是SEQID NO：8、40、42、44、46(的任意之一)所示的任一多肽序列的多肽，和/或其中所述核酸编码的多肽不是以下多肽之一
a)在WO 2009/009142公开为SEQ ID NO：401、5648、3519、2563、20298或22365或者在WO 2009/009142的表8中公开为WO 2009/009142的SEQ ID NO：401的直向同源物；或者
b)在WO 2006/076423中公开为SEQ ID NO：314、15153、13760或2541或者在WO 2006/076423的表2中公开为WO 2006/076423的SEQID NO：314的直向同源物。
X.前述项目A-U中的任一项，其中所述核酸编码的多肽不是SEQID NO：3-79之一所示的任一多肽序列的多肽或者由SEQ ID NO：3-79之一编码的任一多肽序列的多肽，即不是选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74和76的SEQ ID NO所示的任一多肽序列。
附图简述
现将参考以下附图描述本发明，其中：
图1显示PFK多肽的系统发生树。使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)，Briefings in Bioinformatics 9：286-298)进行比对。使用QuickTree(Howe等人(2002)，Bioinformatics 18(11)：1546-7)计算邻接树。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMCBioinformatics 8(1)：460)绘制进化树。针对物种缩写参见序列表。通过名称的最后一个字母(_A、_B、_C)表示进化枝。
图2表示用于增加稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的PFK多肽编码核酸在稻中表达的二元载体。
图3显示本申请SEQ ID NO：2和81的氨基酸序列与UniProtKB/TrEMBL数据库中已知为B9HFR9的序列的比对。浅灰色背景表示保守氨基酸，深灰色背景表示在大多数序列中保守的氨基酸。具有深灰色背景的氨基酸和具有白色背景的那些氨基酸允许在SEQ ID NO：81的序列和其他两种序列之间进行区分。共有序列显示在比对的底部。
可以看出，通过改变几个氨基酸，可以将SEQ ID NO：81的多肽转变成SEQ ID NO：2的多肽。
该图还公开了在SEQ ID NO：2和81的氨基端区域中(但不在B9HFR9中)的如上所述的SAT区。
实施例
现将参考以下仅用于说明的实施例来描述本发明。以下实施例不旨在完整的定义或以其它方式限定本发明的范围。
DNA操作：除非另有说明，根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York)或Ausubel等(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中所述标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的由R.D.D Croy编著的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。
实施例1：鉴定与SEQ ID NO：80和1以及SEQ ID NO：81和2相关的序列。
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：80和1以及SEQ ID NO：81和2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，SEQ ID NO：80的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。
序列表提供了与SEQ ID NO：80和1以及SEQ ID NO：81和2相关的核酸序列的列表，例如选自表A的。
表A：序列SEQ ID NO.：80、81和1-76显示了PFK核酸和多肽的实例。
＞毛果杨(P.trichocarpa)_PFK变体1 SEQ ID NO.：80和81。
＞毛果杨_PFK变体2 SEQ ID NO.：1和2。
＞A.anophagefferens_31362 SEQ ID NO.：3和4。
＞A.lyrata_481109 SEQ ID NO.：5和6。
＞油菜(B.napus)_TC84406 SEQ ID NO.：9和10。
＞莱茵衣藻(C.reinhardtii)_196430 SEQ ID NO.：11和12。
＞莱茵衣藻_196629 SEQ ID NO.：13和14。
＞C.vulgaris_40684 SEQ ID NO.：15和16。
＞C.vulgaris_81035 SEQ ID NO.：17和18。
＞小球藻属(Chlorella)_29926 SEQ ID NO.：19和20。
＞大豆(G.max)_Glyma01g03040.1 SEQ ID NO.：21和22。
＞M.truncatula_AC135848_8.4 SEQ ID NO.：23和24。
＞M.truncatula_AC183305_22.5 SEQ ID NO.：25和26。
＞细小微胞藻(Micromonas)_RCC299_63659 SEQ ID NO.：27和28。
＞细小微胞藻_RCC299_97915 SEQ ID NO.：29和30。
＞O.lucimarinus_29493 SEQ ID NO.：31和32。
＞O.lucimarinus_37009 SEQ ID NO.：33和34。
＞O.RCC809_40974 SEQ ID NO.：35和36。
＞O.RCC809_43365 SEQ ID NO.：37和38。
＞P.patens_145714 SEQ ID NO.：47和48。
＞P.patens_81369 SEQ ID NO.：49和50。
＞P.taeda_TA10697_3352 SEQ ID NO.：51和52。
＞P.tricornutum_14284 SEQ ID NO.：53和54。
＞P.virgatum)_TC8346 SEQ ID NO.：55和56。
＞S.bicolor_Sb01g022370.1 SEQ ID NO.：57和58。
＞S.bicolor_Sb02g024680.1 SEQ ID NO.：59和60。
＞S.bicolor_Sb07g021500.1 SEQ ID NO.：61和62。
＞T.aestivum_TC310862 SEQ ID NO.：63和64。
＞V.carteri_74177 SEQ ID NO.：65和66。
＞V.carteri_78805 SEQ ID NO.：67和68。
＞V.vinifera_GSVIVT00011477001 SEQ ID NO.：69和70。
＞V.vinifera_GSVIVT00020939001 SEQ ID NO.：71和72。
＞玉米_BPS32747 SEQ ID NO.：73和74。
＞玉米_TC472542 SEQ ID NO.：75和76。
序列已经由研究协会例如基因组研究协会(TIGR；以TA开头)暂时组装并对公众公开。还可以使用真核基因直向同源物(EGO)数据库鉴定这类相关序列，用目的核酸或多肽序列进行关键词搜索或通过使用BLAST算法进行。针对具体的生物已经创建了具体的核酸序列数据库，例如由联合基因组协会(Joint Genome Institute)创建的那些。另外，使用专利数据库允许鉴定新的核酸和多肽序列。
优选地，PFK具有PFK活性。该测定描述于Mustroph 2007中：
ATP+D-果糖6-磷酸＝ADP+D-果糖1，6-二磷酸
实施例2：PFK多肽序列序列比对
使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)，Briefings in Bioinformatics9：286-298)进行多肽序列的比对。
使用逐步比对的ClustalW 2.0算法(Thompson等人(1997)NucleicAcids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet(或者Blosum 62(如果比对多肽))，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)。进行少量人工编辑以进一步优化比对。
使用在来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻接聚类算法构建PFK多肽的系统发生树(图1)。
图1显示了该系统发生树的实例。为了简单化作图，毛果杨(P.trichocarpa_PFK_A)的条目表示了SEQ ID NO：2和81二者，因为这些序列大体上是相同的。
使用逐步比对的ClustalW(1.83/2.0)算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)。进行少量人工编辑以进一步优化比对。
实施例3：计算多肽序列之间的全局百分比同一性
使用逐步比对的ClustalW 2.0算法(Thompson等人(1997)NucleicAcids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)，采用标准设定确定全长多肽序列之间全局相似性百分数和同一性百分数。
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka提供)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列逐对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。
实施例4：鉴定在用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域
使用MEME算法(Bailey和Elkan，Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)鉴定基序。在MEME基序的每一位置处，显示在频率高于0.2的序列的查询集中存在的残基。方括号中的残基表示备选。
使用Interpro数据库鉴定结构域。
蛋白质家族、结构域和位点集成资源(Integrated Resouce of ProteinFamilies，domain and Site，InterPro)数据库是基于文本和序列的检索的通常所用特征序列数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质特征序列。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的，多重序列比对和隐藏的马尔可夫模型(hidden Markov models)的大集合。Pfam由大不列颠联合王国的Sanger研究所的服务器上提供。Interpro由大不列颠联合王国的欧洲生物信息研究所提供。
因此，鉴定了以下包含于用于实施本发明方法的多肽序列中的结构域：
Interpro结构域IPR000023和/或Interpro结构域IPR012004
Interpro结构域IPR012004
果糖磷酸激酶(PFK)催化果糖-6-磷酸磷酸化为果糖-1，6-二磷酸，然后其进入Embden-Meyerhof途径。PFK是糖酵解中的关键调节酶。该群组包括植物和细菌焦磷酸依赖的果糖磷酸激酶。细菌版本是非变构的二聚体，而植物版本是变构的异源四聚体。它们属于蛋白质的PFK结构域超家族，其还包括原核(与INTERPRO：IPR012003交叉引用)和真核ATP依赖的PFK(与INTERPRO：IPR009161交叉引用)。该群组的成员大体上类似于群组B1 PFK。
从ATP酶催化地转移磷酸基团是多种生物学过程中的重要反应PUBMED：2953977。使用该反应的一种酶是果糖磷酸激酶(PFK)，其催化果糖-6-磷酸至果糖-1，6-二磷酸的磷酸化(糖酵解途径中的关键调节步骤)PUBMED：12023862，PUBMED：7825568。在细菌和哺乳动物中，PFK以同源四聚体存在(其中每一单体具有2个相似的结构域)，并且在酵母中以八聚体存在(其中存在4α-(PFK1)和4β-链(PFK2)，后者与哺乳动物单体类似，具有2个相似的结构域PUBMED：7825568)。
实施例5：PFK多肽序列的拓扑学预测
TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配是基于经预测存在的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所依据的评分并非真的是概率，并且它们未必加起来等于一。然而，具有最高评分的位置根据TargetP是最有可能的，并且评分之间的关系(可靠性类别)可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别(RC)范围从1至5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。
选择了众多参数，如生物群(非植物或植物)、临界设置(cutoff set)(无、临界的预定义设置或临界的用户指定设置)和对切割位点预测的计算(是或否)。
众多其它算法可以用来执行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上提供的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute forMolecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器上提供的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序(Protein ProwlerSubcellular Localisation Predictor)第1.2版；
·在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学(University ofAlberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器上提供的PENCEProteome Analyst PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上提供的TMHMM；
·PSORT(URL：psort.org)。
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
TargetP给出的亚细胞定位预测的结果：根据TargetP1.1服务器，预测SEQ ID NO：81所示的PFK的亚细胞定位为叶绿体(RC值＝2；cTP得分为0.916)。
表B：
名称 果糖磷酸激酶(SEQ ID NO：81) 临界值
长度(AA) 532 0.000
叶绿体转运肽 0.916 0.000
线粒体转运肽 0.057 0.000
分泌途径信号肽 0.036 0.000
其他亚细胞靶向 0.155
预测的定位 C
可靠的类别 2
实施例6：编码PFK的核酸序列的克隆
通过PCR，使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库(在pDONR222.1；Invitrogen，Paisley，英国中)作为模板，扩增核酸序列。用于克隆的cDNA文库定制自毛果杨的不同组织(例如叶、根)。所用的毛果杨的幼株获自Dr Wout Boerjan，University of Ghent，Belgium。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶，使用在50μl PCR混合物中的200ng模板实施PCR。所用的引物为prm15051(SEQ ID NO：78正义)。
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggactctgtgtcgcatg3’
和prm15052(SEQ ID NO：79；反义，互补的)：
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagctgtataaggctggagg3’，
其包括用于Gateway重组的AttB位点。并使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pPFK。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：80的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子位于这种Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将获得的表达载体GOS2::PFK根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
备选地，将包含SEQ ID NO：1的进入克隆用于LR反应。
实施例7：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本(japonica)栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％醇中孵育一分钟，随后在0.2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上发芽。在黑暗中孵育4周后，将胚胎发生的，来自小盾片的愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上继代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上继代培养3日，之后共培育(以强化细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下培育后，胚发生潜力释放并且芽在随后4至5周发育。将芽从愈伤组织中切下并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，将芽从所述的培养基上转移至土壤。硬化的芽在高湿度和短日照下于温室中培育。
对一个构建体而言产生约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
实施例8：其他作物的转化
玉米转化
玉米(玉蜀黍)的转化根据Ishida等(1996.Nature Biotech 14(6)：745-50)描述方法的改进方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可适用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。在授粉后(DAP)大约11日从玉米植物中收获玉米穗，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至芽发育。将绿色芽从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至芽发育。将绿色芽从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改进方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的芽切下并置于芽伸长培养基上。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基上直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜/低芥酸油菜(rapeseed/canola)转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培育的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对低芥酸油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种(含有表达载体的)农杆菌。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至芽再生。当芽具有5-10mm长度时，将芽切下并转移至芽伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的芽转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
紫苜蓿(Medicago sativa)的再生性克隆使用(McKersie等，1999 PlantPhysiol 119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学(University of Wisconsin))已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天。外植体在半强度(half-strength)Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上发芽。将生根的幼苗移植至花盆内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
棉花转化
根据US 5,159,135中所述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面灭菌20分钟，并以含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水洗涤。接着将种子转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中进行发芽。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，剪成0.5cm的片并置于0.8％琼脂上。用农杆菌悬液(约108个细胞/ml，从转化有目的基因和适当选择标记的过夜培养物稀释而成)接种下胚轴外植体。室温光照3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其带有包含B5维生素的Murashige和Skoog盐(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCL2，并含有50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素以杀死残余细菌。2至3个月(每4至6周继代培养)后分离单个细胞系，并在选择培养基上进一步培养进行组织扩增(30℃，16小时光周期)。接着在非选择培养基上将转化组织再培养2至3个月，以产生体细胞胚。将至少4mm长的表观健康的胚转移至管中，其中含有细蛭石中的SH培养基，并补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6糠胺嘌呤和赤霉酸。以16小时光周期在30℃下培养胚，并将2至3叶期的小植株转移至含有蛭石和养分的盆中。植物变硬并接着移至温室中进一步培养。
糖萝卜转化
将糖萝卜(甜菜(Beta vulgaris L.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，然后在20％次氯酸盐漂白剂，例如
Figure BDA00002414173301141
常规漂白剂(可商购自Clorox，1221 Broadway，Oakland，CA 94612，美国)中振荡20分钟。用无菌水漂洗种子并风干，然后种植在萌发培养基(补充了10g/l蔗糖和0,8％琼脂的基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(参见Murashige，T.和Skoog，.，1962。A revised medium for rapid growthand bioassays with tobacco tissue cultures。Physiol.Plant，第15卷，473-497)，包含维生素B5(Gamborg等人；Nutrient requirements ofsuspension cultures of soybean root cells.Exp.Cell Res.，vol.50，151-8))上。根据Hussey和Hepher(Hussey，G.和Hepher，A.，1978。Clonalpropagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids by tissueculture。Annals of Botany，42，477-9)，将下胚轴组织基本上用于芽培养物的萌发，并在23-25℃，16小时光周期下维持在补充了30g/l蔗糖加上0,25mg/l苄氨基嘌呤(benzylamino purine)和0,75％琼脂，pH5,8的基于MS的培养基上。
将携带具有可选择标记基因例如nptII的二元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验。转化前一天，将含抗生素的液体LB培养物培养于摇床上(28℃，150转/分)，直到600nm处光密度(O.D.)达到～1。离心过夜培养的细菌培养物并重悬在包含乙酰丁香酮，pH5,5的接种培养基中(O.D.～1)。
将芽基组织(Shoot base tissue)剪成薄片(大约1.0cm x 1.0cm x2.0mm)。将组织浸没在液体细菌接种培养基中30秒。通过滤纸吸干去除多余的液体。在包含30g/l蔗糖的基于MS的培养基上共培养24-72小时，然后是非选择时期，包括基于MS的培养基、具有1mg/l BAP的30g/l蔗糖诱导芽发育和头孢噻肟消除农杆菌。3-10天后，将外植体转移到具有例如卡那霉素或G418(50-100mg/l基因型依赖的)的类似选择性培养基中。
每2-3周将组织转移到新鲜的培养基中，以维持选择压力。芽的非常快速萌发(3-4天后)表明现存分生组织的再生而不是新发育的转基因分生组织的器官发生。几轮亚培养后，将小芽转移到含有5mg/l NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基中。采取其他步骤，以降低产生嵌合的(部分转基因的)转化植物的可能性。将再生芽的组织样品用于DNA分析。
糖萝卜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey&Gallois(Linsey，K.和Gallois，P.，1990。Transformation of sugarbeet(Betavulgaris)by Agrobacterium tumefaciens。Journal of ExperimentalBotany；第41卷，第226期；529-36)的那些转化方法或者公开于国际申请WO9623891A的方法。
甘蔗转化
从6月龄田间生长的甘蔗植物中分离纺锤状细胞(Spindle)(参见Arencibia A.，等人，1998。An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformation mediated by Agrobacteriumtumefaciens。Transgenic Research，第7卷，213-22；Enriquez-ObregonG.，等人，1998。Herbicide-resistant sugarcane(Saccharum officinarumL.)plants by Agrabacterium-mediated transformation。Planta，第206卷，20-27)。通过浸没在20％次氯酸盐漂白剂例如
Figure BDA00002414173301161
常规漂白剂(可商购自Clorox，1221 Broadway，Oakland，CA 94612，美国)中20分钟来消毒材料。将大约0.5cm的横断面顶部朝上放置于培养基中。在23℃，在补充了20g/l蔗糖，500mg/l酪蛋白水解产物，0,8％琼脂和5mg/l 2，4-D，包括B5维生素(Gamborg，O.，等人，1968。Nutrientrequirements of suspension cultures of soybean root cells。Exp.CellRes.，第50卷，151-8)的基于MS(Murashige，T.和Skoog，.，1962。A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissuecultures。Physiol.Plant，第15卷，473-497)的培养基中避光培养植物材料4周。4周后，将培养物转移到相同的新鲜培养基上。
将携带具有可选择标记基因例如hpt的二元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验。转化前一天，将含抗生素的液体LB培养物培养于摇床上(28℃，150转/分)，直到600nm处光密度(O.D.)达到～0,6。离心过夜培养的细菌培养物并重悬在包含乙酰丁香酮，pH5,5的基于MS的接种培养基中(O.D.～0,4)。
基于形态学特征(致密结构和黄色)分离甘蔗胚性愈伤组织小片(2-4mm)，并在流动通风橱干燥20分钟，然后浸没在液体细菌接种培养基中10-20分钟。通过滤纸吸干去除多余的液体。在滤纸上避光进行共培养3-5天，所述滤纸至于包含，含1mg/l 2，4-D，B5维生素的基于MS的培养基的上部。共培养后，将愈伤组织用无菌水洗涤(ished)，然后在含有500mg/l用于消除农杆菌的头孢噻肟的类似培养基上进行非选择时期。3-10天后，将外植体转移到包含1mg/l 2，4-D，B5维生素的基于MS的选择性培养基中另外3周，所述选择性培养基含有潮霉素(基因型依赖的)。全部处理都在避光条件下，在23℃进行。
在16小时光照光周期下，在包含1mg/l BA和25mg/l潮霉素，缺乏2，4-D的培养基上进一步培养抗性愈伤组织，导致了芽结构的发育。分离芽并在选择性生根培养基(基于MS的包含20g/l蔗糖、20mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟的培养基)上培养。
将来自再生的芽的组织样品用于DNA分析。
用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例如来自公开为WO2010/151634A的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。
实施例9：表型评价方法
9.1评价设置
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70％。定期给生长于非胁迫条件下的植物浇水，以确保水和养分不受限制，从而满足植物完成生长和发育的需要。
使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
干旱筛选
在正常培养条件下在盆土中培养来自T2种子的植物，直至到达抽穗阶段。接着将其转移至停止浇水的“干旱”部分。在随机选择的盆中插入湿度探测器，以检测土壤含水量(SWC)。当SWC降至一定阈值之下时，自动对植物持续再浇水直至再次达到正常水平。接着将植物再转移至正常条件。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。
氮使用效能筛选
在除营养液以外均为正常的条件下在盆土中培养来自T2种子的稻植物。从移植到成熟均使用特定的营养液对盆浇水，其中含有降低的氮(N)含量，通常降低7至8倍。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。
盐胁迫筛选
在由椰子纤维和argex(3∶1比例)构成的基质上培养植物。在将小植株移植到温室后的前两周使用正常营养液。前两周之后，向营养液中加入25mM盐(NaCl)，直至收获植物。随后测量种子相关参数。
9.2.统计分析：F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
9.3测量的参数
生物量相关的参数测量
从播种期直至成熟期，使植物通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方毫米表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加被表述为总根生物量(测量为植物寿命中观察到的根的最大的生物量)的增加；或者表述为根/枝条指数(测量为根和枝条活性生长期中根质量和枝条质量的比例)的提高。
植物高度的有效的指标是重力的测量，即测定叶生物量的重心的高度(以mm计)。基于曲线拟合的渐近线，或者，如果拟合不符合要求而基于绝对最大值，其避免了单一直立叶片的影响。
早期萌发势通过计数在来自植物地上部分的区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方毫米表达的物理表面值。以下描述的结果是针对萌发后三周的植物。
种子相关参数的测量
将成熟的主圆锥花序(primary panicles)收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒(husk)与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后保留下来的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量和地上面积(mm2)之间的比值再乘以因子106。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟的主圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以a％表示)。
实施例10：转基因植物的表型评价结果
在非胁迫条件下，表达包含SEQ ID NO：80中最长开放阅读框的核酸的转基因稻植物T1代植物中的评估结果显示如下。关于转基因植物产生的详细内容参见前面的实施例。
在低氮条件下转基因稻植物的评价结果显示如下。
与无效对照植物比较，在组成型启动子GOS2下过表达SEQ IDNO：81所示的PFK的转基因植物表现出增加的产量。更具体而言，转基因植物显示出增加的枝条生物量，对地上生物量(10.1％)、植物高度(6.9％)和重力(即重心的高度)(6.8％)和出芽萌发势(13.2％)都具有整体的阳性作用(p值分别为0.0000、0.0000、0.0000和0.0250)。过表达PFK的转基因植物还表现出增加的种子产量，对总种子重量(11.4％)、饱满种子数(10.2％)、种子饱满率(6.4％)和每圆锥花序的小花数(5.6％)都具有整体的阳性作用(p值分别为0.0087、0.0132、0.0243和0.0428)。类似地，与无效对照植物比较，在组成型启动子GOS2的控制下过表达SEQ ID NO：1的植物表现出增加的产量、增加的枝条生物量、增加的种子产量。
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Claims (23)

1.用于在植物中相对于对照植物增强产量的方法，包括调节编码多肽的核酸分子在植物中的表达，其中所述多肽包含至少一个Interpro结构域IPR000023或Interpro结构域IPR012004结构域，优选地含有二者，并且其中所述多肽在氨基端氨基酸序列中包含SAT区。
2.权利要求1的方法，其中所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序1(SEQ ID NO：82)：
PKTIDNDI[LPA][VL]ID[KR][ST]FGFDTAVEEAQRAIN[AS]A[HY][VI]EAE；
基序2(SEQ ID NO：83)：
A[VI][PR][SA]NASDN[VI][YL]CT[LV]L[AG][QH][SN]A[VI]HGA[MF]AG[YF][TS]G[FI]T；或
基序3(SEQ ID NO：84)：A[AC]IVTCGGLCPGLN[TD]VIRE[IL]V；
优选地，所述多肽包含一个或多个以下基序：
基序4(SEQ ID NO：85)：
PKTIDNDILL[MI]DKTFGFDTAVEEAQ[RK]AIN[SA]A[YK][IV]EA[HR]SAY[HN]G；
基序5(SEQ ID NO：86)：
[AS][CV]R[AT]NASD[AGR]I[LY]CT[VI]LGQNAVH[GA]AFAG[FY][ST]GITVG[IL][CV]NTHY[VA]；或
基序6(SEQ ID NO：87)：
RAGPR[KE][EK]IY[FY][ED]PEEVKAAIVTCGGLCPGLNDV[IV]RQ[IL]V[IF]TLE。
3.权利要求1或2的方法，其中所述受调控的表达通过在植物中引入和表达果糖磷酸激酶(PFK)之编码核酸分子而实现。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述多肽通过核酸分子编码，所述核酸分子包含选自下述的核酸分子：
(i)SEQ ID NO：80、1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的任意之一所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的任意之一所示的核酸的互补序列；
(iii)SEQ ID NO：81、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76的任意之一所示的多肽的编码核酸，优选地，由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以衍生自SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76的任意之一所示的多肽序列，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状。
(iv)核酸，其以递增优选顺序与SEQ ID NO：80、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或75的核酸序列的任一具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并进一步优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状，其中所述核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46的任意之一所示的任一多肽序列的多肽；
(v)第一核酸分子，其在严格杂交条件下与第二核酸分子杂交，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状，其中所述第一核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46的任意之一所示的任一多肽序列的多肽，并且所述第二核酸分子是(i)至(iv)的核酸分子；
(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽以递增优选顺序与SEQ ID NO：81、2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76的任意之一所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述核酸编码的多肽不是SEQ ID NO：8、40、42、44、46的任意之一所示的任一多肽序列的多肽，并优选地赋予相对于对照植物而言增强的产量相关性状。
5.任一前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物而言增加的产量，优选增加的种子产量和/或枝条生物量。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得的。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选地与GOS2启动子，最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
10.通过权利要求1-9中任一项方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码如在权利要求1-9中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
11.构建体，包含：
(i)编码如权利要求1-7中任一项所定义的所述多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
12.权利要求11的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
13.权利要求11或12的构建体在用于制造植物的方法中的用途，其中所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的种子产量和/或枝条生物量。
14.用权利要求11或12的构建体转化的或者通过权利要求1-9中任一项的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物或其部分包含编码如在权利要求1-10中任一项所定义的所述多肽之重组核酸。
15.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中引入和表达如权利要求1-7中任一项所定义的所述多肽之编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
16.相对于对照植物而言具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物，获得自权利要求3中所定义的核酸受调控的表达，所述核酸编码权利要求1或2中所定义的多肽，或者源于权利要求10或14的转基因植物的转基因植物细胞。
17.权利要求10、14或16的植物，或源自它的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如糖萝卜、苜蓿、三叶草、菊苣、胡箩卜、木薯、棉花、大豆、低芥酸油菜或者单子叶植物，例如甘蔗或者谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦、德国小麦、黑麦属、一粒系小麦、teff、蜀黍和燕麦。
18.用于生产产品的方法，所述方法包括培养权利要求10、14、16或17的植物，以及从(i)所述植物或(ii)所述植物的部分，包括种子中生产所述产品或者通过(i)所述植物或(ii)所述植物的部分，包括种子生产所述产品的步骤。
19.权利要求10的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条和/或根生物量和/或种子。
20.来自权利要求10的植物和/或权利要求18的植物的可收获部分的产品。
21.如在权利要求1-7中任一项所定义的多肽之编码核酸相对于对照植物在增加产量，特别是增加种子产量和/或生物量中的用途。
22.包含在植物细胞中的权利要求11或12的构建体。
23.前述权利要求中的任一项，其中所述核酸编码的多肽不是选自如下所示的序列的多肽
(i)SEQ ID NO：8、40、42、44、46的任意之一，和/或
(ii)表3或表4或表5的任一多肽，和/或
(iii)在UniProtKB/TrEMBL数据库中公开为B9HFR9的序列。
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