CN102066568A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 - Google Patents

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Abstract

具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法。本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)多肽之核酸在植物中的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码ODC多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明该方法的构建体。在另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过增加编码苯并噻二唑诱导的同源域λ(BIHD1)多肽之核酸序列在植物中的表达来增加多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加了编码BIHD1多肽之核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明该方法的构建体。在另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码MYB30之核酸在植物中的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码MYB30多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明该方法的构建体。在另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码THOM(番茄同源框)蛋白之核酸在植物中的表达来改进多种植物生长特性的方法。本发明还涉及具有调节了编码THOM多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有改进的生长特性。本发明还提供可用于本发明该方法的构建体。在又一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过增加编码苯并噻二唑诱导的同源域2(BIHD2)多肽之核酸序列在植物中的表达来增加多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加了编码BIHD2多肽之核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明该方法的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)多肽之核酸在植物中的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码ODC多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
在另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过增加编码苯并噻二唑诱导的同源域1(benzothiadiazole-induced homeodomain 1，BIHD1)多肽之核酸序列在植物中的表达来增加多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加了编码BIHD1多肽之核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码MYB30之核酸在植物中的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码MYB30多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
另一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码THOM(tomato homeobox，番茄同源框)蛋白之核酸在植物中的表达来改进多种植物生长特性的方法。本发明还涉及具有调节了编码THOM多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物而言具有改进的生长特性。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
在又一个实施方案中，本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过增加编码苯并噻二唑诱导的同源域2(benzothiadiazole-induced homeodomain 2，BIHD2)多肽之核酸序列在植物中的表达来增加多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加了编码BIHD2多肽之核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物而言具有增加的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明的方法的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改进手段利用选择育种技术来鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，这可能不总是导致从亲代植物中传递所希望的性状。分子生物学进展已经允许人类改进动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改进性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为作物产生的可测量的经济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。因此，优化前述因素可以对增加作物产量有贡献。
种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的苗和根的来源)和胚乳(萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈籽粒。
植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草的产量。在谷物作物中使用产量的许多替代参数。其中首要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不同，可以通过许多方法测量植物大小，但是包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根生物量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段维持植物不同部分大小间的保守比。利用这些异速生长关系而对这些有关大小的测量结果进行由此及彼的外推(如Tittonell等2005 Agric Ecosys & Environ 105：213)。早期发育阶段的植物大小通常将与晚期发育阶段的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula & Tollenaar 2005Maydica 50：39)。除了植物所具有的最初达到较大大小的微环境或遗传优势的潜在延续，此为其附加效应。植物大小和生长速率存在着强遗传组分(如ter Steege等2005 Plant Physiology 139：1078)，且迄今为止，种种多样化基因型植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003 Theoretical Applied Genetics 107：679)。以这种方式，使用标准环境作为田地中作物在不同时间和地点所遭遇的多样化动态环境的替代参数。
对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻栽培品种上的一个重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固着是重要的。在将稻直接播种至涝田的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好的出苗是重要的。人工改造植物内早期萌发势的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带生殖质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和谷物产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(如Rebetzke等2002 Crop Science 42：739)。这些方法固有地联系在一起，因为大多数谷物生物量取决于植物叶和茎当前或贮存的光合作用生产力(Gardener等1985 Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，第68-73页)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等，2005，Agric Ecosys & Environ 105：213)。当测试遗传差异对胁迫耐性的影响时，温室或植物培养室环境与田地相比具有固有的优势：即能够使土壤性能、温度、水和营养的可用性以及光强度标准化。不过，因缺乏风力或昆虫导致不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或株冠生长等等，对产量造成的这些人工局限性会限制这些控制环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产量优势指标的标准方法。
另一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量元素和/或微量元素)过剩或缺乏、辐射和氧化胁迫引起。增加和/或改进植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民具有极大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。
取决于最终用途，对某些产量性状的改进可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是期望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
增加植物中产量相关性状和/或产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过改进植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。
现已发现可以通过调节植物中的编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)多肽的核酸在植物中表达而改进植物中的多种产量相关性状。
在另一个实施方案中，现已发现可以通过增加植物中编码苯并噻二唑诱导的同源域1(BIHD1)多肽之核酸序列在植物中相对于对照植物的表达而增加植物中多种产量相关性状。所述增加的产量相关性状包括以下一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物种子总产量、增加的饱满种子数、增加的种子总数和增加的收获指数。
还在一个实施方案中，现已发现可以通过调节植物中的编码MYB30的核酸在植物中表达而增强植物中的多种增强的产量相关性状。
还在一个实施方案中，现已发现可以通过调节植物中的编码THOM(番茄同源框)蛋白质的核酸在植物中表达而改进植物中的多种生长特性。
在又一个实施方案中，现已发现可以通过增加编码苯并噻二唑诱导的同源域2(BIHD2)多肽之核酸序列在植物中相对于对照植物的表达而增加植物中多种产量相关性状。所述增加的产量相关性状包括以下一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物种子总产量、增加的饱满种子数、增加的种子总数和增加的收获指数。
背景技术
鸟氨酸脱羧酶(ODC)
聚胺是带有两个或更多氨基的碱性脂肪族烃类化合物。聚胺是生物体中广泛存在的天然物质，已经描述了20种以上的类型。聚胺的实例是精胺、亚精胺和腐胺。聚胺在植物中的生物学作用包括在非生物胁迫期间的细胞保护和促进核酸或蛋白质生物合成。聚胺生物合成中催化的必要步骤的酶包括精胺合酶、亚精胺合酶(SPDS)和数个β/α桶状折叠类型的碱性氨基酸脱羧酶如鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精氨酸脱羧酶(ADC)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)、二氨基庚二酸脱羧酶(DAPCD)和羧基去亚精胺脱羧酶(Carboxynorspermidine Decarboxylase，CANSDC)。编码这类酶的基因已从原核和真核生物(包括植物)中分离。β/α桶状折叠脱羧酶就其系统发育而言分离为包含ADC、DAPDC、ODC和CANSDC的四个不同的群(Lee等2007.The Journal of Biological Chemistry第282卷，27115-27125)。这些酶形成同二聚体。在来自一个亚单位的N-末端结构域和来自另一个亚单位的C-末端结构域之间的二聚体界面形成两个相同的活性位点。
鸟氨酸脱羧酶或L-鸟氨酸羧基裂合酶催化L-鸟氨酸的脱羧以产生腐胺和CO2。ODC是在原核生物和真核生物中发现的。由生物化学与分子生物学国际联盟指定的ODC的名称是EC 4.1.1.17。
已有大量研究了解植物聚胺代谢相关基因应答胁迫的表达和使用此类基因改变细胞中聚胺的浓度。例如小鼠ODC在胡萝卜中表达或人ODC在转基因水稻中的表达改变了转基因植物中的聚胺库(Bastola和Minocha 1995.Plant Physiol.1995.109(1)：63-71.Lepri等；2001Mol Genet Genomics.2001 Oct；266(2)：303-12.)。据报道ODC在烟草植物中的免疫调节导致转基因植物中聚胺水平改变、发育异常(abnormalieties)和矮小表型(Nolke等；2005.plant Biotechnology J.3(2)：237-47。在烟草中表达编码小鼠ODC的cDNA增加了腐胺水平(Descenzo和Minocha 1993)Plant Mol Biol.22，113-127。在本研究中，虽然那些积累高水平腐胺的植物显示发育障碍、叶子发皱、花的雄蕊减少，大多数转化体植物具有正常的外观。
意想不到的是，现已发现调节编码鸟氨酸脱羧酶多肽之核酸的表达产生与对照植物相比具有增强产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了与对照植物相比增强植物产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码鸟氨酸脱羧酶多肽之核酸的表达。增强的产量相关性状包括增加的早期萌发势、增加的种子产量和增加的生物量。
苯并噻二唑诱导的同源域蛋白质1(BIHD1)
DNA结合蛋白质是包含许多DNA结合结构域中任一个结构域的蛋白质，因此对DNA具有特异的或一般的亲和力。DNA结合蛋白质包括例如调节转录过程的转录因子、切割DNA分子的核酸酶和参与细胞核中DNA包装的组蛋白。
转录因子通常定义为蛋白质，其显示序列特异性DNA结合亲和力并能够激活和/或抑制转录。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组编码至少1533转录调节蛋白，占其估计的基因总数的～5.9％(Riechmann等(2000)Science 290：2105-2109)。稻转录因子数据库(DRTF)是一组已知和预测的籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)和粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)的转录因子集合，目前包含籼稻中(indica)2,025个推定的转录因子(TF)基因模式和粳稻(japonica)中2,384个转录因子基因模式，分布在63个家族中(Gao等(2006)Bioinformatics 2006，22(10)：1286-7)。
这些家族之一是同源域(HD)转录因子超家族，其参与发育过程的许多方面。HD转录因子以同源域(HD)的存在为特征，其是60个氨基酸的DNA结合结构域(BD)。拟南芥和稻包含大约100个HD转录因子，基于氨基酸序列同一性可将其进一步分为亚家族(Richardt等(2007)Plant Phys 143(4)：1452-1466)。这些亚家族中的一些以存在其它保守结构域(其促进DNA结合和/或蛋白质-蛋白质相互作用)为特征。
这些亚家族之一是BEL1(BELL-1)亚家族(Reiser等(1995)，Cell 83：735-742)，以带有珠被形成缺陷的拟南芥突变体bell1命名。除了同源域之外，BEL1转录因子以被称为POX结构域的保守结构域为特征，其仅在植物蛋白质中发现。两个基序进一步表征BEL1多肽：SKY盒和VSLTGL盒，以它们包含的保守氨基酸残基命名。
从稻(Oryza sativa)中分离了一种编码BEL1同源域多肽的基因，显示用苯并噻二唑(BTH)(一种能够诱导抗病性的分子)处理时其表达增加了，在用稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)病原体接种时其表达也增加了(Luo等(2005)Plant Biol 7：459-468)。它被命名为稻苯并噻二唑诱导的同源域1(OsBIHD1)。在烟草中使用CaMV 35S启动子过量表达该基因(Luo等(2005)J Ex Bot 56(420)：2673-2682)。转基因烟草植物显示增强的抗病性，在一些情况下，显示顶芽萌发、根异常、生育力减低或不育。
意想不到的是，现已发现增加编码苯并噻二唑诱导的同源域蛋白质1(BIHD1)之核酸序列的表达产生与对照植物相比具有增加产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了与对照植物相比增加植物中产量相关性状的方法，包括增加植物中编码如本文所定义的BIHD1多肽之核酸序列的表达。增加的产量相关性状包括以下一个或多个：增加的早期萌发势、增加的每株植物总种子产量、增加的饱满种子数、增加的种子总数和增加的收获指数。
MYB30蛋白质
MYB结构域蛋白质是带有高度保守的DNA结合结构域的转录因子。MYB结构域最初在鸟类成髓细胞瘤病毒的癌基因(v-myb)中公开(Klempnauer等(1982)Cell 33，453-63)。许多脊椎动物包含与v-Myb、c-Myb、A-Myb和B-Myb相关的三个基因，其它相似基因已在昆虫、植物、真菌和粘菌中鉴定。所编码的蛋白质对许多细胞类型增殖和分化的控制至关重要。MYB蛋白质包含一至四个保守序列(50-53个氨基酸)的不完全直接重复，该保守序列编码参与DNA结合的螺旋-转角-螺旋结构(Rosinski和Atchley(1998)J Mol Evol 46，74-83)。MYB重复的特征是三个间隔规律的色氨酸残基，在三维螺旋-转角-螺旋结构中它们形成色氨酸聚类。在c-Myb中的三个重复被称为R1、R2和R3；来自其它MYB蛋白质的重复根据它们与R1、R2或R3的相似性进行分类。根据MYB结构域中相邻重复的数量(一个“MYB1R”、两个“R2R3-类型MYB”、三个“MYB3R”)，MYB蛋白质可分成三个亚家族。由于MYB结构域之外几乎没有序列保守性，基于MYB编码区之外鉴定的保守基序将MYB蛋白质聚类为亚群(Stracke等2001.Curr Opin Plant Biol.Oct；4(5)：447-56；Jiang等(2004)Genome Biology 5，R46)。与动物相比，植物含有以R2R3-类型MYB结构域为特征的MYB-蛋白质亚家族。
已显示植物Myb基因在调节次级代谢、细胞形态发生、病原体抗性和对生长调节剂及胁迫的反应中发挥重要作用。另外WO 2007099096公开用于增加植物中种子产量的稻MYB4蛋白质。
MYB30类转录因子构成Myb蛋白质的亚群，该亚群享有共同的进化起源，对应于Jiang等2004报道的G09群。编码MYB30类蛋白质一些成员的基因涉及拟南芥中保卫细胞中的生理反应，以及超敏细胞死亡应答的激活(Cominelli等Curr Biol.2005 15(13)：1196-200；Rivas和Roby FEBS Lett.2006.580(14)：3498-504)。细胞外VLCFA(极长链脂肪酸)来源的代谢产物(叶表皮蜡组分)的积聚在拟南芥MYB30敲除突变体和过表达系中受到影响(Vailleau等2008.Plant Cell.Mar 7[Epub ahead of print].)。
意想不到的是，现已发现调节编码MYB30多肽之核酸的表达产生与对照植物相比具有增强产量相关性状的植物，尤其是增加的营养体生物量和增加的出苗萌发势(emergence vigour)。
根据一个实施方案，提供了与对照植物相比增强植物产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码MYB30多肽之核酸的表达。改进的产量相关性状包括增加的生物量和增加的出苗萌发势。
番茄同源域(THOM)
同源域亮氨酸拉链(HDZip)蛋白质构成以DNA结合结构域(HD)和相邻亮氨酸拉链(Zip)基序存在为特征的转录因子家族。同源域通常由60个保守氨基酸残基(其形成结合DNA的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3)组成。这一DNA结合位点通常是假回文结构的(pseudopalindromic)。亮氨酸拉链毗邻同源域的C-末端，由数个七元重复(至少四个)组成，其中通常每第七个氨基酸出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化是重要的。这个二聚化是DNA结合的前提(Sessa等(1993)EMBO J 12(9)：3507-3517)，并可在两个相同的HDZip蛋白质(同二聚体)之间或在两个不同的HDZip蛋白质(异二聚体)之间进行。
同源域基因存在于所有真核生物中，并构成拟南芥中至少89个成员的基因家族。除了植物，亮氨酸拉链本身还在真核生物中发现。然而，同源域和亮氨酸拉链两者都存在是植物特异性的(于拟南芥属中89个蛋白质的至少47个中发现)，并且除了维管植物还在藓类植物中发现(Sakakibara等(2001)Mol Biol Evol 18(4)：491-502，其并入本文作为参考)。因此亮氨酸拉链位于同源域的C-末端，这两个特征有三个氨基酸的重叠。
拟南芥属HDZip基因基于序列相似性原则分为四个不同类，HDZip I至IV(Sessa等：Plant Molecular Biology(NATO ASI Series，vol H81)，第412-426页，1994)。HD-Zip I和II基因可能参与光、脱水诱导ABA或生长素的信号转导网络。这些信号转导网络与植物的一般生长调控相关。有义或反义HD-Zip I或II mRNA的过表达通常改变生长率和发育。HD-Zip III亚家族的大多数成员在中柱(stele)细胞分化中发挥作用。HD-Zip IV基因与最外层细胞层的分化相关(Sakakibara等，2001)。
密切相关的HD-Zip I和II家族的数个成员与生长素信号转导和运输有关。HDZip I和II基因还涉及光信号转导反应，包括避荫、暗生长幼苗的去黄化、和蓝光信号转导。此外，越来越多的证据表明许多HD-Zip I和II基因与对环境胁迫条件(如干旱)发育适应的调节相关，有关综述，见Agalou等，Plant Molecular Biology 66，87-103，2008。通过体外的随机结合位点选择显示拟南芥属HD-Zip家族I蛋白质Athb-1的优先识别位点由两个在中心位置重叠的5-bp半位点组成，即CAAT(A/T)ATTG，(Sessa等EMBO J.12，3507-3517，1993)。HD-Zip II蛋白质Athb-2与相似的9-bp序列相互作用，但在中心位置显示对G/C碱基对的偏好。显示这个偏好是由60个氨基酸同源域位置46和56处存在Glu和Thr残基决定的，而HD-Zip I蛋白质特征性地分别包含Ala和Trp残基(Sessa等J.Mol.Biol.274，303-309，1997)。来自番茄的THOM1(Meisner和Theres，Planta 195，541-547，1995)在生长的顶端分生组织、花分生组织和腋生分生组织中高度表达。这些分生组织的未成熟衍生物显示相似水平的THOM1转录本，该转录本随着各组织年龄的增加而减少。HB-4是HD-Zip II类蛋白质的成员并与THOM同源，显示其在拟南芥属中被富含远红光的光处理诱导；而在向日葵中，HB-4受水供应和脱落酸调节。据推测向日葵HB-4参与增加对干旱的耐受(Manavella等，PlantJ.48，125-137，2006)。
意想不到的是，现已发现调节编码THOM多肽之核酸的表达产生与对照植物相比具有增强产量相关性状的植物，尤其是增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了与对照植物相比改进植物产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码THOM多肽的核酸的表达。
苯并噻二唑诱导的同源域蛋白质2(BIHD2)
DNA结合蛋白质是包含许多DNA结合结构域中任一个结构域的蛋白质，因此对DNA具有特异的或一般的亲和力。DNA结合蛋白质包括例如调节转录过程的转录因子、切割DNA分子的核酸酶和参与细胞核中DNA包装的组蛋白。
转录因子通常定义为蛋白质，其显示序列特异性DNA结合亲和力并能够激活和/或抑制转录。拟南芥基因组编码至少1533个转录调节蛋白，占其估计的基因总数的～5.9％(Riechmann等(2000)Science 290：2105-2109)。稻转录因子数据库(DRTF)是一组已知和预测的籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)和粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)的转录因子的集合，目前包含籼稻中2,025个推定的转录因子(TF)基因模式和粳稻中2,384个转录因子基因模式，分布在63个家族中(Gao等(2006)Bioinformatics 2006，22(10)：1286-7)。
这些家族之一是同源域(HD)转录因子超家族，其参与发育过程的许多方面。HD转录因子以同源域(HD)的存在为特征，其是60个氨基酸的DNA结合结构域(BD)。拟南芥和稻包含大约100个HD转录因子，基于氨基酸序列同一性可将其进一步分为亚家族(Richardt等(2007)Plant Phys 143(4)：1452-1466)。这些亚家族中的一些以存在其它保守结构域(其促进DNA结合和/或蛋白质-蛋白质相互作用)为特征。
这些亚家族之一是BEL1(BELL-1)亚家族(Reiser等(1995)，Cell83：735-742)，以带有珠被形成缺陷的拟南芥突变体bell1命名。除了同源域之外，BEL1转录因子以被称为POX结构域的保守结构域为特征，其仅在植物蛋白质中发现。两个基序进一步表现BEL1多肽的特征：SKY盒和VSLTGL盒，以它们包含的保守氨基酸残基命名。
从稻中分离了一种编码BEL1同源域多肽的基因，显示用苯并噻二唑(BTH)(一种能够诱导抗病性的分子)处理时其表达增加了，在用稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)病原体接种时其表达也增加了(Luo等(2005)Plant Biol 7：459-468)。它被命名为稻苯并噻二唑诱导的同源域1(OsBIHD1)。在烟草中使用CaMV 35S启动子过量表达该基因(Luo等(2005)J Ex Bot56(420)：2673-2682)。转基因烟草植物显示增强的抗病性，在一些情况下，显示顶芽萌发、根异常、生育力减低或不育。
意想不到的是，现已发现增加编码苯并噻二唑诱导的同源域蛋白质2(BIHD2)之核酸序列的表达产生与对照植物相比具有增加产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了与对照植物相比增加植物中产量相关性状的方法，包括增加植物中编码如本文所定义的BIHD2多肽之核酸序列的表达。增加的产量相关性状包括以下一个或多个：增加的早期萌发势、增加的每株植物总种子产量、增加的饱满种子数、增加的种子总数和增加的收获指数。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指处于任意长度聚合形式中的通过肽键连接在一起的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合无分支形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设置的常规部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评价植物属于相同的植物物种或甚至是相同的品种。对照植物也可以是待评价植物的失效合子。失效合子是通过分离丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG
Figure BPA00001277504000131
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸替换的例子
  残基   保守性替换   残基  保守性替换
  Ala   Ser   Leu  Ile；Val
  Arg   Lys   Lys  Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met  Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe  Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser  Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr  Ser；Val
  Glu   Asp   Trp  Tyr
  Gly   Pro   Tyr  Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val  Ile；Leu
  Ile   Leu，Val
氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然发生形式蛋白质与标签肽(如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白)的融合物(标签肽的综述参阅Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来源于共同的先祖基因。
结构域
术语“结构域”指依据进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其它树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。
术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃，高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30至45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交分子：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。
cL＝双链体的长度(以碱基对计)。
d oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，如例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex，(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改进生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用，并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF的其它3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活性的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水平和模式。合适的公知报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子强度和/或表达模式与参考启动子(如用于本发明方法中的进行比较。或者，可以通过定量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域熟知的技术，如通过放射自显影的光密度测定分析进行的Northern印迹、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)。通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细胞中约1/10,000的转录物至约1/100,000的转录物至约1/500,0000的转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约1/100的转录物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35S CaMV启动子控制时获得的水平表达。
有效连接
如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
  基因来源   参考文献
  肌动蛋白   McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990
  HMGP   WO 2004/070039
  CAMV 35S   Odell等，Nature，313：810-812，1985
  CaMV 19S   Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997
  GOS2   de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，WO 2004/065596
  泛素   Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
  稻亲环蛋白   Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
  玉米H3组蛋白   Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
  苜蓿H3组蛋白   Wu等Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
  肌动蛋白2   An等，Plant J.10(1)；107-121，1996
  34S FMV   Sanger等，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
  Rubisco小亚基   US 4,962,028
  OCS   Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553
  SAD1   Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
  SAD2   Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
  nos   Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846
  V-ATP酶   WO 01/14572
  超级启动子   WO 95/14098
  G盒蛋白   WO 94/12015
遍在启动子
遍在启动子在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导型”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导型”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性”。
根特异性启动子的例子列于下表2b中：
表2b：根特异性启动子的例子
Figure BPA00001277504000221
种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不一定仅在种子组织中有(泄漏表达的情况)。种子特异性启动子可在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。种子特异性启动子的实例(胚乳/糊粉/胚特异性的)在下表2c至表2f中显示。种子特异性启动子的其它实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，其公开内容整体并入本文作为参考。
表2c：种子特异性启动子的例子
Figure BPA00001277504000222
Figure BPA00001277504000231
表2d：胚乳特异性启动子的例子
Figure BPA00001277504000242
  玉米ESR基因家族   Opsahl-Ferstad等(1997)Plant J 12：235-46
  高粱高粱醇溶蛋白   DeRose等(1996)Plant Mol Biol 32：1029-35
表2e：胚特异性启动子的例子：
  基因来源   参考文献
  稻OSH1   Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
  KNOX   Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
  PRO0151   WO 2004/070039
  PRO0175   WO 2004/070039
  PRO005   WO 2004/070039
  PRO0095   WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子的例子：
Figure BPA00001277504000251
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的例子在下表2g中显示。
表2g：绿色组织特异性启动的例子
  基因   表达   参考文献
  玉米正磷酸二激酶   叶特异性   Fukavama等，2001
  (orthophosphate dikinase)
  玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶   叶特异性  Kausch等，2001
  稻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶   叶特异性  Liu等，2003
  稻Rubisco小亚基   叶特异性  Nomura等，2000
  稻β扩展蛋白EXBP9   苗特异性  WO 2004/070039
  木豆(Pigeonpea)Rubisco小亚基   叶特异性  Panguluri等，2005
  豌豆RBCS3A   叶特异性
组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。可用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的例子示于下列的表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的例子
Figure BPA00001277504000261
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。
调节
术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加或减少。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
表达
术语“表达”或“基因表达”指转录一个或多个特定基因或特定的遗传构建体。特别地，术语“表达”或“基因表达”指将一个或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，包括或者不包括后者随后翻译成蛋白质。该过程包括转录DNA和加工所得的mRNA产物。
增加的表达/过表达
如本文中所用的术语”增加的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。
在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。
如果期望表达多肽，一般期望在多核苷酸编码区的3’末端包含多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可来自该天然基因，来自多种其它植物基因，或者来自T-DNA。待被加入的3’末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因，或者较不优选地来自任何其它真核基因。
内含子序列也可添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单元5′端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)引入植物的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可从生物体分离，或可人工制造(例如通过化学合成)。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或者“降低或基本去除”的表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。用于降低表达的方法是本领域已知的，技术人员会轻易地能够调整已知的用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现在整株植物或在其部分中降低内源基因的表达。
为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
用于降低或基本去除内源基因在植物中表达，或用于降低蛋白质的水平和/或活性的多种方法的例子是本领域技术人员已知的。技术人员会轻易地能够调整已知的用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现在整株植物或在其部分中降低内源基因的表达。
表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是通过在植物中引入和表达遗传构建体，将被间隔物(非编码DNA)分隔的核酸作为反向重复序列(部分地或完全地)克隆入此构建体中(在此情况下该核酸是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码任何目的蛋白质之一的直向同源物、旁系同源物或同源物)。
在这样的优选方法中，通过RNA介导的沉默降低或基本去除内源基因表达，其中使用反向重复的核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)，优选能够形成发夹结构。反向重复序列克隆在含有控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔物，例如基质结合区片段(MAR)、内含子、聚合接头等等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成带有自身互补结构(部分或完全的)的嵌合RNA。这个双链RNA结构被称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，其整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切割mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。对于更多一般性细节见例如，Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明方法的实施不依赖于在植物中引入和表达遗传构建体(核酸作为反向重复序列克隆至该构建体中)，也可使用数个熟知的“基因沉默”方法中的任何一个或多个达到相同效果。
用于减少内源基因表达的一个此类方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在此情况下，沉默由植物中的双链RNA序列(dsRNA)引发，该双链RNA序列与内源靶基因基本相似。这个dsRNA由植物进一步加工成约20至约26个核苷酸，被称为短干扰RNA(siRNA)。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个例子包括以有义方向引入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录本同源的DNA序列。因此引入植物的将至少是核酸序列的一个拷贝。附加的核酸序列将减少内源基因的表达，引起通常所说的共抑制现象。因为高转录本水平和共抑制的引发之间正相关，如果数个附加拷贝的核酸序列引入植物中，基因表达的减少将更显著。
RNA沉默方法的另一个例子包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补的核苷酸序列，也就是，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录本序列互补。反义核酸序列优选与将被沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指含有翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语“非编码区”指位于编码区侧翼的5′和3′序列，其将被转录却不被翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。
反义核酸序列可根据Watson和Crick碱基配对的规则进行设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在这种情况下，基本上连续的核苷酸片段可以来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸)，也可以是寡核苷酸，其仅与核酸序列(包括mRNA 5’和3’UTR)的一部分是反义的。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录本的翻译起始位点周围的区域互补。适合的反义寡核苷酸序列长度在本领域是已知的，可从约50、45、40、35、30、25、20、15或10核苷酸长度或更少起始。本发明的反义核酸序列可使用化学合成以及酶连接反应通过本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或各种改进的核苷酸(为增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双螺旋的物理稳定性而设计)进行化学合成，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本领域熟知可用于产生反义核酸序列的改进的核苷酸实例。已知的核苷酸改进包括甲基化、环化和‘帽’和一个或多个天然存在核苷酸用类似物如肌苷替换。核苷酸的其它改进是本领域众所周知的。
可使用表达载体生物学产生反义核酸序列，其中核酸序列以反义方向亚克隆进入该表达载体(例如，转录自插入核酸的RNA与目的靶核酸是反义方向的)。优选地，植物中反义核酸序列通过稳定整合的核酸构建体(包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子)产生。
本发明方法中用于沉默的核酸分子(无论引入植物或在原位产生)与mRNA转录本和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，由此抑制蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规的核苷酸互补形成稳定的双螺旋，或例如，就结合至DNA双螺旋的反义核酸序列而言，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。反义核酸序列可通过转化或在特异组织位点直接注射引入植物中。备选地，可改进反义核酸序列以靶向被选细胞，随后全身性施用。例如，对于全身施用，可改进反义核酸序列，使它们与表达于被选细胞表面上的受体或抗原特异性结合，例如通过将反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。也可使用本文所述的载体将反义核酸序列输送至细胞。
另一方面，反义核酸序列是一种a-异头物核酸序列。a-异头物核酸序列与互补的RNA形成特异性双链杂交，其中(与常见的b-单位相反)链相互之间平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可包含2′-o-甲基核糖核苷(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本消除也可使用核酶实施。核酶是有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，能切割单链的核酸序列，如mRNA，它们与切割的单链核酸序列具有互补区。因此，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录本，由此基本上减少将要被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录本可用于从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。使用核酶用于植物中基因沉默是本领域已知的。(例如，Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)PlantJ.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。
如果内源基因上有突变，和/或在随后引入植物中的分离的基因/核酸上有突变，也可以发生基因沉默。降低或基本上消除可由非功能性多肽引起。例如，多肽可结合至多种相互作用的蛋白质；因此一个或多个突变和/或截断可提供一种多肽，该多肽仍能结合至相互作用的蛋白质(如受体蛋白质)，但不可显示其正常功能(如信号配体)。
基因沉默的另一种方法是通过靶向与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成三重螺旋结构，该结构防止基因在靶细胞中转录。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。特别地，可预见人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能或用于干扰靶多肽参与的信号通路。
备选地，可以设立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可用于例如实施同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微RNA(miRNA)与它们的靶序列具有完全或近乎完全的互补性。然而，有的天然靶标多达五个错配。它们通过Dicer家族双链特异性核糖核酸酶从更长的非编码RNA(带有特征性折回结构)加工。加工后，通过结合到其主要组分(Argonaute蛋白质)将它们整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。由于它们与细胞质中的靶核酸(主要是mRNA)进行碱基配对，MiRNA用作RISC的特异性组分。随后的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的影响常常反映在靶基因减少的mRNA水平中。
通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等，Dev.Cell 8：517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，Plant Cell 18：1121-1133，2006)。
为优化性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的例子。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现在整株植物或在其部分中降低内源基因的表达。
选择标记(基因)/报告基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin，G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta
Figure BPA00001277504000341
抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。视觉标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。一旦不再需要它们，标记基因可以从转基因细胞中去掉或切除。去掉标记基因的技术在本领域是已知的，有用的技术在上述的定义部分已描述了。
因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体与导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于已知的重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则在已经成功发生转化时，通过重组酶表达去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有那些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中或存在于基因组文库中的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如例如诱变处理)修饰后，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中该核酸的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
转化
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。或者，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的显微注射(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；包被有DNA或RNA的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物如，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由
Figure BPA00001277504000381
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet.208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座中心中的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改进的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染”法的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA激活标签化
T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改进表达。因靠近所引入启动子的基因的改进表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写，指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改进的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑，Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体在汇集物中的存在检测为色谱图之一额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等，(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且不论何种目标生物，都存在一般可用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评价的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以与该植物的营养体生物量(根和/或苗生物量)、繁殖器官和/或繁殖体(例如种子)有关。
早期萌发势
“早期萌发势”指活跃、健康、良好平衡的生长(特别是在植物生长早期期间)，并可以因植物适合度增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因素如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。
增加/改进/增强
术语“增加”、“改进”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数除以种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量除以总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW；和g)增加的原圆锥花序(primary panicles)数，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的种子产量也可以产生改进的结构，或可以因改进的结构而出现。
绿度指数
如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、及在养分利用度下降的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。
植物
如本文中所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[芸苔(canola)、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、天麻苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、Eragrostis tef、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Tripsacum dactyloides、黑小麦物种(Triticale sp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、Triticum monococcum或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
发明详述
意想不到的是，现在发现调节编码鸟氨酸脱羧酶多肽之核酸序列在植物中的表达产生相对于对照植物而言具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物而言增强产量相关性状的方法，包括调节植物中编码鸟氨酸脱羧酶多肽之核酸的表达。
还意想不到的是，现在发现增加编码本文所定义的BIHD1多肽之核酸序列在植物中的表达产生了相对于对照植物具有增加的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物增加植物中产量相关性状的方法，其包括增加编码BIHD1多肽之核酸序列在植物中的表达。
还意想不到的是，现在发现调节编码MYB30多肽之核酸在植物中的表达产生相对于对照植物而言具有增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物而言增强产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MYB30多肽之核酸的表达。
还意想不到的是，现在发现调节编码THOM多肽之核酸在植物中的表达产生相对于对照植物而言具有增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物而言增强产量相关性状的方法，包括调节植物中编码THOM多肽之核酸的表达。
还意想不到的是，现在发现增加编码本文所定义的BIHD2多肽之核酸序列在植物中的表达产生相对于对照植物而言具有增加的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了在植物中相对于对照植物而言增加产量相关性状的方法，包括增加植物中编码BIHD2多肽之核酸序列的表达，以及任选地选择具有已经增加的产量相关性状的植物。
调节(优选增加)编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽之核酸序列的表达的优选方法是在植物中引入并表达编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽之核酸序列。
关于ODC多肽/基因，下文中以“可用于本发明方法的蛋白质”而对其的任何提及均指本文所定义的鸟氨酸脱羧酶多肽。下文中以“可用于本发明方法的核酸”而对其的任何提及均指能够编码该鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任何核酸，下文也称为“鸟氨酸脱羧酶核酸”或“鸟氨酸脱羧酶基因”。
ODC多肽指能够在脱羧反应中作用于作为底物的L-鸟氨酸，并因此催化反应以产生来自L-鸟氨酸的腐胺的蛋白质。因此鸟氨酸脱羧酶多肽催化以下反应：L-鸟氨酸＝腐胺+CO2。鸟氨酸(2，5-二氨基戊酸)是具有化学组成C5H12N2O2的氨基酸。腐胺(putrescine，有时拼写为putrescin 或putrescene)是具有化学组成C4H12N2(1，4-二氨基丁烷或丁二胺)的有机化学化合物。图1显示L-鸟氨酸脱羧反应。
鸟氨酸脱羧酶多肽在一级序列和在二级结构中具有相似性。它们属于β/α桶脱羧酶类蛋白质。在β/α桶脱羧酶的系统进化分析中，ODC构成蛋白质的不同分支。
当用于构建α/β桶状折叠碱性氨基酸脱羧酶多肽的系统树时，可用于本发明方法的鸟氨酸脱羧酶多肽与已知的鸟氨酸脱羧酶构成的进化枝聚类，而不是与精氨酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱羧酶、或羧基去亚精胺脱羧酶多肽构成的进化枝聚类。可用于本发明方法的OCD优选聚类在真核生物来源的ODC多肽构成的进化枝中，还优选聚类在由植物来源的ODC多肽构成的进化枝中，甚至更优选聚类在由双子叶来源的ODC多肽构成的进化枝中，最优选聚类在与SEQ ID NO：2相同的进化枝中。α/β桶状折叠碱性氨基酸脱羧酶多肽此类系统树的实例在Lee等2007的图1和本申请的图2B中给出。
用于推断系统发生的方法是本领域众所周知的，包括基于矩阵的“距离法”，其含有比对中所有序列之间配对距离值，和对序列的每个单个碱基进行计算的“基于特性的方法”。“距离法”的实例是UPGMA(Unweighted Pair Group with Arithmetic Mean)和邻接法(Saitou和Nei，1987)。后一种方法被用于著名的软件程序，其用于实施蛋白质系统发生如Phylip包的Neighbor(Jo Felsentein，Univ.Washington)，或ClustalW(D.Higgins，EMBL)。“基于特性的方法”的实例是蛋白质最大似然(Protein Maximum likelihood)和蛋白质最大简约法(Protein maximal parsimony)。本领域技术人员对各种可用方法是已知的，并能够有利地选择系统发生分析的方法。用于推断ODC多肽系统发生的优选方法是邻接法。
可用于本发明方法的优选的鸟氨酸脱羧酶多肽以递增优选顺序包括一个或多个以下序列基序：
(i)基序1：
[N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG(SEQ ID NO：51)；
(ii)基序2：
[K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S](SEQ ID NO：52)；
(iii)基序3：
RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHH P(SEQ ID NO：53)；
(iv)基序4：
EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT(SEQ ID NO：54)；
(v)基序5：EYVLSLG[V/I]SPD(SEQ ID NO：55)；
(vi)基序6：
AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A](SEQ ID NO：56)；
(vii)基序7：
[G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM[V/L]SIITQKLQD[E/D](SEQ ID NO：57)；
(viii)基序8：QT[V/I]IVSGLNPAAILQ(SEQ ID NO：58)；
(ix)与基序(i)至(viii)的任一个基序以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的基序。
ODC多肽包含各种众所周知的保守的蛋白质结构域。具有共同保守结构域的蛋白质被认为执行相同或相关的功能。鉴定保守结构域的方法在本领域是众所周知的，包括搜索专门数据库如Interpro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)和Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。实施例4详述了通过筛选Interpro数据库发现SEQ ID NO：2的保守结构域。
可用于本发明方法的进一步优选的ODC多肽包含一个或多个以下保守序列：
(i)登录号PF00278也称为吡哆醛依赖，C-末端片层结构域或Orn_DAP_Arg_deC的脱羧酶的PFAM结构域；
(ii)登录号PF02784也称为吡哆醛依赖，吡哆醛结合结构域或Orn_Arg_deC_N的脱羧酶的PFAM结构域；
(iii)登录号PS00878的PROSITE模式，也称为ODR_DC_2_1或Orn/DAP/Arg脱羧酶家族2吡哆醛-P附着位点，具有如[F/Y]-[P/A]-x-K-[S/A/C/V]-[N/H/C/L/F/W]-x(4)-[L/I/V/M/F]-[L/I/V/M/T/A]-x(2)-[L/I/V/M/A]-x(3)-[G/T/E](SEQ ID NO：64)所示共有模式；
(iv)登录号PS00879的PROSITE模式，也称为ODR_DC_2_2或Orn/DAP/Arg脱羧酶家族2标签2，具有如[G/S/A]-x(2，6)-[L/I/V/M/S/C/P]-x-N-[L/I/V/M/F]-[D/N/S]-[L/I/V/M/C/A]-G(3)-[L/I/V/M/F/Y]-[G/S/T/P/C/E/Q](SEQ ID NO：65)所示共有模式；
(v)以递增优选顺序具有与基序(i)至(iv)的任一个基序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序。
可用于本发明方法的甚至更优选的ODC多肽包含下述结构域，该结构域与实施例4表C1中所述结构域的任一氨基酸序列以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
可用于本发明方法的ODC多肽的实例在本文实施例1表A1中给出。所选表A1多肽之间的全局序列相似性和同一性在实施例3的表B1中给出。
可用于本发明方法的进一步优选的ODC多肽包含下述序列，该序列与表A1的任一多肽的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。进一步优选的是表A1的多肽的任一个。最优选的是SEQ ID NO：2。
备选地，ODC蛋白质的同源物以递增优选顺序与SEQ ID NO：2所示氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的总体序列同一性，只要同源蛋白质包含如上所述保守基序。总体序列同一性使用全局比对算法，如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数来进行确定。与总体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时序列同一性通常更高。
优选地，当利用多肽序列构建系统树(如图2B所示)时，该多肽序列优选地与ODC多肽的群聚类，最优选地与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD1多肽/基因，下文中以“可用于本发明方法的蛋白质”而对其的任何提及均指本文所定义的BIHD1多肽。下文中以“可用于本发明方法的核酸序列”而对其的任何提及均指能够编码此BIHD1多肽的核酸序列。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸序列是编码现将描述的多肽类型的任何核酸序列，下文也称为“BIHD1核酸序列”或“BIHD1基因”。
本文所定义的“BIHD1多肽”指任何多肽，该多肽与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，本文所定义的“BIHD1多肽”指任何多肽，其包含：(i)有InterPro登录号IPR0001356的同源框结构域；(ii)InterPro登录号IPR006563的POX结构域；以及(ii)至少一个预测的卷曲螺旋结构域。
备选地或额外地，本文所定义的“BIHD1多肽”指任何多肽序列，当利用其构建BIHD1系统树(如图4所示)时，其与BELL-1同源域多肽的进化枝而非任何其它同源域多肽的进化枝聚类。
备选地或额外地，本文所定义的“BIHD1多肽”指任何多肽，该多肽与本文表A2中给出的任一多肽序列以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
SEQ ID NO：67的多肽序列分析在如下本文实施例4中呈现。例如，如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽包含InterPro登录号IPR0001356的同源框结构域和InterPro登录号IPR0006563的POX结构域，等等。还可以使用常规技术(如序列比对)来鉴定结构域。表A2多肽的比对在图6中显示。此类比对对于鉴定BIHD1多肽之间最保守的结构域(如SKY盒和VSLTGL盒，根据它们含有的保守氨基酸残基命名)是有用的。
关于MYB30多肽/基因，下文中以“可用于本发明方法的蛋白质”而对其的任何提及均指本文所定义的MYB30多肽。下文中以“可用于本发明方法的核酸”而对其的任何提及均指能够编码该MYB30多肽的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任何核酸，下文也称为“MYB30核酸”或“MYB30基因”。
本文所定义的“MYB30多肽”指任何R2R3 MYB多肽，其包含至少一个，优选两个SANT结构域(SMART条目SM00717，Myb_DNA-结合结构域(Pfam条目PF00249))。此外，“MYB30多肽”还包含一个或多个基序9至11优选基序9。
备选地，“MYB30多肽”指下述多肽序列，当利用其构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，其聚类在包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的由AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96和AtMYB94多肽定义的进化枝中而非与任何其它群聚类。
基序9(SEQ ID NO：119)：QGsLSL[IF]EKWLFd[DE][x][SG]；其中位置+15中的X可以是任何或没有氨基酸，但以递增优选顺序优选S、G、D、Q、A的一个；
基序10(SEQ ID NO：120)：NI[AS][RK][LM]LXG[WF]MK；其中位置+7中的X可以是任何或没有氨基酸；
基序11(SEQ ID NO：121)：YASSX[ED]；
其中如果在特定位置单个残基相对频率大于50％并大于第二最频繁残基的两倍，给出单个大写字母。当没有单个残基满足这些标准时，如果它们的相对频率总和超过75％，残基对被指定为括号中的大写字母。如果这两条标准均不满足，如果残基的相对频率大于40％则给出小写字母。否则，给出x。这个共有序列遵从Joshi等1997.Plant Mol Biol 35：993-1001的标准。
可用于本发明方法的优选MYB30蛋白包含下列任何一个：
基序9(SEQ ID NO：119)：QGSLSL[I/F]EKWLFD[D/E]x[S/G]；其中1至8氨基酸可以被任何氨基酸替换。
基序10(SEQ ID NO：120)：NI[A/S][R/K][L/M]LXG[W/F]MK；其中X是任何或无氨基酸，并且其中1至6氨基酸可以被任何氨基酸替换。
基序11(SEQ ID NO：121)：YASSX[ED]；其中X是任何或无氨基酸，并且其中1至6氨基酸可以被任何氨基酸替换。
可用于本发明方法的优选MYB30多肽结合至DNA片段，其包含本领域众所周知的Myb DNA结合基序的任何一个，例如那些Jamin等(1996)Int.J.Quantum Chem.59，333-341.(GTAACGGTCTAC)；或G[G/T]T[A/T]G[G/T]T(PNAS 93，14972-14977(1996))；或GGTTTAG(J.Biol.Chem.，Vol.276，Issue 19，16511-16519，2001)所描述的。
优选地，可用于本发明方法的MYB30蛋白质包括保守结构域，其以递增优选顺序与实施例部分的表C3中所列的氨基酸结构域或基序1至3的任何一个具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性，只要同源蛋白质包括如上所述的保守基序。序列同一性使用比对算法，如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数或BLAST来进行确定。
备选地，MYB30蛋白质的同源物以递增优选顺序与SEQ ID NO：89所示氨基酸具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的总体序列同一性，只要同源蛋白质包括如上所述的保守基序。总体序列同一性使用全局的比对算法，如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数来进行确定。与总体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时序列同一性通常更高。
优选地，当利用多肽序列构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，该多肽序列聚类在包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽定义的进化枝，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽/基因，下文中以“可用于本发明方法的蛋白质”而对其的任何提及均指本文所定义的THOM多肽。下文中以“可用于本发明方法的核酸”而对其的任何提及均指能够编码此THOM多肽的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任何核酸，下文也称为“THOM核酸”或“THOM基因”。
本文所定义的“THOM多肽”指II类HD-Zip转录因子。II类HD-Zip转录因子形成所定义的转录因子群，见例如Sakakibara等(2001)或Agalou等(2008)。“II类HD-Zip转录因子”被认为意指转录因子，其含有(i)“N-末端HD-ZIP”亮氨酸拉链结构域(ii)同源框结构域，(iii)与同源框结构域相关的HALZ亮氨酸拉链结构域，和(iv)以下给出的基序12、13和14(以任何顺序)。
基序12(SEQ ID NO：124)：(R/S)(K/R)KLRL，和
基序13(SEQ ID NO：125)：RQVEVWFQNRRARTKL(K/E)QTEVDCE，和
基序14(SEQ ID NO：126)：TLXMC(L/P)(S/Q)C(E/K/R)(R/H)，
其中位置3中的X可以是任何氨基酸，优选A、L、I或T的一个。优选基序14是TLTMCPQCER。
此外，基序12至14每个在任何位置可以有保守的氨基酸替换，保守替换的实例在表1中提供。
此外，THOM多肽优选地还包含一个或多个以下的基序：
基序15(SEQ ID NO：127)：SPNS(T/A)，
基序16(SEQ ID NO：128)：LGL，
基序17(SEQ ID NO：129)：(E/D)(E/D)(E/D)，
基序18(SEQ ID NO：130)：(E/Q/D)N(R/K)RL，
优选地，基序18是ENRRL。
HD-ZIP_N亮氨酸拉链结构域(Pfam PF04618)在植物同源框亮氨酸拉链蛋白质的N末端区域中发现。它的功能是未知的。同源框结构域(PfamPF00046)首先在许多果蝇同源异型和分节蛋白质中进行鉴定。结构域通过螺旋-转角-螺旋(HTH)结构结合DNA。HTH基序以两个α-螺旋为特征，使其可以与DNA进行直接接触并通过短的转角进行连接。第二个螺旋通过许多氢键和疏水性相互作用结合至DNA，发生在特异性侧链和DNA大沟内暴露碱基和胸腺嘧啶甲基之间。第一个螺旋有助于稳定结构。在广泛的DNA结合蛋白质中(例如，cro和阻遏物蛋白质，同源异型蛋白质等等)，该基序在序列和结构上非常相似。这些不同蛋白质中HTH基序之间一个主要差别是由转角中的甘氨酸立体化学要求造成的，需要该甘氨酸来避免β-碳原子对主链的空间阻碍：对于cro和阻遏物蛋白质甘氨酸似乎是必需的，而对于很多同源异型和其它DNA结合蛋白质，这个要求是宽松的。在THOM多肽中发现的HALZ亮氨酸拉链结构域(Pfam PF02183)是植物特异性亮氨酸拉链，发现其总是与同源框结构域相关。
此外，Agalou等2008年报道拟南芥属和稻中II类HD-zip转录因子中同源域螺旋2中的内含子在I类和III类中都不存在。
备选地，THOM蛋白质的同源物以递增优选顺序与SEQ ID NO：123所示氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的总体序列同一性，只要同源蛋白质包括如上所述的保守基序。总体序列同一性使用全局的比对算法，如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数和优选用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)来进行确定。与总体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时序列同一性通常更高。
优选地，当利用多肽序列构建系统树(如在Sakakibara等2001的图3中所描述的系统树)时，该多肽序列聚类在包含THOM1和SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子群中，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD2多肽/基因，下文中以“可用于本发明方法的蛋白质”而对其的任何提及均指本文所定义的BIHD2多肽。下文中以“可用于本发明方法的核酸序列”而对其的任何提及均指能够编码此BIHD2多肽的核酸序列。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸序列是编码现将描述的蛋白质类型的任何核酸序列，下文也称为“BIHD2核酸序列”或“BIHD2基因”。
本文所定义的“BIHD2多肽”指任何多肽，该多肽与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，本文所定义的“BIHD2多肽”指任何多肽，其包含：(i)有InterPro登录号IPR0001356的同源框结构域和(ii)有InterPro登录号IPR006563的POX结构域。
用于本发明方法的优选BIHD2多肽指多肽，其包含与i)InterPro登录号IPR0001356的同源框结构域；(ii)如实施例1表A5任何多肽所示InterPro登录号IPR006563的POX结构域，优选如SEQ ID NO：193所示任何结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％总体序列同一性的结构域。
备选地或额外地，本文所定义的“BIHD2多肽”指任何多肽，该多肽以递增优选顺序与本文实施例1表A5中给出的任何多肽序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”章节中定义。存在用于鉴定结构域的专门数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)，InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)，Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo 等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)或者Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。用于计算机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASy蛋白组服务器(Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。还可以使用常规技术(如序列比对)来鉴定结构域或基序。
关于BIHD2序列，对SEQ ID NO：193的多肽序列的分析示于本文的实施例4。例如，如SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽包含InterPro登录号IPR0001356的同源框结构域和InterPro登录号IPR0006563的POX结构域等等。还可以使用常规技术(如序列比对)来鉴定结构域。表A5多肽的比对示于图14。这种比对可用于鉴定BIHD2多肽之间最为保守的结构域，例如GPFTGY盒、SNWFINARV盒、RGLP盒和HFLHPYP盒，根据它们含有的保守性氨基酸来命名。
比对序列以进行比较的方法为本领域所熟知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol 48：443-453)的算法来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)在两序列间计算百分比序列同一性并进行相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information(NCBI))向公众提供。可以使用例如默认配对比对参数的ClustalW多重序列比对算法(1.83版)和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用MatGAT软件包(Campanella 等，BMC Bioinformatics.2003 Jul 10；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequence)中提供的一种方法确定全局的相似性和同一性百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动编辑以优化保守性基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替全长序列来鉴定同源物。序列同一性值可以是使用默认参数的上述程序在完整的核酸或氨基酸序列上或在所选择的结构域或保守的基序上测定的。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
关于BIHD1序列，本文的实施例3在表B2中描述了SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽与表A2中所列BIHD1多肽之间的百分比同一性。SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽与表A2中所列BIHD1多肽之间的氨基酸序列百分比同一性是至少35％。已知同源域转录因子同源框结构域以外的氨基酸序列同一性一般低。
蛋白质亚细胞定位预测的工作是很重要的，并已充分研究。了解蛋白质的定位有助于阐明其功能。蛋白质定位实验方法的范围从免疫定位到使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡萄糖醛酸酶(GUS)标记蛋白质。这些方法很准确，但与计算机方法相比需要大量劳动。从序列数据对蛋白质定位进行计算机预测近来已取得很大进展。本领域技术人员熟知的算法在Swiss Institute for Bioinformatics提供的ExPASy蛋白组学工具中可获得，例如PSort、FargetP、ChloroP、LocFree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等。
关于BIHD1序列，本申请的实施例5和6中描述了对SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽的亚细胞定位和拓扑学预测。
关于BIHD2序列，本申请的实施例5和6中描述了对SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽的亚细胞定位和拓扑学预测。
此外，ODC多肽(至少在其天然形式下)一般具有鸟氨酸脱羧酶活性。用于测量鸟氨酸脱羧酶活性的工具和技术是本领域所熟知的。其它细节在实施例8中提供。
此外，ODC多肽根据本发明的方法当在稻中表达时(如实施例9和10所概述)产生具有增加产量相关性状的植物，尤其是增加的生物量、增加的早期萌发势、增加的种子总重量、增加的每株植物种子数和增加的饱满种子数中一个或更多个性状。
此外，MYB30多肽一般具有DNA结合活性和激活结构域。本领域技术人员可以使用常规技术和方法容易地确定激活结构域和DNA结合活性的存在，例如在Xue GP.Plant J.2005.41(4)：638-49及其中的参考文献中所描述的。本领域技术人员可以使用标准技术对MYB30多肽相互作用的蛋白质(例如在转录复合物中)容易地进行鉴定，如使用双杂交相互作用。据推测MYB30蛋白质与BHLH转录因子(Zimmerman等，Plant Journal 40，22-34，2004)相互作用。
此外，MYB30多肽根据本发明的方法当在稻中表达时(如实施例9和10所概述)产生具有增加产量相关性状的植物，尤其是增加的生物量和/或增加的出苗萌发势。
此外，THOM多肽显示转录因子的一般生物活性(至少在其天然形式下)，并一般具有DNA结合活性。用于测量DNA结合活性的工具和技术在本领域是众所周知的。Sessa等，(J.Mol.Biol.274，303-309，1997)研究ATHB-1和ATHB-2(＝HAT4)HD-Zip(HD-Zip-1和-2)结构域的DNA结合特性，发现它们以同二聚体与DNA相互作用，分别识别两个不同的9bp假回文序列：CAAT(A/T)ATTG(BS-1)和CAAT(G/C)ATTG(BS-2)。通过对HD-Zip-2结构域的突变分析，他们确定螺旋3的保守性氨基酸残基Val47、Asn51和Arg55对于HD-Zip-2结构域DNA结合活性是必需的。他们还报道通过用赖氨酸代替Arg55或用HD-Zip-1结构域相应残基(分别是丙氨酸和色氨酸)替换Glu46和Thr56，HD-Zip-2结构域丧失了对中心位置中G/C碱基对的优先识别。实施例8中提供了其它细节。
此外，THOM多肽根据本发明的方法当在稻中表达时(如实施例9、10和11所概述)产生具有增加产量相关性状的植物，尤其是增加的种子产量。
关于鸟氨酸脱羧酶序列，本发明以SEQ ID NO：1所示核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码多肽序列SEQ ID NO：2。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何ODC编码核酸或ODC多肽来实施。
关于鸟氨酸脱羧酶序列，编码ODC多肽的核酸的实例在本文实施例1表A1中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例1表A1中给出的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示ODC多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A1中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，二次BLAST将因此会针对烟草序列)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。
关于BIHD1序列，本发明以SEQ ID NO：66所示核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码序列为EQ ID NO：67的BIHD1多肽。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的编码BIHD1多肽的任何核酸序列来实施。
关于BIHD1序列，编码BIHD1多肽的核酸序列的例子在本文实施例1表A2中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例1表A2中给出的多肽序列为SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A2中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67的情况下，二次BLAST将因此会针对水稻序列)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。
关于MYB30序列，本发明以SEQ ID NO：88所示核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码SEQ ID NO：89的多肽序列。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何MYB30编码核酸或MYB30多肽来实施。
关于MYB30序列，编码MYB30多肽的核酸序列的例子在本文实施例1表A3中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例1表A3中给出的氨基酸序列为SEQ ID NO：89所示MYB30多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A3中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89的情况下，二次BLAST将因此会针对拟南芥序列)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命之列，则找到了直向同源物。
关于THOM序列，本发明以SEQ ID NO：122所示核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码多肽序列SEQ ID NO：123。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何THOM编码核酸或THOM多肽来实施。
编码THOM多肽的核酸序列的例子在本文实施例1表A4中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例部分的表A4中给出的氨基酸序列为SEQ ID NO：123所示THOM多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例部分的表A4中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：123的情况下，二次BLAST将因此会针对番茄序列)。然后比较首次和第二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。
关于BIHD2序列，本发明以SEQ ID NO：192所示核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码BIHD2多肽序列SEQ ID NO：193。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的编码BIHD2多肽的任何核酸序列来实施。
编码BIHD2多肽的核酸序列的例子在本文实施例1表A5中给出。这样的核酸序列可用于实施本发明的方法。实施例1表A5中给出的多肽序列为SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A5中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193的情况下，二次BLAST将因此会针对紫苜蓿序列)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则找到了旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则找到了直向同源物。
高排名的命中是那些E值低的命中。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类核酸变体的例子包括编码实施例1表A1-A5中给出的任一多肽序列的同源物和衍生物的核酸序列，其中术语“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有编码实施例1表A1-A5中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸序列。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。
可用于实施本发明方法的其它核酸变体包括ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸序列的部分，与ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸杂交的核酸，ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸的剪接变体，ODC多肽编码核酸的等位变体，以及通过基因改组获得的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。
ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A1-A5中给出的任一核酸序列的部分、或者编码实施例1表A1-A5中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。
例如，可以通过对核酸序列进行一个或多个缺失来制备所述核酸序列的部分。部分可以以分离的形式使用，或者可将其与其它编码(或非编码)序列融合，以便例如，产生组合了若干活性的蛋白质。当与其它编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分所预测到的要大。
关于ODC多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的ODC多肽，并与实施例1表A1中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选部分是实施例1表A1中给出的任一核酸的部分，或是编码实施例1表A1中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选该部分长度为至少200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500个连续核苷酸，所述连续核苷酸来自实施例1表A1中给出的任一核酸序列或者编码实施例1表A1中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选该部分是核酸SEQ ID NO：1的一部分。优选该部分编码下述氨基酸序列的片段，当利用其构建系统树(例如如图2所示)时，其优选与ODC多肽的群，最优选与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群而非任何其它蛋白质群聚类。
关于BIHD1多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的BIHD1多肽，并与实施例1表A2中给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选该部分是实施例1表A2中给出的任一核酸序列的部分，或是编码实施例1表A2中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一部分。优选该部分长度为至少1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1925或更多(以递增优选顺序)个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例1表A2中给出的任一核酸序列或者编码实施例1表A2中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列。优选该部分是编码与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性的多肽之核酸序列的一部分。更优选该部分是SEQ ID NO：66所示核酸序列的一部分。
关于MYB30多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的MYB30多肽，并与实施例1表A3中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选该部分是实施例1表A3中给出的任一核酸的一部分，或是编码实施例1表A3中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选该部分长度为至少400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例1表A3中给出的任一核酸序列或者编码实施例1表A3中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列。最优选该部分是核酸SEQ ID NO：88的一部分。
关于MYB30多肽，优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，当利用其构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，其与包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的由AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽定义的进化枝聚类，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽，可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的THOM多肽，并与实施例1表A4中给出的氨基酸序列具有基本相同的生物活性。优选该部分是实施例1表A4中给出的任一核酸的一部分，或是编码实施例1表A4中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选该部分长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例1表A4中给出的任一核酸序列或者编码实施例1表A4中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选该部分是核酸SEQ ID NO：122的一部分。优选该部分编码氨基酸序列片段，当利用其构建系统树(如在Sakakibara等(2001)的图3中所描述的系统树)时，其与包含THOM1和SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子群聚类，而非与任何其它群聚类。
可用于本发明方法的部分编码如本文所定义的BIHD2多肽，并与实施例1表A5中给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选该部分是实施例1表A5中给出的任一核酸序列的一部分，或是编码实施例1表A5中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的一部分。优选该部分长度以递增优选顺序为至少20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1925、或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例1表A5中给出的任一核酸序列或者编码实施例1表A5中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列。优选该部分是编码多肽序列的核酸序列的一部分，该多肽序列与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选该部分是SEQ ID NO：192所示核酸序列的一部分。
可用于本发明方法中的另一种核酸序列变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如本文中所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列杂交，或与如本文中所定义的部分进行杂交的核酸序列。
根据本发明，提供用于增加植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入并表达能够与实施例1表A1-A5中给出的任何一种核酸杂交的核酸序列，或包括在植物中引入并表达这样的核酸序列，其能够与编码在实施例1表A1-A5中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列杂交。
关于ODC多肽，可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的ODC多肽，与实施例1表A1中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A1中给出的任一核酸序列杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与编码实施例1表A1中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸杂交。最优选杂交序列能够与SEQ ID NO：1所示核酸或其部分杂交。优选杂交序列编码下述氨基酸序列多肽，当全长用于构建系统树(如图2所示)时，其优选与ODC多肽的群，最优选与包含如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD1多肽，可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的BIHD1多肽，并与实施例1表A2中给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A2中给出的任一核酸序列杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与编码实施例1表A2中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列杂交。优选杂交序列能够与编码下述多肽序列的核酸序列杂交，该多肽序列与如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选杂交序列能够与SEQ ID NO：66所示核酸序列或其部分杂交。
关于MYB30多肽，可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的MYB30多肽，与实施例1表A3中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A3中给出的任一核酸的互补链杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者杂交序列能够与编码实施例1表A3中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸的互补链杂交。最优选杂交序列能够与如SEQIDNO：88所示核酸或其部分的互补链杂交。
关于MYB30多肽，优选杂交序列编码下述氨基酸序列的多肽，当其全长用于构建系统树(如Stracke等2001年所描述的系统树)时，与由包含如SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽所定义的进化枝聚类，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽，可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的THOM多肽，与实施例1表A4中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A4中给出的任一核酸的互补链杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者杂交序列能够与编码实施例1表A4中给出的任一氨基酸序列之直向同源物或旁系同源物的核酸之互补链杂交。最优选杂交序列能够与如SEQ ID NO：122所示核酸或其部分的互补链杂交。
关于THOM多肽，优选杂交序列编码下述氨基酸序列的多肽，当利用其构建系统树(如Sakakibara等(2001)的图3中所述的系统树)时，其与包含THOM1和如SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD2多肽，可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的BIHD2多肽，并与实施例1表A5中给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A5中给出的任一核酸序列杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与编码实施例1表A5中给出的任一多肽序列之直向同源物或旁系同源物的核酸序列杂交。优选杂交序列能够与编码下述多肽序列的核酸序列杂交，该多肽序列与如SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选杂交序列能够与SEQ ID NO：192所示核酸序列或其部分杂交。
可用于本发明方法中的另一种核酸序列变体是编码如上文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的剪接变体，剪接变体如本文所定义。
根据本发明，提供用于增强和/或增加植物中产量相关性状的方法，包括在植物中引入并表达在实施例1表A1-A5中给出的任何一种核酸序列的剪接变体，或如此核酸的剪接变体，其中所述的核酸编码在实施例1表A1-A5中给出的任一氨基酸序列之直向同源物、旁系同源物或同源物。
关于ODC多肽，优选剪接变体是SEQ ID NO：1所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：2之直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如图2所示系统树)时，其优选与ODC多肽的群，最优选与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD1多肽，优选剪接变体是SEQ ID NO：66所示核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NO：67之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选地，剪接变体是编码下述多肽序列的核酸序列的剪接变体，该多肽序列与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
关于MYB30多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：88所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：89之直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，其与包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽定义的进化枝聚类，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：1所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：2之直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Sakakibara等(2001)的图3中所描述的系统树)时，其与包含THOM1和SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD2序列，优选的剪接变体是SEQ ID NO：192所示核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NO：193之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选地，剪接变体是编码下述多肽序列的核酸序列的剪接变体，该多肽序列与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
可用于实施本发明方法的另一类核酸序列变体为前文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸序列的等位变体，其中等位变体如本文所定义。
根据本发明，提供了增加产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A1-A5给出的任一核酸序列的等位变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A1-A5给出的任一多肽序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的等位变体。
关于ODC多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO：2的ODC多肽及实施例1表A1中所示任一氨基酸具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选地，等位变体为SEQ ID NO：1的等位变体，或编码SEQ ID NO：2之直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如图2所示)时，其优选与ODC多肽群，最优选与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD1多肽，可用于本发明方法的等位变体与SEQ ID NO：67的BIHD1多肽及实施例1表A2中所示任一多肽序列具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选地，等位变体为SEQ ID NO：66的等位变体，或编码SEQ ID NO：67之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选地，等位变体是下述多肽序列的等位变体，该多肽序列与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
关于MYB30多肽，可用于本发明方法的等位变体所编码的多肽与SEQ ID NO：89的MYB30多肽及实施例1表A3中所示任一氨基酸具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选的等位变体是SEQ ID NO：88的等位变体，或编码SEQ ID NO：89之直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，其与包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的由AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽定义的进化枝聚类，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO：123的THOM多肽及实施例1表A4中所示任一氨基酸具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选的等位变体是SEQ ID NO：122的等位变体，或编码SEQ ID NO：123之直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码下述氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Sakakibara等(2001)的图13中所描述的系统树)时，其与包含THOM1和SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD2多肽，可用于本发明方法的等位变体与SEQ ID NO：193的BIHD2多肽及实施例1表A5中所示任一多肽序列具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且这些天然等位基因的使用包含于本发明的方法中。优选地，等位变体为SEQID NO：192的等位变体，或编码SEQ ID NO：193之直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选地，等位变体是下述多肽序列的等位变体，该多肽序列与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
基因改组或定向进化也可用于产生上文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸序列的变体；其中术语“基因改组”如本文所定义。
根据本发明，提供了增强和/或增加产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A1-A5中给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A1-A5中给出的任一多肽序列之直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。
关于ODC多肽，优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码其氨基酸序列，当利用其构建系统树(如图2所示)时，其优选与ODC多肽的群，最优选与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的群聚类，而非与任何其它群聚类。
关于BIHD1多肽，优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码下述多肽序列，该多肽序列与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
关于MYB30多肽，优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码其氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Stracke等2001年所描述的系统树)时，其与包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的由AtMYB60、AtMYB30、AtMYB31、AtMYB96、AtMYB94多肽定义的进化枝聚类，而非与任何其它群聚类。
关于THOM多肽，优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码其氨基酸序列，当利用其构建系统树(如在Sakakibara等(2001)的图3中所描述的系统树)时，其与包含THOM1和SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的II类HD-zip转录因子的群聚类，而非与任何其它群聚类。
优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码下述多肽序列，该多肽序列与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
此外，还可利用定点诱变获得核酸序列变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。
编码ODC多肽的核酸序列可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。优选ODC多肽编码核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自茄科，最优选核酸来自烟草。
编码BIHD1多肽的核酸序列可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。BIHD1多肽编码核酸序列来自真核领域，优选来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选核酸序列来自稻。
编码MYB30多肽的核酸序列可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。优选MYB30多肽编码核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，最优选核酸来自拟南芥。
编码THOM多肽的核酸可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。优选THOM多肽编码核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自茄科，最优选核酸来自番茄。
编码BIHD2多肽的核酸序列可以来自任何天然或人工来源。可以通过有目的的人工操作对其进行修饰，使之不同于其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。BIHD2多肽编码核酸序列来自真核领域，优选来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选核酸序列来自稻。
本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增强的和/或增加的产量相关性状的植物。尤其本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的产量、尤其增加的种子产量的植物。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“产量”和“种子产量”。
在本文中对增强的产量相关性状的提及意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量而具有增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩中已建立植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其它。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其它。
本发明提供了增加植物相对于对照植物的产量、特别是种子产量的方法，所述方法包括调节植物中如本文所定义的ODC多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽编码核酸序列的表达。
本发明还提供了增加植物相对于对照植物的产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中如本文所定义的BIHD1多肽、或BIHD2多肽编码核酸序列的表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量和/或产量相关性状，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期之一或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的和/或增加的(早期)萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得；延迟的开花时间通常不是作物中想要的性状)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其它稻植物，全部均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其它合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加和/或调节如本文中所定义的编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列在植物中的表达。
与在相当条件下培育的对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％或30％，优选小于25％、20％或15％，更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是那些允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“交叉(cross talk)”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。最佳生长下生长的植物(在非胁迫条件下生长)一般出产以递增优选顺序至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的任何给定环境下这样植物的平均生产。平均生产可以收获和/或季节为基础进行计算。本领域技术人员清楚作物的平均产量生产。
关于ODC序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码ODC多肽的核酸在植物中表达。
关于BIHD1序列，本发明方法的实施相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微胁迫条件下培育的植物增加的产量相关性状。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微胁迫条件下培育的植物中增加产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码BIHD1多肽的核酸序列在植物中表达。
关于MYB30序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码MYB30多肽的核酸在植物中表达。
关于THOM序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码THOM多肽的核酸在植物中表达。
关于BIHD2序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微胁迫条件下培育的植物增加的产量相关性状。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微胁迫条件下培育的植物中增加产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码BIHD2多肽的核酸序列在植物中表达。
关于ODC序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在养分缺乏条件下(特别是在氮缺乏的条件下)培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在养分缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，该方法包括在植物中调节编码ODC多肽的核酸的表达。养分缺乏可能是由于养分(如氮、磷酸和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等)的缺少。
关于BIHD1序列，本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，导致在非生物胁迫条件下培育的植物增加的产量相关性状。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“交叉(cross talk)”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。由于不同的环境胁迫激活相似的途径，因此本发明就干旱胁迫进行的示例不应看作局限在干旱胁迫，而是更应看作为筛选，其表明在一般性非生物胁迫下上文定义的BIHD1多肽参与相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物而增加植物的产量相关性状。
关于BIHD1序列，本发明方法的实施赋予在非生物胁迫条件下植物相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物而言具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在非生物胁迫条件下培育的植物中增加产量相关性状的方法，该方法包括在植物中增加编码BIHD1多肽的核酸序列的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一种或多种：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
如本文定义的术语“非生物胁迫”指以下任何一种或多种：水胁迫(由于干旱或水过多)、厌氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冻温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，水胁迫为干旱胁迫。术语盐胁迫不限于常见盐(NaCl)，而是可以为由以下一种或多种引起的任何胁迫：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。
非生物环境胁迫的另一例子是植物生长和发育的同化所需的一种或多种养分利用度的降低。由于养分利用效率对植物产量和产品质量有显著影响，因此在田间倾倒了大量肥料来优化植物生长和质量。植物的生产力一般受限于三种主要养分：磷、钾和氮，在植物生长的这三者中，氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。这是可见于活细胞中的多种重要化合物的组分，所述化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素。植物干物质的1.5％至2％以及总植物蛋白质的约16％是氮。因此，氮的利用度是作物植物生长和生产的主要限制因素(Frink等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(4)：1175-1180)，并也对蛋白质积累和氨基酸组成有重大影响。因此，在氮有限条件下培养时具有增加的产量相关性状的作物植物是很有意义的。
本发明方法的实施赋予在养分利用度降低条件下(特别是在减少的氮利用度的条件下)培育的植物相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在养分利用度降低条件下(优选在降低的氮利用度的条件下)培育的植物中增加产量相关性状的方法，该方法包括在植物中增加编码BIHD1多肽的核酸序列的表达。降低的养分利用度可能是由于养分(如氮、磷酸和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等)的缺少或过剩所致。优选地，降低的养分利用度是降低的氮利用度。
关于MYB30序列，本发明方法的实施赋予在养分缺乏条件下(特别是在氮缺乏的条件下)培育的植物相对于在相当条件下培育的对照植物而言增加的产量。因此，根据本发明，提供了在养分缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，该方法包括在植物中调节编码MYB30多肽的核酸的表达。养分缺乏可能是由于养分(如氮、磷酸和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等)的缺少。
关于THOM序列，本发明方法的实施赋予在养分缺乏条件下(特别是在氮缺乏的条件下)培育的植物相对于在相当条件下培育的对照植物而言增加的产量。因此，根据本发明，提供了在养分缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，该方法包括在植物中调节编码THOM多肽的核酸的表达。养分缺乏可能是由于养分(如氮、磷酸和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等)的缺少。
本发明方法的实施赋予在盐胁迫下培育的植物相对于在相当条件下培育的对照植物而言增加的产量。因此，根据本发明，提供了在盐胁迫条件下培育的植物中增加产量的方法，该方法包括在植物中调节编码THOM多肽的核酸的表达。术语盐胁迫不限于常见盐(NaCl)，可以为以下一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。
关于BIHD2序列，实施根据本发明的方法导致在非生物胁迫条件下培育的植物相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物而具有增加的产量相关性状。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“交叉(cross talk)”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。由于不同的环境胁迫激活相似的途径，因此本发明就干旱胁迫进行的示例不应看作局限在干旱胁迫，而是更应看作为筛选，其表明在一般性非生物胁迫下，上文定义的BIHD2多肽参与相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物而增加产量相关性状。
本发明方法的实施赋予在非生物胁迫条件下植物相对于在相当胁迫条件下培育的对照植物而言具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在非生物胁迫条件下培育的植物中增加产量相关性状的方法，该方法包括在植物中增加编码BIHD2多肽的核酸序列的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一种或多种：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
非生物环境胁迫的另一例子是植物生长和发育的同化所需的一种或多种养分利用度的降低。由于养分利用效率对植物产量和产品质量有显著影响，因此在田间倾倒了大量肥料来优化植物生长和质量。植物的生产力一般受限于三种主要养分：磷、钾和氮，在植物生长的这三者中，氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。这是可见于活细胞中的多种重要化合物的组分，所述化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素。植物干物质的1.5％至2％以及总植物蛋白质的约16％是氮。因此，氮的利用度是作物植物生长和生产的主要限制因素(Frink等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(4)：1175-1180)，并也对蛋白质积累和氨基酸组成有重大影响。因此，在氮有限条件下培养时具有增加的产量相关性状的作物植物是很有意义的。
本发明方法的实施赋予在养分利用度降低条件下(特别是在减少的氮利用度的条件下)培育的植物相对于在相当条件下培育的对照植物而言具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在养分利用度降低条件下(优选在降低的氮利用度的条件下)培育的植物中增加产量相关性状的方法，该方法包括在植物中增加编码BIHD2多肽的核酸序列的表达。降低的养分利用度可能是由于养分(如氮、磷酸和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等)的缺少或过剩所致。优选地，降低的养分利用度是降低的氮利用度。
本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)或细胞。所述植物或其部分或细胞包括编码如上文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体，以利于在植物中引入和/或(增加的)表达如本文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽编码核酸。可以将遗传构建体插入适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中，该载体可以是可商购的载体。本发明还提供了如本文所定义的遗传构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供这样的构建体，其含有：
(a)编码如上文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸；
(b)一个或多个能够驱动(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选的
(c)转录终止序列。
优选地，编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸是如上文所定义的。术语“控制序列”和“终止序列”是如本文所定义的。
可以使用含有任何上述核酸的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。
可以使用含有任何上述核酸序列的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。
其它器官特异性启动子，例如优选用于在叶、茎、块茎、分生组织、种子(胚和/或胚乳)中表达，在实施本发明的方法中是有用的。多种启动子类型的定义参见本文的“定义”部分。
有利地，任何类型的启动子，不论天然的或合成的，均可用于驱动和/或增加核酸序列的表达，但是优选启动子是植物来源的。组成型启动子在方法中是特别有用的。优选组成型启动子也是遍在启动子。多种启动子类型的定义参见本文的“定义”部分。也可用于本发明方法的是根特异性启动子。
关于BIHD1序列，优选构建体的控制序列之一是种子特异性启动子。种子特异性启动子的一个例子是WSI18启动子，优选为稻WSI18启动子，更优选为如SEQ ID NO：84所示WSI18启动子。种子特异性启动子的另一个例子是RAB21启动子，优选为稻RAB21启动子，更优选为如SEQ ID NO：85所示RAB21启动子。种子特异性启动子的其它例子可在前文“定义”部分中发现。
有利地，任何类型的启动子，不论天然的或合成的，均可用于驱动核酸序列的表达。多种启动子类型的定义参见本文的“定义”部分。年幼绿色组织特异性启动子在所述方法中特别有用。优选地，编码MYB30多肽的核酸序列与如本文所定义的年幼绿色组织特异性启动子是有效连接的。年幼绿色组织特异性启动子优选原叶绿素酸酯还原酶(PcR)启动子，更优选由与SEQ ID NO：118基本相似的核酸序列所示原叶绿素酸酯还原酶启动子，最优选启动子如SEQ ID NO：118所示。
关于ODC序列，应该明白，本发明的适用范围不限于SEQ ID NO：1所示ODC多肽的编码核酸，本发明的适用范围也不限于由组成型启动子驱动时表达ODC多肽的编码核酸。
组成型启动子优选是GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是与SEQ ID NO：61基本相似的核酸序列所表示的，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：61所示。组成型启动子的其它实例见本文“定义”部分中表2a。
关于BIHD1序列，应该明白，本发明的适用范围不限于如SEQ ID NO：66所示编码BIHD1多肽的核酸序列，本发明的适用范围也不限于由种子特异性启动子驱动时表达BIHD1多肽编码核酸序列。
关于MYB30序列，应该明白，本发明的适用范围不限于SEQ ID NO：88所示MYB30多肽编码核酸，本发明的适用范围也不限于由绿色组织特异性启动子驱动时表达MYB30多肽编码核酸。
关于THOM序列，应该明白，本发明的适用范围不限于SEQ ID NO：122所示THOM多肽编码核酸，本发明的适用范围也不限于由组成型启动子驱动时表达THOM多肽编码核酸。
组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选选自植物驱动启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是与SEQ ID NO：131基本相似的核酸序列所表示的，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：131所示。组成型启动子的其它实例见本文“定义”部分。
关于BIHD2序列，应该明白，本发明的适用范围不限于SEQ ID NO：192所示BIHD2多肽编码核酸，本发明的适用范围也不限于由组成型启动子驱动时表达BIHD2多肽编码核酸。
组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选选自植物驱动启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的启动子GOS2启动子。还优选组成型启动子是与SEQ ID NO：248基本相似的核酸序列所表示的，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：248所示。组成型启动子的其它实例见本文“定义”部分。
可以使用含有任何上述核酸序列的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。
关于BIHD2序列，还应该明白，本发明的适用范围不限于如SEQ ID NO：192所示编码BIHD2多肽的核酸序列，本发明的适用范围也不限于由种子特异性启动子驱动时表达BIHD2多肽编码核酸序列。
任选地，可在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。其它调节元件可包括转录及翻译增长子(increaser)。本领域技术人员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子(或增长子)序列。也可将内含子序列添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量，如在定义部分所述。其它控制序列(除启动子、增长子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制需要的复制起点序列。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择标记基因。选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记基因去除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文“定义”部分中描述。
已知当核酸序列稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸序列稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记基因去除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文“定义”部分中描述。
本发明还提供产生与对照植物相比具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达编码上文所定义ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的任何核酸序列。
更具体地，本发明提供了产生具有增强的和/或增加的产量相关性状(特别是增加的(种子)产量)的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)向植物、或植物部分、或植物细胞中引入和表达ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
(i)的核酸序列可以是任何能编码如本文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列。
可以将核酸序列直接引入植物细胞或植物本身(包括引入植物的组织、器官或任何其它部分)。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。备选地，针对转化的植物筛选可选择标记如上文所述标记的存在。
DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选地或额外地，可用Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗上)。
本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，唯一的要求是所述后代呈现出与在本发明方法中亲本产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括含有分离的编码如上文所定义的ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，其宿主植物原则上有利地为能够合成在本发明方法中使用的多肽的所有植物。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜(rapeseed)、亚麻子、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦(emmer)、德国小麦(spelt)、黑麦属、一粒系小麦(einkorn)、teff、高粱(milo)和燕麦。
本发明也延及植物的可收获部分，该植物包含分离的编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽(如上文所定义的)的核酸序列。这样的可收获部分包括，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和鳞茎。本发明进一步涉及来自、优选直接来自该植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明优选的特征，调节的表达是提高的表达。用于增加核酸或基因或基因产物之表达的方法均已详细记载于本领域中，并且在定义部分提供了实例。
如上所述，用于调节编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列；然而实施该方法的效果(也就是增强产量相关性状)也可使用其它已知技术来实现，包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组。在定义部分提供了这些技术的描述。
本发明也包括编码如本文中所述的ODC多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽的核酸序列的用途和这些ODC多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽的用途，用于增强植物中的任何前述的产量相关性状。
而且，本发明也包括编码如本文中所述的BIHD1多肽、或BIHD2多肽的核酸序列的用途和这些BIHD1多肽、或BIHD2多肽的用途，用于增加在正常生长条件下、在非生物胁迫生长条件(优选渗透胁迫生长状况)下和在养分利用度降低的生长条件下(优选在减少的氮利用度的生长条件下)植物中的任何前述的产量相关性状。
关于ODC序列，编码本文中所述ODC多肽的核酸序列或ODC多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与ODC多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述核酸/基因或ODC多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
关于BIHD1序列，编码本文中所述BIHD1多肽的核酸序列或BIHD1多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与BIHD1多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述基因/核酸序列或BIHD1多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增加的产量相关性状的植物。
关于MYB30序列，编码本文中所述MYB30多肽的核酸序列或MYB30多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与MYB30多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述核酸/基因或MYB30多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
关于THOM序列，编码本文中所述THOM多肽的核酸或THOM多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与THOM多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述核酸/基因或THOM多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
关于BIHD2序列，编码本文中所述BIHD2多肽的核酸序列或BIHD2多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以与BIHD2多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。所述基因/核酸序列或BIHD2多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增加的产量相关性状的植物。
编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的基因/核酸序列的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非故意引起的所谓“自然”起源的等位变体集合开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论序列的优选等位变体且其导致增加的产量的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其它任选步骤包括将鉴定到优选等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列也可以用作探针以便对基因进行遗传作图和物理作图，所述探针作为所述基因的一部分，及用作与那些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码ODC多肽、或BIHD1多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或BIHD2多肽的核酸序列来探测。产生的条带图谱随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码ODC多肽、BIHD1多肽、或MYB30多肽、或BIHD2多肽的核酸序列在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改进方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其它个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改进可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。例子包括等位基因特异的扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的整个区域内作图亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
本发明方法产生具有如前文所述的增强的和/或增加的产量相关性状的植物。这些性状也可以与其它经济有利的性状组合，如其它的产量增强和/或产量增加性状、对非生物胁迫和生物胁迫的耐性、对除草剂、杀虫剂的耐性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
项目
1.用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，包括调节编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸在植物中的表达，并且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
2.根据项目1的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶多肽，当用于构建α/β桶状折叠碱性氨基酸脱羧酶多肽的系统树时，与含有鸟氨酸脱羧酶的进化枝聚类而不是与含有精氨酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱羧酶、或羧基去亚精胺脱羧酶多肽的进化枝聚类。
3.根据项目1或2的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶多肽包含以下一个或多个序列：
(i)与表A1任何多肽的氨基酸序列具有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，
(ii)与实施例4表C1中所述任何结构域的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
(iii)与基序1的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序1为：
[N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG(SEQ ID NO：51)；
(iv)与基序2的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序2为：
[K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S](SEQ ID NO：52)；
(v)与基序3的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序3为：
RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHHP(SEQ ID NO：53)；
(vi)与基序4的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序4为：
EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT(SEQ ID NO：54)；
(vii)与基序5的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序5为：EYVLSLG[V/I]SPD(SEQ ID NO：55)；
(viii)与基序6的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序6为：
AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A](SEQ ID NO：56)；
(ix)与基序7的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序7为：
[G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM[V/L]SIITQKLQD[E/D](SEQ ID NO：57)；
(x)与基序8的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中基序8为：QT[V/I]IVSGLNPAAILQ(SEQ ID NO：58)。
4.根据项目1、2或3的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入并表达编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸来实现。
5.根据前述项目中任一项的方法，其中所述编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸编码表A1中所列任一个蛋白质或是这样的核酸的一部分，或是能与这样的核酸杂交的核酸或其互补序列。
6.根据前述项目中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
7.根据前述项目中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物而言增加的苗生物量和/或种子产量。
8.根据前述项目中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在氮缺乏的培育条件下获得的。
9.根据项目4至8中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
10.根据前述项目中任一项的方法，其中所述编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸为植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自茄科，最优选来自烟草(Nicotiana tabacum)。
11.可通过前述项目中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码鸟氨酸脱羧酶多肽的重组核酸。
12.构建体，其包含
(i)编码如项目1、2或3中所定义的鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸；
(ii)能驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及任选的
(iii)转录终止序列。
13.根据项目12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
14.根据项目12或13中的构建体在产生与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物的方法中的用途。
15.转化有根据项目12或13的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
16.产生与对照植物相比具有增加的产量，优选增加的种子产量的转基因植物的方法，包括
(i)在植物中引入和表达编码如在项目1、2或3中定义的鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养该植物细胞；和任选地
(iii)选择具有增强的产量相关性状的植物。
17.由于编码如项目1、2或3中定义的鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸的经调节的表达而与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的生物量的转基因植物，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
18.根据项目11、15或17的转基因植物或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
19.根据项目18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗生物量和/或种子。
20.来自根据项目18的植物和/或来自根据项目19的植物的可收获部分的产品。
21.编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸在植物中相对于对照植物而增加产量特别是增加苗和/或生物量中的用途。
22.一种与对照植物相比增加植物中产量相关性状的方法，包括增加编码苯并噻二唑诱导的同源域1(BIHD1)多肽的核酸序列在植物中的表达，其中BIHD1多肽与如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性，并任选地选择具有增加的产量相关性状的植物。
23.根据项目22的方法，其中所述BIHD1多肽包含：(i)InterPro登录IPR0001356的同源框结构域；(ii)InterPro登录IPR006563的POX结构域；和(ii)至少一个预测的卷曲螺旋结构域。
24.根据项目22或23的方法，其中当用于构建BIHD1系统树时，如用于构建如图4中所述的系统树时，所述BIHD1多肽与BELL-1同源域多肽的进化枝聚类，而不是与任何其它同源域多肽进化枝聚类。
25.根据项目22至24中任一项的方法，其中所述BIHD1多肽与本文表A2中给出的任何多肽序列以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
26.根据项目22至25中任一项的方法，其中所述编码BIHD1多肽的核酸序列是表A2中给出的SEQ ID NO中的任一核酸序列或其部分，或者能与表A2中给出的SEQ ID NO中的任一核酸序列杂交的序列。
27.根据项目22至26中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A2中给出的任一多肽序列EQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
28.根据项目22至27中任一项的方法，其中所述增加的表达通过T-DNA激活标签、TILLING或同源重组的任何一种或多种实现。
29.根据项目22至28中任一项的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并表达编码BIHD1多肽的核酸序列来实现。
30.根据项目22至29中任一项的方法，其中所述增加的产量相关性状是下述的一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
31.根据项目22至30中任一项的方法，其中所述核酸序列与种子特异性启动子有效连接。
32.根据项目31的方法，其中所述种子特异性启动子优选是WSI18启动子，更优选是来自稻的WSI18启动子，最优选如SEQ ID NO：84所示WSI19启动子。
33.根据项目31的方法，其中所述种子特异性启动子优选是RAB21启动子，更优选是来自稻的RAB21启动子，最优选如SEQ ID NO：85所示RAB21启动子。
34.根据项目22至33中任一项的方法，其中所述编码BIHD1多肽的核酸序列为植物来源，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科(Poacae)，更优选来自稻属(Oryza)，最优选来自稻。
35.可通过前述项目中任一项的方法获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或细胞包含分离的编码BIHD1多肽的核酸转基因，该转基因与种子特异性启动子有效连接。
36.构建体，其包含
(a)编码如项目22至27中任一项所定义的BIHD1多肽的核酸序列；
(b)能驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及任选的
(c)转录终止序列。
37.根据项目36的构建体，其中所述控制序列是种子特异性启动子。
38.根据项目36或37的构建体在产生植物的方法中的用途，该植物与对照植物相比具有增加的产量相关性状，其中增加的产量相关性状是下述一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
39.转化有项目36或37的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
40.产生与对照植物相比具有增加的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达编码如项目22至27中任一项所定义的BIHD1多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。
41.与对照植物相比具有增加的产量相关性状的转基因植物，或所述转基因植物的转基因植物细胞或转基因植物部分，增加的产量相关性状来自于编码如项目22至27中任一项所定义的BIHD1多肽的核酸序列表达的增加，该核酸序列与种子特异性启动子有效连接。
42.根据项目35、39或41的转基因植物或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
43.根据项目42的植物的可收获部分，该可收获部分包含编码BIHD1多肽的分离的核酸序列，其中所述可收获部分优选为种子。
44.来自根据项目42的植物和/或来自根据项目43的植物的可收获部分的产品，该产品包含编码BIHD1多肽的分离的核酸序列。
45.编码如项目22至27中任一项所定义的BIHD1多肽的核酸序列在增加产量相关性状中的用途，其中所述增加的产量相关性状包含下述一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
46.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码MYB30多肽的核酸在植物中的表达，其中所述MYB30多肽包含至少一个SANT结构域。
47.根据项目46的方法，其中所述MYB30多肽包含基序9至11(SEQ ID NO：119至SEQ ID NO：121)中的一个或多个。
48.根据项目46或47的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入并表达编码MYB30多肽的核酸来实现。
49.根据项目46至48任一项的方法，其中所述编码MYB30多肽的核酸编码表A3中所列任一个蛋白质，或是这样的核酸的部分，或能与这样的核酸杂交的核酸。
50.根据项目46至49中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A3中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
51.根据项目46至50中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括与对照植物相比增加的生物量和/或增加的出苗萌发势。
52.根据项目46至51中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
53.根据项目48至52中任一项的方法，其中所述核酸与绿色组织特异性启动子有效连接，优选与pPcR启动子有效连接，最优选与来自稻的pPcR启动子有效连接。
54.根据项目46至53中任一项的方法，其中所述编码MYB30多肽的核酸为植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选来自拟南芥。
55.可通过前述项目中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码MYB30多肽的重组核酸。
56.构建体，其包含
(a)编码如项目46或47中所定义的MYB30类多肽的核酸序列；
(b)能驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及任选的
 (c)转录终止序列。
57.根据项目56的构建体，其中所述控制序列之一是绿色组织特异性启动子，优选是pPcR启动子，最优选是来自稻的pPcR启动子。
58.根据项目56或57的构建体在产生与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的出苗萌发势的植物之方法中的用途。
59.转化有项目56或57的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
60.产生与对照植物相比具有增加的产量(特别是增加的生物量和/或增加的出苗萌发势)的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物中引入和表达编码如项目46或47中所定义的MYB30多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
61.由于编码如项目46或47中所定义的MYB30多肽的核酸的表达调节而与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的出苗萌发势的转基因植物，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
62.根据项目55、59或61的转基因植物或其来源的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
63.根据项目62的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为营养生物量。
64.来自根据项目62的植物和/或来自根据项目63的植物的可收获部分的产品。
65.编码MYB30多肽的核酸在植物中相对于对照植物而增强产量相关性状，特别是增加生物量和/或出苗萌发势中的用途。
66.用于在植物中相对于对照植物而增强产量相关性状的方法，其包括调节编码THOM多肽的核酸在植物中的表达，其中所述THOM多肽包含(i)“N-末端HD-ZIP”亮氨酸拉链结构域，(ii)同源域，(iii)与同源域相关的HALZ亮氨酸拉链结构域。
67.根据项目66的方法，其中所述THOM多肽包含以下一种或多种基序：
(i)基序12，SEQ ID NO：124，
(ii)基序13，SEQ ID NO：125，
(iii)基序14，SEQ ID NO：126。
68.根据项目66或67的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入并表达编码THOM多肽的核酸来实现。
69.根据项目66至68任一项的方法，其中所述编码THOM多肽的核酸编码表A4中所列的任一个蛋白质，或是这样的核酸的一部分，或能与这样的核酸杂交的核酸。
70.根据项目66至69任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A4中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
71.根据项目66至70任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物而言增加的产量，优选增加的种子产量。
72.根据项目68至71任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
73.根据项目66至72任一项的方法，其中所述编码THOM多肽的核酸为植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自茄科，更优选来自茄属(Solan um)，最优选来自番茄(Solanum lycopersicum)。
74.可通过项目66至73任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码THOM多肽的重组核酸。
75.构建体，其包含
(a)编码如项目65或66中所定义的THOM多肽的核酸序列；
(b)能驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及任选的
(c)转录终止序列。
76.根据项目75的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
77.根据项目75或76的构建体在产生与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
78.转化有项目75或76的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
79.产生与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物中引入和表达编码如项目66或67中所定义的THOM多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
80.由于编码如项目66或67中所定义的THOM多肽的核酸的表达调节而与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
81.根据项目74、78或80的转基因植物或其来源的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和野小麦、德国小麦、黑麦属、一粒系小麦、teff、高粱和燕麦。
82.根据项目81的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗生物量和/或种子。
83.来自根据项目81的植物和/或来自根据项目82的植物的可收获部分的产品。
84.编码THOM多肽的核酸在植物中相对于对照植物而增加产量特别是增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
85.用于与对照植物相比增加植物中产量相关性状的方法，其包括增加植物中编码苯并噻二唑诱导的同源域2(BIHD2)多肽的核酸序列的表达，其中BIHD2多肽与如SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性，并任选地选择具有增加的产量相关性状的植物。
86.根据项目85的方法，其中所述BIHD2多肽包含：(i)InterPro登录IPR0001356的同源框结构域；(ii)InterPro登录IPR006563的POX结构域；和(ii)至少一个预测的卷曲螺旋结构域。
87.根据项目85或86的方法，其中所述BIHD2多肽是包含下述结构域的多肽，该结构域具有与以下任一结构域至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的总体序列同一性，所述以下任一结构域是i)InterPro登录IPR0001356的同源框结构域；(ii)如表A5中任何多肽中所示的，优选如SEQ ID NO：193所示的，InterPro登录IPR006563的POX结构域。
88.根据项目85至87中任一项的方法，其中所述BIHD2多肽与本文表A5中给出的任何多肽序列以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
89.根据项目85至88中任一项的方法，其中所述编码BIHD2多肽的核酸序列以以下来表示：表A5中给出的SEQ ID NO中的任一核酸序列或其部分，或者能与表A5中给出的SEQ ID NO中的任一核酸序列杂交的序列。
90.根据项目85至89中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A5中给出的任一多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
91.根据项目85至90中任一项的方法，其中所述增加的表达通过T-DNA激活标签、TILLING、或同源重组的任何一种或多种实现。
92.根据项目85至91中任一项的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并表达编码BIHD2多肽的核酸序列来实现。
93.根据项目85至92中任一项的方法，其中所述增加的产量相关性状是一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
94.根据项目85至93中任一项的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接。
95.根据项目94中的方法，其中所述组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选是选自植物来源的启动子，最优选是来自稻的启动子。
96.根据项目94中的方法，其中所述组成型启动子优选是GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子，最优选如SEQ ID NO：248所示的GOS2启动子。
97.根据项目85至96中任一项的方法，其中所述编码BIHD2多肽的核酸序列为植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自豆科植物，更优选来自苜蓿属(medicago)，最优选来自蒺藜苜蓿(medicago truncatula)。
98.可通过前述项目任一项中的方法获得的植物、其部分(包括种子)，或植物细胞，其中所述植物、其部分或细胞包含分离的有效连接至组成型启动子的核酸转基因，该转基因编码BIHD2多肽。
99.构建体，其包含：
(a)编码如项目85至90中任一项所定义的BIHD2多肽的核酸序列；
(b)能驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及任选的
(c)转录终止序列。
100.根据项目99的构建体，其中所述控制序列是组成型启动子。
101.根据项目99或100的构建体在产生与对照植物相比具有增加的产量相关性状的植物的方法中的用途，所述增加的产量相关性状是下述一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
102.转化有根据项目98或99的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
103.产生与对照植物相比具有增加的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达编码如项目85至90中任一项所定义的BIHD2多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。
104.与对照植物相比具有增加的产量相关性状的转基因植物，或来自于所述转基因植物的转基因植物细胞或转基因植物部分，增加的产量相关性状来自于编码如项目85至90中任一项所定义的BIHD2多肽的核酸序列表达的增加，该核酸序列与组成型启动子有效连接。
105.根据项目98、102或104的转基因植物或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
106.根据项目105的植物的可收获部分，该可收获部分包含编码BIHD2多肽的分离的核酸序列，其中所述可收获部分优选为种子。
107.来自根据项目105的植物和/或来自根据项目106的植物的可收获部分的产品，该产品含有编码BIHD2多肽的分离的核酸序列。
108.编码如项目84至89中任一项所定义的BIHD2多肽的核酸序列用于增加产量相关性状，其中所述增加的产量相关性状是下述一种或多种：增加的早期萌发势、增加的每株植物的总种子产量、增加的饱满种子数、增加的总种子数、或增加的收获指数。
附图简述
现将参考以下附图描述本发明，其中：
图1表示由ODC多肽催化的脱羧反应。
图2A显示了β/α桶脱羧酶多肽的比对。
图2B显示了β/α桶脱羧酶多肽的系统树。
图3表示用于增加稻GOS2(pGOS2)启动子控制下的ODC编码核酸在稻中表达的二元载体。
图4是来自Luo等(2005；Plant Biol 7：459-468)的系统树。它显示了稻BIHD1多肽与同源域转录因子的BELL1亚家族聚类，而不与其它亚家族如Knotted1、glabra2、HD-Zip和PHD-HDrobust同源域多肽聚类。
图5显示了COILS算法预测在如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽中有至少一个卷曲螺旋结构域的图形输出。X轴代表氨基酸残基坐标，Y轴代表卷曲螺旋结构域存在的概率(范围从0至1)，及三条线代表检查的三个窗口(14，21，28)。
图6显示了来自表A2的BIHD1多肽的AlignX(来自载体NTI 10.3，Invitrogen Corporation)多重序列比对。PFAM同源框结构域PF00046(整合入InterPro登录号IPR0001356)和PFAM POX结构域PF07526(整合入InterPro登录号IPR0006563)鉴定在共有序列下方以X。SKY和VSLTLGL保守性基序也在共有序列下方以X标出。包含在同源域内的三个螺旋在比对的序列的顶上通过黑粗线显示。PYP和WF保守性氨基酸通过它们的单个氨基酸密码得到鉴定，其被认为与DNA靶序列直接相互作用。
图7显示了用于增加在来自稻的种子特异性启动子控制下的BIHD1多肽编码核酸序列在稻中表达的二元载体。
图8表示SEQ ID NO：89的序列的结构域结构。
图9表示MYB30多肽的多重比对。
图10表示用于增加稻原叶绿素酸酯还原酶启动子(pPcR)控制下的MYB30编码核酸在稻中表达的二元载体。
图11表示有保守性基序或结构域的SEQ ID NO：123的结构域结构：粗体：HD-ZIP结构域，下划线：同源框(HOX)结构域，斜体：同源框相关的亮氨酸拉链(HALZ)。
图12表示THOM多肽的多重比对。SEQ ID NO：123以Le_THOM表示。
图13表示用于增加稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的THOM编码核酸在稻中表达的二元载体。
图14显示了来自表A5的BIHD2多肽的AlignX(来自载体NTI 10.3，Invitrogen Corporation)多重序列比对。鉴定PFAM同源框结构域PF00046(整合入InterPro登录号IPR0001356)和PFAM POX结构域PF07526(整合入InterPro登录号IPR0006563)。PYP和WF保守性氨基酸可通过它们的单个氨基酸密码来表示(带有下划线的)，其被认为与DNA靶序列直接相互作用。
图15显示了用于增加来自稻的组成型启动子GOS2控制下的编码BIHD2多肽的核酸序列在稻中表达的二元载体。
实施例
现将参考以下仅用于说明的实施例来描述本发明。以下实施例不旨在完整的定义或以其它方式限定本发明的范围。
DNA操作：除非另有说明，根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中所述标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的由R.D.D Croy编著的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。
实施例1：鉴定与SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：88，或SEQ ID NO：89，或SEQ ID NO：122，或SEQ ID NO：123，或SEQ ID NO：192，或SEQ ID NO：193相关的序列。
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：88，或SEQ ID NO：89，或SEQ ID NO：122，或SEQ ID NO：123，或SEQ ID NO：192，或SEQ ID NO：193相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，在本发明中使用的SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：88，或SEQ ID NO：122，或SEQ ID NO：192所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和启动(set off)过滤以忽略低复杂性序列。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节检索的严格性。例如，增加E-值来显示较少严格性的匹配。藉此鉴定短的接近精确的匹配。
表A1提供了与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的ODC序列相关的序列的列表。
表A1：ODC多肽的实例：
Figure BPA00001277504001061
Figure BPA00001277504001071
Figure BPA00001277504001081
表A2提供了与所用SEQ ID NO：66和/或SEQ ID NO：67序列相关的序列的列表。
表A2：BIHD1多肽序列和编码核酸序列的实例：
Figure BPA00001277504001082
表A3提供了与SEQ ID NO：88和/或SEQ ID NO：89相关核酸序列的列表。
表A3：MYB30核酸和多肽的实例：
Figure BPA00001277504001091
表A4提供了与SEQ ID NO：122和/或SEQ ID NO：123相关核酸序列的列表。
表A4：THOM多肽的实例：
  番茄  137   166
  番茄  138   167
  玉蜀黍  139   168
  毛果杨  140   169
  毛果杨  141   170
  拟南芥  142   171
  拟南芥  143   172
  拟南芥  144   173
  拟南芥  145   174
稻 146 175
  毛果杨  147   176
  稻  148   177
  稻  149   178
  稻  150   179
  稻  151   180
  大豆  152   181
  普通小麦  153   182
  蒺藜苜蓿  154   183
  拟南芥  155   184
  复苏植物(Craterostigma plantagineum)  156   185
  短果茴芹(Pimpinella brachycarpa)  157   186
  拟南芥  158   187
  白麦瓶草(Silene latifolia)  159   188
  毛果杨  160   189
  北美云杉(Picea sitchensis)  161   190
  大豆  162   191
表A5提供了与本发明方法中使用的核酸序列相关核酸序列的列表。
表A5：BIHD2多肽序列和编码核酸序列的例子：
Figure BPA00001277504001111
在一些情况下，序列由研究协会例如基因组研究协会(The Institute for Genomic Research，TIGR)暂时组装并对公众公开。还可以使用真核基因直向同源物(EGO)数据库鉴定这类序列，用目的核酸或多肽序列进行关键词搜索或通过使用BLAST算法进行。在其它情况下，针对具体的生物创建了特定的核酸序列数据库，如由接合基因组协会(Joint Genome Institute)创建的。
实施例2：多肽序列的比对
2.1.ODC多肽序列的比对
使用逐步比对的Clustal W算法(Larking等Bioinformatics.2007Nov 1；23(21)：2947-8.Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施所选的β/α桶脱羧酶多肽序列的比对。默认值为空位开放罚分10，空位延伸罚分0.1，和选定的权重矩阵为Blosum 62。蛋白质比对在图2A中给出。
使用Clustal W程序所提供的邻接聚类算法构建ODC多肽的系统树(图2B)。ODC多肽聚类与其它脱羧酶如ADC，CANSDC和DAPCD分离。
2.2BIHD1多肽序列的比对
使用AlignX算法(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen公司)实施表A2中的所有BIHD1多肽序列的多重序列比对。PFAM同源框结构域PF00046(整合入InterPro登录号IPR0001356)和PFAM POX结构域PF07526(整合入InterPro登录号IPR0006563)鉴定在共有序列下方以X。SKY和VSLTLGL保守性基序也在共有序列下方以X标出。包含在同源域内的三个螺旋在比对序列的顶上通过黑粗线显示。PYP和WF保守性氨基酸通过它们的单个氨基酸密码得到鉴定，其被认为与DNA靶序列直接相互作用。
2.3：MYB30多肽序列的比对
使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序(基于逐步比对的一般Clustal W算法)(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施MYB30多肽序列的比对。默认值如下：空位开放罚分10，空位延伸罚分0.1，和权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的话)。可以进行少量手动编辑以进一步优化比对。MYB30多肽中的序列保守性基本上在多肽的SANT或MYB_DNA结合结构域中，而不是在结构域以外区域中。表A3的MYB30多肽在图9中进行比对。
MYB30多肽系统树的实例在Stracke等2001(拟南芥MYB蛋白)的图2中给出，并在Jiang等2004(拟南芥和稻MYB蛋白)的图8中和补充数据中给出。
2.4.THOM多肽序列的比对
使用ClustalW 2.0算法的逐步比对(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设置(慢比对、相似矩阵：Gonnet、空位开放罚分10、空位延伸罚分：0.2)。可以进行少量手动编辑以进一步优化比对。THOM多肽中的序列保守性基本上在同源框结构域和多肽C-末端部分相关的HALZ亮氨酸拉链结构域中。N-末端HD-ZIP结构域是较不保守的。THOM多肽在图12中进行比对。
2.5.BIHD2多肽序列的比对
使用AlignX算法(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen公司)实施表A5中的所有BIHD2多肽序列的多重序列比对。PFAM同源框结构域PF00046(整合入InterPro登录号IPR0001356)和PFAM POX结构域PF07526(整合入InterPro登录号IPR0006563)鉴定在共有序列下方。GPFTGY盒、SNWFINARV盒、RGLP盒和HFLHPYP保守性盒(或者也称为基序)在共有序列上可通过它们的单个氨基酸密码来鉴定。PYP和WF保守性氨基酸是带有下划线的，其被认为与DNA靶序列直接相互作用。
实施例3：计算全局百分比同一性。
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka提供)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列逐对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。
比较中所用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
多肽序列全长上的全局相似性和同一性软件分析结果在表B1-B4中显示。同一性百分数在对角线之上以粗体给出并且相似性百分数在对角线之下给出(普通字体)。
3.1.鸟氨酸脱羧酶(ODC)序列
与SEQ ID NO：2相比，用于实施本发明方法的表B1的ODC多肽序列之间的同一性百分数可以低到39％氨基酸同一性。
Figure BPA00001277504001151
3.2.BIHD1序列
SEQ ID NO：67所示BIHD1全长多肽序列与表A2中所列其它BIHD1多肽序列之间的同一性百分数是35％或更高。
表B2：表A2的多肽序列全长的全局相似性及同一性的MatGAT结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
  1.Orysa_BIHD1   78   76   46   42   46   37   35   40
  2.Zeama_BEL\样   87   74   44   42   43   36   34   38
  3.Orysa_BEL1II   86   84   47   42   45   36   36   40
  4.Gymco_BIHD1   64   62   64   44   47   39   32   41
  5.Soltu_BEL30   59   58   60   60   58   39   34   40
  6.Vitvi_BEL1 HD   62   59   62   60   71   42   36   42
  7.Medtr_BEL1 HD   56   53   55   59   56   57   32   38
  8.Arath_BHL1   52   52   52   49   49   53   49   34
  9.Arath_BHL6   52   52   54   54   52   53   52   46
3.3.MYB30序列
与SEQ ID NO：89(4.MYB30_1)相比，用于实施本发明方法的MYB30多肽序列之间的同一性百分数可以低到37.8％氨基酸同一性。
表B3：多肽序列全长的全局相似性及同一性的MatGAT结果。
3.4.THOM序列
与SEQ ID NO：123(Le_THOM)相比，用于实施本发明方法的THOM多肽序列之间的同一性百分数可以低到39％氨基酸同一性。
表B4：多肽序列全长的全局相似性及同一性的MatGAT结果。
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11
  1.Pt_40.143   85.3   61.5   59.9   61.0   48.1   46.0   44.4   58.9   56.4   53.8
  2.Pt_II.1260   88.3   57.6   56.5   56.5   44.0   43.2   42.1   55.3   52.7   51.4
  3.Pt_29.72   73.2   70.6   52.4   68.7   46.3   47.3   44.7   56.1   64.2   62.3
  4.SI_TA56840   71.1   68.6   65.2   52.2   46.1   41.7   41.7   51.7   50.7   49.5
  5.SI_TA49906   71.8   68.0   77.2   62.9   46.9   45.1   47.6   52.6   62.7   58.4
  6.Zm_07MC27159   55.4   53.1   54.3   56.6   57.9   38.4   39.1   45.5   44.8   46.8
  7.Pt_XVI.516   57.6   58.1   54.9   52.0   54.9   45.3   86.6   39.8   43.2   41.5
  8.Pt_VI.1202   57.7   58.6   55.5   54.3   58.6   46.0   90.4   42.0   43.6   42.2
  9.At3g60390   74.4   71.8   69.6   62.5   64.4   54.2   53.8   54.3   50.9   48.7
  10.At4g16780   67.1   65.4   75.8   61.5   77.6   54.8   50.6   53.1   63.1   57.7
  11.At5g47370   64.8   63.4   72.5   64.3   69.6   56.8   50.6   53.1   59.9   72.2
  12.At2g44910   71.4   70.4   67.0   63.5   61.9   49.7   53.5   60.1   78.6   61.3   57.9
  13.Os10g41230   62.7   61.8   59.7   56.8   58.8   58.1   52.6   56.4   56.4   56.8   55.2
  14.Pt_286586   63.4   58.6   54.3   54.9   56.8   68.0   43.3   43.9   54.2   55.9   54.3
  15.Os_CAA65456   62.4   61.7   59.8   56.3   59.2   58.2   53.8   57.7   59.9   55.9   54.7
  16.Os_Q84U86   55.2   54.4   56.2   54.9   51.3   49.0   50.0   50.3   52.9   54.2   48.1
  17.Os06g04850   49.0   49.2   54.6   55.2   55.0   57.0   43.6   45.7   48.7   53.4   53.6
  18.Os04g4635012004   56.4   54.0   56.0   57.7   59.3   62.8   45.6   49.1   55.4   57.3   57.1
  19.Gm_06MC31751   57.6   58.8   57.2   55.0   58.8   49.8   55.2   57.1   57.4   50.5   52.7
  20.Ta_ABC86568   55.0   53.1   53.3   55.9   55.4   54.1   46.8   46.6   54.2   55.5   56.4
  21.Mt_DW016069_ps   48.0   46.9   51.7   51.0   53.9   62.2   48.3   53.1   46.2   52.3   52.9
  22.At5g06710   55.7   53.0   54.5   53.0   52.7   45.5   64.2   64.9   56.3   54.5   50.9
  23.Le_THOM   71.1   68.6   65.2   100.0   62.9   56.3   51.7   54.3   63.1   61.5   64.3
Figure BPA00001277504001171
Figure BPA00001277504001181
实施例4：鉴定结构域
蛋白质家族、结构域和位点集成资源(Integrated Resouce of Protein Families，domain and Site，InterPro)数据库是基于文本和序列的检索的通常所用标签数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam数据库是蛋白质家族的大集合，每个由多重序列比对和隐藏的马尔可夫模型(hidden Markov models(HMMs))所代表。蛋白质通常由一个或多个功能区域组成，一般称为结构域。不同结构域的组合产生自然中发现的多种多样的蛋白质。因此蛋白质内进行的结构域鉴定可提供对其功能的了解。Pfam在大不列颠联合王国的Sanger研究所的服务器上提供。Interpro由大不列颠联合王国的欧洲生物信息研究所提供。
4.1.ODC序列
InterPro扫描如SEQ ID NO：2所表示的多肽序列的结果在表C1中示出。
以下Interpro结构域在SEQ ID NO：2中发现：IPR000183(Orn/DAP/Arg脱羧酶)，IPR009006(丙氨酸/消旋酶/组/IV/脱羧酶：C-末端)，IPR 002433(鸟氨酸脱羧酶)。
表C1：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
*PRINTS.Attwood等(2003)Nucleic Acids Research，31(1)，400-402.
**Superfamily Gough等(2001)J Mol Biol.Nov 2；313(4)：903-19。
4.2.BIHD1序列
InterPro扫描如SEQ ID NO：67所表示的多肽序列的结果在表C2中示出。
表C2：SEQ ID NO：67所示多肽序列的InterPro扫描结果
4.3.MYB30序列
InterPro扫描如SEQ ID NO：89所表示的多肽序列的结果在表C3中示出。
表C3：SEQ ID NO：89所示多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
Figure BPA00001277504001202
4.4.THOM序列
InterPro扫描如SEQ ID NO：123所表示的多肽序列的结果在表C4中示出。
表C4：SEO ID NO：123所示多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
Figure BPA00001277504001211
SEQ ID NO：123中保守结构域的存在通过搜索Pfam数据库(Release 1.7)来确定，Finn等Nucleic Acids Research(2008)Database Issue36：D281-D288。
Pfam搜索如SEQ ID NO：193所示多肽序列的结果在表C5中进行详细描述。
表C5
Figure BPA00001277504001221
实施例5：BIHD1多肽序列和BIHD2多肽序列的亚细胞定位预测
蛋白质定位实验方法的范围从免疫定位到使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。例如，在洋葱细胞中使用基于GFP方法和瞬时表达，已经发现稻BIHD1多肽主要定位于植物细胞的核中(Luo等(2005)，见上文)。
还进行了从序列数据对蛋白质定位的计算机预测。本领域技术人员熟知的算法可获得自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute for Bioinformatics)提供的ExPASy蛋白组学工具，例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM和其它。
LOCtree是一种可预测非植物和植物真核生物及原核生物中非膜蛋白质亚细胞定位和DNA结合倾向的算法。LOCtree将真核动物蛋白质归类为五种亚细胞分类的一种，而植物蛋白质则归类为六中分类的一种，原核蛋白质归类为三种分类的一种。
如果可获得结果，LOCtree还报告基于下列的预测：1)通过PredictNLS算法发现的核定位信号，2)使用Prosite基序和Pfam结构域发现在蛋白质中推断的定位，和3)与蛋白质相关的SWISS-PROT关键词。在后两种情况中，定位使用基于熵的LOCkey算法进行推断。软件由美国哥伦比亚大学提供。
基于基序和关键词(使用LOCkey)预测如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽的亚细胞定位：
实施例6：BIHD1多肽序列和BIHD2多肽序列二级结构特征的预测
卷曲螺旋通常包括重复的七氨基酸残基模式，该模式被称为七元重复。卷曲螺旋对于鉴定蛋白质-蛋白质之间的相互作用(如寡聚化)是重要的，该相互作用可以是相同蛋白质的、同一家族蛋白质的或是不相关蛋白质的。最近，在来自序列数据的卷曲螺旋的计算机预测方面已取得很大进展。本领域技术人员熟知的很多算法在ExPASY蛋白组学工具中提供。其中之一，COILS程序，比较序列与已知平行双链卷曲螺旋的数据库并得出相似性评分。通过比较这个分数与球状和卷曲螺旋蛋白质中分数的分布，然后程序计算序列将采用卷曲螺旋构象的概率。
6.1.BIHD1序列
如SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽在检查的所有三个窗口(Window)(14、21和28)中有很高概率具有至少一个预测的卷曲螺旋结构域。在表D中，显示残基坐标、残基、三个窗口和相应概率值。图5是如SEQ ID NO：67所示多肽上COILS算法的图形输出，其中预测的卷曲螺旋在所有三个窗口(如三条线所示)中清晰可见。
表D：如SEQ ID NO：67所示多肽上COILS算法的数字输出。显示残基坐标(#)、残基、三个窗口和相应的概率值。
  #   残基   窗口＝14   概率   窗口＝21   概率   窗口＝28   概率
  259   E   b   0.570   b   0.895   b   0.995
  260   I   c   0.570   c   0.895   c   0.995
  261   S   d   0.808   d   0.991   d   0.996
  262   A   e   0.995   e   0.997   e   0.999
  263   A   f   0.997   f   0.998   f   0.999
  264   E   g   0.997   g   0.999   g   0.999
  265   K   a   0.997   a   0.999   a   0.999
  266   Q   b   0.997   b   0.999   b   0.999
  267   E   c   0.997   c   0.999   c   0.999
  268   L   d   0.997   d   0.999   d   0.999
  269   Q   e   0.997   e   0.999   e   0.999
  270   N   f   0.997   f   0.999   f   0.999
  271   K   g   0.997   g   0.999   g   0.999
  272   M   a   0.997   a   0.999   a   0.999
  273   A   b   0.997   b   0.999   b   0.999
  274   K   c   0.997   c   0.999   c   0.999
  275   L   d   0.997   d   0.999   d   0.999
  276   M   e   0.997   e   0.999   e   0.999
  277   A   f   0.997   f   0.999   f   0.999
  278   M   g   0.978   g   0.999   g   0.999
  279   L   a   0.978   a   0.999   a   0.999
  280   D   b   0.975   b   0.999   b   0.999
  281   E   c   0.975   c   0.999   c   0.999
  282   V   d   0.771   d   0.999   d   0.999
  283   D   e   0.315   e   0.999   e   0.999
  284   R   f   0.261   f   0.999   f   0.999
  285   K   g   0.261   g   0.998   g   0.999
  286   Y   a   0.257   a   0.998   a   0.999
  287   K   b   0.257   b   0.998   b   0.999
  288   H   c   0.075   c   0.972   c   0.999
  289   Y   d   0.027   d   0.899   d   0.999
  290   Y   e   0.019   e   0.228   e   0.998
  291   H   f   0.019   f   0.122   f   0.995
  292   Q   g   0.019   g   0.122   g   0.995
  293   M   a   0.015   a   0.122   a   0.995
  294   Q   b   0.015   b   0.122   b   0.995
  295   I   c   0.002   c   0.021   c   0.883
  296   V   d   0.002   d   0.005   d   0.500
  297   V   e   0.001   e   0.002   e   0.055
6.2.BIHD2序列
BIHD2多肽中卷曲螺旋结构域的存在可通过上述的任何一个技术和方法进行确定。
实施例7：THOM多肽序列的拓扑学预测
TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位(Emanuelsson等，Nature Protocols 2，953-971，(2007))。位置分配是基于任何N端前序列的预测的存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。作为最终预测基础的评分并不是真正的概率，并且它们未必加起来等于一。然而，具有最高评分的位置根据TargetP是最有可能的，并且评分之间的关系(可靠性类别)可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别(RC)范围从1至5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有N端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。
选择了众多参数，如生物组(非植物或植物)、临界设置(无、临界的预定义设置或临界的用户指定设置)和对切割位点预测的计算(是或否)。
如SEQ ID NO：123所表示的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果在表E中显示。已经选择“植物”生物组，未定义临界值并且需要转运肽的预测长度。SEQ ID NO：123所示多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
表E：SEQ ID NO：123所示多肽序列的TargetP 1.1分析；cTP，叶绿体定位的概率；mTP，线粒体定位的概率；SP，分泌途径信号肽的概率；其它，其它定位(细胞质，细胞核)的概率；Loc，预测的定位；RC，可靠性类别
名称    长度  cTP    mTP    SP     其它   Loc  RC
------------------------------------------------------
序列    286   0.414  0.125  0.051  0.538  -   5
------------------------------------------------------
临界值        0.000  0.000  0.000  0.000
当使用PLOC算法(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)时，预测THOM多肽具有细胞核定位。
众多其它算法可以用来执行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学(Technical University of Denmar)服务器上提供的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器上提供的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序(Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor)第1.2版；
·在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器上提供的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上提供的TMHMM；
·PSORT(URL：psort.org)。
实施例8：功能测定
8.1.ODC序列
根据Plant Physiol.第116卷，1998测试SEQ ID NO：2的鸟氨酸脱羧酶活性。简言之，测量24小时期间转基因细胞中放射标记的鸟氨酸的脱羧。使用闪烁计数器测量[U-14C]Orn向标记的腐胺的掺入。Minocha等(1994)的改进方法适合TLC(薄层色谱法)分离，其使用较大量的组织，该方法用于多胺的丹磺酰作用和定量。
8.2.BIHD1序列
用于本发明方法中的BIHD1多肽(至少在其天然形式)通常(但并非必需)具有转录调节活性。DNA-结合活性可使用本领域熟知的技术在体外或在体内容易地确定(例如在Current Protocols in Molecular Biology，卷1和2，Ausubel等(1994)，Current Protocols)。在大肠杆菌中表达的来自稻的重组BIHD1结合至TGTCA基序，该基序是同源域转录因子的特征性顺式元件DNA序列(Luo等(2005)，见上文)。
8.3.MYB30序列
可如Li和Parish(1995)所述测定MYB30蛋白质活性。MYB30编码序列克隆在T7基因10前导序列的框架内并在大肠杆菌中表达。纯化蛋白质并在迁移阻滞实验中分析，使用32P-标记的c-myb结合位点(MBS)和玉米P基因产物的结合位点(PBS)。通过这种方法可以确定MYB30多肽及其部分对MBS和PBS位点的结合特性。
8.4.THOM多肽
可根据Meijer等(2000)和Meijer等(Plant J.11，263-276，1997)实施电泳迁移率变动分析，以稻HD-Zip蛋白质为例：HD-Zip cDNA序列克隆在大肠杆菌表达载体中的GST-编码序列框架内。含有表达构建体的过夜大肠杆菌培养物(100ml)通过添加IPTG至0.1mM进行诱导。在37℃培养2小时后，沉淀细胞，在1ml NET-N缓冲液(20mM TRIS-HCl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％Nonidet-P40，1mM PMSF，0.5μM胰蛋白酶抑制剂，1μM亮抑蛋白酶肽)中重悬浮，并用温和超声裂解。离心后，将400μl澄清提取物加到在NET-N缓冲液中的150μl的50％谷胱甘肽-琼脂糖4B(Pharmacia)浆液中。在4℃孵育60分钟后，用NET-N缓冲液洗四次琼脂糖珠。然后通过与在pH8的50mM TRIS-HCl缓冲液中的300μl还原型谷胱甘肽(10mM)室温孵育15分钟来洗脱GST融合蛋白，并在添加甘油至10％后在液氮中冷冻。在10 1μl核提取缓冲液中EMSA反应包含3μg大肠杆菌蛋白质提取物，0.1ng32P-末端标记探针AH1(CAATAATTG)，不同量的竞争DNA和3μg聚-(dldC)-聚-(dldC)。反应混合物在室温孵育20分钟，随后加载到在0.5×Tris-硼酸盐/EDTA缓冲液中，电压(10V cm-1)下的5％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5∶1)胶上。胶在Whatman DE81纸上进行干燥和放射自显影。
8.5.BIHD2序列
用于本发明方法中的BIHD2多肽(至少在其天然形式)通常(但并非必需)具有转录调节活性。DNA-结合活性可使用本领域熟知的技术在体外或在体内容易地确定(例如在Current Protocols in Molecular Biology，卷1和2，Ausubel等(1994)，Current Protocols)。在大肠杆菌中表达的来自稻的重组BIHD1结合至TGTCA基序，该基序是同源域转录因子的特征性顺式元件DNA序列(Luo等(2005)，见上文)。
实施例9：基因克隆和表达载体构建
除非另外说明，否则根据以下所述的标准方法进行重组DNA技术：(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols的第1和2卷。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
9.1.ODC序列
使用定做的烟草幼苗cDNA文库作为模板通过PCR扩增本发明方法中所用的核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。所用的引物是SEQ ID NO：59；有义：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaag caggcttaaacaatggccggccaaaca-3’和SEQ ID NO：60；反向，互补：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttacaggtggttcatcagcttg-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pNicta_ODC。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：61)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，产生的表达载体pGOS2::Nicta_ODC(图3)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
与上述的克隆方法相似，使用定做的莱茵衣藻cDNA文库作为模板通过PCR扩增SEQ ID NO：62。所用的引物是：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaaggaattgccaactc-3’(有义)和5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaatcgcgaagtgctgtcac-3’(互补)。通过LR重组步骤将SEQ ID NO：62转移至表达载体pGOS2：Chlre_ODC，其中Chlre_ODC的表达在GOS2启动子的控制下。
9.2.BIHD1序列
使用来自从不同生长阶段和在不同生长情况下的稻提取的mRNA合成的cDNA作为模板，通过PCR扩增SEQ ID NO：2所示编码BIHD1多肽序列的稻cDNA。使用下列引物(包含用于Gateway重组的AttB位点)用于PCR扩增：prm08627(SEQ ID NO：68，有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcagg cttaaacaatggctacttactactcgag-3’和prm08628(SEQ ID NO：69，反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaggccacaaaatcat-3’。
在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。也使用标准方法扩增预计长度(包含attB位点)的PCR片段并纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为Gateway
Figure BPA00001277504001291
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：66的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。两个表达载体区别在启动子，用于后期胚胎特异性表达的稻WSI18启动子(SEQ ID NO：84)位于这种Gateway盒的上游。在第二个表达载体中，用于种子特异性表达的另一个启动子，稻RAB21启动子(SEQ ID NO：85)，位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，根据本领域已知技术将所得的用于种子特异性表达的表达载体(图5)独立地转化至农杆菌菌株LBA4044。
9.3.MYB30序列
使用定做的拟南芥幼苗cDNA文库(pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增MYB30_1的核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。所用的引物是SEQ ID NO：116(有义)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccatgtgattaaagcaaactcttca-3’和SEQ ID NO：117(反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccatgtgattaaagcaaactcttca-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pMYB30。质粒pDONR201作为Gateway
Figure BPA00001277504001301
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：88的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于在绿色组织中表达的稻原叶绿素酸酯还原酶启动子(pPcR)(SEQID NO：118)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，根据本领域已知技术将所得表达载体pPcR::MYB30(图10)转化至农杆菌菌株LBA4044。
9.4.THOM多肽
使用定做的番茄幼苗cDNA文库(pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增本发明方法中使用的核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。所用的引物是prm10162(SEQID NO：132；有义，起始密码为粗体)：5’-gggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgag tagtgaaaaagaagatgg-3’和prm10163(SEQ ID NO：133；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacggatccatatttatctttc-3’，引物包含用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pTHOM。质粒pDONR201作为Gateway
Figure BPA00001277504001311
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：122的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：131)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，根据本领域已知技术将所得表达载体pGOS2::THOM(图13)转化至农杆菌菌株LBA4044。
9.5.BIHD2多肽
使用来自从不同生长阶段和在不同生长情况下的紫苜蓿(Medicago sativa)提取的mRNA合成的cDNA作为模板，通过PCR扩增SEQ ID NO：193所示编码BIHD2多肽序列的紫苜蓿cDNA。使用下列引物用于PCR扩增，其包含用于Gateway重组的AttB位点：prm08627(SEQ ID NO：212，有义)：5’-ggggacaagttt gtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctgaggagggtttt-3’和prm08628(SEQ ID NO：213，反向，互补)：5，-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttgcttagtta gtggattgaagat-3’。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。也使用标准方法扩增预计长度(包含attB位点)的PCR片段并纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：192的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。该表达载体的GOS2启动子(SEQ ID NO：245)用于后期胚胎特异性表达，位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，根据本领域已知技术将所得的用于组成型表达的表达载体(图15)独立地转化至农杆菌菌株LBA4044。
实施例10：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育一分钟，随后在0.2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚胎发生的，来自小盾片的愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上继代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上继代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下培育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4至5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。
对一个构建体而言产生约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米(玉蜀黍)的转化根据Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改进方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改进方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜/芸苔转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培育的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种(含有表达载体的)农杆菌。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
紫苜蓿(Medicago sativa)的再生性克隆使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天。外植体在半强度(half-strength)Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花盆内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
棉花转化
根据US 5,159,135中所述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面灭菌20分钟，并以含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水洗涤。接着将种子转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中进行萌发。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，剪成0.5cm的片并置于0.8％琼脂上。用农杆菌悬液(约108个细胞/ml，从转化有目的基因和适当选择标记的过夜培养物稀释而成)接种下胚轴外植体。室温光照3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其带有包含B4维生素的Murashige和Skoog盐(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCL2，并含有50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素以杀死残余细菌。2至3个月(每4至6周继代培养)后分离单个细胞系，并在选择培养基上进一步培养进行组织扩增(30℃，16小时光周期)。接着在非选择培养基上将转化组织再培养2至3个月，以产生体细胞胚。将至少4mm长的表观健康的胚转移至管中，其中含有细蛭石中的SH培养基，并补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6糠胺嘌呤和赤霉酸。以16小时光周期在30℃下培养胚，并将2至3叶期的小植株转移至含有蛭石和养分的盆中。植物变硬并接着移至温室中进一步培养。
实施例11：表型评价方法
11.1评价设置
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70％。定期给生长于非胁迫条件下的植物浇水，以确保水和养分不受限制，从而满足植物完成生长和发育的需要。
4个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评价，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
干旱筛选
在正常培养条件下在盆土中培养来自T2种子的植物，直至到达抽穗阶段。接着将其转移至停止浇水的“干旱”部分。在随机选择的盆中插入湿度探测器，以检测土壤含水量(SWC)。当SWC降至一定阈值之下时，自动对植物持续再浇水直至再次达到正常水平。接着将植物再转移至正常条件。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。
氮使用效能筛选
在除营养液以外均为正常的条件下在盆土中培养来自T2种子的稻植物。从移植到成熟均使用特定的营养液对盆浇水，其中含有降低的氮(N)含量，通常降低7至8倍。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。
盐胁迫筛选
在由椰子纤维和argex(3∶1比例)构成的基质上培养植物。在将小植株移植到温室后的前两周使用正常营养液。前两周之后，向营养液中加入25mM盐(NaCl)，直至收获植物。随后测量种子相关参数。
11.2统计分析：F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
由于实施的是具有相互重叠事件的两个实验，对此进行组合分析。这可用来检验两次实验效果的一致性，如果一致，可积累两个实验的证据以提高结论的置信度。所用的方法是混合模型法，考虑了数据的多级结构(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布获得P值。
11.3测量的参数
生物量相关的参数测量
从播种期直至成熟期，使植物通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方毫米表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加被表述为总根生物量(测量为植物寿命中观察到的根的最大的生物量)的增加；或者表述为根/苗指数(测量为根和苗活性生长期中根质量和苗质量的比例)的提高。
早期萌发势通过计数在来自植物地上部分的区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方毫米表达的物理表面值。以下描述的结果是用于萌发后三周的植物。
种子相关参数的测量
将成熟的原圆锥花序(primary panicle)收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒(husk)与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量和地上面积(mm2)之间的比值再乘以因子106。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟的原圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以a％表示)。
实施例12：转基因植物的表型评价结果
12.1ODC序列
如在T1和T2世代中评价的，对转基因稻植物的评价结果示于下文，该转基因稻植物在非胁迫条件下表达Nicta_ODC(SEQ ID NO：1)核酸。观察到地上生物量(AreaMax)、出苗萌发势(早期萌发势或EmerVigor)、总种子产量、饱满种子数和每株植物的总种子数至少增加5％(表F1)。
表F1
  参数   转基因植物中相对于对照植物的增加％
  地上生物量(AreaMax)   11
  出苗萌发势(EmerVigor)   30
  总种子产量(totalwgseeds)   12
  饱满种子数(nrfilledseed) 11
每株植物的总种子产量(nrtotalseed) 14
氮使用效率筛选
在除营养液以外均为正常的条件下在盆土中培养来自T2种子的稻植物。从移植到成熟均使用特定的营养液对盆浇水，其中特定营养液含有降低的氮(N)含量，通常降低7至8倍。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和产量参数。
在氮使用效率条件下表达Chlre_ODC核酸(SEQ ID NO：62)的转基因稻植物的评价结果示于下文(表F2)。观察到种子总重量、饱满种子数、饱满率、收获指数和千粒重的增加。
表F2.用pChlre_ODC转化的转基因植物的评价
  参数   转基因植物相对于对照植物的增加％
  地上生物量   30.8
  出苗萌发势   33.4
Figure BPA00001277504001401
13.2.BIHD1序列
在稻WSI18启动子的控制下
T2世代转基因稻植物的评价结果示于下文，该转基因稻植物在用于种子特异性表达的WSI18启动子控制下表达编码SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽的核酸序列，并在正常生长条件下生长。
与相应的失效合子(对照)相比，转基因植物的早期萌发势、每株植物的总种子产量、饱满种子数、种子总数和收获指数均增加，如表G中所示。
表G：T2世代转基因稻植物评价结果，该植物在用于种子特异性表达的WSI18启动子控制下表达编码SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽的核酸序列。
  性状  T2世代中4个事件的总体平均增加％
  早期萌发势  24％
  每株植物的总种子产量  13％
  饱满种子数  14％
  种子总数  13％
  收获指数  8％
在稻RAB21启动子的控制下
在用于种子特异性表达的稻RAB21启动子的控制下，表达编码SEQID NO：67所示BIHD1多肽的核酸序列的转基因稻植物表现出下列产量相关性状的肯定趋势：早期萌发势、每株植物的总种子产量、饱满种子数、种子总数和收获指数。
13.3.MYB30序列
在正常培养条件下在盆土中培养来自T2种子的植物，直至到达抽穗阶段。接着将其转移至停止浇水的“干旱”部分。在随机选择的盆中插入湿度探测器，以检测土壤含水量(SWC)。当SWC降至一定阈值之下时，自动对植物持续再浇水直至再次达到正常水平。接着将植物再转移至正常条件。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和产量参数。
在上述干旱胁迫条件下表达MYB30核酸的转基因稻植物的评价结果示于下文。显示地上生物量(AreaMax)和出苗萌发势(早期萌发势)总体增加大于5％(表H)。
表H.表达MYB30核酸的转基因稻植物的评价结果
  参数   转基因植物相对于失效合子对照的增加％
  出苗萌发势(Emervigor)   19.9
13.4.THOM序列
在非胁迫条件下表达THOM核酸的转基因稻植物的评价结果示于下文。观察到总种子产量、饱满种子数、收获指数和千粒重的显著增加(表I)。
表I：
  T1植物   T2植物
  参数   总体增加％   总体增加％
  总种子产量   20.3   39.7
  饱满种子数   16.9   30.4
  收获指数   11.3   11.8
  千粒重   2.6   2.4
13.5.BIHD2多肽
干旱筛选
在正常培养条件下在盆土中培养来自T2种子的植物，直至到达抽穗阶段。接着将其转移至停止浇水的“干旱”部分。在随机选择的盆中插入湿度探测器，以检测土壤含水量(SWC)。当SWC降至一定阈值之下时，自动对植物持续再浇水直至再次达到正常水平。接着将植物再转移至正常条件。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和产量参数。
在GOS2启动子的控制下
T1世代转基因稻植物的评价结果示于下文，该转基因稻植物在用于组成型表达的稻GOS2启动子控制下表达编码SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽的核酸序列，并在如上所述干旱筛选条件下生长(表J)。
表J：
  产量性状   转基因植物中相对于对照植物的增加％
  开花时间   5.3
  总种子产量   37.1
  饱满率   54.9
  收获指数   49.0
  饱满种子数   31.1
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Claims (21)

1.用于相对于对照植物增强和/或增加植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码下述多肽的核酸序列在植物中的表达，以及任选地选择具有增强的产量相关性状的植物，所述多肽为鸟氨酸脱羧酶多肽、或苯并噻二唑诱导的同源域1(BIHD1)多肽、或MYB30多肽、或THOM多肽、或苯并噻二唑诱导的同源域2(BIHD2)多肽，其中所述BIHD1多肽与SEQ ID NO：67所示BIHD1多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性，其中所述MYB30多肽包含至少一个SANT结构域，其中所述THOM多肽包含(i)“N-末端HD-ZIP”亮氨酸拉链结构域，(ii)同源框结构域，(iii)与同源框结构域相关的HALZ亮氨酸拉链结构域，其中所述BIHD2多肽与SEQ ID NO：193所示BIHD2多肽以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶多肽，当其用于构建α/β桶状折叠碱性氨基酸脱羧酶多肽的系统树时，与包含鸟氨酸脱羧酶的进化枝聚类，而不是与包含精氨酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱羧酶、或羧基去亚精胺脱羧酶多肽的进化枝聚类。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述鸟氨酸脱羧酶多肽包含一种或多种下列序列：
(i)与表A1的任何多肽的氨基酸序列具有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性；
(ii)与实施例4表C1中所列的任何结构域的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性；
(iii)与基序1的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序1为：
[N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG(SEQ ID NO：51)；
(iv)与基序2的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序2为：
[K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S](SEQ ID NO：52)；
(v)与基序3的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序3为：
RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHHP(SEQ ID NO：53)；
(vi)与基序4的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序4为：
EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT(SEQ ID NO：54)；
(vii)与基序5的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序5为：EYVLSLG[V/I]SPD(SEQ ID NO：55)；
(viii)与基序6的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序6为：
AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A](SEQ IDNO：56)；
(ix)与基序7的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序7为：
[G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM[V/L]SIITQKLQD[E/D](SEQ ID NO：57)；
(x)与基序8的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，基序8为：QT[V/I]IVSGLNPAAILQ(SEQ ID NO：58)。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入并表达编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸来实现。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸编码表A1中所列任一蛋白质，或是所述核酸的一部分，或能与所述核酸杂交的核酸，或其互补序列。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的苗生物量和/或种子产量。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在氮缺乏的培养条件下获得。
9.根据权利要求4至8中任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸为植物来源，优选来自双子叶植物，还优选来自茄科，最优选来自烟草。
11.通过前述权利要求中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码鸟氨酸脱羧酶多肽的重组核酸。
12.构建体，其包含
(i)编码权利要求1、2或3中定义的鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸；
(ii)能驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；以及任选的
(iii)转录终止序列。
13.根据权利要求12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
14.根据权利要求12或13的构建体在产生与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物的方法中的用途。
15.转化有根据权利要求12或13的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
16.产生与对照植物相比具有增加的产量，优选增加的种子产量的转基因植物的方法，包括
(i)在植物中引入和表达编码如在权利要求1、2或3中定义的鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；和任选地
(iii)选择具有增强的产量相关性状的植物。
17.由于编码如权利要求1、2或3中定义的鸟氨酸脱羧酶多肽之核酸经调节的表达而与对照植物相比具有增加的产量，特别是增加的生物量的转基因植物，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
18.根据权利要求11、15或17的转基因植物或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
19.根据权利要求18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗生物量和/或种子。
20.来自根据权利要求20的植物和/或来自根据权利要求20的植物的可收获部分的产品。
21.编码鸟氨酸脱羧酶多肽的核酸在植物中相对于对照植物增加产量的用途，特别是增加苗和/或生物量的用途。
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