DE112009000705T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, oder ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (BIHD1)-Polypeptid, wobei das BIHD1-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, aufweist, oder ein MYB30-Polypeptid, wobei das MYB30-Polypeptid mindestens eine SANT-Domäne umfasst, oder ein THOM-Polypeptid, wobei das THOM-Polypeptid (i) eine ”N-terminale HD-ZIP”-Leucin-Zipper-Domäne, (ii) eine Homeobox-Domäne, (iii) eine mit der Homeobox-Domäne assoziierte HALZ-Leucin-Zipper-Domäne umfasst, oder ein Benzothiadiazolinduziertes Homeodomäne 2 (BIHD2)-Polypeptid, wobei das BIHD2-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert, aufweist, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase(ODC)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein ODC-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen- der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (BIHD1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30 codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein THOM(Tomate-Homeobox)-Protein codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 2 (BIHD2)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
• Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
• Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten dar, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
• Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
• Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais (Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
• Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
• Ein anderes Merkmal von Bedeutung ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelemente und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Erhöhung und/oder Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
• Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
• Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
• Eine Vorgehensweise zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften und/oder des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
• Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase(ODC)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze moduliert.
• In einer anderen Ausführungsform ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1(BIHD1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen und erhöhtem Ernteindex.
• In noch einer anderen Ausführungsform ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen gesteigert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30 in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert.
• In noch einer anderen Ausführungsform ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene Wachstumscharakteristika in Pflanzen durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein THOM(Tomate-Homeobox)-Protein in einer Pflanze codiert, verbessert werden können.
• In einer weiteren Ausführungsform ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 2(BIHD2)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen und erhöhtem Ernteindex.
• Hintergrund
• Ornithin-Decarboxylase (ODC)
• Polyamine sind basische aliphatische Kohlenwasserstoff-Verbindungen mit zwei oder mehr Aminogruppen. Polyamine sind ubiquitäre natürliche Substanzen, die im Organismus mit mehr als 20 beschriebenen Typen vorkommen. Beispiele von Polyaminen sind Spermin, Spermidin und Putrescin. Biologische Rollen, die Polyaminen in Pflanzen zugeschrieben werden, beinhalten den Schutz der Zelle während abiotischem Stress und die Förderung von Nukleinsäure- oder Proteinbiosynthese. Enzyme, die essentielle Schritte in der Polyaminbiosynthese katalysieren, schließen Spermin-Synthase, Spermidin-Synthase (SPDS) und mehrere Basische-Aminosäure-Decarboxylasen vom beta/alpha-Barrel-gefalteten Typ, wie Ornithin-Decarboxylasen (ODC), Arginin-Decarboxylase (ADC), S-Adenosylmethionin-Decarboxylase (SAMDC), Diaminopimelat-Decarboxylase (DAPCD) und Carboxynorspermidin-Decarboxylase (CANSDC), ein. Gene, welche derartige Enzyme codieren, sind aus prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, einschließlich Pflanzen, isoliert worden. Beta/alpha-barrel-gefaltete Decarboxylasen segregieren hinsichtlich ihrer Phylogenie in vier unterschiedliche Gruppen, die ADCs, DAPDCs, ODCs und CANSDCs enthalten (Lee et al. 2007. The Journal of Biological Chemistry Bd. 282, 27115–27125). Diese Enzyme bilden Homodimere. Zwei identische aktive Stellen werden an der Dimer-Grenzfläche zwischen der N-terminalen Domäne aus einer Untereinheit und der C-terminalen Domäne aus der anderen gebildet.
• Ornithin-Decarboxylase oder L-Ornithin-Carboxy-Lyase katalysiert die Decarboxylierung von L-Ornithin unter Erzeugung von Putrescin und CO₂. ODCs werden in Prokaryoten und eukaryotischen Organismen gefunden. Die Nomenklatur, die ODC von der ”International Union Of Biochemistry And Molecular Biology” zugeordnet wurde, ist EC 4.1.1.17.
• Es wurden beträchtliche Forschungsanstrengungen zum Verstehen der Expression von mit dem pflanzlichen Polyaminstoffwechsel zusammenhängenden Genen in Antwort auf Stressformen und die Verwendung derartiger Gene zur Veränderung der Polyaminkonzentration in einer Zelle unternommen. Zum Beispiel veränderte die Expression einer Maus-ODC in Karotte oder eines menschlichen ODC in transgenen Reispflanzen die Polyamin-Pools in der transgenen Pflanze (Bastola und Minocha 1995. Plant Physiol. 1995. 109(1): 63–71. Lepri et al; 2001, Mol. Genet. Genomics, Okt. 2001; 266(2): 303–12.). Die Immunmodulation von ODC in Tabakpflanzen führte, so wurde berichtet, zu veränderten Polyaminspiegeln und Entwicklungsabnormalitäten und Zwergenwuchs-Phänotypen bei den transgenen Pflanzen. (Nolke et al; 2005. Plant Biotechnology J. 3(2): 237–47). Die Expression einer cDNA, welche eine Maus-ODC codiert, in Tabak erhöhte die Putrescin-Spiegel (Descenzo und Minocha (1993) Plant Mol. Biol. 22, 113–127). In dieser Untersuchung wiesen die meisten Transformanten-Pflanzen ein normales Aussehen auf, obwohl diejenigen, welche hohe Spiegel an Putrescin akkumulierten, ein verkümmertes Wachstum, faltige Blätter und Blüten mit reduzierten Staubblättern aufwiesen.
• Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen erhöhte Frühwuchskraft, erhöhten Samenertrag und erhöhte Biomasse.
• Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne-Protein 1 (BIHD1)
• DNA-bindende Proteine sind Proteine, welche Beliebige von vielen DNA-Bindungsdomänen umfassen und somit eine spezifische oder allgemeine Affinität für DNA besitzen. DNA-bindende Proteine schließen zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, welche den Vorgang der Transkription modulieren, Nukleasen, welche DNA-Moleküle spalten, sowie Histone, welche an der DNA-Verpackung im Zellkern beteiligt sind, ein.
• Transkriptionsfaktoren sind üblicherweise als Proteine definiert, welche sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität aufzeigen und welche zum Aktivieren und/oder Unterdrücken von Transkription in der Lage sind. Das Genom von Arabidopsis thaliana codiert mindestens 1533 transkriptionelle Regulatoren, was ~5,9% seiner geschätzten Gesamtzahl an Genen ausmacht (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die ”Datenbank der Reis-Transkriptionsfaktoren” (DRTF) ist eine Sammlung von bekannten und vorhergesagten Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica, und enthält derzeit 2025 putative Transkriptionsfaktor(TF)-Genmodelle in indica und 2384 in japonica, die in 63 Familien verteilt sind (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10): 1286–7).
• Eine dieser Familien ist die Überfamilie der Homeodomäne(HD)-Transkriptionsfaktoren, welche bei vielen Aspekten von Entwicklungsprozessen beteiligt sind. HD-Transkriptionsfaktoren sind durch das Vorhandensein einer Homeodomäne (HD) gekennzeichnet, welche eine 60 Aminosäuren große DNA-Bindungs-Domäne (BD) ist. Arabidopsis thaliana und Reis enthalten ungefähr 100 HD-Transkriptionsfaktoren, welche basierend auf Aminosäuresequenz-Identität weiter in Subfamilien klassifiziert werden können (Richardt et al. (2007) Plant Phys. 143(4): 1452–1466). Einige dieser Subfamilien sind durch das Vorhandensein von zusätzlichen konservierten Domänen gekennzeichnet, welche DNA-Bindung und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen erleichtern.
• Eine dieser Subfamilien ist die BEL1(BELL-1)-Subfamilie (Reiser et al. (1995), Cell 83: 735–742), benannt nach einer Arabidopsis-Mutante bell 1 mit mangelhafter Integument-Ausbildung. BEL1-Transkriptionsfaktoren sind, zusätzlich zur Homeodomäne, durch eine konservierte Domäne gekennzeichnet, welche als die POX-Domäne bezeichnet wird, die ausschließlich in Pflanzenproteinen gefunden wird. Zwei Motive kennzeichnen BEL1-Polypeptide weiterhin: die SKY-Box und die VSLTGL-Box, die nach den konservierten Aminosäureresten benannt sind, welche sie umfassen.
• Ein Gen, welches ein BEL1-Homeodomänen-Polypeptid codiert, wurde aus Oryza sativa isoliert, und es wurde gezeigt, dass seine Expression nach Behandlung mit Benzothiadiazol (BTH), einem Molekül, das zum Induzieren von Krankheitsresistenz fähig ist, erhöht ist, jedoch ebenfalls nach Inokulation mit Magnaporthe grisea-Pathogen (Luo et al. (2005) Plant Biol. 7: 459–468). Es wurde Oryza sativa Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (OsBIHD1) genannt. Das Gen wurde in Tabak unter Verwendung des CaMV-35S-Promotors überexprimiert (Luo et al. (2005) J. Ex. Bot. 56(420): 2673–2682). Transgene Tabakpflanzen zeigten eine gesteigerte Krankheitstoleranz und in einigen Fällen ausgekeimte Apikalknospen, abnorme Wurzeln, verringerte Fruchtbarkeit oder Unfruchtbarkeit.
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne-Protein 1 (BIHD1) codiert, Pflanzen ergibt, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, in einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen und erhöhtem Ernteindex.
• MYB30-Protein
• MYB-Domänen-Proteine sind Transkriptionsfaktoren mit einer hochkonservierten DNA-bindenden Domäne. Die MYB-Domäne wurde ursprünglich in dem Onkogen (v-myb) von Vogel-Myeloblastose-Virus beschrieben (Klempnauer et al. (1982) Cell 33, 453–63). Viele Wirbeltiere enthalten drei Gene, die mit v-Myb, c-Myb, A-Myb und B-Myb verwandt sind, und weitere ähnliche Gene sind in Insekten, Pflanzen, Pilzen und Schleimpilzen indentifizert worden. Die codierten Proteine sind entscheidend für die Steuerung von Proliferation und Differenzierung in einer Reihe von Zelltypen. MYB-Proteine enthalten ein bis vier unperfekte direkte Repeats bzw. Wiederholungen einer konservierten Sequenz von 50–53 Aminosäuren, welche eine Helix-Turn-Helix-Struktur codiert, die an der DNA-Bindung beteiligt ist (Rosinski und Atchley (1998) J. Mol. Evol. 46, 74–83). Drei voneinander regulär beabstandete Tryptophanreste, welche ein Tryptophan-Cluster in der dreidimensionalen Helix-Turn-Helix-Struktur ausbilden, sind charakteristisch für einen MYB-Repeat. Die drei Repeats in c-Myb werden als R1, R2 und R3 bezeichnet; und Repeats von anderen MYB-Proteinen werden gemäß ihrer Ähnlichkeit mit R1, R2 oder R3 kategorisiert. MYB-Proteine können in drei Subfamilien klassifiziert werden, abhängig von der Anzahl von aneinandergrenzenden Repeats in der MYB-Domäne (eine ”MYB1R”, zwei ”R2R3-Typ MYB”, drei ”MYB3R”). Da es wenig Sequenzkonservierung außerhalb der MYB-Domäne gibt, sind MYB-Proteine in Subgruppen eingeordnet bzw. geclustert worden, basierend auf konservierten Motiven, welche außerhalb der MYB-codierenden Region identifiziert wurden (Stracke et al. 2001. Curr. Opin. Plant. Biol., Okt.; 4(5): 447–56; Jiang et al. (2004) Genome Biology 5, R46). Im Gegensatz zu Tieren enthalten Pflanzen eine MYB-Protein-Subfamilie, welche durch die R2R3-Typ-MYB-Domäne gekennzeichnet ist.
• Es wurde vorgeschlagen, dass pflanzliche Myb-Gene wichtige Rollen bei der Regulierung des Sekundär-Stoffwechsels, der zellulären Morphogenese, der Pathogen-Resistenz und bei Antworten auf Wachstumsregulatoren und Stress spielen. Zusätzlich offenbart WO 2007099096 ein Reis-MYB4-Protein, welches nützlich zur Erhöhung des Samenertrages bei Pflanzen ist.
• Die MYB30-Klasse von Transkriptionsfaktoren bildet eine Subgruppe von Myb-Proteinen, welche einen gemeinsamen evolutionären Ursprung teilen und der Gruppe G09 entsprechen, welche von Jiang et al., 2004, berichtet wurde. Gene, welche einige Mitglieder der MYB30-Klasse von Proteinen codieren, sind mit physiologischen Antwortreaktionen in Schließzellen und der Aktivierung der hypersensitiven Zelltod-Antwort bei Arabidopsis thaliana in Zusammenhang gebracht worden (Cominelli et al., Curr. Biol. 2005 15(13): 1196–200; Rivas und Roby, FEBS Lett. 2006. 580(14): 3498–504). Die Akkumulierung von extrazellulären VLCFA(very-long-chain fatty acids)-abgeleiteten Metaboliten (Blatt-epidermale Wachskomponenten) war in MYB30-Knockout-Mutanten und überexprimierenden Linien in Arabidopsis thaliana betroffen bzw. beeinträchtigt (Vailleau et al. 2008. Plant Cell; 7. März ["Epub" vor der Drucklegung].).
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein MYB30-Poylpeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter vegetativer Biomasse und erhöhter Emergenz-Wuchskraft im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren für gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen erhöhte Biomasse und erhöhte Emergenz-Wuchskraft.
• Tomate-Homeodomäne (THOM)
• Homeodomäme-Leucin-Zipper(HDZip)-Proteine bilden eine Familie von Transkriptionsfaktoren, welche durch die Gegenwart einer DNA-bindenden Domäne (HD) und eines angrenzenden Leucin-Zipper(Zip)-Motives gekennzeichnet sind. Die Homeodomäne besteht üblicherweise aus 60 konservierten Aminosäureresten, welche einen Helix1-Schleife-Helix2-Turn-Helix3 ausbilden, der DNA bindet. Diese DNA-Bindungsstelle ist üblicherweise pseudopalindromisch. Der Leucin-Zipper, der benachbart zum C-terminalen Ende der Homeodomäne ist, besteht aus mehreren Heptaden-Repeats (mindestens vier), in denen üblicherweise ein Leucin (gelegentlich ein Valin- oder ein Isoleucin) an jeder siebten Aminosäure auftritt. Der Leucin-Zipper ist wichtig für die Proteindimerisierung. Diese Dimerisierung ist eine Voraussetzung für die DNA-Bindung (Sessa et al. (1993) EMBO J. 12(9): 3507–3517) und kann zwischen zwei identischen HDZip-Proteinen (Homodimer) oder zwischen zwei unterschiedlichen HDZip-Proteinen (Heterodimer) vonstattengehen.
• Homeodomäne-Gene sind in allen Eukaryoten vorhanden und bilden eine Genfamilie von mindestens 89 Mitgliedern in Arabidopsis thaliana. Der Leucin-Zipper wird an sich auch in von Pflanzen verschiedenen Eukaryoten gefunden. Allerdings ist das Vorhandensein sowohl einer Homeodomäne als auch eines Leucin-Zippers pflanzenspezifisch (vorgefunden in mindestens 47 der 89 Proteine in Arabidopsis), und ist in Moos ebenso wie in Gefäßpflanzen angetroffen worden (Sakakibara et al. (2001) Mol. Biol. Evol. 18(4): 491–502, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist). Der Leucin-Zipper ist dann am C-terminalen Ende der Homeodomäne lokalisiert, wobei diese zwei Merkmale um drei Aminosäuren überlappen.
• Die Arabidopsis HDZip-Gene sind in vier unterschiedliche Klassen, HDZip I bis IV, basierend auf Sequenzähnlichkeits-Kriterien klassifiziert worden (Sessa et al., in: Plant Molecular Biology (NATO ASI Series, Band H81), S. 412–426, 1994). HD-Zip I- und II-Gene sind wahrscheinlich in den Signaltransduktions-Netzwerken von Licht, Dehydratations-induziertem ABA oder Auxin verwickelt. Diese Signaltransduktions-Netzwerke stehen mit der allgemeinen Wachstumsregulierung von Pflanzen in Zusammenhang. Die Überexpression von Sense- oder Antisense-HD-Zip I- oder II-mRNA verändert für gewöhnlich die Wachstumsrate und die Entwicklung. Die meisten Mitglieder der HD-Zip III-Subfamilie spielen Rollen in der Zelldifferenzierung in der Stele bzw. den Leitbündeln. HD-Zip IV-Gene stehen in Verbindung mit der Differenzierung der äußersten Zellschicht (Sakakibara et al., 2001).
• Mehrere Mitglieder der eng verwandten HD-Zip I- und II-Familien sind mit Auxin-Signalleitung und Transport in Zusammenhang gebracht worden. HDZip I- und II-Gene sind auch mit Licht-Signalleitungs-Antwortreaktionen, einschließlich Schattenvermeidung, De-Etiolierung von im Dunkeln gewachsenen Keimlingen und Blaulicht-Signalleitung, in Verbindung gebracht worden. Darüber hinaus gibt es zunehmende Beweise, dass viele HD-Zip I- und II-Gene mit der Regulierung der Entwicklungsadaption an Umweltstress-Bedingungen, wie Dürre, in Zusammenhang stehen; für eine Übersicht siehe Agalou et al., Plant Molecular Biology 66, 87–103, 2008. Durch zufällige Bindungsstellen-Selektion in vitro wurde gezeigt, dass die bevorzugte Erkennungsstelle für das Arabidopsis-HD-Zip-Familie I-Protein, Athb-1, aus zwei 5-bp großen Halbstellen aufgebaut ist, welche sich an einer zentralen Position überlappen, CAAT(A/T)ATTG (Sessa et al., EMBO J. 12, 3507–3517, 1993). Das HD-Zip II-Protein Athb-2 interagiert mit einer ähnlichen 9-bp-Sequenz, zeigt jedoch eine Präferenz für ein G/C-Basenpaar an der zentralen Position. Es wurde gezeigt, dass diese Präferenz durch das Vorhandensein von Glu- und Thr-Resten an den Positionen 46 und 56 der 60-Aminosäuren-Homeodomäne festgelegt ist, wo HD-Zip I-Proteine charakterischerweise jeweils einen Ala- bzw. einen Trp-Rest enthalten (Sessa et al. J. Mol. Biol. 274, 303–309, 1997). THOM1 aus Tomate (Meisner und Theres, Planta 195, 541–547, 1995) ist im vegetativen Sproß-Apikalmeristem, dem Blütenmeristem und den Achselmeristemen in hohem Maße exprimiert. Junge Derivate dieser Meristime zeigen ähnliche Spiegel an THOM1-Transkripten, welche mit zunehmendem Alter des jeweiligen Gewebes sinken. Von HB-4, einem Mitglied der HD-Zip-Klasse II-Proteine, und homolog zu THOM, wurde gezeigt, dass es in Arabidopsis durch eine Behandlung mit Fernrot-reichem Licht induziert wird; wohingegen HB-4, in der Sonnenblume, durch die Wasserverfügbarkeit und Abscisinsäure reguliert ist. Es wurde postuliert, dass Sonnenblumen-HR-4 bei der Erhöhung der Austrocknungstoleranz beteiligt ist (Manavella et al., Plant J. 48, 125–137, 2006).
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne-Protein 2 (BIHD2)
• DNA-bindende Proteine sind Proteine, welche Beliebige von vielen DNA-Bindungsdomänen umfassen und somit eine spezifische oder allgemeine Affinität für DNA besitzen. DNA-bindende Proteine schließen zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, welche den Vorgang der Transkription modulieren, Nukleasen, welche DNA-Moleküle spalten, sowie Histone, welche an der DNA-Verpackung im Zellkern beteiligt sind, ein.
• Transkriptionsfaktoren sind üblicherweise als Proteine definiert, welche sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität aufzeigen und welche zum Aktivieren und/oder Unterdrücken von Transkription in der Lage sind. Das Genom von Arabidopsis thaliana codiert mindestens 1533 transkriptionelle Regulatoren, was ~5,9% seiner geschätzten Gesamtzahl an Genen ausmacht (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die ”Datenbank der Reis-Transkriptionsfaktoren” (DRTF) ist eine Sammlung von bekannten und vorhergesagten Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica, und enthält derzeit 2025 putative Transkriptionsfaktor(TF)-Genmodelle in indica und 2384 in japonica, die in 63 Familien verteilt sind (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10): 1286–7).
• Eine dieser Familien ist die Überfamilie der Homeodomäne(HD)-Transkriptionsfaktoren, welche bei vielen Aspekten von Entwicklungsprozessen beteiligt sind. HD-Transkriptionsfaktoren sind durch das Vorhandensein einer Homeodomäne (HD) gekennzeichnet, welche eine 60 Aminosäuren große DNA-Bindungs-Domäne (BD) ist. Arabidopsis thaliana und Reis enthalten ungefähr 100 HD-Transkriptionsfaktoren, welche basierend auf Aminosäuresequenz-Identität weiter in Subfamilien klassifiziert werden können (Richardt et al. (2007) Plant Phys. 143(4): 1452–1466). Einige dieser Subfamilien sind durch das Vorhandensein von zusätzlichen konservierten Domänen gekennzeichnet, welche DNA-Bindung und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen erleichtern.
• Eine dieser Subfamilien ist die BEL1(BELL-1)-Subfamilie (Reiser et al. (1995), Cell 83: 735–742), benannt nach einer Arabidopsis-Mutante bell 1 mit mangelhafter Integument-Ausbildung. BEL1-Transkriptionsfaktoren sind, zusätzlich zur Homeodomäne, durch eine konservierte Domäne gekennzeichnet, welche als die POX-Domäne bezeichnet wird, die ausschließlich in Pflanzenproteinen gefunden wird. Zwei Motive kennzeichnen BEL1-Polypeptide weiterhin: die SKY-Box und die VSLTGL-Box, die nach den konservierten Aminosäureresten benannt sind, welche sie umfassen.
• Ein Gen, welches ein BEL1-Homeodomänen-Polypeptid codiert, wurde aus Oryza sativa isoliert, und es wurde gezeigt, dass seine Expression nach Behandlung mit Benzothiadiazol (BTH), einem Molekül, das zum Induzieren von Krankheitsresistenz fähig ist, erhöht ist, jedoch ebenfalls nach Inokulation mit Magnaporthe grisea-Pathogen (Luo et al. (2005) Plant Biol. 7: 459–468). Es wurde Oryza sativa Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (OsBIHD1) genannt. Das Gen wurde in Tabak unter Verwendung des CaMV-35S-Promotors überexprimiert (Luo et al. (2005) J. Ex. Bot. 56(420): 2673–2682). Transgene Tabakpflanzen zeigten eine gesteigerte Krankheitstoleranz und in einigen Fällen ausgekeimte Apikalknospen, abnorme Wurzeln, verringerte Fruchtbarkeit oder Unfruchtbarkeit.
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne-Protein 2 (BIHD2) codiert, Pflanzen ergibt, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, in einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen und erhöhtem Ernteindex.
• Definitionen
• Polypeptid(e)/Protein(e)
• Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
• Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
• Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
• Kontrollpflanze(n)
• Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
• Homolog(e)
• ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
• Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
• Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
• Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

  Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
  Ala	Ser	Leu	Ile; Val
  Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
  Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
  Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
  Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
  Cys	Ser	Thr	Ser; Val
  Glu	Asp	Trp	Tyr
  Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
  His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
  Ile	Leu, Val

• Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
• Derivate
• ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
• Ortholog(e)/Paralog(e)
• Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
• Domäne
• Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
• Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
• Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
• Hybridisierung
• Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
• Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
• Die T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
• 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
• 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² – 820/L^c
• 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für <20 Nukleotide: T_m = 2 (l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (l_n)
^a oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.
^b nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
^c L = Länge des Duplex in Basenpaaren.
^d Oligo, Oligonukleotid; l_n = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
• Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
• Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
• Splice-Variante
• Der Begriff ”Splice-Variante” wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
• Allelische Variante
• Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
• Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
• Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
• Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
• Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine –35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende –10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
• Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
• Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
• Funktionsfähig verbunden
• Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
• Konstitutiver Promotor
• Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
  HMGP	WO 2004/070039
  CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
  CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
  GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
  Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
  Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
  Mais H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
  Alfalfa H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
  Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
  34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
  kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
  OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
  SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
  SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
  nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
  V-ATPase	WO 01/14572
  Super-Promotor	WO 95/14098
  G-Box-Proteine	WO 94/12015

• Ubiquitärer Promotor
• Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
• Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
• Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
• Induzierbarer Promotor
• Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
• Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
• Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe, etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
• Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  RCc3	Plant Mol. Biol., Jan. 1995; 27(2): 237–48
  Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
  Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
  Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
  wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
  Tabak, Auxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
  β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
  Tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
  B. napus G1-3b-Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
  SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
  LRX1	Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
  BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
  LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  The LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
  KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
  TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
  OsRAB4a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
  ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
  NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

• Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
  	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
  	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
  Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
  Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
  	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
  Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
  napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
  Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
  Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
  Weizen, α-, β-, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
  Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
  Gerste B1, C, D-Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
  Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
  blz2	EP99106056.7
  synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
  Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
  Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
  Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
  Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
  Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
  Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
  Sonnenblume-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
  PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
  PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
  PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
  PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
  PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
  PRO005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
  Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

  Tabelle 2d: Beispiele von endosperm-spezifischen Promotoren

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
  Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
  Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
  Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
  Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
  Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
  Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
  Gerste DOF	Mena et al, (1998) Plant J. 116(1): 53–62
  blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
  synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
  Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
  Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
  Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
  Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

  Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
  PRO0151	WO 2004/070039
  PRO0175	WO 2004/070039
  PRO005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039

  Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
  Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

• Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.
• Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

  Gen	Expression	Literatur-Bezugsstelle
  Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
  Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
  Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
  Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
  Reis, beta-Expansin EXBP9	spross-spezifisch	WO 2004/070039
  Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
  Erbse RBCS3A	blattspezifisch

• Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

  Genquelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
  Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
  Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
  WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

• Terminator
• Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
• Modulierung
• Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
• Expression
• Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
• Erhöhte Expression/Überexpression
• Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
• Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5.565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
• Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
• Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1,2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
• Endogenes Gen
• Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
• Verringerte Expression
• Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
• Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
• Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
• Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
• In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des Inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
• Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
• Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
• Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
• Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
• Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
• Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
• Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
• Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
• Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
• Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
• Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
• Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
• Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
• Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
• Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
• Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
• Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus- und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
• Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
• Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
• Transgenisch/Transgen/Rekombinant
• Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
• (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
• (b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
• (c) a) und b),
nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
• Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
• Transformation
• Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
• Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
• Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
• TILLING
• Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
• Homologe Rekombination
• Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Mat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
• Ertrag
• Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
• Früh-Wuchskraft
• ”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
• Erhöhen/Verbessern/Steigern
• Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
• Samenertrag
• Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
• Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann aufgrund einer modifierten Architektur auftreten.
• Grünheits-Index
• Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
• Pflanze
• Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
• Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
• Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein BIHD1-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein MYB30-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein MYB30-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein THOM-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein THOM-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
• Ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide/Gene versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen Ornithin-Decarboxylase-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”Ornithin-Decarboxylase-Nukleinsäure” oder ”Ornithin-Decarboxylase-Gen”.
• Ein ODC-Polypeptid, wie hierin darauf Bezug genommen wird, ist in der Lage, auf L-Ornithin als Substrat in einer Decarboxylierungs-Reaktion einzuwirken, und katalysiert deshalb die Reaktion zur Erzeugung von Putrescin aus L-Ornithin. Somit katalysiert ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid die folgende Reaktion: L-Ornithin = Putrescin + CO₂. Ornithin (2,5-Diaminopentansäure) ist eine Aminosäure mit der chemischen Zusammensetzung C₅H₁₂N₂O₂. Putrescin (gelegentlich buchstabiert Putrescin oder Putrescene) ist eine organische chemische Verbindung mit der chemischen Zusammensetzung C₄H₁₂N₂ (1,4-Diaminobutan oder Butandiamin). Die 1 zeigt die L-Ornithin-Decarboxylierungs-Reaktion.
• Ornithin-Decarboxylase-Polypeptide teilen eine Ähnlichkeit in der Primärsequenz und in der Sekundärstruktur. Sie gehören der beta/alpha-Barrel-Decarboxylase-Proteinklasse an. In einer phylogenetischen Analyse von beta/alpha-Barrel-Decarboxylase bilden ODCs einen eigenen Ast bzw. Stamm von Proteinen.
• Ornithin-Decarboxylase-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, lassen sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums von alpha/beta-Barrel-gefalteten Basische-Aminosäure-Decarboxylase-Polypeptiden verwendet werden, eher innerhalb des Astes, der von bekannter Ornithin-Decarboxylase gebildet wird, als bei Arginin-Decarboxylase-, Diaminopimelat-Decarboxylase- oder Carboxynorspermidin-Decarboxylase-Polypeptiden einordnen. Vorzugsweise lässt sich ein in den Verfahren der Erfindung nützliches OCD innerhalb des Astes einordnen, der durch ODCs-Polypeptide von eukaryotischem Ursprung gebildet wird, weiter bevorzugt innerhalb des Astes einordnen, der durch ODC-Polypeptide von pflanzlichem Ursprung gebildet wird, noch weiter bevorzugt bei dem Ast einordnen, der von ODC-Polypeptiden von dikotyledonem Ursprung gebildet wird, am stärksten bevorzugt innerhalb desselben Astes wie SEQ ID NR: 2 einordnen. Beispiele von einem solchen phylogenetischen Baum von alpha/beta–Barrel-gefalteten Basische-Aminosäure-Decarboxylase-Polypeptiden sind in 1 von Lee et al. 2007 und in der 2B der vorliegenden Patentanmeldung angegeben.
• Verfahrens für den Rückschluß auf die Phylogenie sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen ”Distanzmethoden”, welche auf einer Matrix basieren, die paarweise Distanzwerte zwischen allen Sequenzen in einem Alignment enthält, und ”Zeichen-basierte Methoden” ein, welche Berechnungen über jeden der einzelnen Reste der Sequenzen ausführen. Beispiele von ”Distanzmethoden” sind die UPGMA (Ungewichtete Paar-Gruppe mit Arithmetischem Mittel) und Neighbor-Joining (Saitou und Nei, 1987). Das letztgenannte Verfahren wird in allgemein bekannten Softwareprogrammen angewandt, die nützlich zur Ausführung von Protein-Phylogenese sind, wie etwa ”Neighbor” aus dem Phylip-Paket (Jo Felsentein, Univ. Washington) oder ClustalW (D. Higgins, EMBL). Beispiele von ”Zeichen-basierten Methoden” sind Protein Maximum Likelihood und Protein Maximal Parsimony. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt die verschiedenen verfügbaren Verfahren und ist in der Lage, das Verfahren der Phylogenieanalyse in vorteilhafter Weise auszuwählen. Ein bevorzugtes Verfahren für den Rückschluß auf die Phylogenie von ODCs-Polypeptiden ist die Neighbor-Joining-Methode.
• Ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches Ornitin-Decarboxylase-Polypeptid umfasst, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive:
• (i) Motiv 1: [N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG (SEQ ID NR: 51);
• (ii) Motiv 2: [K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S] (SEQ ID NR: 52);
• (iii) Motiv 3: RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHHP (SEQ ID NR: 53);
• (iv) Motiv 4: EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT (SEQ ID NR: 54);
• (v) Motiv 5: EYVLSLG[V/I]SPD (SEQ ID NR: 55);
• (vi) Motiv 6: AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A] (SEQ ID NR: 56);
• (vii) Motiv 7: [G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM[V/L]SIITQKLQD[E/D] (SEQ ID NR: 57);
• (viii) Motiv 8: QT[V/I]IVSGLNPAAILQ (SEQ ID NR: 58);
• (ix) ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen der Motive (i) bis (viii).
• ODC-Polypeptide umfassen verschiedene allgemein bekannte konservierte Proteindomänen. Proteine, die gemeinsame konservierte Domänen teilen, werden als gleiche oder verwandte Funktionen ausführend betrachtet. Verfahren zum Identifizieren konservierter Domänen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen das Durchsuchen von spezialisierten Datenbanken, wie Interpro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), und Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)) ein. Das Beispiel 4 schildert Einzelheiten der konservierten Domänen, die bei SEQ ID NR: 2 durch Screening der Interpro-Datenbank gefunden wurden.
• Ein weiter bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches ODC-Polypeptid umfasst eine oder mehrere der folgenden konservierten Sequenzen:
• (i) Eine PFAM-Domäne mit der Zugangsnummer PF00278, auch bezeichnet als Pyridoxal-abhängige Decarboxylase, C-terminale Blatt-Domäne, oder Orn_DAP_Arg_deC;
• (ii) Eine PFAM-Domäne mit der Zugangsnummer PF02784, auch bezeichnet als Pyridoxal-abhängige Decarboxylase, Pyridoxal-Bindungsdomäne, oder Orn_Arg_deC_N;
• (iii) Ein PROSITE-Muster mit der Zugangsnummer PS00878, auch als ODR_DC_2_1 oder Orn/DAP/Arg-Decarboxylasen-Familie 2-Pyridoxal-P-Anlagerungs-Stelle bezeichnet, das ein Consensus-Muster aufweist, wie es durch [F/Y]-[P/A]-x-K-[S/A/C/V]-[N/H/C/L/F/W]-x(4)-[L/I/V/M/F]-[L/I/V/M/T/A]-x(2)-[L/I/V/M/A]-x(3)-[G/T/E] (SEQ ID NR: 64) repräsentiert wird;
• (iv) Ein PROSITE-Muster, Zugangsnummer PS00879, auch als ODR_DC_2_2 oder Orn/DAP/Arg-Decarboxylasen-Familie 2-Signatur 2 bezeichnet, das ein Consensus-Muster aufweist, wie durch [G/S/A]-x(2,6)-[L/I/V/M/S/C/P]-x-N-[L/I/V/M/F]-[D/N/S]-[L/I/V/M/C/A]-G(3)-[L/I/V/M/F/Y]-[G/S/T/P/C/E/Q] (SEQ ID NR: 65) repräsentiert;
• (v) ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen der Motive (i) bis (iv).
• Ein noch weiter bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches ODC-Polypeptid umfasst eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von beliebigen der Domänen, wie in der Tabelle C1 von Beispiel 4 dargestellt.
• Beispiele von in den Verfahren der Erfindung nützlichen ODC-Polypeptiden sind in der Tabelle A1 von Beispiel 1 hierin angegeben. Die globale Sequenzähnlichkeit und -identität zwischen ausgewählten Polypeptiden von Tabelle A1 wird in der Tabelle B1 von Beispiel 3 aufgeführt.
• Weiter bevorzugt, umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche ODC-Polypeptide eine Sequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1. Weiter bevorzugt ist ein beliebiges der Polypeptide der Tabelle A1. Am stärksten bevorzugt ist SEQ ID NR: 2.
• Alternativ besitzt das Homolog eines ODC-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2B abgebildet ist, verwendet wird, bevorzugt eher bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, die die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf BIHD1-Polypeptide/Gene, versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein BIHD1-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches BIHD1-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die den Typ von Polypeptid codiert, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”BIHD1-Nukleinsäuresequenz” oder ”BIHD1-Gen”.
• Ein ”BIHD1-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”BIHD1-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend: (i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356; (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563; und (ii) mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”BIHD1-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf eine beliebige Polypeptidsequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen BIHD1-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, eher bei dem Ast von BELL-1-Homeodomäne-Polypeptiden als bei einem beliebigen anderen Homeodomäne-Polypeptid-Ast einordnen lässt.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”BIHD1-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A2 hierin angegeben sind.
• Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 67 ist nachstehend im Beispiel 4 hierin wiedergegeben. Zum Beispiel umfasst ein BIHD1-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 67, unter anderem eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356 und eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0006563. Domänen können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie durch Sequenzalignment, identifiziert werden. Ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A2 ist in der 6 gezeigt. Derartige Alignments sind nützlich zur Identifizierung der meisten konservierten Domänen unter den BIHD1-Polypeptiden, wie etwa der SKY-Box, und der VSLTGL-Box, welche nach den konservierten Aminosäureresten, die sie enthalten, benannt sind.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide/Gene, versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein MYB30-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches MYB30-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, die den Typ von Protein codiert, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”MYB30-Nukleinsäure” oder ”MYB30Gen”.
• Ein ”MYB30-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges R2R3-MYB-Polypeptid, das mindestens eine, vorzugsweise zwei SANT-Domänen (SMART-Eintrag SM00717, Myb_DNA-bindende Domäne (Pfam-Eintrag PF00249)) umfasst. Darüber hinaus umfasst ein ”MYB30-Polypeptid” ferner eines oder mehrere der Motive 9 bis 11, vorzugsweise Motiv 9.
• Alternativ dazu bezieht sich ein ”MYB30-Polypeptid” auf eine Polypeptidsequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96- und AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die von SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
  Motiv 9 (SEQ ID NR: 119): QGsLSL[IF]EKWLFd[DE][x][SG]; worin X in Position +15 eine beliebige oder keine Aminosäure, aber vorzugsweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, eines von S, G, D, Q, A sein kann;
  Motiv 10 (SEQ ID NR: 120): NI[AS][RK][LM]LXG[WF]MK; worin X in Position +7 eine beliebige oder keine Aminosäure sein kann;
  Motiv 11 (SEQ ID NR: 121): YASSX[ED];
  wobei ein einzelner Großbuchstabe angegeben ist, wenn die relative Häufigkeit eines einzelnen Rests an einer bestimmten Position größer als 50% und größer als das Zweifache derjenigen des zweithäufigsten Rests ist. Wenn kein einzelner Rest diese Kriterien erfüllte, wurde ein Paar von Resten als Großbuchstaben in Klammern zugeweisen, falls die Summe ihrer relativen Häufigkeiten 75% überschritt. Wenn keines dieser zwei Kriterien erfüllt war, wurde ein Kleinbuchstabe angegeben, falls die relative Häufigkeit eines Rests größer als 40% ist. Andernfalls wird x angegeben. Diese Consensus-Sequenzen folgen den Kriterien von Joshi et al. 1997. Plant Mol Biol 35: 993–1001.
• Vorzugsweise umfasst ein in den Verfahren der Erfindung nützliches MYB30-Protein ein beliebiges aus dem Folgenden:
  Motiv 9 (SEQ ID NR: 119): QGSLSL[I/F]EKWLFD[D/E]x[S/G]; worin 1 bis 8 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
  Motiv 10 (SEQ ID NR: 120): NI[A/S][R/K][L/M]LXG[W/F]MK; worin X eine beliebige oder keine Aminosäure ist, und worin 1 bis 6 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
  Motiv 11 (SEQ ID NR: 121): YASSX[ED]; worin X eine beliebige oder keine Aminosäure ist, und worin 1 bis 6 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
• Vorzugsweise binden in den Verfahren der Erfindung nützliche MYB30-Polypeptide an DNA-Fragmente, die ein beliebiges der im Fachgebiet allgemein bekannten Myb-DNA-Bindungsmotive umfassen, wie zum Beispiel diejenigen, die von Jamin et al. (1996) Int. J. Quantum Chem. 59, 333–341, beschrieben wurden. (GTAACGGTCTAC); oder G[G/T]T[A/T]G[G/T]T (PNAS 93, 14972–14977 (1996)); oder GGTTTAG (J.-Biol. Chem., Bd. 276, Ausgabe 19, 16511–16519, 2001).
• Vorzugsweise umfasst das in den Verfahren der Erfindung nützliche MYB30-Protein eine konservierte Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure-Domäne, die in Tabelle C3 des Abschnitts ”Beispiele” dargestellt ist, oder zu einem beliebigen der Motive 1 bis 3; vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Sequenzidentität wird unter Anwendung eines Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, oder BLAST ermittelt.
• Alternativ besitzt das Homolog eines MYB30-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 89, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die durch SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide/Gene versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein THOM-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches THOM-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, die den Typ von Protein codiert, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”THOM-Nukleinsäure” oder ”THOM-Gen”.
• Ein ”THOM-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf einen Klasse II-HD-Zip-Transkriptionsfaktor. Class II HD-Zip-Transkriptionsfaktoren bilden eine definierte Gruppe von Transkriptionsfaktoren, siehe zum Beispiel Sakakibara et al. (2001) oder Agalou et al. (2008). Es versteht sich, dass ”Klasse II HD-Zip-Transkriptionsfaktor” einen Transkriptionsfaktor bedeutet, der (i) eine ”N-terminale HD-ZIP”-Leucin-Zipper-Domäne, (ii) eine Homeobox-Domäne, (iii) eine mit der Homeobox-Domäne assoziierte HALZ-Leucin-Zipper-Domäne, und (iv) die nachstehend angegebenen Motive 12, 13 und 14 (in beliebiger Reihenfolge) umfasst.
  Motiv 12 (SEQ ID NR: 124): (R/S)(K/R)KLRL
  und
  Motiv 13 (SEQ ID NR: 125): RQVEVWFQNRRARTKL(K/E)QTEVDCE
  und
  Motiv 14 (SEQ ID NR: 126): TLXMC(L/P)(S/Q)C(E/K/R)(R/H)
  wobei X in Position 3 eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise eines von A, L, I oder T sein kann. Vorzugsweise ist das Motiv 14 TLTMCPQCER.
• Weiterhin kann jedes der Motive 12 bis 14 eine konservative Aminosäuresubstitution an beliebiger Position aufweisen, wobei Beispiele einer konservativen Substitution in Tabelle 1 angegeben sind.
• Darüber hinaus umfasst ein THOM-Polypeptid vorzugsweise auch eines oder mehrere der folgenden Motive:
  Motiv 15 (SEQ ID NR: 127): SPNS(T/A)
  Motiv 16 (SEQ ID NR: 128): LGL
  Motiv 17 (SEQ ID NR: 129): (E/D)(E/D)(E/D)
  Motiv 18 (SEQ ID NR: 130): (E/Q/D)N(R/K)RL
• Vorzugsweise ist das Motiv 18 ENRRL.
• Die HD-ZIP_N Leucin-Zipper-Domäne (Pfam PF04618) wird in der N-terminalen Region von Pflanzen-Homeobox-Leucin-Zipper-Proteinen gefunden. Ihre Funktion ist unbekannt. Die Homeobox-Domäne (Pfam PF00046) wurde zuerst in einer Anzahl von homeotischen und Segmentierungs-Proteinen von Drosophila identifiziert. Die Domäne bindet DNA durch eine Helix-Turn-Helix(HTH)-Struktur. Das HTH-Motiv ist durch zwei Alpha-Helizes gekennzeichnet, die enge Kontakte mit der DNA herstellen und durch einen kurzen ”Turn” bzw. Umbiegungsabschnitt verbunden sind. Die zweite Helix bindet an DNA über eine Anzahl von Wasserstoffbrücken- und hydrophobischen Wechselwirkungen, welche zwischen spezifischen Seitenketten und den exponierten Basen und Thyminmethyl-Gruppen innerhalb der großen Furche der DNA stattfinden. Die erste Helix hilft dabei, die Struktur zu stabilisieren. Das Motiv ist hinsichtlich Sequenz und Struktur in einem weitem Bereich an DNA-bindenden Proteinen sehr ähnlich (z. B. cro und Repressorproteine, homeotische Proteine, etc.). Einer der Hauptunterschiede zwischen HTH-Motiven in diesen verschiedenen Proteinen erwächst aus dem stereochemischen Erfordernis nach Glycin in dem Turn, welches erforderlich ist, um eine sterische Interferenz des beta-Kohlenstoffatoms mit der Hauptkette zu vermeiden: für cro und Repressorproteine scheint das Glycin zwingend erforderlich zu sein, während das Erfordernis für viele der homeotischen und sonstigen DNA-bindenden Proteine aufgelockert ist. Die HALZ-Leucin-Zipper-Domäne (Pfam PF02183), die in THOM-Polypeptiden gefunden wird, ist ein pflanzen-spezifischer Leucin-Zipper, der immer mit einer Homeobox-Domäne assoziiert vorzufinden ist.
• Weiterhin berichteten Agalou et al., 2008, dass ein Intron in der Helix 2 der Homeodomäne in Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis und Reis weder in Klasse I noch in Klasse III vorhanden ist.
• Alternativ besitzt das Homolog eines THOM-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 123, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf BIHD2-Polypeptide/Gene, versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Eine beliebige Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches BIHD2-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die den Typ von Polypeptid codiert, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”BIHD2-Nukleinsäuresequenz” oder ”BIHD2-Gen”.
• Ein ”BIHD2-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”BIHD2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, das umfasst: (i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356 und (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563.
• Ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches BIHD2-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid, umfassend eine Domäne mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu beliebigen der Domänen i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356; (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A5 von Beispiel 1 vorhanden, vorzugsweise wie in SEQ ID NR: 193 vorhanden.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”BIHD2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, wenigstens mindestens 50, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A5 von Beispiel 1 hierin angegeben sind.
• Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen ist die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 193 nachstehend im Beispiel 4 hierin wiedergegeben. Zum Beispiel umfasst ein BIHD2-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, unter anderem eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356 und eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0006563. Domänen können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie durch Sequenzalignment, identifiziert werden. Ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A5 ist in der 14 gezeigt. Derartige Alignments sind nützlich zur Identifizierung der meisten konservierten Domänen unter den BIHD2-Polypeptiden, wie etwa der GPFTGY-Box, der SNWFINARV-Box, der RGLP-Box und der HFLHPYP-Box, welche nach den konservierten Aminosäureresten, die sie enthalten, benannt sind.
• Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen beschreibt das Beispiel 3 hierin in der Tabelle B2 die prozentuale Identität zwischen dem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert ist, und den in Tabelle A2 aufgelisteten BIHD1-Polypeptiden. Die prozentuale Aminosäuresequenzidentität zwischen dem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird, und den BIHD1-Polypeptiden, die in Tabelle A2 aufgelistet sind, beträgt mindestens 35%. Die Aminosäuresequenzidentität außerhalb der Homeobox-Domäne von Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren ist, wie allgemein bekannt, niedrig.
• Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss Institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere verfügbar.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen ist die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung und der Topologie eines BIHD1-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, in den Beispielen 5 und 6 der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen ist die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung und der Topologie eines BIHD2-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert, in den Beispielen 5 und 6 der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben.
• Darüber hinaus weisen ODC-Polypeptide (zumindest in ihrer natürlichen Form) typischerweise Ornithine-Decarboxylase-Aktivität auf. Werkzeuge und Techniken zur Messung von Ornithin-Decarboxylase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Weitere Einzelheiten sind in Beispiel 8 angegeben.
• Darüber hinaus ergeben ODC-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 9 und 10 geschildert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehren von erhöhter Biomasse, erhöhter Frühwuchskraft, erhöhtem Gesamtsamengewicht, erhöhter Zahl an Samen pro Pflanze und erhöhter Anzahl an gefüllten Samen.
• Darüber hinaus besitzen MYB30-Polypeptide in der Regel DNA-bindende Aktivität und eine Aktivierungsdomäne. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht das Vorhandensein einer Aktivierungsdomäne und DNA-bindende Aktivität unter Anwendung von Routinetechniken und Prozeduren feststellen, wie zum Beispiel jenen, die in Xue GP. Plant J. 2005. 41(4): 638–49) und den Bezugsstellen darin beschrieben sind. Proteine, die mit MYB30-Polypeptiden (zum Beispiel in transkriptionellen Komplexen) Wechselwirken, können leicht identifiziert werden, wofür Standardtechniken für einen Fachmann, wie etwa Zwei-Hybrid-Wechselwirkung, angewandt werden. Es wird postuliert, dass MYB30-Proteine mit BHLH-Transkriptionsfaktoren interagieren (Zimmerman et al., Plant Journal 40, 22–34, 2004).
• Darüber hinaus ergeben MYB30-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 9 und 10 geschildert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Emergenzwuchskraft.
• Darüber hinaus zeigen THOM-Polypeptide die allgemeine biologische Aktivität von Transkriptionsfaktoren (zumindest in ihrer natürlichen Form) und weisen typischerweise DNA-Bindungsaktivität auf. Werkzeuge und Techniken zur Messung von DNA-Bindungsaktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Sessa et al. (J. Mol. Biol. 274, 303–309, 1997) untersuchten die DNA-bindenden Eigenschaften der ATHB-1- und ATHB-2 (= HAT4)-HD-Zip (HD-Zip-1 und -2)-Domänen und stellten fest, dass sie mit DNA als Homodimere interagieren und zwei unterschiedliche 9-bp-pseudopalindromische Sequenzen, CAAT(A/T)ATTG (BS-1) bzw. CAAT(G/C)ATTG (BS-2), erkennen. Aus einer Mutations-Analyse der HD-Zip-2-Domäne ermittelten sie, dass konservierte Aminosäurereste von Helix 3, Val47 und Asn51, sowie Arg55, essentiell für die DNA-Bindungsaktivität der HD-Zip-2-Domäne sind. Sie berichten auch, dass die präferentielle Erkennung eines G/C-Basenpaars an der zentralen Position durch die HD-Zip-2-Domäne entweder durch die Ersetzung von Arg55 mit Lysin oder durch die Substitution von Glu46 und Thr56 mit den entsprechenden Resten der HD-Zip-1-Domäne (Alanin bzw. Tryptophan) aufgehoben wird. Weitere Einzelheiten sind in Beispiel 8 angegeben.
• Darüber hinaus ergeben THOM-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 9, 10 und 11 geschildert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
• In Bezug auf Ornithin-Decarboxylase-Sequenzen wird die vorliegende Erfindung durch das Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen ODC-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen ODC-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• In Bezug auf Ornithin-Decarboxylase-Sequenzen sind Beispiele von Nukleinsäuren, welche ODC-Polypeptide codieren, in der Tabelle A1 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 2 repräsentierten ODC-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Nicotiana tabacum-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 66 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die BIHD1-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 67 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, durchgeführt werden.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen sind Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, welche BIHD1-Polypeptide codieren, in Tabelle A2 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 67 repräsentierten BIHD1-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 66 oder SEQ ID NR: 67 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Oryza sative-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 88 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 89 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen MYB30-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen MYB30-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen sind Beispiele von Nukleinsäuren, welche MYB30-Polypeptide codieren, in Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 89 repräsentierten MYB30-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 88 oder SEQ ID NR: 89 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf THOM-Sequenzen wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 122 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 123 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen THOM-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen THOM-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• Beispiele für Nukleinsäuren, welche THOM-Polypeptide codieren, sind in Tabelle A4 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 123 repräsentierten THOM-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 122 oder SEQ ID NR: 123 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Solanum Lycopersicum-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 192 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die BIHD2-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 193 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, durchgeführt werden.
• Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, welche BIHD2-Polypeptide codieren, sind in Tabelle A5 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 193 repräsentierten BIHD2-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 192 oder SEQ ID NR: 193 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Medicago sativa-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
• Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, welche Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert beschaffen sind. Außerdem sind Nukleinsäuresequenzen in den Verfahren der Erfindung nützlich, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
• Ferner zählen zu den, bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die an Nukleinsäuren hybridisieren, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuren, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die ODC-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
• Nukleinsäuren, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen.
• Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäuresequenz hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein ODC-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf BIHD1-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein BIHD1-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1925 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert. Weiter bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz, wie sie von SEQ ID NR: 66 repräsentiert wird.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein MYB30-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 88.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide, codiert der Abschnitt vorzugsweise ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die durch SEQ ID NR: 94 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein THOM-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 122. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Polypeptidsequenzen codiert, die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegeben sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1925 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird. Weiter bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 192 repräsentiert wird.
• Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stingenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein ODC-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage. Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein BIHD1-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 66, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein MYB30-Polypeptid, wie hierin definiert, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 88, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide, codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die von SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenzumfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein THOM-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 122, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 192, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einer Splice-Variante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, eher vorzugsweise bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf BIHD1-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 66, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 67 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Splice-Variante um eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es von der SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 88, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 89 codiert. Vorzugsweise lässt sich die, von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die von SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäure oder um eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf BIHD2-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 192 repräsentiert wird, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 193 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Splice-Variante um eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es von SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird.
• Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelische Variante einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ODC-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, bevorzugt eher bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf BIHD1-Polypeptide weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das BIHD1-Polypeptid von SEQ ID NR: 67 und eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 66 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 67 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert ist.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das MYB30-Polypeptid von SEQ ID NR: 89 und beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 88 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 89 codiert. Vorzugsweise lässt sich die, von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMYB31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die von SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide, weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das THOM-Polypeptid von SEQ ID NR: 123 und beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 122 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 123 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 13 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf das BIHD2, weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das BIHD2-Polypeptid von SEQ ID NR: 193 und beliebige der in Tabelle A5 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 192 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 193 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es von SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird.
• Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide, wie oben definiert, codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1–A5 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz durch Gen-Shuffling erhalten wird.
• In Bezug auf ODC-Polypeptide, Isst sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von ODC-Polypeptiden, am stärksten bevorzugt bei der Gruppe, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe bevorzugt einordnen.
• In Bezug auf BIHD1-Polypeptide, codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es von SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird.
• In Bezug auf MYB30-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in Stracke et al., 2001, abgebildet ist, vorzugsweise eher innerhalb des von AtMYB60-, AtMYB30-, AtMY31-, AtMYB96-, AtMYB94-Polypeptiden definierten Astes, der die von SEQ ID NR: 91 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf THOM-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 von Sakakibara et al. (2001), abgebildet ist, vorzugsweise eher innerhalb der Gruppe von Klasse II-HD-zip-Transkriptionsfaktoren, die THOM1 und die durch SEQ ID NR: 123 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• Vorzugsweise codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es von SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird.
• Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenz-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
• ODC-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die ODC-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Nicotiana tabacum.
• BIHD1-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, stammt aus der Domäne Eukaryota, vorzugsweise aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Oryza sativa.
• MYB30-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die MYB30-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
• THOM-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die THOM-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Solanum Lycopersicum.
• BIHD2-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, stammt aus der Domäne Eukaryota, vorzugsweise aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Oryza sativa.
• Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten und/oder erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
• Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
• Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Hektar oder Acre hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser. Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
• Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhten Ertrag und/oder erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
• Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte und/oder erhöhte (frühe) Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden; ein verzögertes Aufblühen ist bei Nutzpflanzen üblicherweise keine erwünschte Eigenschaft). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen und/oder Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden, auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen erlauben. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
• Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen, die unter optimalen Wachstumsbedingungen kultiviert (unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen) werden, ergeben typischerweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
• In Bezug auf ODC-Sequenzen, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein ODC-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf THOM-Sequenzen, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, und gibt ihnen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf ODC-Sequenzen gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ODC-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen führt die Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dazu, dass unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogene Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Da diverse umweltbedingte Stressformen ähnliche Wege aktivieren, sollte die beispielhafte Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung mit Dürrestress nicht als ein Beschränkung auf Dürrestress angesehen werden, sondern vielmehr als Abbild zum Aufzeigen der Beteiligung von BIDH1-Polypeptiden, wie oben stehend definiert, an der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, im Allgemeinen abiotischen Stressformen, wachsen gelassen werden.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen kultiviert werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein BIHD1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, der aus einem oder mehreren der folgenden ausgewählt ist: Wasser-Stress, Salz-Stress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
• Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ verursacht wird.
• Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Cholorphyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein BIHD1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein MYB30 Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
• In Bezug auf THOM-Sequenzen gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein THOM-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Bedingungen von Salzstress kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Salzstress kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein THOM-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich dabei, unter anderem, um eines oder mehrere von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ handeln.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen führt die Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dazu, dass unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogene Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Da diverse umweltbedingte Stressformen ähnliche Wege aktivieren, sollte die beispielhafte Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung mit Dürrestress nicht als ein Beschränkung auf Dürrestress angesehen werden, sondern vielmehr als Abbild zum Aufzeigen der Beteiligung von BIDH2-Polypeptiden, wie oben definiert, an der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, im Allgemeinen abiotischen Stressformen, kultiviert werden.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein BIHD2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, der aus einem oder mehreren der folgenden ausgewählt ist: Wasser-Stress, Salz-Stress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
• Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Cholorphyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
• Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das ein ODC Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid, ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie oben definiert, codiert.
• Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der (erhöhten) Expression von ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide, wie hierin definiert, codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen vor. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
• Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
• (a) eine Nukleinsäure, codierend ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie oben definiert;
• (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
• (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
• Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
• Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
• Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
• Andere organspezifische Promotoren, zum Beispiel für bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), sind nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
• In vorteilhafter Weise kann ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben und/oder zu erhöhen, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. Ebenfalls nützlich in den Verfahren der Erfindung ist ein wurzelspezifischer Promotor.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen, ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise ein samenspezifischer Promotor. Ein Beispiel eines samenspezifischen Promotors ist ein WSI18-Promotor, vorzugsweise ein Reis-WSI18-Promotor, weiter bevorzugt ein WSI18-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 84 repräsentiert wird. Ein anderes Beispiel eines samenspezifischen Promotors ist ein RAB21-Promotor, vorzugsweise ein Reis-RAB21-Promotor, weiter bevorzugt ein RAB21-Promotor, wie durch SEQ ID NR: 85 repräsentiert. Weitere Beispiele von samenspezifischen Promotoren können im Abschnitt ”Definitionen” hierin oben stehend gefunden werden.
• In vorteilhafter Weise kann ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. Ein für junges grünes Gewebe spezifischer Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist die, ein MYB30-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem für junges Grüngewebe spezifischen Promotor verbunden, wie hierin definiert. Der für junges grünes Gewebe spezifische Promotor ist vorzugsweise ein Protochlorophyllid-Reductase(PcR)-Promotor, weiter bevorzugt der Protochlorophyllid-Reductase-Promotor, der repräsentiert wird durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 118 ist, am stärksten bevorzugt ist der Promotor beschaffen, wie von SEQ ID NR: 118 repräsentiert.
• In Bezug auf ODC-Sequenzen sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die ODC-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer ODC-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 61 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 61 repräsentiert. Siehe Tabelle 2a im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das BIHD1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 66 repräsentiert wird, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer BIHD1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen samen-spezifischen Promotor begrenzt ist.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die MYB30-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 88 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer MYB30-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen Grüngewebe-spezifischen Promotor begrenzt ist.
• In Bezug auf THOM-Sequenzen sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die THOM-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 122, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer THOM-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem Pflanzen-abgeleiteten Promotor, wie einem GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ist der Promotor der GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 131 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 131 repräsentiert. Siehe den hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die BIHD2-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 192, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem Pflanzen-abgeleiteten Promotor, wie einem GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ist der Promotor der GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 248 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 248 repräsentiert. Siehe den hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenzen sollte ebenfalls klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das BIHD2-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 192, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter Steuerung durch einen samen-spezifischen Promotor begrenzt ist.
• Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Erhöher einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancer-(oder Erhöher-)Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Erhöher, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
• Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
• Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
• Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markengen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
• Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, codierend ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, umfasst.
• Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten und/oder erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren umfasst:
• (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert; und
• (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines ODC-Polypeptids, oder eines BIHD1-Polypeptid, oder eines MYB30-Polypeptids, oder eines THOM-Polypeptids, oder eines BIHD2-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung, wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
• Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
• Nach einer Transformation, werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich-exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und, nach einer anfänglichen Wachstumsperiode, einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
• Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
• Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
• Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
• Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, welche ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
• Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer.
• Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz umfassen, welche ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid (wie hierin oben definiert) codiert. Zu solchen erntefähigen Teilen zählen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäure-Sequenzen, die ODC-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser ODC-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
• Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die BIHD1-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser BIHD1-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
• In Bezug auf ODC-Sequenzen, können die hierin beschriebenen Nukleinsäuren-Sequenzen, die ODC-Polypeptid codieren, oder die ODC-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein ODC-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die ODC-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• In Bezug auf BIHD1-Sequenzen, können hierin beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die BIHD1-Polypeptide codieren, oder die BIHD1-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein BIHD1-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen, oder die BIHD1-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• In Bezug auf MYB30-Sequenzen, können hierin beschriebene Nukleinsäuren-Sequenzen, die MYB30-Polypeptide codieren, oder die MYB30-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein MYB30-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die MYB30-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• In Bezug auf THOM-Sequenzen, können hierin beschriebene Nukleinsäuren, die THOM-Polypeptid codieren, oder die THOM-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein THOM-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die THOM-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• In Bezug auf BIHD2-Sequenz, können hierin beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die BIHD2-Polypeptide codieren, oder die BIHD2-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein BIHD2-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen, oder die BIHD2-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• Allelische Varianten einer ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codierenden Gen/Nukleinsäuresequenz können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, und welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
• Nukleinsäure-Sequenzen, die ODC-Polypeptide oder BIHD1-Polypeptide oder MYB30-Polypeptide oder THOM-Polypeptide oder BIHD2-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die ein ODC Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den ein ODC-Polypeptid oder ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein THOM-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der ein ODC-Polypeptid, ein BIHD1-Polypeptid oder ein MYB30-Polypeptid oder ein BIHD2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
• Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
• Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
• In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
• Eine Vielzahl von auf Nukleinsäuresequenz-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
• Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten und/oder erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden und/oder ertragserhöhenden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressformen, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
• Merkmals-Gesichtspunkte
• 1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei sich das Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums von alpha/beta–Barrel-gefalteten Basische-Aminosäure-Decarboxylase-Polypeptiden verwendet wird, eher bei den Ornithin-Decarboxylase umfassenden Ästen als bei Arginin-Decarboxylase-, Diaminopimelat-Decarboxylase- oder Carboxynorspermidin-Decarboxylase-Polypeptiden einordnen lässt.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei das Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Sequenzen umfasst: (i) 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz von einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1 (ii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz von einer beliebigen der Domänen, wie in Tabelle C1 von Beispiel 4 dargestellt. (iii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 1: [N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG (SEQ ID NR: 51); (iv) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 2: [K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S] (SEQ ID NR: 52); (v) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 3: RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHHP (SEQ ID NR: 53); (vi) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 4: EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT (SEQ ID NR: 54); (vii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 5: EYVLSLG[V/I]SPD (SEQ ID NR: 55); (viii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 6: AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A] (SEQ ID NR: 56); (ix) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 7: [G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM[V/L]SIITQKLQD[E/D] (SEQ ID NR: 57); (x) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 8: QT[V/I]IVSGLNPAAILQ (SEQ ID NR: 58).
• 4. Verfahren gemäß Punkt 1, 2 oder 3, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure oder dem Komplement davon in der Lage ist.
• 6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
• 7. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte(n) Sprossbiomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Kultivierungsbedingungen mit Stickstoffmangel erhalten werden.
• 9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 4 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 10. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt aus Nicotiana tabacum ist.
• 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, umfasst.
• 12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 1, 2 oder 3 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
• 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
• 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1, 2 oder 3 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
• 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1, 2 oder 3 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
• 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
• 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Spross- und/oder Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 22. Ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (BIHD1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das BIHD1-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird, aufweist, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
• 23. Verfahren gemäß Punkt 22, wobei das BIHD1-Polypeptid umfasst: (i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356; (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563; und (ii) mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne.
• 24. Verfahren gemäß Punkt 22 oder 23, wobei sich das BIHD1-Polypeptid, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen BIHD1-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, eher bei dem Ast von BELL-1-Homeodomäne-Polypeptiden als bei einem beliebigen anderen Homeodomäne-Polypeptid-Ast einordnen lässt.
• 25. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 24, wobei das BIHD1-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A2 hierin angegeben sind, aufweist.
• 26. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 25, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, durch eine beliebige der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID-NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID-NRn in der Lage ist, repräsentiert wird.
• 27. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 26, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
• 28. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 27, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere beliebige aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
• 29. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 28, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 30. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 29, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex.
• 31. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist.
• 32. Verfahren gemäß Punkt 31, wobei der samenspezifische Promotor vorzugsweise ein WSI18-Promotor, weiter bevorzugt ein WSI18-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt ein WSI19-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 84 repräsentiert wird, ist.
• 33. Verfahren gemäß Punkt 31, wobei der samenspezifische Promotor vorzugsweise ein RAB21-Promotor, weiter bevorzugt ein RAB21-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt ein RAB21-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 85 repräsentiert wird, ist.
• 34. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 33, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa ist.
• 35. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die bzw. der Pflanze, Teil oder Zelle davon ein isoliertes, ein BIHD1-Polypeptid codierendes Nukleinsäure-Transgen, das funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist, umfasst.
• 36. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein BIHD1-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen von Punkt 22 bis 27; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 37. Konstrukt gemäß Punkt 36, wobei die Steuerungssequenz ein samenspezifischer Promotor ist.
• 38. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 36 oder 37 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften eines oder mehrere sind von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex.
• 39. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 36 oder 37 transformiert ist.
• 40. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein BIHD1-Polypeptid, wie in einem beliebigen von Punkt 22 bis 27 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 41. Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz resultieren, die in funktionsfähiger Verknüpfung an einen samenspezifischen Promotor ein BIHD1-Polypeptid codiert, wie es in einem beliebigen von Punkt 22 bis 27 definiert ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 42. Transgene Pflanze gemäß Punkt 35, 39 oder 41, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
• 43. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 42, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
• 44. Produkte, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 42 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 43 abgeleitet sind.
• 45. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen von Punkt 22 bis 27 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere Von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex, umfassen.
• 46. Ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, wobei das MYB30-Polypeptid mindestens eine SANT-Domäne umfasst.
• 47. Verfahren gemäß Punkt 46, wobei das MYB30-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 9 bis 11 (SEQ ID NR: 119 bis SEQ ID NR: 121) umfasst.
• 48. Verfahren gemäß Punkt 46 oder 47, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
• 49. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 48, wobei die Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
• 50. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 49, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
• 51. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 50, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte erhöhte Biomasse und/oder erhöhte Emergenzwuchskraft im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 52. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 51, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
• 53. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 48 bis 52, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem Grüngewebe-spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem pPcR-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem pPcR-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 54. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 53, wobei die Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
• 55. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, umfasst.
• 56. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, codierend ein Klasse-MYB30-Polypeptid, wie in den Punkten 46 oder 47 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 57. Konstrukt gemäß Punkt 56, wobei eine der Steuerungssequenzen ein Grüngewebe-spezifischer Promotor, vorzugsweise ein pPcR-Promotor, am stärksten bevorzugt ein pPcR-Promotor aus Reis, ist.
• 58. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 56 oder 57 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Emergenzwuchskraft im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 59. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 56 oder 57 transformiert ist.
• 60. Verfahren für die Produktion einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Emergenzwuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid codiert, wie in Punkt 46 oder 47 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 61. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Emergenzwuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, wie in Punkt 46 oder 47 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 62. Transgene Pflanze gemäß Punkt 55, 59 oder 61, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
• 63. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 62, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise vegetative Biomasse sind.
• 64. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 62 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 63 abgeleitet sind.
• 65. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, bei der Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere bei der Erhöhung von Biomasse und/oder Emergenzwuchskraft in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 66. Ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wobei das THOM-Polypeptid (i) eine ”N-terminale HD-ZIP”-Leucin-Zipper-Domäne, (ii) eine Homeobox-Domäne, (iii) eine mit der Homeobox-Domäne assoziierte HALZ-Leucin-Zipper-Domäne umfasst.
• 67. Verfahren gemäß Punkt 66, wobei das THOM-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 12, SEQ ID NR: 124, (ii) Motiv 13, SEQ ID NR: 125, (iii) Motiv 14, SEQ ID NR: 126.
• 68. Verfahren gemäß Punkt 66 oder 67, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
• 69. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 66 bis 68, wobei die Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A4 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
• 70. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 66 bis 69, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Proteine codiert.
• 71. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 66 bis 70, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 72. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 68 bis 71, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 73. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 66 bis 72, wobei die Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Solanaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Solanum, am stärksten bevorzugt aus Solanum lycopersicum ist.
• 74. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 66 bis 73, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, umfasst.
• 75. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 65 oder 66 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 76. Konstrukt gemäß Punkt 75, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
• 77. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 75 oder 76 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 78. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 75 oder 76 transformiert ist.
• 79. Verfahren für die Produktion einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wie in Punkt 66 oder 67 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und entwicklung fördern.
• 80. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wie in Punkt 66 oder 67 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 81. Transgene Pflanze gemäß Punkt 74, 78 oder 80, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 82. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 81, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 83. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 81 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 82 abgeleitet sind.
• 84. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 85. Ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 2 (BIHD2)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das BIHD2-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird, aufweist, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
• 86. Verfahren gemäß Punkt 85, wobei das BIHD2-Polypeptid umfasst: (i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356; (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563; und (ii) mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne.
• 87. Verfahren gemäß Punkt 85 oder 86, wobei das BIHD2-Polypeptid ein Polypeptid ist, umfassend eine Domäne mit mindestens 50 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu beliebigen der Domänen i) eine Homeobox-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR0001356; (ii) eine POX-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR006563, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A5 vorhanden, vorzugsweise wie in SEQ ID NR: 193 vorhanden.
• 88. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 87, wobei das BIHD2-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A5 hierin angegeben sind, aufweist.
• 89. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 88, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, durch eine beliebige der in Tabelle A5 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID-NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A5 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID-NRn in der Lage ist, repräsentiert wird.
• 90. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 89, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
• 91. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 90, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere beliebige aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
• 92. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 91, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 93. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 92, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex.
• 94. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 93, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist.
• 95. Verfahren gemäß Punkt 94, wobei der konstitutive Promotor vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem Pflanzen-abgeleiteten Promotor, am stärksten bevorzugt aus Reis, ist.
• 96. Verfahren gemäß Punkt 94, wobei der konstitutive Promotor vorzugsweise ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie durch SEQ ID NR: 248 repräsentiert, ist.
• 97. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 96, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus einer Leguminosen-Pflanze, stärker bevorzugt aus der Gattung Medicago, am stärksten bevorzugt aus Medicago truncatula ist.
• 98. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes, ein BIHD2-Polypeptid codierendes Nukleinsäure-Transgen, das funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, umfasst.
• 99. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein BIHD2-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 85 bis 90 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 100. Konstrukt gemäß Punkt 99, wobei die Steuerungssequenz ein konstitutiver Promotor ist.
• 101. Verwendung eines Konstrukts gemäß den Punkten 99 oder 100 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften eines oder mehrere sind von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex.
• 102. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 98 oder 99 transformiert ist.
• 103. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein BIHD2-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 85 bis 90 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 104. Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz resultieren, die in funktionsfähiger Verknüpfung an einen konstitutiven Promotor ein BIHD2-Polypeptid codiert, wie es in einem beliebigen der Punkte 85 bis 90 definiert ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 105. Transgene Pflanze gemäß Punkt 98, 102 oder 104, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
• 106. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 105, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
• 107. Produkte, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 105 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 106 abgeleitet sind.
• 108. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 84 bis 89 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Gesamtzahl an Samen oder erhöhtem Ernteindex, umfassen.
• Beschreibung der Figuren
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
• 1 die Decarboxylierungs-Reaktion, die von ODC-Polypeptiden katalysiert wird, repräsentiert.
• 2A ein Alignment von beta/alpha-Barrel-Decarboxylase-Polypeptiden zeigt.
• 2B zeigt einen phylogenetischen Baum von beta/alpha-Barrel-Decarboxylase-Polypeptiden.
• 3 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, von (einer) ODC-codierenden Nukleinsäure(n) unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
• 4 ist ein phylogenetischer Baum aus Luo et al. (2005; Plant Biol. 7: 459–468). Er zeigt, dass das Reis-BIHD1-Polypeptid sich bei der BELL 1-Unterfamilie von Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren, und nicht bei den anderen Unterfamilien, wie den Homeodomänen-Polypeptiden Knotted1, glabra2, HD-Zip und PHD-HDrobust, einordnet.
• 5 zeigt die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus, der mindestens eine Coiled-Coil-Domäne im BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, vorhersagt. Die X-Achse repräsentiert die Aminosäurerest-Koordinaten, die Y-Achse die Wahrscheinlichkeit (im Bereich von 0 bis 1), dass eine Coiled-Coil-Domäne vorhanden ist, und die drei Linien die drei untersuchten Fenster (14, 21, 28).
• 6 zeigt ein AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der BIHD1-Polypeptide von Tabelle A2. Die PFAM-Homeobox-Domäne PF00046 (integriert bzw. ”intergratiert” in InterPro-Zugangsnummer IPR0001356) und die PFAM-POX-Domäne PF07526 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0006563) sind durch X'e unterhalb der Consensus-Sequenz identifiziert. Die konservierten SKY- und VSLTLGL-Motive sind ebenfalls durch X'e unter der Consensus-Sequenz markiert. Die drei Helizes, die innerhalb der Homeodomäne enthalten sind, sind durch eine schwarze fettformatierte Linie über den alignierten Sequenzen gezeigt. Die konservierten Aminosäuren PYP und WF, von denen angenommen wird, dass sie direkt mit der DNA-Zielsequenz Wechselwirken, sind durch ihren Einzel-Aminosäure-Code identifiziert.
• 7 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, unter der Steuerung eines samenspezifischen Promotors (pWSI18 oder pRAB21) aus Reis.
• 8 repräsentiert die Domänenstruktur, seq von SEQ ID NR: 89.
• 9 repräsentiert ein Mehrfach-Alignment von MYB30-Polypeptiden.
• 10 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer MYB30-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-Protochlorophyllid-Reductase-Promotors (pPcR).
• 11 repräsentiert die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 123 mit konservierten Motiven oder Domänen: fett formatiert: HD-ZIP-Domäne, unterstrichen: Homeobox(HOX)-Domäne, kursiv formatiert: Homeobox-assoziierter Leucin-Zipper (HALZ).
• 12 repräsentiert ein Mehrfach-Alignment von THOM-Polypeptiden. SEQ ID NR: 123 ist durch Le_THOM wiedergegeben.
• 13 repräsentiert den binären Vektor, verwendet für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer THOM-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
• 14 zeigt ein AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der BIHD2-Polypeptide von Tabelle A5. Die PFAM-Homeobox-Domäne PF00046 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0001356) und die PFAM-POX-Domäne PF07526 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0006563) sind identifiziert. Die konservierten Aminosäuren PYP und WF, von denen angenommen wird, dass sie direkt mit der DNA-Zielsequenz Wechselwirken, sind durch ihren Einzel-Aminosäure-Code identifiziert (unterstrichen).
• 15 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, unter der Steuerung des konstitutiven Promotors GOS2 aus Reis.
• Beispiele
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
• DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
• Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 66 oder SEQ ID NR: 67 oder SEQ ID NR: 88 oder SEQ ID NR: 89 oder SEQ ID NR: 122 oder SEQ ID NR: 123 oder SEQ ID NR: 192 oder SEQ ID NR: 193 verwandt sind
• Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 66 oder SEQ ID NR: 67 oder SEQ ID NR: 88 oder SEQ ID NR: 89 oder SEQ ID NR: 122 oder SEQ ID NR: 123 oder SEQ ID NR: 192 oder SEQ ID NR: 193 verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 66 oder SEQ ID NR: 88 oder SEQ ID NR: 122 oder SEQ ID NR: 192 codierte Polypeptid, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen wurden die Vorgabeparameter angepasst, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel wurde der E-Wert erhöht, so dass weniger stringente. Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise wurden kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert.
• Die Tabelle A1 gibt eine Liste von Sequenzen an, die mit der ODC-Sequenz von SEQ ID NR: 1 und/oder SEQ ID NR: 2 verwandt sind. Tabelle A1: Beispiele von ODC-Polypeptiden:

  Name der Sequenz	Pflanzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR	Protein SEQ ID NR
  N.tabacum ODC_(Nicta_ODC)	Nicotiana tabacum	1	2
  A.anophagefferens 27655	Aureococcus anophagefferens	3	4
  A.formosa TA15389	Aquilegia formosa	5	6
  C.annuum AAL83709	Capsicum annum	7	8
  C.reinhardtii 195696	Chlamydomonas reinhardtii	9	10
  C.reinhardtii XP 001697502	Chlamydomonas reinhardtii	11	12
  D.stramonium CAA61121	Datura stramonium	13	14
  G.max CAD91349	Glycine max	15	16
  G.max CAD91350	Glycine max	17	18
  L.japonicus CAE02644	Lotus japonicus	19	20
  N.benthamiana BAF91874	Nicotiana benthamiana	21	22
  N.glutinosa AAG45222	Nicotiana glutinosa	23	24
  O.anatinus XP 001513468	Ornithorhynchus anatinus	25	26
  O.sativa Os04g0136500	Oryza sativa	27	28
  O.sativa Os09g0543400	Oryza sativa	29	30
  P.tricornutum 12642	Phaeodactylum tricomutum	31	32
  S.lycopersicum TA39775	Solanum lycopersicum	33	34
  S.pombe CAB45689	Schizosaccharomyces pombe	35	36
  S.tuberosum TA25894	Solanum tuberosum	37	38
  T.cacao ABN04356	Theobroma cacao	39	40
  T.maritima ODC NP 229669	Thermotoga maritima	41	42
  V.carteri 84542	Volvox carteri	43	44
  V.vinifera GSVIVT00016806001	Vitis vinifera	45	46
  V.vulnificus LODC NP 762948	Vibrio vulnifcus	47	48
  X.laevi NP 001080167	Xenopus laevi	49	50
  Chlre_ODC	Chlamydomonas reinhardtii	62	63

• Die Tabelle A2 gibt eine Liste von Sequenzen an, welche mit der verwendeten Sequenz SEQ ID NR: 66 und/oder SEQ ID NR: 67 verwandt sind. Tabelle A2: Beispiele von BIHD1-Polypeptidsequenzen, und codierende Nukleinsäuresequenzen:

  Name	Quellorganismus	Öffentliche Datenbank Zugangsnummer	Nukleinsäure SEQ ID NR	Protein SEQ ID NR
  Orysa_BIHD1	Oryza sativa	AY524972.1	66	67
  Orysa_BEL1-like II HD	Oryza sativa	NM_001073895	68	69
  Zeama_BEL1-like HD	Zea mays	AC212186.2	70	71
  Gymco_BIHD1	Gymnadenia conopsea	EF051330	72	73
  Soltu_BEL30	Solanum tuberosum	AF406703	74	75
  Vitvi_BEL1-like HD	Vitis vinifera	AM436871	76	77
  Medtr_BEL1-like_HD	Medicago truncatula	AC159535	78	79
  Arath_BHL1	Arabidopsis thaliana	NM_001036413	80	81
  Arath_BHL6	Arabidopsis thaliana	NM_119627	82	83

• Die Tabelle A3 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit SEQ ID NR: 88 und/oder SEQ ID NR: 89 verwandt sind. Tabelle A3: Beispiele von MYB30-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

  Name	Ursprungs-Spezies	Nukleinsäure SEQ ID NR	Protein SEQ ID NR
  MYB30_1	Arabidopsis thaliana	88	89
  At3g28910	Arabidopsis thaliana	90	91
  AT1G08810	Arabidopsis thaliana	92	93
  AT1G74650	Arabidopsis thaliana	94	95
  AT3G47600	Arabidopsis thaliana	96	97
  AT5G62470	Arabidopsis thaliana	98	99
  LOC_Os03g26130_11973.m07957_CDS	Oryza sativa	100	101
  LOC_Os07g43580_11977.m08585_CDS	Oryza sativa	102	103
  LOC_Os08g33940	Oryza sativa	104	105
  LOC_Os09g24800_11979.m05634_CDS	Oryza sativa	106	107
  LOC_Os11g03440_11981.m04539_CDS	Oryza sativa	108	109
  LOC_Os12g03150_11982.m04313_CDS	Oryza sativa	110	111
  Poplar MYB30	Populus trichocarpa	112	113
  Zea MYB30	Zea mays	114	115

• Die Tabelle A4 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit SEQ ID NR: 122 und/oder SEQ ID NR: 123 verwandt sind. Tabelle A4: Beispiele von THOM-Polypeptiden:

  Pflanzen-Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
  Solanum lycopersicum	122	123
  Populus trichocarpa	134	163
  Populus trichocarpa	135	164
  Populus trichocarpa	136	165
  Solanum lycopersicum	137	166
  Solanum lycopersicum	138	167
  Zea mays	139	168
  Populus trichocarpa	140	169
  Populus trichocarpa	141	170
  Arabidopsis thaliana	142	171
  Arabidopsis thaliana	143	172
  Arabidopsis thaliana	144	173
  Arabidopsis thaliana	145	174
  Oryza sativa	146	175
  Populus trichocarpa	147	176
  Oryza sativa	148	177
  Oryza sativa	149	178
  Oryza sativa	150	179
  Oryza sativa	151	180
  Glycine max	152	181
  Triticum aestivum	153	182
  Medicago truncatula	154	183
  Arabidopsis thaliana	155	184
  Craterostigma plantagineum	156	185
  Pimpinella brachycarpa	157	186
  Arabidopsis thaliana	158	187
  Silene latifolia	159	188
  Populus trichocarpa	160	189
  Picea sitchensis	161	190
  Glycine max	162	191

• Die Tabelle A5 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle A5: Beispiele von BIHD2-Polypeptidsequenzen, und codierende Nukleinsäuresequenzen:

  Name	SEQ ID NR: Nukleinsäure	SEQ ID NR: Polypeptid
  M.sativa_BHID2	192	193
  A_thaliana_AT2G27990_1_1	194	195
  G_gnemon_AJ318871_1	196	197
  O_sativa_indica_BGIOSIBCE004273_1	198	199
  O_sativa_indica_BGIOSIBCE012511_1	200	201
  O_sativa_indica_BGIOSIBCE019267_1	202	203
  O_sativa_LOC_Os01g62920_1_1	204	205
  O_sativa_LOC_Os03g47730_1_1	206	207
  O_sativa_LOC_Os05g38120_1_1	208	209
  O_sativa_Os01g0848400_1	210	211
  O_sativa_0s03g0680700_1	212	213
  O_sativa_0s05g0455200_1	214	215
  O_sativa_TA50671_4530_1	216	217
  O_sativa_TA55403_4530_1	218	219
  P_trichocarpa_558279_1	220	221
  P_trichocarpa_scaff_IX_1538_1	222	223
  P_trichocarpa_scaff_IX_1539_1	224	225
  S_bicolor_5257689_1	226	227
  S_bicolor_5266102_1	228	229
  S_bicolor_5289797_1	230	231
  TMxxx5170	232	233
  TMxxx6639	234	235
  V_vinifera_GSVIVT00018398001_1	236	237
  V_vinifera_GSVIVT00021404001_1	238	239
  V_vinifera_GSVIVT00024567001_1	240	241
  Z_mays_TA211699_4577_1	242	243
  Z_mays_ZM07MC19826_BFb0096N05_19776_1	244	245

• In manchen Fällen sind Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann ebenfalls verwendet werden, um derartige Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”.
• Beispiel 2: Alignment der Polypeptidsequenzen
• 2.1. Alignment von ODC-Polypeptidsequenzen
• Das Alignment von ausgewählten beta/alpha-Barrel-Decarboxylase-Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment (Larking et al., Bioinformatics. 1. Nov. 2007; 23(21): 2947–8. Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) durchgeführt. Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62. Ein Alignment von Proteinen ist in der 2A angegeben.
• Ein phylogenetischer Baum von ODC-Polypeptiden (2B) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm Clustal W zur Verfügung gestellt wird. ODC-Polypeptide lassen sich getrennt von sonstiger Decarboxylase, wie etwa ADC, CANSDC und DAPCD, einordnen.
• 2.2 Alignment von BIHD1-Polypeptidsequenzen
• Ein Mehrfach-Sequenzalignment von allen der BIHD1-Polypeptidsequenzen in Tabelle A2 wurde mit Hilfe des Algorithmus AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die PFAM-Homeobox-Domäne PF00046 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0001356) und die PFAM-POX-Domäne PF07526 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0006563) sind durch X'e unterhalb der Consensus-Sequenz identifiziert. Die konservierten SKY- und VSLTLGL-Motive sind ebenfalls durch X'e unter der Consensus-Sequenz markiert. Die drei Helizes, die innerhalb der Homeodomäne enthalten sind, sind durch eine schwarze fettformatierte Linie über den alignierten Sequenzen gezeigt. Die konservierten Aminosäuren PYP und WF, von denen angenommen wird, dass sie direkt mit der DNA-Zielsequenz Wechselwirken, sind durch ihren Einzel-Aminosäure-Code identifiziert.
• 2.3: Alignment von MYB30-Polypeptidsequenzen
• Ein Alignment von MYB30-Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte sind wie folgt: der Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) beträgt 10, der Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) beträgt 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments kann eine geringfügige Editierung von Hand vorgenommen werden. Die Sequenzkonservierung zwischen MYB30-Polypeptiden liegt im Wesentlichen eher in der SANT- oder in der MYB_DNA-Bindungs-Domäne der Polypeptide, als in der Region außerhalb der Domäne vor. Die MYB30-Polypeptide von Tabelle A3 sind in der 9 aligniert. Beispiele von phylogenetischen Bäumen von MYB30-Polypeptiden sind in der 2 von Stracke et al. 2001 (Arabidopsis thaliana-MYB-Proteine) und in 8 und den ergänzenden Daten von Jiang et al. 2004 (Arabidopsis thaliana- und Oryza sativa-MYB-proteins) angegeben.
• 2.4. Alignment von THOM-Polypeptidsequenzen
• Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2) durchgeführt. Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die Sequenzkonservierung zwischen THOM-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der Homeobox-Domäne und der assoziierten HALZ-Leucine-Zipper-Domäne im C-terminalen Teil der Polypeptide. Die N-terminale HD-ZIP-Domäne ist weniger konserviert. Die THOM-Polypeptide sind in der 12 aligniert.
• 2.5. Alignment von BIHD2-Polypeptidsequenzen
• Ein Mehrfach-Sequenzalignment von allen der BIHD2-Polypeptidsequenzen in Tabelle A5 wurde mit Hilfe des Algorithmus AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die PFAM-Homeobox-Domäne PF00046 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0001356) und die PFAM-POX-Domäne PF07526 (integriert in InterPro-Zugangsnummer IPR0006563) sind unterhalb der Consensus-Sequenz identifiziert. Die GPFTGY-Box, die SNWFINARV-Box, die RGLP-Box und die konservierten HFLHPYP-Boxen, oder auch Motive genannt, sind auf der Consensus-Sequenz durch ihren Einzel-Aminosäure-Code identifizierbar. Die konservierten Aminosäuren PYP und WF, von denen angenommen wird, dass sie direkt mit der DNA-Zielsequenz Wechselwirken, sind unterstrichen.
• Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1–B4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
• 3.1. Ornithin-Decarboxylase(ODC)-Sequenzen
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, ODC-Polypeptidsequenzen der Tabelle B1 kann so gering wie 39% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, sein.

  
• 3.2. BIHD1-Sequenzen
• Der Prozentsatz der Identität zwischen einer BIHD1-Volllängenpolypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, und anderen BIHD1-Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A2 zusammengestellt sind, beträgt um 35% oder mehr. Tabelle B2: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen von Tabelle A2.

  	1	2	3	4	5	6	7	8	9
  1. Orysa_BIHD1		78	76	46	42	46	37	35	40
  2. Zeama_BEL\like	87		74	44	42	43	36	34	38
  3. Orysa_BEL1 II	86	84		47	42	45	36	36	40
  4. Gymco_BIHD1	64	62	64		44	47	39	32	41
  5. Soltu_BEL30	59	58	60	60		58	39	34	40
  6. Vitvi_BEL1 HD	62	59	62	60	71		42	36	42
  7. Medtr_BEL1 HD	56	53	55	59	56	57		32	38
  8. Arath_BHL1	52	52	52	49	49	53	49		34
  9. Arath_BHL6	52	52	54	54	52	53	52	46

• 3.3. MYB30-Sequenzen
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, MYB30-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 37,8% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 89 (4. MYB30_1), sein. Tabelle B3: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

  Polypeptid-Name	1	2	3	4	5
  1. Poplar\MYB30\		39,4	50,5	55,7	56,0
  2. LOC_Os08g33940	51,8		53,7	37,8	38,1
  3. Zea\MYB30\	66,8	58,9		49,0	49,3
  4. MYB30_1	73,7	51,6	66,9		99,7
  5. At3g28910	73,7	51,6	66,9	100,0

• 3.4. THOM-Sequenzen
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, THOM-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 39% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 123 (Le_THOM), sein.
• Tabelle B4: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

  
• 
• Beispiel 4: Identifizierung von Domänen
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Die Datenbank Pfam ist eine große Sammlung von Proteinfamilien, jeweils repräsentiert durch Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle (HMMs). Proteine sind im Allgemeinen aus einer oder mehreren funktionellen Regionen aufgebaut, die gewöhnlich als Domänen bezeichnet werden. Verschiedene Kombinationen von Domänen führen zur Entstehung der vielfältigen Palette an Proteinen, die in der Natur zu finden sind. Die Identifizierung von Domänen, welche innerhalb von Proteinen vorkommen, kann deshalb Einblicke in ihre Funktion gewähren. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
• 4.1. ODC-Sequenzen
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 dargestellt.
• Die folgenden Interpro-Domänen wurden in SEQ ID NR: 2 gefunden: IPR000183 (Orn/DAP/Arg-Decarboxylase), IPR009006 (Alanin/Racemase/Gruppe/IV/Decarboxylase:C-terminal), IPR 002433 (Ornithin-Decarboxylase). Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert wird.

  Methode	Datenbank	Domäne Zg.-Nummer	Domäne Kurz-Name.	Aminosäurekoordinaten in SEQ ID NR 2	e-Wert
  FPrintScan	PRINTS*	PR01179	ODADCRBXLASE	T[93-111]	4,2E–33
  				T[113-125]	4,2E–33
  				T[216-229]	4,2E–33
  				T[296-315]	4,2E–33
  				T[405-418]	4,2E–33
  HMMPfam	Pfam	PF00278	Orn_DAP_Arg_deC	T[310-427]	5,3E–48
  HMMPfam	Pfam	PF02784	Orn_Arg_deC_N	T[71-307]	3,2E–80
  ProfileScan	PROSITE	PS00878	ODR_DC_2_1	T[93-111]	0,0
  ProfileScan	PROSITE	PS00879	ODR_DC_2_2	T[251-268]	0,0
  FPrintScan	PRINTS*	PR01182	ORNDCRBXLASE	T[65-89]	2,6E–66
  				T[91-118]	2,6E–66
  				T[135-159]	2,6E–66
  				T[165-187]	2,6E–66
  				T[331-344]	2,6E–66
  				T[372-382]	2,6E–66
  				T[392-405]	2,6E–66
  superfamily	Superfamily**	SSF50621	Racem_decarbox_C	T[301-419]	7,93E–16

  *PRINTS. Attwood et al. (2003) Nucleic Acids Research, 31(1), 400–402.
  **Superfamily Gough et al. (2001) J. Mol. Biol., 2. Nov.; 313(4): 903–19.
• 4.2. BIHD1-Sequenzen
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 67 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 67 repräsentiert wird

  InterPro Zugangsnummer und -name	Integrierte Datenbank, Name	Integrierte Datenbank, Zugangsnummer	Integrierte Datenbank, Zugangs-Name
  IPR0001356 Homeobox	Pfam	PF00046	Homeobox
  	SMART	SM00389	HOX
  	ProSite	PS50071	Homeobox_2
  	ProSite	PS00027	Homeobox_1
  IPR0006563 POX	Pfam	PF07526	POX
  	SMART	SM00574	POX
  No IPR integrated	PANTHER	PTHR11850	Homeobox-Protein Transkriptionsfaktoren
  	PANTHER	PTHR11850:SF14	BEL1 homeotisches Protein

• 4.3. MYB30-Sequenzen
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 89 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 89 repräsentiert wird.

  Datenbank	Zugangsnummer	Zugangs-Name	e-Wert	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 89
  HMMPfam	PF00249	Myb_DNA-binding	7,6e–11/1,3e–10	[14-61]T/[67-112]P
  HMMSmart	SM00717	SANT	1,6e–14/2,5e–15	[13-63]T/[66-114]T
  ProfileScan	PS00334	MYB_2	8e–5	[89-112]T
  ProfileScan	PS50090	MYB_3	17,058/15,179	[9-61]T/[62-112]P
  PANTHER	PTHR10641	MYB-RELATED	5e–92	[3-159]T

• 4.4. THOM-Sequenzen
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ. ID NR: 123 repräsentiert, sind in der Tabelle C4 dargestellt. Tabelle C4: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 123 repräsentiert wird.

  Datenbank	Zugangs-nummer	Zugangs-Name	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 123
  InterPro	IPR000047	Helix-Turn-Helix-Motiv, lambda-like-Repressor
  PRINTS	PR00031	HTHREPRESSR	157-182
  InterPro	IPR001356	Homeobox
  PRODOM	PD000010	Q7XC54_EEEEE_Q7XC54	130-187
  PRINTS	PR00024	HOMEOBOX	165-184
  PFAM	PF00046	Homeobox	131-185
  SMART	SM00389	HOX	128-190
  PROSITE	PS00027	HOMEOBOX_1	161-184
  InterPro	IPR003106	Leucin-Zipper, homeobox-assoziiert
  PFAM	PF02183	HALZ	186-230
  SMART	SM00340	HALZ	186-229
  InterPro	IPR006712	HD-ZIP Protein, N-terminal
  PFAM	PF04618	HD-ZIP_N	1-107
  InterPro	IPR012287	Homeodomänen-verwandt
  GENE3D	G3DSA:1.10.10.60	keine Beschreibung	132-184
  PANTHER	PTHR19418	HOMEOBOX PROTEIN	103-191

• Das Vorhandensein von konservierten Domänen in SEQ ID NR: 123 wurde durch Suche in der Datenbank Pfam (Release 1.7) Finn et al. Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36: D281–D288, bestimmt.
• Die Ergebnisse der Pfam-Suche von der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird, sind in Tabelle C5 aufgeführt. Tabelle C5.

  Datenbank	Name	Aminosäure-Koordinate Start	Aminosäure-Koordinate Ende
  PF07526	POX	136	261
  PF00046	Homeobox	307	365

• Beispiel 5: Vorhersage der subzellulären Lokalisation der BIHD1-Polypeptidsequenzen und BIHD2-Polypeptidsequenzen
• Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen unter Verwendung von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucoronidase (GUS). Zum Beispiel wurde festgestellt, dass das Oryza sativa-BIHD1-Polypeptid hauptsächlich im Zellkern von Pflanzenzellen lokalisiert ist, wofür ein GFP-basiertes Vorgehen und transiente Expression in Zwiebelzellen angewandt wurden (Luo et al. (2005) siehe oben).
• Eine Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten wurde ebenfalls durchgeführt. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Schweizer Institut für Bioinformatik (Swiss Institute for Bioinformatics) bereitgestellt werden, beispielsweise PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere verfügbar.
• LOCtree ist ein Algorithmus, welcher die subzelluläre Lokalisierung und DNA-Bindungs-Neigung von Nicht-Membran-Proteinen in nicht-pflanzlichen und pflanzlichen Eukaryoten sowie Prokaryoten vorhersagen kann. LOCtree klassifiziert eukaryotische tierische Proteine in eine von fünf subzellulären Klassen, während pflanzliche Proteine in eine von sechs Klassen klassifiziert werden, und prokaryotische Proteine in eine von drei Klassen klassifiziert werden.
• Wann immer verfügbar, gibt LOCtree auch Vorhersagen auf Basis des folgenden an: 1) Zellkern-Lokalisationssignale, die durch den Algorithmus PredictNLS gefunden werden, 2) die Lokalisation, die unter Verwendung von im Protein gefundenen Prosite-Motiven und Pfam-Domänen abgeleitet wird, und 3) SWISS-PROT-Suchworte, die mit einem Protein assoziiert sind. In den letzten zwei Fällen wird unter Anwendung des Entropie-basierenden LOCkey-Algorithmus auf die Lokalisierung geschlossen. Die Software wird an der University of Columbia, USA, bereitgehalten. Motiv- und Suchwort-basierende Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines BIHD1-Polypeptides, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, unter Verwendung von LOCkey:

  Vorhergesagte Lokalisierung	Konfidenz	Alternative Vorhersage	SWISS-PROT-Schlagworte, verwendet zur Zuordnung der Lokalisierung
  Nukleär	100	-	Homeobox, DNA-bindend, Transkriptionsregulierung, Nukleäres Protein, Transkription, Repressor

• Beispiel 6: Vorhersage von Sekundärstruktur-Merkmalen der BIHD1-Polypeptidsequenzen und BIHD2-Polypeptidsequenzen
• Coiled-Coils enthalten üblicherweise ein wiederkehrendes Sieben-Aminosäurerest-Muster, das Heptad-Repeats genannt wird. Coiled-Coils sind wichtig, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Oligomerisierung, entweder von identischen Proteinen, von Proteinen der gleichen Familie oder von nicht-verwandten Proteinen zu identifizieren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage von Coiled-Coils aus Sequenzdaten gemacht worden. Viele dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen verfügbar. Einer von ihnen, COILS, ist ein Programm, das eine Sequenz mit einer Datenbank von bekannten parallel-zweisträngigen Coiled-Coils vergleicht und eine Ähnlichkeitswertung ableitet. Durch Vergleichen dieser Bewertung mit der Verteilung von Bewertungen in globulären und Coiled-Coil-Proteinen berechnet das Programm dann die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz eine Coiled-Coil-Konformation annehmen wird.
• 6.1. BIHD1-Sequenzen
• Das BIHD1-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 67, besitzt mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, in allen drei untersuchten Fenstern (14, 21 und 28). In der Tabelle D sind die Rest-Koordinaten, Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte gezeigt. in der 5 findet sich die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus über das Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert ist, wobei der vorhergesagte Coiled-Coil in allen drei Fenstern deutlich sichtbar ist (wie durch die drei Linien repräsentiert). Tabelle D: Numerische Ausgabe des COILS-Algorithmus hinsichtlich des Polypeptids, wie durch die SEQ ID NR: 67 repräsentiert. Die Restkoordinaten (#), Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte sind gezeigt.

  #	Rest	Fenster = 14	Wahrschein lichk.	Fenster = 21	Wahrschein lichk	Fenster = 28	Wahrscheinlichk.
  259	E	b	0,570	b	0,895	b	0,995
  260	I	c	0,570	c	0,895	c	0,995
  261	S	d	0,808	d	0,991	d	0,996
  262	A	e	0,995	e	0,997	e	0,999
  263	A	f	0,997	f	0,998	f	0,999
  264	E	g	0,997	g	0,999	g	0,999
  265	K	a	0,997	a	0,999	a	0,999
  266	Q	b	0,997	b	0,999	b	0,999
  267	E	c	0,997	c	0,999	c	0,999
  268	L	d	0,997	d	0,999	d	0,999
  269	Q	e	0,997	e	0,999	e	0,999
  270	N	f	0,997	f	0,999	f	0,999
  271	K	g	0,997	g	0,999	g	0,999
  272	M	a	0,997	a	0,999	a	0,999
  273	A	b	0,997	b	0,999	b	0,999
  274	K	c	0,997	c	0,999	c	0,999
  275	L	d	0,997	d	0,999	d	0,999
  276	M	e	0,997	e	0,999	e	0,999
  277	A	f	0,997	f	0,999	f	0,999
  278	M	g	0,978	g	0,999	g	0,999
  279	L	a	0,978	a	0,999	a	0,999
  280	D	b	0,975	b	0,999	b	0,999
  281	E	c	0,975	c	0,999	c	0,999
  282	V	d	0,771	d	0,999	d	0,999
  283	D	e	0,315	e	0,999	e	0,999
  284	R	f	0,261	f	0,999	f	0,999
  285	K	g	0,261	g	0,998	g	0,999
  286	Y	a	0,257	a	0,998	a	0,999
  287	K	b	0,257	b	0,998	b	0,999
  288	H	c	0,075	c	0,972	c	0,999
  289	Y	d	0,027	d	0,899	d	0,999
  290	Y	e	0,019	e	0,228	e	0,998
  291	H	f	0,019	f	0,122	f	0,995
  292	Q	g	0,019	g	0,122	g	0,995
  293	M	a	0,015	a	0,122	a	0,995
  294	Q	b	0,015	b	0,122	b	0,995
  295	I	c	0,002	c	0,021	c	0,883
  296	V	d	0,002	d	0,005	d	0,500
  297	V	e	0,001	e	0,002	e	0,055

• 6.2. BIHD2-Sequenzen
• Das Vorhandensein von Coiled-coil-Domänen in einem BIHD2-Polypeptid kann durch eine beliebige der oben erwähnten Techniken und Methoden bestimmt werden.
• Beispiel 7. Topologie-Vorhersage der THOM-Polypeptidsequenzen
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus (Emanuelsson et al., Nature Protocols 2, 953–971, (2007)). Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie von SEQ ID NR: 123 repräsentiert ist, sind in der Tabelle E wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der wie durch SEQ ID NR: 123 repräsentierten Polypeptidsequenz kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle E: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 123; cTP, Wahrscheinlichkeit einer Chloroplasten-Lokalisierung; mTP, Wahrscheinlichkeit einer mitochondrialen Lokalisierung; SP, Wahrscheinlichkeit eines Signalpeptids für den sekretorischen Weg; andere, Wahrscheinlichkeit einer anderen Lokalisierung (Zytoplasma, Zellkern); Loc, vorhergesagte Lokalisierung; RC, Zuverlässigkeitsklasse

  Name	Länge	cTP	mTP	SP	andere	Loc	RC
  Sequenz	286	0,414	0,125	0,051	0,538	-	5
  Cutoff		0,000	0,000	0,000	0,000

• Bei Anwendung des PLOC-Algorithmus (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003) wird vorhergesagt, dass das THOM-Polypeptid eine nukleäre Lokalisierung hat.
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark
• • PSORT (URL: psort. org)
• Beispiel 8. Funktion-Assays
• 8.1. ODC-Sequenzen
• Die Ornithin-Decarboxylase-Aktivität von SEQ ID NR: 2 wird gemäß Plant Physiol. Bd. 116, 1998, getestet. Kurz gesagt, wird die Decarboxylierung von radioaktiv markiertem Ornithin in transgenen Zellen über einen Zeitraum von 24 h gemessen. Der Einbau von [U-14C]Orn in markiertes Putrescin wird unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Eine modifizierte Herangehensweise aus Minocha et al. (1994), die für TLC(Dünnschichtchromatographie)-Auftrennung unter Verwendung größerer Mengen an Gewebe geeignet ist, wird für Dansylierung und Quantifizierung von Polyaminen verwendet.
• 8.2. BIHD1-Sequenzen
• In den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche BIHD1-Polypeptide weisen (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel, aber nicht notwendigerweise, transkriptionelle regulatorische Aktivität auf. DNA-bindende Aktivität kann leicht in vitro oder in vivo unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel, in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Das rekombinante BIHD1 aus Oryza sativa, das in Escherichia coli exprimiert wurde, bindet an das TGTCA-Motiv, welches die charakteristische cis-Element-DNA-Sequenz der Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren ist (Luo et al. (2005) siehe oben).
• 8.3. MYB30-Sequenzen
• MYB30-Proteinaktivität kann geassayt werden, wie durch Li und Parish (1995) beschrieben. Die MYB30 codierende Sequenz wird im Leseraster mit der T7-Gen 10-Leadersequenz kloniert und in E. coli exprimiert. Die Proteine werden gereinigt und in einem Mobilitätsretardations-Assay unter Verwendung von ³²P-markierter c-myb-Bindungsstelle (MBS) und der Bindungsstelle des Mais-P-Gen-Produkts (PBS) analysiert. Auf diese Weise werden die Bindungseigenschaften von MYB30-Polypeptiden und Abschnitten davon an die MBS- und PBS-Stelle ermittelt.
• 8.4. THOM-Polypeptide
• Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assays können gemäß Meijer et al. (2000) und Meijer et al. (Plant J. 11, 263–276, 1997) durchgeführt werden, was verdeutlicht wird mit Reis-HD-Zip-Proteinen: HD-Zip-cDNA-Sequenzen wurden im-Leseraster mit der GST-codierenden Sequenz in einen E. coli-Expressionsvektor einkloniert. E. coli-Übernachtkulturen (100 ml), welche die Expressionskonstrukte enthielten, wurden durch Hinzusetzen von IPTG zu 0,1 mM induziert. Nach 2 Stunden Wachstum bei 37°C wurden die Zellen pelletiert, in 1 ml NET-N-Puffer (20 mM TRIS-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet-P40, 1 mM PMSF, 0,5 μM Trypsininhibitor, 1 μM Leupeptin) resuspendiert und durch milde Schallbehandlung lysiert. Im Anschluß an Zentrifugation wurden 400 μl des geklärten Extrakts zu 150 μl einer 50%igen Glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia)-Schlämmung in NET-N-Puffer zugesetzt. Nach 60-minütiger Inkubation bei 4°C wurden die Sepharose-Kügelchen viermal mit dem Puffer NET-N gewaschen. GST-Fusionsproteine wurden dann durch Inkubation während 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 300 μl reduziertem Glutathion (10 mM) in 50 mM TRIS-HCl-Puffer, pH 8, eluiert und nach Zugeben von Glycerol zu 10% in flüssigem Stickstoff eingefroren. EMSA-Reaktionen enthielten 3 μg E. coli-Proteinextrakt, 0,1 ng ³²P-endmarkierte Sonde AH1 (CAATAATTG), variable Mengen an Kompetitor-DNAs und 3 μg Poly-(dIdC)-poly-(dIdC) in 10 1 μl Zellkern-Extraktionspuffer. Die Reaktionsmischungen wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend unter Spannung (10 V cm^–1) auf 5%ige Acrylamid/Bisacrylamid(37,5:1)-Gele in 0,5 × Tris-Borat/EDTA-Puffer aufgetragen. Gele wurden auf Whatman DE81-Papier getrocknet und autoradiographiert.
• 8.5. BIHD2-Sequenzen
• In den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche BIHD2-Polypeptide weisen (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel, aber nicht notwendigerweise, transkriptionelle regulatorische Aktivität auf. DNA-bindende Aktivität kann leicht in vitro oder in vivo unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel, in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Das rekombinante BIHD1 aus Oryza sativa, das in Escherichia coli exprimiert wurde, bindet an das TGTCA-Motiv, welches die charakteristische cis-Element-DNA-Sequenz der Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren ist (Luo et al. (2005) siehe oben).
• Beispiel 9: Genklonierung und Expressionsvektorkonstruktion
• Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
• 9.1. ODC-Sequenzen
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Nicotiana tabacum-Sämlingen verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren SEQ ID NR: 59; Sense: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaag caggcttaaacaatggccggccaaaca-3', und SEQ ID NR: 60; rückwärts, komplementär: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttacaggtggttcatcagcttg-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Danach wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, p Nicta_ODC, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Eintritts- bzw. Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 1 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 61) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::Nicta_ODC (3) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• Ähnlich zu dem oben beschriebenen Klonierungs-Vorgehen wurde SEQ ID NR: 62 mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte Chlamydomonas reinhardtii-cDNA-Bibliothek verwendet wurde. Die verwendeten Primer waren: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaaggaattgccaactc-3' (Sense) und 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaatcgcgaagtgctgtcac-3' (komplementär). SEQ ID NR: 62 wurde durch einen LR-Rekombinationsschritt in den Expressionsvektor pGOS2:Chlre_ODC übertragen, worin die Expression von Chlre_ODC unter der Steuerung des GOS2-Promotors steht.
• 9.2. BIHD1-Sequenzen
• Die Oryza sativa-cDNA, welche eine BIHD1-Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, codiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize cDNA verwendet wurde, die von mRNA synthetisiert wurde, welche aus Orysa sativa an verschiedenen Stadien des Wachstums, und unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, extrahiert worden war. Es wurden die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, für die PCR-Amplifikation verwendet: prm08627 (SEQ ID NR: 68, Sense):5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcagg cttaaacaatggctacttactactcgag-3', und prm08628 (SEQ ID NR: 69, rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaggccacaaaatcat-3'.
• Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (attB-Stellen beinhaltend) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Eintritts-Klon, welcher die SEQ ID NR: 66 umfasst, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Zwei Expressionsvektoren, sich unterscheidend [...] Ein Reis-WSI18-Promotor (SEQ ID NR: 84) für späte-embryo-spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. In einem zweiten Expressionsvektor war ein anderer Promotor, ein Reis-RAB21-Promotor (SEQ ID NR: 85) für samenspezifische Expression, stromaufwärts der Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren für samenspezifische Expression (5) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren unabhängig in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 9.3. MYB30-Sequenzen
• Die Nukleinsäuresequenz von MYB30_1 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren SEQ ID NR: 116 (Sense): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccatgtgattaaagcaaactcttca-3', und SEQ ID NR: 117 (rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccatgtgattaaagcaaactcttca-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Danach wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pMYB30, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Eintritts-Klon, welcher die SEQ ID NR: 88 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-Protochlorophyllid-Reductase-Promotor (pPcR) (SEQ ID NR: 118) für die Expression in grünem Gewebe war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pPcR::MYB30 (10) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 9.4. THOM-Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Tomaten-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm10162 (SEQ ID NR: 132; Sense, Startcodon in Fettdruck): 5'-gggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgag tagtgaaaaagaagatgg-3' und prm10163 (SEQ ID NR: 133; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacggatccatatttatctttc-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Danach wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pTHOM, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 122 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 131) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::THOM (13) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 9.5. BIHD2-Polypeptide
• Die Medicago sativa-cDNA, welche eine BIHD2-Polynukleotidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert, codiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize cDNA verwendet wurde, die von mRNA synthetisiert wurde, welche aus Medicago sativa an verschiedenen Stadien des Wachstums, und unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, extrahiert worden war. Es wurden die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, für die PCR-Amplifikation verwendet: prm08627 (SEQ ID NR: 212, Sense): 5'-ggggacaagttt gtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctgaggagggtttt-3', und prm08628 (SEQ ID NR: 213, rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttgcttagtta gtggattgaagat-3'. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (attB-Stellen beinhaltend) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Eintritts-Klon, welcher die SEQ ID NR: 192 umfasst, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Expressionsvektor, sich unterscheidend hinsichtlich des GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 245) für späte-embryo-spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor für konstitutive Expression (15) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren unabhängig in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• Beispiel 10: Pflanzentransformation
• Transformation von Reis
• Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
• Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
• Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
• Transformation von Mais
• Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Weizen
• Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Sojabohne
• Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ausäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Raps/Canola
• Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ausäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Alfalfa
• Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Baumwolle
• Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B4-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
• Beispiel 11: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
• 11.1 Auswertungsansatz
• Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, so dass die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
• Vier T1-Ereignisse wurden, unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation aber mit mehr Individuen pro Ereignis, in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048 × 1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Dürre-Screen
• Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fällt, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Screen der Stickstoffverwendungseffzienz
• Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Salzstress-Screen
• Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden Samen-bezogene Parameter gemessen.
• 11.2 Statistische Analyse: F-Test
• Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
• Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
• 11.3 Gemessene Parameter
• Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
• Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048 × 1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
• Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
• Messungen von Samen-bezogenen Parametern
• Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
• Beispiel 12: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
• 12.1 ODC-Sequenzen
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine Nicta_ODC (SEQ ID NR: 1)-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, wie bei der T1- und T2-Generation untersucht, sind nachstehend aufgeführt. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für oberirdische Biomasse (AreaMax), Emergenz-Wuchskraft (Frühwuchskraft oder EmerVigor), Gesamtsamenertrag, Anzahl gefüllter Samen und Gesamtzahl an Samen pro [...] beobachtet (Tabelle F1). Tabelle F1

  Parameter	% Erhöhung in transgener im Vergleich zur Kontrollpflanze
  AreaMax	11
  EmerVigor	30
  Gesamtgew. Samen	12
  Anz. gefüllter Samen	11
  Anz. insges. Samen	14

• Screen der Stickstoffverwendungseffzienz
• Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche Chlre_ODC-Nukleinsäure (SEQ ID NR: 62) unter den Bedingungen der Stickstoffverwendungseffizienz exprimieren, sind hier nachstehend präsentiert (Tabelle F2). Eine Erhöhung wurde für Gesamt-Samengewicht, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Ernteindex und Tausendkerngewicht beobachtet. Tabelle F2. Auswertung von transgenen Pflanzen, die mit pChlre_ODC transformiert sind.

  Parameter	% Zuwachs in transgener im Vergleich zur Kontrollpflanze
  AreaMax	30,8
  EmerVigor	33,4
  Gesamtgew. Samen	23,66
  Anz. gefüllter Samen	24,7
  Blüten pro Rispe	9,9
  Ernteindex	7,2
  Hauptrispe	14,77
  Höhe Max.	13,5
  GNbfFlow	9,3
  Anz. insges. Samen	24,9

• 13.2. BIHD1-Sequenzen
• Unter der Steuerung eines Reis-WSI18-Promotors
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T2-Generation-Reispflanzen, welche eine Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung eines WSI18-Promotors für samenspezifische Expression exprimieren und unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden, sind nachstehend angegeben.
• Es bestand eine Erhöhung bei der Frühwuchskraft, beim Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, bei der Anzahl gefüllter Samen, bei der Gesamtzahl an Samen und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle G gezeigt ist. Tabelle G: Ergebnisse der Auswertung von transgenen T2-Generation-Reispflanzen, welche eine Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung eines WSI18-Promotors für samenspezifische Expression exprimieren.

  Eigenschaft	Insgesamte durchschnittliche % Erhöhung in 4 Ereignissen in der T2-Generation
  Frühwuchskraft	24%
  Gesamt-Samenertrag pro Pflanze	13%
  Anzahl gefüllter Samen	14%
  Gesamtzahl an Samen	13%
  Ernteindex	8%

• Unter der Steuerung eines Reis-RAB21-Promotors
• Transgene Reispflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung eines Reis-RAB21-Promotors für samenspezifische Expression exprimieren, zeigten eine positive Tendenz für die folgenden ertragsbezogenen Eigenschaften: Frühwuchskraft, Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen, Gesamtzahl an Samen und Ernteindex.
• 13.3. MYB30-Sequenzen
• Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fiel, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine MYB30-Nukleinsäure unter den oben beschriebenen Dürre-Stress-Bedingungen exprimieren, sind hierin nachstehend dargestellt. Eine insgesamte Erhöhung von mehr als 5% für die oberirdische Biomasse (AreaMax) und für Emergenzwuchskraft (Frühwuchskraft) wurde offenbart (Tabelle H). Tabelle H. Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine MYB30-Nukleinsäure exprimieren

  Parameter	% Erhöhung bei den Transgenischen gegenüber der nullizygoten Kontrolle
  Emervigor	19,9

• 13.4. THOM-Sequenzen
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine THOM-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend dargestellt. Eine signifikante Erhöhung wurde für Gesamtsamenertrag, Anzahl gefüllter Samen, Ernteindex und Tausendkerngewicht beobachtet (Tabelle I). Tabelle I:

  	T1-Pflanzen	T2-Pflanzen
  Parameter	Gesamte % Erhöhung	Gesamte % Erhöhung
  Gesamtsamenertrag	20,3	39,7
  Anzahl gefüllter Samen	16,9	30,4
  Ernteindex	11,3	11,8
  Tausendkerngewicht	2,6	2,4

• 13.5. BIHD2-Polypeptide
• Dürre-Screen
• Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fiel, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Unter der Steuerung des GOS2-Promotors
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1-Generation-Reispflanzen, welche eine Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung des Reis-GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren und unter den Dürre-Screen-Bedingungen, wie oben aufgeführt, wachsen gelassen wurden, sind nachstehend angegeben (Tabelle J). Tabelle J:

  Ertragseigenschaft	% Erhöhung in transgenen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
  Zeit bis z. Blühen	5,3
  Gesamtgew. Samen	37,1
  Füllrate	54,9
  Ernteindex	49,0
  Anz. gefüllte Samen	31,1

• ZUSAMMENFASSUNG
• Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben
• Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase(ODC)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein ODC-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1(BIHD1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit erhöhter Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30 codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB30-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM(Tomate-Homeobox)-Protein codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein THOM-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 2(BIHD2)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein BIHD2-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Seqenzauflistung

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (21)

1. Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, oder ein Benzothiadiazol-induziertes Homeodomäne 1 (BIHD1)-Polypeptid, wobei das BIHD1-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einem BIHD1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 67 repräsentiert, aufweist, oder ein MYB30-Polypeptid, wobei das MYB30-Polypeptid mindestens eine SANT-Domäne umfasst, oder ein THOM-Polypeptid, wobei das THOM-Polypeptid (i) eine ”N-terminale HD-ZIP”-Leucin-Zipper-Domäne, (ii) eine Homeobox-Domäne, (iii) eine mit der Homeobox-Domäne assoziierte HALZ-Leucin-Zipper-Domäne umfasst, oder ein Benzothiadiazolinduziertes Homeodomäne 2 (BIHD2)-Polypeptid, wobei das BIHD2-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einem BIHD2-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert, aufweist, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei sich das Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums von alpha/beta-Barrelgefalteten Basische-Aminosäure-Decarboxylase-Polypeptiden verwendet wird, eher bei den Ornithin-Decarboxylase umfassenden Ästen als bei Arginin-Decarboxylase-, Diaminopimelat-Decarboxylase- oder Carboxynorspermidin-Decarboxylase-Polypeptiden einordnen lässt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Sequenzen umfasst: (i) 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1; (ii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von einer beliebigen der Domänen, wie in der Tabelle C1 von Beispiel 4 dargestellt; (iii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 1: [N/G]AR[C/V]P[L/M][G/S][P/L]K[Y/F]GALPEE[V/A]EPLL[R/Q][A/T]A[Q/K][A/E][A/L][G/R]LTV[S/V]GVSFH[V/I]GSG (SEQ ID NR: 51); (iv) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 2: [K/D][D/Q][P/A]FYV[L/V]DL[G/A][E/V]VV[S/R]LMDQW[R/K/N][A/S] (SEQ ID NR: 52); (v) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 3: RI[V/I][F/Y]ANPCK[P/R]ES[D/H]I[I/K/R][Y/F]AA[K/S]VGVNLTT[Y/F]DSEDE[V/L][Y/E]K[I/V][R/A/K]KHHP (SEQ ID NR: 53); (vi) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 4: EY[W/Y]I[N/D]DG[L/V/I]YGS[F/M/L]NC[I/V]L[Y/F]DHAT (SEQ ID NR: 54); (vii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 5: EYVLSLG[V/I]SPD (SEQ ID NR: 55); (viii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 6: AI[A/E]AA[K/R]EVF[E/D][T/A]A[A/S][K/Q/R][L/F]G[M/L][P/S][K/R/P]M[T/R]VL[D/N][I/V]GGGFT[S/A]G[H/P]QF[T/E][T/E]AA[A/V][A/K/V][V/I][K/N][S/A] (SEQ ID NR: 56); (ix) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 7: [G/I]G[G/A]AP[P/T/V]AAAA[A/E][EN][N/D/G][G/H]TRKV[V/I]PLS[R/K]DALQDFM [V/L]SIITQKLQD[E/D] (SEQ ID NR: 57); (x) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 8: QT[V/I]IVSGLNPAAILQ (SEQ ID NR: 58).
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure oder dem Komplement davon in der Lage ist.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte(n) Sprossbiomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Kultivierungsbedingungen mit Stickstoffmangel erhalten werden.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
10. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt aus Nicotiana tabacum ist.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden, Anspruch erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, umfasst.
12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in den Ansprüchen 1, 2 oder 3 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
13. Konstrukt gemäß Anspruch 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
18. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 20 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 20 abgeleitet sind.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein Ornithin-Decarboxylase-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Spross- und/oder Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

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