DE112009001667T5

DE112009001667T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE112009001667T5
Application number: DE112009001667T
Authority: DE
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero; Yves Hatzfeld; Christophe Reuzeau
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2011-09-29
Also published as: AU2009272815A1; US9175303B2; MX2011000483A; CN102099480A; CA2730538A1; AU2009272815B2; AR074636A1; BRPI0916207A2; EP2313508A1; EP2657341A3; WO2010007035A1; EP2313508B1; US20110131684A1; EP2657341A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die eine MSR (Methionin_Sulfoxid_Reductase) codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die eine MSR codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene [Eigenschaften] im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die eine Enolase codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die eine Enolase codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Noch weiter betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die einen ZAT-like-Zinktransporter codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die einen ZAT-like-Zinktransporter codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Noch darüber hinaus, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die 6-PGDH(6-Phosphogluconat-Dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase)-Polypeptid codiert,...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die eine MSR (Methionin_Sulfoxid_Reductase) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die eine MSR codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene [Eigenschaften] im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die eine Enolase codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die eine Enolase codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Noch weiter betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die einen ZAT-like-Zinktransporter codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die einen ZAT-like-Zinktransporter codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Noch darüber hinaus, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die 6-PGDH(6-Phosphogluconat-Dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstums-Charakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz, und anderen, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Frühwuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten dar, die in industriellen Verfahren verwendet werden. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums von Sämlingen). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl bei gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Eine weitere wichtige Eigenschaft ist jene der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
Eine Vorgehensweise zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
In Bezug auf MSR-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, welche eine MSR (Methioninsulfoxid-Reductase) in einer Pflanze codiert, moduliert.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die eine Enolase in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide, ist jetzt festgestellt worden, dass ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen gesteigert werden können, indem man die Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, welche einen ZAT-like-Zinktransporter in einer Pflanze codiert, moduliert.
Hintergrund
1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
Sauerstoff ist für alle aeroben Organismen essentiell, kann aber auch viele schädliche Effekte aufweisen. Die Oxidation von Methioninresten in einem Protein oder einem Peptid ist mit mehreren ernsthaften Zuständen in Menschen in Verbindung gebracht worden, einschließlich Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, rheumatoide Arthritis, Emphysem bei Rauchern und Morbus Alzheimer. Es gibt jetzt zunehmend Beweise, dass die enzymatische Reparatur von oxidierten Methioninresten eine ausschlaggebende schützende Rolle in Organismen, welche von Bakterien bis zu Menschen reichen, spielen kann (El Hassouni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 887–892). Zusätzlich dazu, dass sie die häufigste Form von oxidativem Schaden an Proteinen ist, ist die Oxidation von Methionin zu Methioninsulfoxid (MetSO) dahingehend einzigartig, dass sie leicht durch das Enzym Peptid-Met-Sulfoxid-Reduktase (MSR; EC 1.8.4.11) reversibel ist, was nahelegt, dass MRS in der Lage sein kann, oxidativ beschädigte Proteine in vivo zu reparieren (Brot et al., Anal. Biochem. 1982b; 122: 291–294).
Die Methionin-Sulfoxid-Reduktase(Msr)-Familie besteht aus zwei monomeren Enzymen, welche MsrA und MsrB genannt werden, die oxidierte Methioninreste in einem Peptid (Peptid-L-Methionin(S)-S-Oxid) reduzieren. MsrA und MsrB zeigen spezifische Stereoselektivitäten gegenüber dem Sulfoxid. Beide Isoformen tragen zum Schutz der Zelle gegen den Stress bei, welcher durch die Oxidation von Met-Resten am Schwefelatom erzeugt wird, und sind dafür notwendig, wobei sie typischerweise ein racemisches Gemisch aus den zwei Stereoisomeren darstellen.
Darüber hinaus haben die MsrA- und MsrB-Typen den gleichen chemischen Reaktionsmechanismus gemeinsam, welcher drei Schritte, mit (1) Bildung eines Sulfensäure-Intermediats mit einer einhergehenden Freisetzung von 1 Mol Methionin pro Mol Enzym; (2) Bildung einer intramonomerischen Disulfid-Msr-Bindung, gefolgt von; (3) Reduktion des oxidierten Msr durch Thioredoxin (Trx), einschließt. Die aktiven Stellen beider Msr's sind effizienter für die Bindung von proteingebundenem Methioninsulfoxid (MetSO) als von freiem MetSO angepasst (Boschi-Muller et al., Biochim. Biophys. Acta (2005); 1703: 231–238; Boschi Muller et al., 2008, Arch. Biochem. Biophys. 15; 474(2): 266–73). In einer Anzahl von Bakterien sind die MSRA- und MSRB-Domänen fusioniert (Kryukov et al., 2002, PNAS 99: 4245–4250).
In Pflanzenzellen sind mehrere MSR-Protein-Isoformen, sowohl vom Typ A als auch B, vorhanden. Die Isoformen können in einem unterschiedlichen subzellulären Kompartiment lokalisiert sein, wie etwa Cytosol, Chloroplast oder sekretorischer Weg. Eine phylogenetische Analyse enthüllte, dass der A- und B-Typ sich so evolviert haben, dass zwei MSR-A- und MSR-B-Untergruppen unterschieden werden können. Sie unterscheiden sich im Wesentlichen hinsichtlich der Anzahl und hinsichtlich der Position der an Katalyse und Enzym-Regeneration beteiligten Cysteine, aber auch hinsichtlich der subzellulären Lokalisierung oder hinsichtlich der Intron/Exon-Verteilung des Gens, welches die Isoform codiert. MSR-A- und MSR-B-Isoformen tragen zu einer insgesamten enzymatischen MSR-Aktivität in Pflanzenzellen bei, wie es durch Sanchez at al., 1983, Plant Physiol. 73: 619–623; Bechtold et al., 2004, Plant Cell 16: 908–919, gemessen wurde. In funktioneller Hinsicht scheinen die pflanzlichen MSR's, einschließlich Typ A und B, Schlüsselkomponenten bei der Verhinderung von Schäden an Proteinen unter schroffen Umweltanforderungen, welche bekanntermaßen -ROS in Plastiden erzeugen (Romero et al., 2004, Plant Physiol. 136: 3784–3794), oder bei Pathogeninfektion (Sanchez et al., 1983), jedoch ebenfalls unter milderen Behandlungen, wie etwa langen Nachtperioden (Bechtold et al., 2004), darzustellen.
2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase) ist ein essentielles glycolytisches Enzym, das die wechselseitige Umwandlung von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat katalysiert. Enolase-Proteine codierende Gene sind von Prokaryoten bis zu Eukaryoten konserviert. In Wirbeltieren sind die Isoenzyme alpha, beta und gamma vorhanden: alpha ist in den meisten Geweben vorhanden; beta ist in Muskelgewebe lokalisiert; und gamma findet sich lediglich in Nervengewebe. Das funktionelle Enzym existiert als ein Dimer von beliebigen 2 Isoformen: in unreifen Organen und in adulter Leber ist es üblicherweise ein alpha-Homodimer; in adultem Skelettmuskel ein beta-Homodimer; und in adulten Neuronen ein gamma-Homodimer; in sich entwickelndem Muskel ist es üblicherweise ein alpha/beta-Heterodimer; und beim sich entwickelnden Nervensystem ein alpha/gamma-Heterodimer. Die gewebespezifischen Formen zeigen kleinere kinetische Unterschiede. In Pflanzen stiegen die Spiegel an Enolase-Transkripten sowie die Aktivität berichtetermaßen in Antwort auf abiotische Stressformen, wie Salz-, Nieder- und Hochtemperatur- und Anaerob-Stressformen (Forsthoefel et al., 1995; Plant Physiol. 108(3): 1185–1195). In Tierzellen ist es ebenfalls bekannt gewesen, dass Enolase als ein Transkriptionsfaktor wirkt, welcher die Expression von c-myc durch Bindung an den c-myc-Genpromotor unterdrückt.
In höheren Pflanzen ist Enolase, wie andere glycolytische Enzyme, als mehrere Isoformen vorhanden, welche auf das Cytosol und auf Plastiden lokalisiert werden. Zusätzlich zu seiner essentiellen Rolle in der Glycolyse und der Gluconeogenese in Pflanzen erfüllt Enolase spezialisierte Rollen in Prozessen mit hoher Anforderung hinsichtlich Kohlenstoff-Fluss durch die Glycolyse, wie etwa der Fruchtreifung (Van Der Straeten et al., 1991; Plant Cell, 3:, 719–735) und dem Wachstum unter Anaerobiose-Bedingungen. Die Exposition von Pflanzen an einen anaeroben Stress bedingt eine Verschiebung von einem oxidativen zu einem fermentativen Modus des Kohlehydrat-Stoffwechsels, was zu einer erhöhten Expression vieler Enzyme des glycolytischen Weges führt (Lal et al.; 1998, Plant Physiol., Dez. 1998; 118(4): 1285–93).
In Tierzellen wurde von einem Teil des Enolase-Proteins gezeigt, an das Promotorelement des c-myc-Gens zu binden und die c-myc-Expression zu unterdrücken (Subramanian et al., 2000; J. Biol. Chem., 275:, 5958–5965). In ähnlicher Weise kann ein aus Pflanzen abgeleitetes Enolase-Protein, das LOS2-Protein, an den c-myc-Promotor als auch an den Promotor des Zinkfinger-STZ/ZAT10 von Arabidopsis binden. Die charakteristischen DNA-Bindungs- und Repressorprotein-Domänen von Enolasen sind zwischen der humanen alpha-Enolase und der Arabidopsis-LOS2-Enolase konserviert. Das LOS2-Enolase-Protein spielt, so wurde vorgeschlagen, eine Rolle bei der Steuerung von Genexpression unter Niedertemperatur-Stress in Arabidopsis thaliana (Lee et al., 2002; EMBO J. 21(11): 2692–2702). Die Arabidopsis thaliana-lost-Mutantenpflanzen wiesen berichtetermaßen Kälte- und Frostempfindlichkeit auf.
3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Van der Zaal et al., (Plant Physiology, März 1999, Band 119, S. 1047–1055) beschreiben einen ZAT-Zink-Transporter (wobei der Begriff ZAT abgeleitet ist aus Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana) mit 398 Aminosäureresten, von welchem vorhergesagt wird, sechs membranüberspannende Domänen aufzuweisen. Die Autoren analysierten transgene Pflanzen, welche die Arabidopsis thaliana-ZAT codierende Sequenz unter der Steuerung des Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotors enthielten. Es wurde berichtet, dass Pflanzen, welche mit ZAT in der Sense-Orientierung erhalten wurden, eine gesteigerte Zn-Resistenz und einen stark erhöhten Zn-Gehalt in den Wurzeln bei Aussetzung an hohes Zn aufwiesen. Antisense-mRNA-produzierende Pflanzen waren berichtetermaßen lebensfähig, bei einem Wildtyp-Spiegel von Zn-Resistenz und -Gehalt, wie auch Pflanzen, welche eine verkürzte codierende Sequenz exprimieren, der die C-terminale Domäne des Proteins fehlte.
Ramesh et al. (Plant Molecular Biology 54: 373–385, 2004) beschreiben die Effekte der Überexpression des Arabidopsis-Zinktransporters AtZIP1 in Hordeum vulgare cv. Golden Promise auf das Pflanzenwachstum, den Samenmineralgehalt und die Zinktransport-Raten. Die Autoren berichteten, dass es, in den Langzeit-Wachstumsexperimenten, keine signifikanten Unterschiede zwischen den transgenen und den Kontroll-Linien hinsichtlich des Blattzinkgehalts oder der Sprossbiomasse unter Bedingungen mit genügend Zink oder mangelndem Zink gab. Die Wurzel-zu-Spross-Verhältnisse waren berichtetermaßen in den transgenen Pflanzen, welche unter Bedingungen mit wenig Zink wachsen gelassen wurden, höher.
Da die in Ramesh et al. beschriebenen ZIP-Typ-Zinktransporter keinerlei signifikante Unterschiede zwischen transgenen und Kontroll-Linien hinsichtlich des Blattzinkgehalts oder der Sprossbiomasse unter Bedingungen mit genügend Zink oder mangelndem Zink ergaben, war es überraschend, festzustellen, dass ZAT-like-Zinktransporter gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften bei Modulierung der Expression eines ZAT-like-Zinktransporters in einer Pflanze ergaben.
4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.44) (6-PGDH) ist eine oxidative Carboxylase, welche die Decarboxylierungs-Reduktion von 6-Phosphogluconat zu Ribulose-5-phosphat in Gegenwart von NADP katalysiert. Dieses Enzym trägt zur Erzeugung eines erheblichen Ausmaßes des Reduzierungsvermögens (NADPH) in einer Zelle bei. Diese Reaktion ist eine Komponente des Hexose-Monophosphat-Nebenweges und der Pentosephosphat-Pfade (PPP); Broedel und Wolf, J. Bacteriol. 172, 4023–4031, 1990. Prokaryotische und eukaryotische 6PGD sind Proteine von etwa 470 Aminosäuren, deren Sequenz hochkonserviert ist; Adams et al., EMBO J. 2, 1009–1014, 1983. Das Protein ist ein Homodimer, in welchem die Monomere unabhängig wirken: jedes enthält eine große, hauptsächlich alpha-helikale Domäne und eine kleinere beta-alpha-beta-Domäne, welche ein gemischt-paralleles sowie anti-paralleles 6-strängiges beta-Blatt enthält. NADP wird in einer Spalte in der kleinen Domäne gebunden, wobei das Substrat in einer angrenzenden Tasche bindet.
Zusammenfassung
1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein MSR-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Enolase-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von den Pflanzenertrag betreffenden Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid in einer Pflanze codiert, umfasst.
4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein 6-PGDH(6-Phosphogluconat-Dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase)-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure umfasst, welche ein 6-PGDH(6-Phosphogluconat-Dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase)-Polypeptid codiert. Die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassten eines oder mehrere aus erhöhter Biomasse, erhöhter Frühwuchskraft und erhöhtem Samenertrag.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, aufweisen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag•100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman und Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht durchgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), Quick-Change-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” schließen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide ein, die im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um deren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert einen Doppelstrang in zwei Einzelstrange aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb der T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
Die Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unterhalb der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäuresträngen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2 (I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (I_n) ^a oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M. ^b nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%. ^c L = Länge des Duplex in Basenpaaren. ^d Oligo, Oligonukleotid; I_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer beliebigen von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%) durchgeführt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unterhalb der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Splice-Variante
Der Begriff ”Splice-Variante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelische Variante
Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern, eingeschlossen. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine – 35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende – 10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktionsfähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Alfalfa H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Super-Promotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben, wie Blättern, Wurzeln, Samengewebe, etc., präferentiell zu initiieren. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Medicago Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Tabak, Auxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.
Tabak, wurzelspezifische Gene	Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
B. napus G1-3b Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
The LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD-Dissertation, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2;1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen, α-, β-, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1-, C-, D-Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblume-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like-Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele von endosperm-spezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FERS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
Weizen-Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1-, C-, D-Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gerste DOF	Mena et al. (1998) Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
Reis Prolamin NRP33	Wu et al, (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
Sorghum-Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß jeglicher sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

Gen	Expression	Literatur-Bezugsstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Reis, beta-Expansin EXBP9	spross-spezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbse RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N.Y. (1994).
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff erfolgt ist) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wurde (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98% 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencen so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon zum Beispiel durch die Verwendung eines geeigneten Promotors erreicht wird.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, die das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, die ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Invertierte Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Invertierten Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des invertierten Repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz wird daher in eine Pflanze eingebracht werden. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, das als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse eine AntisenseOrientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäure-Konstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die in den Verfahren der Erfindung zum Silencing verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expression des Proteins, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5116742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion (wie etwa Signalleitungs-Ligand) nicht aufzeigen kann.
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition.
Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäure-Konstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgenisch/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5 565 350

WO 00/15815

Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformation angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22(3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6(2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie, entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet), oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K. (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch transformierte Samen in ähnlicher Weise zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22(2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidäre Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312(3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen) aufzeigen. Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz, EM, Somerville, CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods on Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132-8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
Frühwuchskraft
”Frühwuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann aufgrund von modifierter Architektur auftreten.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Muse spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein MSR-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren nach Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein Enolase-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide stellt die Erfindung in vorteilhafter Weise außerdem bislang unbekannte, Enolase-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen bereit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:

(i) eine Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 215 und 217;
(ii) das Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 215 und 217;
(iii) eine Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 216 und 218, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 216 und 218 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(iv) eine Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A2 aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(vi) eine Nukleinsäure, codierend ein Enolase-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 216 und 218, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A2, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:

(i) eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 216 und 218;
(ii) eine Aminosäuresequenz, die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 24 und 26, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
(iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.

Noch weiter ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Noch weiter ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein 6-PGDH(6-Phosphogluconat-Dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase)-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren nach Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
In Bezug auf MSR-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die Erhöhung der Expression beträgt in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mehr als das 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-fache des Spiegels der Expression der gleichen und/oder der homologen Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Kontrolle. Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Sambrook et al. 1989; John Wiley & Sons 1989, und jährliche Aktualisierungen).
In Bezug auf Enolase-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf MSR-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein MSR-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen MSR-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”MSR-Nukleinsäure” oder ”MSR-Gen”.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein Enolase-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen Enolase-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”ENOLASE-Nukleinsäure” oder ”ENOLASE-Gen”.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”ZAT-like-Zinktransporter-Nukleinsäure” oder ”ZAT-like-Zinktransporter-Gen”.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen 6-PGDH-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”6-PGDH-Nukleinsäure” oder ”6-PGDH-Gen”.
Ein ”MSR-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist und vorzugsweise Methioninsulfoxid-Reductase Aktivität aufweist.
Vorzugsweise umfasst ein in den Verfahren der Erfindung nützliches MSR-Polypeptid mindestens ein konserviertes Proteinmotiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einem beliebigen von:

(i) Motiv 1, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 173: (Q)(Y)(R)(S)
(ii) Motiv 2, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 174 (Y/H/E/D/G)(H/S)(Q/R)(Q/K/R)(Y/F)(L/C/E)
(iii) Motiv 3, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 175 (I/V)(V/M/I/A/R/F/T)(T/V/R)(E/D/T)(I/V/I/Q)(L/K/A/V/I)(P/G/T/K)(A/S/P/T/Q)
(iv) Motiv 4, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 176 (A/F/T/-)(Q/v/e/s/c/t/-)(F/I/A/-)(G/A/-)(A/L/S/T/-)(G/-)(C/S/-)(F/-)(W/-)(G/R/S/-)(V/S/G/-)(E/-)(L/-)(A/M/G/V/T/-)(F/C/A/Y/-)(Q/W/R/G/-)(R/C/E/-)(V/I/L/S/A/-)(P/H/R/N/S/-)(G/-)(V/L/-)(T/V/I/Y/R/A/-)(K/R/E/S/A/Y/Q/V/-)(T/A/-)(E/S/R/A/-)(V/A/-)(G/-)(Y/-)(T/S/A/V/I/-)(Q/G/A/H/-)(G/-)(N/S/L/H/K/A/D/Q/-)(L/K/S/T/I/V/F/R/M/-(H/T/A/S/Q/K/E/P/D/-)(N/D/H/R/G/E/M/-)(P/-)(T/S/L/N/D/-(Y/-)(E/R/K/Y/G/Q/-)(D//A/L/-)(V/E/D/A/I/-)(C/Y/-(T/S/R/H/G/-)(G/N/S/-)(A/L/V/Q/R/K/T/D/M/-)(T/G/A/-(Y/D/G/N/S/K/-)(H/-)(S/A/T/V/N/M)(E/Q)(V/S/F/A/G/C)(V/L/D)(R/Q/E/K/Y)(V/I/L/M)(Q/H/E/T/V/I)(Y/F)(D/N)(P/V/L)(K/R/S/Q/A/N)(A/V/L/I/M/Q/E/D/N)(C/I/V/G)(K/P/K/T/G/Q/H)(Y/F)(D/R/S/K/T/E/Q)(D/Q/K/N/T/V/S)(L/I)(L/V)(D/E/S/A/K)(V/F/I/L/M/A/T)(F/H/L)(W/Y)(A/S/Q/K/T/D/N)(R/K/S/M/N)(H)(D/N)(P/S)(T/R)(T/Q/E/A)(L/P/V/I/G/K/F)(N/F/H/M/D)(R/G)(Q)(G/V)(N/P/G/A/E)(D/L)(V/Q/R/L/S)(G)(T/N/A/S/P)(Q)(Y)(R)(S)(G/V/A/C/I)(I/V/L)(Y/F)(Y/T/F/C)(Y/N/H/Q/T/S)

Alternativ dazu umfasst ein in den Verfahren der Erfindung nützliches MSR-Polypeptid ein Proteinmotiv mit mindestens, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem oder mehreren der folgenden Motive:

(i) Motiv 5, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 177: (G)(W)(P)
(ii) Motiv 6, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 178: (L/V)(Y/F/L)(K/D/E/Q/S/R)(S/T/)(T/S/A/I/L/K/D/-)(T/A/-)(K/-)(F/-)(D/N/-)(S/A/R)(G/P)
(iii) Motiv 7, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 179: (G/D/E/N/-)(G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R)
(iv) Motiv 8, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 180: (K/R/L/T/W/L/F/I/-)(S/T/R/Q/P/K/G/-)(E/D/N/A/T/K/-)(E/A/Q/A/G/R/-)(E/D/R/-)((W/L/Q/-)(R/K/A/V/E/Q/-)(A/V/K/T/Q/R/-)(V/I/Q/R/K/G/-)(L/A/-)(S/T/E/N/-)(P/D/S/Q/A/N/E/K/-)(E/D/Q/A/-)(Q/E/A)(F/Y/R/-)(R/Y/H/K/T/Q/-)(I/V/-)(L/T/A/-)(R/L/-)(Q/K/L/D/R/E/H/-)(K/A/E/H/-)(G/M/S/A)(T/I/S)(E/D/R)(R/A/K/N/Y/T/I/P/F/L)(P/A/K/Q/R/A)(G/F/N)(T/S/K/C)(G/S/E)(E/P/V/R)(Y/F/L)(N/D/W/V/T/L/E)(K/N/Q/D)(F/T/N/V/L/K/E/S)(F/W/Y/K/H/D/S)(T/N/A/G/E/D/K/R)(E/P/A/D/K/Q/V)(G)(I/V/A/T)(Y/F)
(v) Motiv 9, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 181: (C)(A/V/I/R)(G/C/L)(C)(G/A/D(N/K/Q/E)(T/S/A/L/N)(P/A/D/K)(L/V)(Y/F/L)(K/E/D/Q/S/R)(S/-)(T/S/K/D/A/I/L)
(vi) Motiv 10, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 182: (A/S)(F/Y)(F/Y/W/D)(E/Q/D/R/A)(G/P/T/A)(I/V/L/F)(G/P/A/D)(G/A/P/N/D/K/E)(A/N/T)(I/V/H)(N/K/T/G/V/I/A)(R/Q/S/E/T)(T/K/H/I/E/A/S/N)(P/L/R/T/A/M/V/I/E)(D/E/R/I/G/N)(P/L/A/D/R/W/M)(D/E/S/T/A/G/-(G/I/S/F/H/-)(R/I/F/P/G/H/L/K/M/-)(R/F/S/G/M/-)(M/V/Y/I/T/-)(P/R/V/-)(R/-)(Q/T/-)(E/A/-)(I/V/S/T/-)(T/L/I/V/H/N/-)(C/-)
(vii) Motiv 11, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 183: (G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R)(G/D/N/T/V)(E/G/R/H)(G/P/N/D/W/S)(F/P/H/Y/I/N/R/S)(S/L/P/A/D/G/K/R-)(T/R/N/V/-)(P/D/A/F/T/-)(T/L/F/S/R)(D/G/L/Y/N)(E/K/A/N/Q/L)(R/K/D/E/A/P)(H/Y/I/L/K/C/F)(C/V/-)(V/L/I/S/M/-)(N/Q/K/L/-)(S/L/Q/R/-)(V/I/A/R/Y/-)

Die Motive 1 bis 11 umfassen ferner eine Sequenz, wie durch SEQ ID NR: 173 bis 183 jeweilig repräsentiert, in der jedweder Aminosäurerest durch beliebige konservative Aminosäurereste gemäß Tabelle 1 substitutiert ist.
Die Motive 1 bis 4 sind typischerweise in MSR-Polypeptiden des Typs A vorhanden, während die Motive 5 bis 11 für ein MSR-Polypeptid des Typs B charakteristisch sind.
Vorzugsweise besitzt das Homolog eines MSR-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 102, vorausgesetzt dass das homologe Protein ein konserviertes Motiv(e), wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Ein Methioninsulfoxid-Reductase-Enzym mit dem systematischen Namen ”Peptid-L-Methionin:Thioredoxin-Disulfid-S-Oxidoreductase [L-Methionin(S)-S-oxide-bildend]” katalysiert die Reduktion von Peptiden, die oxidierte Methioninreste aufweisen, welche durch Thioredoxin vermittelt wird. MSR-Enzyme sind fähig, jedwede der folgenden Reaktionen zu katalysieren:

(1) Peptid-L-Methionin(S)-S-oxid + Thioredoxin = Peptid-L-Methionin + Thioredoxin-Disulfid + H₂O
(2) L-Methionin(S)-S-oxide + Thioredoxin = L-Methionin + Thioredoxin-Disulfid + H₂O

Vorzugsweise ist die in den Verfahren der Erfindung nützliche MSR-Polypeptidsequenz ein Polypeptid, das sich, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Rouhier et al. 2006 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von AtMSRB1- oder OsMSRA4-Polypeptiden als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
Ein ”Enolase-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, das eine Proteindomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Aminosäure-Sequenzidentität zu (i) einer Konservierten Enolase N-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 235, mit einer Pfam-Zugangsnummer PF00113, und zu (ii) einer Konservierten Enolase C-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 236 mit einer Pfam-Zugangsnummer PF03952, umfasst und gegebenenfalls Enolase(2-Phospho-D-glycerat-Hydrolyase)-Aktivität aufweist.
Darüber hinaus umfasst ein ”Enolase-Polypeptid”, wie hierin definiert, vorzugsweise eines oder mehrere der folgenden Proteinmotive (i) SIE(D/Q)PFD (SEQ ID NR: 237); (ii) VGDDLL (SEQ ID NR: 238); (iii) GAPCR (SEQ ID NR: 239); und KYNQ(L/I)LRIE (SEQ ID NR: 240); worin jegliche Aminosäure durch eine konservative Aminosäure gemäß Tabelle 1 substitutiert sein kann.
Weiter bevorzugt umfasst ein in den Verfahren der Erfindung nützliches ”Enolase-Polypeptid” eine oder mehrere Proteinsignaturen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu:

(i) den Aminosäureresten 38–52 von SEQ ID NR: 194;
(ii) den Aminosäureresten 113–129 von SEQ ID NR: 194;
(iii) den Aminosäureresten 170–183 von SEQ ID NR: 194;
(iv) den Aminosäureresten 328–339 von SEQ ID NR: 194;
(v) den Aminosäureresten 351–365 von SEQ ID NR: 194; und
(vi) den Aminosäureresten 380–397 von SEQ ID NR: 194;

Die Proteinsignaturen, die oben bei (i) bis (vi) genannt werden, entsprechen dem ”6-Element-Fingerprint”, der typischerweise eine Signatur für Enolasen bereitstellt. Der oben erwähnte ”Elements” besitzt die Zugangsnummer PR00148 in der Datenbank PRINTS-S (PRINTS-S Version 16, modeliert auf PRINTS Version 38.0, Attwood et al. 2003 Nucleic Acids Research, 31(1), 400–402). Derartige Signaturen können unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Werkzeugen und Verfahren identifiziert werden, wie etwa SPRINT, einem Web-Tool, das von Attwood und Kollegen an der ”Faculty of Life Sciences” an der Universität Manchester, Manchester M13 9PT, Großbritannien, entwickelt und gewartet wird. Alternativ dazu können die Signaturen mittels Durchsuchung von Datenbanken, enthaltend konservierte Proteinsequenzen oder Domänen, oder Motive oder Signaturen, Proteinalignments, zum Beispiel unter Verwendung von Interpro, identifiziert werden. Weitere Einzelheiten sind im Beispiele-Abschnitt angegeben.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Enolase-Polypeptid eine oder mehrere Proteindomänen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu:

(i) SEQ ID NR: 245, die der konservierten DNA-Bindungsdomäne entspricht;
(ii) SEQ ID NR: 246, die der konservierten Repressordomäne entspricht.

Typischerweise weist ein Enolasepolypeptid eine Enolase-Aktivität (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolyase) entsprechend der IntEnz(Integrierte relationale Enzym-Datenbank, Fleischmann et al. 2004, Nucleic Acids Res. 32, D434–D437)-Klassifikationsnummer EC:4.2.1.11 auf. Das Enzym Enolase katalysiert die Reaktion 2-Phospho-D-glycerat = Phosphoenolpyruvat + H₂O. Andere akzeptierte Ausdrücke im Fachgebiet zur Bezugnahme auf ein Enolase-Enzym sind Phosphopyruvat-Hydratase und 14-3-2-Protein, 2-Phosphoglycerat-Dehydratase, 2-Phosphoglycerat-Enolase, 2-Phosphoglycerat-Dehydratase und γ-Enolase, Phosphoenolpyruvat-Hydratase und 2-Phospho-D-glycerat-Hydrolyase.
Alternativ dazu besitzt ein Enolase-Protein, und ein Homolog davon, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 194, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Enolase-N- und Enolase-C-Domänen, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zur Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen, als dass sie außerhalb der Kladen bzw. Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
Ein ”ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, die durch SEQ ID NR: 248 repräsentiert wird. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Ein ”6-PGDH-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf eine 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH). Das 6-PGDH-Protein gehört der Enzymklasse: EC1.1.1.44 an. Seine chemische Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Sundaramoorthy et al. 2007 FERS J. 2007 Jan; 274(1): 275–86; Huang et al. 2003 Mol. Biol. Rep. 30(4): 223–7; Krepeinsky et al. 2001 Eur. J. Biochem. May; 268(9): 2678–86.
Alternativ dazu bezieht sich ein ”6-PGDH-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierten Proteine und Orthologe, Paraloge und Homologe davon. Bevorzugte Homologe, einschließlich Orthologen und Paralogen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, sind in der Tabelle A4 beschrieben.
Vorzugsweise weist ein 6-PGDH-Protein der Erfindung, insbesondere die Orthologe, Paraloge und Homologe von SEQ ID NR: 281, eine 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase-Domäne mit einer Interpro-Zugangsnummer IPR006115 oder Pfam-Zugangsnummer PF03446 auf. Weiter bevorzugt umfasst das in den Verfahren der Erfindung nützliche 6-PGDH-Polypeptid eine Proteindomäne mit 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der von SEQ ID NR: 282 repräsentierten Aminosäure[sequenz], welche die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase-Domäne darstellt, die in der SEQ ID NR: 281 zwischen den Aminosäureposition 3 bis 178 enthalten ist.
Ferner enthält ein 6-PGDH-Protein der Erfindung, insbesondere die Orthologe, Paraloge und Homologe von SEQ ID NR: 281, vorzugsweise eine konservierte C-terminale Domäne von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase mit der Interpro-Zugangsnummer IPR006114 oder der Pfam-Zugangsnummer PF0393 (siehe Beispiele-Abschnitt). Weiter bevorzugt umfasst das in den Verfahren der Erfindung nützliche 6-PGDH-Polypeptid eine Proteindomäne mit 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der Aminosäure, die zwischen Aminosäureposition 182 und 472 von SEQ ID NR: 281 lokalisiert ist, was der C-terminalen Domäne der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase von SEQ ID NR: 281 entspricht.
Ein weiter bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches, 6-PGDH-Polypeptid weist einen Asparaginsäure-Aminosäurerest an einer Position, äquivalent zu D255 von SEQ ID NR: 281, oder an der Position D253 im L. lactis-6-PGDH-Enzym (Sundaramoorthy et al; 2007) auf. Die 9 zeigt ein Alignment von 6-PGDH-Polypeptid, worin die äquivalenten Aminosäuren zu D255 in mehreren 6-PGDH-Polypeptiden gezeigt sind.
Verfahren zum Identifizieren der äquivalenten Aminosäuren unter 6-PGDH-Polypeptiden an einer gegebenen Position sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel kann das Polypeptid mit dem Motiv verglichen werden, indem deren jeweilige Aminosäuresequenz zum Identifizieren von Regionen mit ähnlicher Sequenz unter Verwendung eines geeigneten Alignment-Algorithmus, wie BLAS (Altschul et al. J Mol Biol 215: 403–10), aligniert werden.
Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”6-PGDH-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem 6-PGDH-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 281 oder ein beliebiges der Polypeptide von Tabelle A4 repräsentiert wird.
Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; (Gasteiger et al., "ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
In Bezug auf MSR-Polypeptide kann ein konserviertes Motiv, alternativ dazu, ebenfalls einfach durch visuelle Inspektion eines Mehrfachsequenzalignment, zum Beispiel der Polypeptidsequenz von Tabelle A1, und wie in 3 gezeigt, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
Ferner weisen MSR-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise Methioninsulfoxid-Reductase-Aktivität auf. Hilfsmittel und Techniken zur Messung von MSR-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel kann MSR-Aktivität in vitro entweder mit einem Proteinsubstrat (oxidierter α-1-Proteaseinhibitor) oder einem synthetischen Substrat (N-Acetyl-[3H]-MetSO), wie von Sadanadom et al. Plant Physiol. 2000; 123(1): 255–264 oder Boschi-Muller et al; 2008 und den Bezugsstellen darin, oder Vieira-Dos Santos et al Plant Physiol. 2005, 138(2): 909–22, beschrieben, geassayt werden.
Darüber hinaus ergeben MSR-Polypeptide bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiele-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, gewählt aus: Frühwuchskraft, Gesamt-Samengewicht, Anzahl gefüllter Samen und Ernteindex.
Ferner weisen ENOLASE-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise 2-Phospho-D-glycerat-Hydro-Lyase-Aktivität (Enolase-Aktivität) auf. Hilfsmittel und Techniken zur Messung von Enolase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Die Aktivität eines Enolase-Polypeptids kann in einem In-vivo-Assay durch Komplementation des E. coli-Stamms, der hinsichtlich in Enolase-Funktion defekt ist, wie von Lal et al. 1991. Plant Mol. Biol. 16(5): 787–95, beschrieben, bestimmt werden. Alternativ kann eine Enolase-Aktivität in einem In-vitro-Assay bestimmt werden, wie es zum Beispiel von Eigembrod et al.; 1983 EMBO J. 1983; 2(9): 1565–1570, und/oder Geige 2003; The Plant Cell, Band 15, 2140–2151, beschrieben wird. Alternativ dazu, kann die Aktivität einer Enolase-Nukleinsäure und des davon codierten Proteins durch Assayen des DNA-Bindungsvermögens des Proteins an den c-myc-Promotor oder an den Promotor des Zinkfingers STZ/ZAT10 von Arabidopsis in Zellen, die mit einem, die Enolase-Nukleinsäure umfassenden Vektor transformiert sind, wie von Lee et al. 2002 beschrieben, bestimmt werden.
Darüber hinaus ergeben ENOLASE-Polypeptide bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiele-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einer oder mehereren Eigenschaften, gewählt aus: Ernteindex, Samenfüllrate, Gesamtsamenertrag und Anzahl gefüllter Samen.
Ferner weisen ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise Zinktransporter-Aktivität auf. Außerdem führt das Einbringen, in eine Pflanze, von jedweder Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, zur Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere Samenertrag.
Ferner weisen 6-PGDH-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form), soweit SEQ ID NR: 2 und ihre Homologe anbelangt sind; vorzugsweise 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.44) auf. Hilfsmittel und Techniken zur Messung von DNA-Bindungs-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
In Bezug auf MSR-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 1 und durch SEQ ID NR: 101 repräsentiert wird, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 bzw. SEQ ID NR: 102. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen MSR codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen MSR-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 102 repräsentierten MSR-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Reis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 194. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen ENOLASE codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen ENOLASE-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuren, die ENOLASE-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 194 repräsentierten ENOLASE-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 193 oder SEQ ID NR: 194 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Reis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 246 repräsentiert wird, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 248. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuren, die ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 248 repräsentierten ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A3 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 246 oder SEQ ID NR: 248 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 280 repräsentiert wird, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 281. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen 6-PGDH codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen 6-PGDH-Polypeptids, wie hierin definiert, vorzugsweise einer/einem beliebigen von denjenigen, die in Tabelle A4 aufgelistet sind, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuren, die 6-PGDH-Polypeptide codieren, können in Datenbanken gefunden werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind, können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung von SEQ ID NR: 281) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 280 oder SEQ ID NR: 281 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Oryza sativa-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
Zu weiteren, bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, oder Nukleinsäuren, die an Nukleinsäuren hybridisieren, welche MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide codieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Im Bezug auf MSR-Polypeptide repräsentiert zum Beispiel SEQ ID NR: 1 eine Variante von SEQ ID NR: 57 mit einer Verkürzung am 5'-Ende. Deshalb codiert SEQ ID NR: 1 ein Derivat des durch SEQ ID NR: 57 repräsentierten Polypeptids, das eine Verkürzung am N-Terminus aufweist und durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert ist. In ähnlicher Weise codiert die SEQ ID NR: 101 eine Variante von SEQ ID NR: 133 mit einer Verkürzung am 5'-Ende. Deshalb codiert die SEQ ID NR: 101 die SEQ ID NR: 102, welche ein Derivat des von SEQ ID NR: 134 repräsentierten Polypeptids ist.
Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
In Bezug auf MSR-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein MSR-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen, vorausgesetzt dass der Abschnitt eines oder mehrere der angegebenen konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein Enolase-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 193. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen lässt, als dass sie außerhalb der Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 246. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NR: 281 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in SEQ ID NR: 280 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in SEQ ID NR: 280 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus SEQ ID NR: 280, oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 281 codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 280.
In Bezug auf MSR-Polypeptide codiert der Abschnitt alternativ dazu ein Fragment eines MSR-Polypeptids, das sich, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Rouhier et al. 2006 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von AtMSRB1- oder OsMSRA4-Polypeptiden als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stingenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
In Bezug auf MSR-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein MSR-Polypeptid, wie hierin definiert, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% oder mehr Sequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist, vorausgesetzt dass das Polypeptid eines oder mehrere der angegebenen konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst.
Alternativ dazu codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Rouhier et al. 2006 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von AtMSRB1- oder OsMSRA4-Polypeptiden als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein Enolase-Polypeptid, wie hierin definiert, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen lässt, als dass sie außerhalb der Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wie hierin definiert, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 246 repräsentiert wird, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in SEQ ID NR: 281 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an SEQ ID NR: 280, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 281 codiert.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einer Splice-Variante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
In Bezug auf MSR-Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten gespleißten Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 101, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog jeweils von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 102 codiert. Vorzugsweise weist die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen auf, vorausgesetzt dass das codierte Ortholog oder Paralog eines oder mehrere der angegebenen konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst.
Alternativ dazu handelt es sich bei gespleißten Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, codierend eine Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Rouhier et al. 2006 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von AtMSRB1- oder OsMSRA4-Polypeptiden als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 194 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen, als dass sie außerhalb der Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 246, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 248 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
In Bezug auf MSR-Polypeptide, handelt es sich bei der allelischen Variante vorzugsweise um eine Nukleinsäure, codierend eine Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Rouhier et al. 2006 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von AtMSRB1- oder OsMSRA4-Polypeptiden als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer allelischen Variante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
In Bezug auf MSR-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten, Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das MSR-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 102 und beliebige der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 101, oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 102 codiert. Vorzugsweise weist die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen auf, vorausgesetzt dass das codierte Ortholog oder Paralog eines oder mehrere der angegebenen konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten, Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ENOLASE-Polypeptid von SEQ ID NR: 194 und beliebige der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 193 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 194 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen, als dass sie außerhalb der Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten, Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid von SEQ ID NR: 248 und beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 246 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 248 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei den ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfassen, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide weisen die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das 6-PGDH-Polypeptid von SEQ ID NR: 281 auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide, wie oben definiert, codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäure durch Gen-Shuffling erhalten wird.
In Bezug auf MSR-Polypeptide weist die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen auf, vorausgesetzt dass die codierte Aminosäure[sequenz] eines oder mehrere der angegebenen konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, vorzugsweise eher bei beliebigen der Enolase-Polypeptide in dem Baum einordnen, als dass sie außerhalb der Äste liegen und deshalb eine Außenseitergruppe darstellen würde.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, vorzugsweise eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Darüber hinaus können Nukleinsäure-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
MSR-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die MSR-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa. Alternativ, stammt eine bevorzugte MSR-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Pflanze Medicago truncatula.
In vorteilhafter Weise sieht die Erfindung auch bislang unbekannte MSR-codierende Nukleinsäuren und MSR-Polypeptide vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird deshalb ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:

(i) einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169 und SEQ ID NR: 171;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169 und SEQ ID NR: 171;
(iii) einer Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(iv) einer Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A1 aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(vi) einer Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:

(i) eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172;
(ii) eine Aminosäuresequenz die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 oder jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
(iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.

ENOLASE-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die ENOLASE-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
6-PGDH-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die 6-PGDH-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze. Im Fall von SEQ ID NR: 280 stammt die 6-PGDH-Polypeptid codierende Nukleinsäure vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
In Bezug auf MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhter Frühwuchskraft und erhöhtem Ertrag, speziell erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
In Bezug auf MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide versteht es sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unter der Erde einschließen können. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide versteht es sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung bei der Frühwuchskraft und/oder der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unter der Erde einschließen können. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche erhöhte(n) Frühwuchskraft, Biomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu Frühwuchskraft, Biomasse oder Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere von Biomasse und/oder Samenertrag, von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, vorzugsweise das Erhöhen der Expression, einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert einer Pflanze umfasst.
Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Geschwindigkeit der Keimung, Frühwuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst. In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, in einer besonderen Ausführungsform, Pflanzen mit erhöhter Frühwuchskraft.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt im Vergleich zu Kontrollpflanzen ungeachtet dessen auf, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Wegen der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) sind starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig anzutreffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen zurückzuführen sein. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, die von Pathogenen, wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten, hervorgerufen werden.
Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen bei optimalen Wachstumsbedingungen (angebaut unter Nicht-Stress-Bedingungen) ergeben typischerweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag und/oder erhöhte Frühwuchskraft im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags und/oder der Frühwuchskraft in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Bedingungen mit Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen mit Stickstoffmangel, wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Bedingungen von Salzstress kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Salzstress kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich dabei, unter anderem, um ein oder mehrere beliebige von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ handeln.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie oben definiert, codiert.
Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von MSR-Polypeptide, oder ein Enolase-Polypeptid, oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen vor. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:

(a) eine Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie oben definiert, codiert;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
Es kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. In Bezug auf Enolase-Polypeptide ist in den Verfahren der Erfindung auch ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein ABA(Abscisinsäure)-induzierter Promotor, brauchbar.
In Bezug auf MSR-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die MSR-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer MSR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem pflanzlich-abgeleitetem Promotor, wie etwa einem GOS2-Promotor, stärker bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 188 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 188 repräsentiert. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
In Bezug auf Enolase-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die ENOLASE-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 193 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer Enolase-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor, oder unter Steuerung durch einen samen-spezifischen Promotor, begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem pflanzlich-abgeleitetem Promotor, wie etwa einem GOS2-Promotor, stärker bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 241 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 241 repräsentiert. Alternativ dazu wird der samenspezifische Promotor, vorzugsweise ein ABA(Abscisinsäure)-induzierter Promotor, von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 242 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 242 repräsentiert.
Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven und/oder samen-spezifischen Promotoren.
In Bezug auf ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die ZAT-like-Zinktransporter codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 246 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer ZAT-like-Zinktransporter codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, wie etwa ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ist der Promotor ein GOS2-Promotor als Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 277 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 277 repräsentiert. Siehe Tabelle 2a im Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, umfassend einen (GOS2-)Promotor, der im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 32 ist, und die Nukleinsäure, welche das ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert.
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die 6-PGDH-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 280 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer 6-PGDH-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven spezifischen Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, wie etwa ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 285 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 6 repräsentiert. Siehe Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von jedweder Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert.
Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer ein MSR-Polypeptid, oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines MSR-Polypeptids, oder eines Enolase-Polypeptids oder eines ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Noch spezifischer, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Frühwuchskraft und/oder erhöhtem Ertrag, bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer 6-PGDH-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines 6-PGDH-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung, wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich der Gegenwart eines oder mehrerer Marker(s) selektiert, welche von pflanzlich-exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und, nach einer anfänglichen Wachstumsperiode, einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterzogen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen in den Verfahren gemäß der Erfindung dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform hervorgebracht werden.
Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, welche ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid oder ein Enolase-Polypeptid oder ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid oder ein 6-PGDH-Polypeptid codiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide, die hierin beschrieben sind, codieren, oder die MSR-Polypeptide selbst, können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein Gen gekoppelt sein kann, das MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codiert. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Allelische Varianten eine(r/s) MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codierenden Nukleinsäure/Gens können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern manchmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, und welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von Nukleinsäuren, die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codieren, erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der Nukleinsäure, welche MSR-Polypeptide oder Enolase-Polypeptide oder ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptide oder 6-PGDH-Polypeptide codiert, in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäure-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In Bezug auf 6-PGDH-Polypeptide, wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt, ergibt die modulierte Expression einer Nukleinsäure, die ein 6-PGDH-Protein wie oben definiert codiert, in einem spezifischen räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster Pflanzen mit verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften. Diese Information kann in einem Screen zum Identifizieren einer Verbindung oder einer Zusammensetzung von Verbindungen verwendet werden, welche die Aktivität einer regulatorischen Sequenz (zum Beispiel ein Promotor) moduliert, was zu einem gewünschten Expressionsmuster einer 6-PGDH, die funktionsfähig an diese regulatorische Sequenz verknüpft ist, in Verfahren zur Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften in einer Pflanze führt. Vorzugsweise ist das Expressionsmuster jenes, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Durch funktionsfähiges Verknüpfen einer regulatorischen Sequenz (wie dem nativen Promotor eines 6-PGDH-Gens) an ein Reportergen werden Chemikalien (allein oder in Kombination) hinsichtlich ihrer Auswirkung auf das Expressionsmuster des Reportergens getestet. Chemische Verbindungen, welche ein gewünschtes Expressionsmuster induzieren, werden als Kandidatenmodulatoren der 6-PGDH-Expression in Verfahren zur Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften beibehalten. Ein Hochdurchsatz-Screen kann zum Testen großer Mengen an chemischen Verbindungen angewandt werden, da das Expressionsmuster des Reportergens als ein Indikator der Ertragserhöhung verwendet werden kann. Die Erfindung sieht daher die Verwendung von 6-PGDH codierenden Nukleinsäuren und/oder von regulatorischen Sequenzen von 6-PGDH-Genen in derartigen Screens vor.
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäure-Sonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Strahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressformen, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
Merkmals-Gesichtspunkte
Die vorliegende Erfindung wird nun in Bezug auf die folgenden Merkmalspunkte beschrieben:
1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)

1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, umfasst, wobei das MSR-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das MSR-Polypeptid mindestens ein konserviertes Proteinmotiv umfasst, aufweisend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen von:
(i) Motiv 1, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 173: (Q)(Y)(R)(S)
(ii) Motiv 2, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 174: (Y/H/E/D/G)(H/S)(Q/R)(Q/K/R)(Y/F)(L/C/E)
(iii) Motiv 3, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 175: (I/V)(V/M/I/A/R/F/T)(T/V/R)(E/D/T)(I/V/I/Q)(L/K/A/V/I)(P/G/T/K)(A/S/P/T/Q)
(iv) Motiv 4, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 176: (A/F/T/-)(Q/v/e/s/c/t/-)(F/I/A/-)(G/A/-)(A/L/S/T/-)(G/-)(C/S/-)(F/-)(W/-)(G/R/S/-)(V/S/G/-)(E/-)(L/-)(A/M/G/V/T/-)(F/C/A/Y/-)(Q/W/R/G/-)(R/C/E/-)(V/I/L/S/A/-)(P/H/R/N/S/-)(G/-)(V/L/-)(T/V/I/Y/R/A/-)(K/R/E/S/A/Y/Q/V/-)(T/A/-)(E/S/R/A/-)(V/A/-)(G/-)(Y/-)(T/S/A/V/I/-)(Q/G/A/H/-)(G/-)(N/S/L/H/K/A/D/Q/-)(L/K/S/T/I/V/F/R/M/-)(H/T/A/S/Q/K/E/P/D/-)(N/D/H/R/G/E/M/-)(P/-)(T/S/L/N/D(-)(Y/-)(E/R/K/Y/G/Q/-)(D/A/L/-)(V/E/D/A/I/-)(C/Y/-)(T/S/R/H/G/-)(G/N/S/-)(A/L/V/Q/R/K/T/D/M/-)(T/G/A-)(Y/D/G/N/S/K/-)(H/-)(S/A/T/V/N/M)(E/Q)(V/S/F/A/G/C)(V/L/D)(R/Q/E/K/Y)(V/I/L/M)(Q/H/E/T/V/I)(Y/F)(D/N)(P/V/L)(K/R/S/Q/A/N)(A/V/L/I/M/Q/E/D/N)(C/I/V/G)(K/P/K/T/G/Q/H)(Y/F)(D/R/S/K/T/E/Q)(D/Q/K/N/T/V/S)(L/I)(L/V)(D/E/S/A/K)(V/F/I/L/M/A/T)(F/H/L)(W/Y)(A/S/Q/K/T/D/N)(R/K/S/M/N)(H)(D/N)(P/S)(T/R)(T/Q/E/A)(L/P/V/I/G/K/F)(N/F/H/M/D)(R/G)(Q)(G/V)(N/P/G/A/E)(D/L)(V/Q/R/L/S)(G)(T/N/A/S/P)(Q)(Y)(R)(S)(G/V/A/C/I)(I/V/L)(Y/F)(Y/T/F/C)(Y/N/H/Q/T/S)
(v) Motiv 5, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 177: (G)(W)(P)
(vi) Motiv 6, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 178: (L/V)(Y/F/L)(K/D/E/Q/S/R)(S/T/-)(T/S/A/I/L/K/D/-)(T/A/-)(K/-)(F/-)(D/N/-)(S/A/R)(G/P)
(vii) Motiv 7, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 179: (G/D/E/N/-)(G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R)
(viii) Motiv 8, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 180: (K/R/L/T/W/L/F/I/-)(S/T/R/Q/P/K/G/-)(E/D/N/A/T/K/-)(E/A/Q/A/G/R/-)(E/D/R/-)((W/L/Q/-)(R/K/A/V/E/Q/-)(A/V/K/T/Q/R/-)(V/I/Q/R/K/G/-)(L/A/-)(S/T/E/N/-)(P/D/S/Q/A/N/E/K/-)(E/D/Q/A/-)(Q/E/A)(F/Y/R/-)(R/Y/H/K/T/Q/-)(I/V/-)(L/T/A/-)(R/L/-)(Q/K/L/D/R/E/H/-)(K/A/E/H/-)(G/M/S/A)(T/I/S)(E/D/R)(R/A/K/N/Y/T/I/P/F/L)(P/A/K/Q/R/A)(G/F/N)(T/S/K/C)(G/S/E)(E/P/V/R)(Y/F/L)(N/D/W/V/T/L/E)(K/N/Q/D)(F/T/N/V/L/K/E/S)(F/W/Y/K/H/D/S)(T/N/A/G/E/D/K/R)(E/P/A/D/K/Q/V)(G)(I/V/A/T)(Y/F)
(ix) Motiv 9, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 181: (C)(A/V/I/R)(G/C/L)(C)(G/A/D/N/K/Q/E)(T/S/A/L/N)(P/A/D/K)(L/V)(Y/F/L)(K/E/D/Q/S/R)(S/-)(T/S/K/D/A/I/L)
(x) Motiv 10, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 182: (A/S)(F/Y)(F/Y/W/D)(E/Q/D/R/A)(G/P/T/A)(I/V/L/F)(G/P/A/D)(G/A/P/N/D/K/E)(A/N/T)(I/V/H)(N/K/T/G/V/I/A)(R/Q/S/E/T)(T/K/H/I/E/A/S/N)(P/L/R/T/A/M/V/I/E)(D/E/R/I/G/N)(P/L/A/D/R/W/M)(D/E/S/T/A/G/-)(G/I/S/F/H/-)(R/I/F/P/G/H/L/K/M/-)(R/F/S/G/M/-)(M/V/Y/I/T/-)(P/R/V/-)(R/-)(Q/T/-)(E/A/-)(I/V/S/T/-)(T/L/I/V/H/N/-)(C/-)
(xi) Motiv 11, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 183: (G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R)(G/D/N/T/V)(E/G/R/H)(G/P/N/D/W/S)(F/P/H/Y/I/N/R/S)(S/L/P/A/D/G/K/R-)(T/R/N/V/-)(P/D/A/F/T/-)(T/L/F/S/R)(D/G/L/Y/N)(E/K/A/N/Q/L)(R/K/D/E/A/P)(H/Y/I/L/K/C/F)(C/V/-)(V/L/I/S/M/-)(N/Q/K/L/-)(S/L/Q/R/-)(V/I/A/R/Y/-) wobei die Aminosäure an jeder Position zwischen Klammern angegeben ist, und ”-” für eine Lücke, d. h. die Abwesenheit einer Aminosäure an der Position, steht.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassen.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
10. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, oder aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Medicago, am stärksten bevorzugt aus Medicago truncatula ist.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein MSR-Polypeptid codiert.
12. Konstrukt, umfassend:
(a) Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 1, 2 oder 22;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
(i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; und
(ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die ein MSR-Polypeptid, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in der Erhöhung des Ertrags, insbesondere in der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
22. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, gewählt aus:
(i) einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169 und SEQ ID NR: 171;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169 und SEQ ID NR: 171;
(iii) einer Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(iv) einer Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A1 aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(vi) einer Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
23. Ein isoliertes Polypeptid, das aus folgendem gewählt ist:
(i) eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172;
(ii) eine Aminosäuresequenz die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 oder jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
(iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.

2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)

1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, wobei das Enolase-Polypeptid eine Proteindomäne umfasst, aufweisend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu:
(i) einer Konservierten Enolase N-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 235, mit einer Pfam-Zugangsreferenz PF00113; und zu
(ii) einer Konservierten Enolase C-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 236 mit einer Pfam-Zugangsreferenz PF03952, und gegebenenfalls
(iii) aufweisend Enolase(2-Phospho-D-glycerat-Hydrolyase)-Aktivität und/oder
(iv) das Selektieren nach Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das Enolase-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
(i) Motiv 12: SIE(D/Q)PFD (SEQ ID NR: 237);
(ii) Motiv 13: VGDDLL (SEQ ID NR: 238);
(iii) Motiv 14: GAPCR (SEQ ID NR: 239);
(iv) Motiv 15: KYNQ(L/I)LRIE (SEQ ID NR: 240), worin X für eine beliebige Aminosäure steht; und worin eine beliebige Aminosäure durch einen konservierten Aminosäurerest gemäß Tabelle 1 substitutiert sein kann.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A2 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress erhalten werden.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig an einen beliebigen aus folgenden gebunden ist:
(i) einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise an einen GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt an einen GOS2-Promotor aus Reis;
(ii) einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise an einen WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt an einen WSI18-Promotor aus Reis.
10. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa ist.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, umfasst.
12. Konstrukt, umfassend:
(i) eine Nukleinsäure, codierend ein Enolase-Polypeptid, wie in den Punkten 1 oder 2 definiert;
(ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen handelt um:
(i) einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, oder
(ii) einen samen-bevorzugten Promotor, vorzugsweise einen WSi18-Promotor, am stärksten bevorzugt einen WSI18-Promotor aus Reis.
14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
(i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und
(ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein Enolase-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
22. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, gewählt aus:
(i) einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 215 und 217;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 215 und 217;
(iii) einer Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 216 und 218, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 24 und 26 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(iv) einer Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(vi) einer Nukleinsäure, codierend ein Enolase-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 24 und 26, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
23. Ein isoliertes Polypeptid, gewählt aus:
(i) einer Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 24 und 26;
(ii) einer Aminosäuresequenz, die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 24 und 26, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
(iii) Derivaten von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.

3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)

1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, das in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 248, umfasst.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei sich das ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 7 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 248 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, umfasst.
11. Konstrukt, umfassend:
(a) eine Nukleinsäure, codierend ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid, wie in Punkt 1 oder 2 definiert;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationsequenz
12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
(i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und
(ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18 abgeleitet sind.
20. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)

1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften, vorzugsweise zur Steigerung samenertragsbezogener Eigenschaften, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das 6-PGDH-Polypeptid eine Proteindomäne umfasst, die 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu den folgenden Domänen aufweist:
(i) der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase-Domäne, die zwischen den Aminosäurepositionen 3 bis 178 in der SEQ ID NR: 281 lokalisiert ist;
(ii) der konservierten 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase-C-terminalen Domäne, die zwischen den Aminosäurepositionen 182 bis 472 in SEQ ID NR: 281 lokalisiert ist.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei das 6-PGDH-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Aminosäuresequenzidentität zu dem 6-PGDH-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 281 repräsentiert, aufweist.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, durch die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 280 oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 280 oder einem Abschnitt davon in der Lage ist, repräsentiert wird.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die modulierte (vorzugsweise erhöhte) Expression durch das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die das 6-PGDH-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften eines oder mehrere von: erhöhter Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhter Frühwuchskraft im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die modulierte Expression eine erhöhte Expression ist.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise an einen GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt an einen GOS2-Promotor aus Reis, gebunden ist.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa ist.
10. Pflanze, ein Teil davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze, der Teil davon, oder die Pflanzenzelle, ein Nukleinsäure-Transgen, das ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, umfasst.
11. Konstrukt, umfassend:
(i) Nukleinsäuresequenz, codierend ein 6-PGDH-Polypeptid, wie in den Punkten 1 bis 3 definiert;
(ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
13. Verwendung eines Konstrukts gemäß beliebigen der Punkte 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhter Frühwuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß beliebigen der Punkte 11 oder 12 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
(i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 1 bis 3 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und
(ii) das Kultivieren der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
16. Transgene Pflanze mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhter Frühwuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz resultieren, die ein 6-PGDH Polypeptid, wie in Punkten 1 bis 3 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
18. Erntefähige Teile einer Pflanze, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18 abgeleitet sind.
20. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein 6-PGDH-Polypeptid codiert, bei der Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, insbesondere bei erhöhter Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl gefüllter Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhter Frühwuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 ein multiples Alignment von MSR-Polypeptiden repräsentiert. Die Benennung der Polypeptidsequenzen in dem Alignment ist wie folgend aufgebaut: PF61417, Unterstrich (_), SEQ ID NR und die Pflanze, aus der die Sequenz stammt (z. B. PF61417_2__Oryza).
2 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer MSR-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
3 repräsentiert die Enolase-Polypeptide von Tabelle A2.
4 zeigt einen phylogenetischen Baum der Enolase-Polypeptide von Tabelle A2.
5 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Enolase-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
7 zeigt einen zirkularen phylogenetischen Baum von verschiedenen ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden und verwandten Sequenzen. Die Polypeptidsequenzen wurden unter Verwendung von MUSCLE aligniert, und das Alignment ist in 6 gezeigt. Ein ”Neighbour-Joining”-Baum wurde mit Hilfe von CLUSTALW; Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500, berechnet. Die Untermauerung für die Haupt-Verzweigung ist für 100 Bootstrap-Repetitionen angezeigt. Das zirkulare Phylogramm wurde unter Verwendung von Dendroscope gezeichnet. Das ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid von SEQ ID NR: 248 ist in Fettdruck angegeben. Andere ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptidsequenzen sind jene innerhalb der Klammer. Beispiele von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden sind jene, die innerhalb der Klammer angegeben sind.
8 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
9 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer 6-PGDH codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2::6-PGDH).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd. (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Sequenzdatenbanken bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und ohne den Filter für Sequenzen geringer Komplexität. Die Ausgabe der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg.
1.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)

Die Tabelle A1 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen und davon codierten Proteinen an, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Tabelle A1: Beispiele von MSR-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
OS_MSR	1	2
AT1G53670.1	3	4
AT2G18030.1	5	6
AT4G04800.1	7	8
AT4G04810.1	9	10
AT4G04830.1	11	12
AT4G04840.1	13	14
AT4G21830.1	15	16
AT4G21840.1	17	18
AT4G21850.1	19	20
AT4G21860.1	21	22
AT4G25130.1	23	24
AT5G07460.1	25	26
AT5G07470.1	27	28
AT5G61640.1	29	30
Gm_Hyseq_1	31	32
Gm_Hyseq_2	33	34
Hv_BI953981	35	36
Hv_CD054996	37	38
Hv_TA34992_4513	39	40
Lu_Hyseq_Linseed	41	42
Mt_TA23181_3880	43	44
M_TA27592_3880	45	46
Os03g0360700	47	48
Os04g0482000	49	50
Os05g0404200	51	52
Os06g0138100	53	54
Os06g0472000	55	56
Os10g0563600	57	58
Ot_29409	59	60
Ot_36412_1400010063	61	62
Pp_TA15842_3218	63	64
Pp_TA19162_3218	65	66
Pp_TA19978_3218	67	68
Pp_TA27864_3218	69	70
Pp_TA27941_3218	71	72
Pt_scaff_13972.1#1	73	74
Pt_scaff_15051.1#1	75	76
Pt_scaff_20878.2#1	77	78
Pt_scaff_232.6#1	79	80
Pt_scaff_VII.1214#1	81	82
Pt_scaff_VIII.1881#1	83	84
Pt_scaff_XI.858#1	85	86
Pt_scaff_XII.839#1	87	88
Pt_scaff_XV.665	89	90
Pt_scaff_XV.916#1	91	92
Ta_CD879384	93	94
Ta_CV781803	95	96
Ta_TA50939_4565	97	98
Zm\TA195613_4577	99	100
Mt_pilin	101	102
AT4G21850.2#1	103	104
AT4G21860.2#1	105	106
BN06MC01167_41893809@1164#1	107	108
BN06MC07870_42642598@7850#1	109	110
BN06MC22817_48769979@22736#1	111	112
BN06MC29626_51364980@29502#1	113	114
BN06MC33493_51487934@33340#1	115	116
GM06MC03057_49779101@3032#1	117	118
GM06MC07468_50798375@7402#1	119	120
GM06MC28560_sc16h05@27910#1	121	122
GM06MC34053_sn39h09@33265#1	123	124
GM06MSsr78c11.f_46805437@69254#1	125	126
CV062108#1	127	128
TA38065_4513#1	129	130
TA19984_3880#1	131	132
TA27217_3880#1	133	134
TA16015_3218#1	135	136
TA19653_3218#1	137	138
TA25821_3218#1	139	140
CD002141#1	141	142
DB702640#1	143	144
TA38052_4081#1	145	146
TA39048_4081#1	147	148
TA39049_4081#1	149	150
TA51472_4081#1	151	152
BQ483809#1	153	154
CJ539550#1	155	156
CV772165#1	157	158
TA81419_4565#1	159	160
TA81420_4565#1	161	162
TA83397_4565#1	163	164
ZM07MC14597_60377151@14563#1	165	166
ZM07MC28955_BFb0044H16@28867#1	167	168
ZM07MC36516_57850824@36391#1	169	170
ZM07MSbpsHQ_68592530.r01@47392#1	171	172

1.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)

Tabelle A2 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen und davon codierten Polypeptiden an, welche mit der Enolase-Nukleinsäure verwandt sind. Tabelle A2: Beispiele von ENOLASE-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
Enolase	193	194
Os\LOC_Os03g14450.1	195	196
Os\LOC_Os03g14450.2	197	198
Os\LOC_Os03g15950.1	199	200
Os\LOC_Os06g04510.1	201	202
Os\LOC_Os09g20820.1	203	204
Os\LOC_Os10g08550	205	206
Zm\Enolase_1	207	208
Zm\Enolase_3	209	210
Zm_Enolase_2	211	212
Hv\Enolase	213	214
Gm\Enolase\Hyseq	215	216
Gm\Enolase\Hyseq_2	217	218
AT1G74030	219	220
AT2G29560	221	222
AT2G36530.1	223	224
Pt\scaff_28.296	225	226
Pt\scaff_IX.1243	227	228
Pt\scaff_XII.488	229	230
Pt\scaff_XV.1093	231	232
Ot\Enolase	233	234

1.3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)

Die Tabelle A3 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit SEQ ID NR: 246 verwandt sind. Tabelle A3: Beispiele von ZAT-like-Zinktransporter-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

Name	Pflanzen-Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
AT3G58810	Arabidopsis thaliana	249	250
AT3G61940	Arabidopsis thaliana	251	252
TA2425	Cathamus tinctorius	253	254
AF197329	Eucalyptus grandis	255	256
TA6615	Ipomoea nil	257	258
TA8245	Nicotiana benthamiana	259	260
TA14631	Nicotiana tabacum	261	262
I910	Populus trichocarpa	263	264
II672	Populus trichocarpa	265	266
XI272	Populus trichocarpa	267	268
XIV.515	Populus trichocarpa	269	270
Os05g03780	Oryza sativa	271	272
TA62	Thlaspi caerulescens	273	274
TA176521	Zea mays	275	276

In manchen Fällen wurden Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) wurde verwendet, um solche Sequenzen durch Ausführung einer Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse zu identifizieren.
1.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)

Die Tabelle A4 gibt eine Liste von Nukleinsäuren und Polypeptiden an (homolog zu SEQ ID NR: 281), die in der Erfindung nützlich sind. Tabelle A4: Beispiele von 6-PGDH-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
A.formosa_TA10107_338618	286	287
A.formosa_TA10178_338618	288	289
A.formosa_TA11596_338618	290	291
A.thaliana_AT1G64190.1	292	293
A.thaliana_AT3G02360.1	294	295
A.thaliana_AT5G41670.1	296	297
B.distachyon_TA154_15368	298	299
C.elegans_NM_069597	300	301
C.reinhardtii_192597	302	303
C.sinensis_TA13778_2711	304	305
D.melanogatser_NM_057512	306	307
D.rerio_AY391449	308	309
E.coli_AF176373	310	311
E.gracilis_AB425328	312	313
G.max_TA45618_3847	314	315
G.raimondii_TA9789_29730	316	317
H.vulgare_TA28670_4513	318	319
L.digitata_AJ130772	320	321
M.domestica_TA26246_3750	322	323
M.sativa_U18239	324	325
M.truncatula_TA20191_3880	326	327
N.punctiforme_CP001037	328	329
N.tabacum_TA13708_4097	330	331
O.basilicum_TA383_39350	332	333
O.lucimarinus_32825	334	335
O.sativa_Os06g0111500	336	337
O.sativa_Os11g0484500	338	339
P.patens_109688	340	341
P.patens_183544	342	343
P.persica_TA3702_3760	344	345
P.taeda_TA3907_3352	346	347
P.taeda_TA3914_3352	348	349
P.taeda_TA6813_3352	350	351
P.trichocarpa_640402	352	353
P.trichocarpa_656743	354	355
P.trichocarpa_799988	356	357
P.trichocarpa_TA13860_3694	358	359
P.tricornutum_13356	360	361
P.tricornutum_26934	362	363
P.vulgaris_TA3361_3885	364	365
S.bicolor_TA22020_4558	366	367
S.cerevisiae_YGR256W	368	369
S.lycopersicum_TA40141_4081	370	371
S.oleracea_chloro	372	373
S.oleracea_cyto	374	375
S.tuberosum_TA30318_4113	376	377
T.pseudonana_33343	378	379
V.carteri_109207	380	381
V.vinifera_TA38655_29760	382	383
Z.mays_TA9675_4577999	384	385

Beispiel 2: Alignment von Sequenzen, die mit den in den Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptidsequenzen verwandt sind.
2.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des AlignX-Programms aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Die MSR-Polypeptide sind in 1 aligniert. Die Position der Motive 1 bis 4 ist auf der Consensus-Sequenz angegeben (MSRA-Typ). Die Position der Motive 5 bis 11 ist auf der Medicago truncatula-Sequenz PF61417_102_Medicago angegeben (MSRB-Typ).
2.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des AlignX-Programms aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert wurden). Die Sequenzkonservierung unter ENOLASE-Polypeptiden ist im Wesentlichen entlang der Enolase-Domäne konserviert. Die Consensus-Sequenz(en) zeigt hoch-konservierte Aminosäure(n) zwischen den ENOLASE-Polypeptiden. In der Consensus-Sequenz stehen Leerräume zwischen Aminosäure(n) für eine beliebige Aminosäure. Die ENOLASE-Polypeptide sind in 4 aligniert.
Ein phylogenetischer Baum von ENOLASE-Polypeptiden (4) wurde mit Hilfe eines 'Neighbour Joining'-Clusterungs-Algorithmus erstellt, wie er im AlignX-Programm aus Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
2.3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Das Alignment von ZAT-like-Zinktransporter-Polypeptiden und anderen Sequenzen wurde durchgeführt, wie bei den 6 und 7 hierin beschrieben. Ein phylogenetischer Baum von ZAT-Polypeptiden (7) wurde ebenfalls erstellt, wie beschrieben.
2.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
Das Alignment von Polypeptidsequenzen wird mit Hilfe des AlignX-Programms aus dem Vector NTI-Paket (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments kann eine geringfügige Editierung von Hand vorgenommen werden.
9 zeigt das Alignment von 6-PGDH-Polypeptidsequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
3.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, MSR-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 13,3% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, oder 12,6% mit der SEQ ID NR: 102, sein.
3.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den ENOLASE-Polypeptidsequenzen von Tabelle A2 kann so gering wie 45,9% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 194, sein.
3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Die Berechnung des globalen Prozentsatzes der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wird unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
Die im Vergleich verwendeten Parameter sind:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
3.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, werden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Auch eine MATGAT-Tabelle für lokales Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten über die % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen kann erstellt werden. Die Tabelle B4 zeigt die Ergebnisse hinsichtlich des Prozentsatzes an Identität von im Verfahren der Erfindung nützlichen Polypeptiden, die mit dem MATGAT-Algorithmus berechnet wurden.
Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die verschiedene Methodiken und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
4.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 dargestellt. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert wird.

Datenbank Zugangsnummer Zugangsname E-Wert Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 2 (Start-Ende)

Interpro IPR002569 PMSR (Methionine sulphoxide reductase A) 2.9e–74 39–192

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 102 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 102 repräsentiert wird.

Interpro-Zugangsnummer	Andere Datenbank	Zugang in anderer Datenbank	Zugangsname	E-Wert	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 102 (Start-Ende)
IPR011057	SUPERFAMILY 1.69	SSF51316	Mss4-like	1,50E–54	26–154
IPR002579	TIGRFAMs	TIGR00357	Methioninsulfoxid-Reduktase B	3,40E–75	28–154
IPR002579	Pfam 23.0	PF01641	Methioninsulfoxid-Reduktase B	1,10E–75	31–153
IPR002579	ProDom 2005.1	PD004057	Methioninsulfoxid-Reduktase B	4,00E–61	31–149

4.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 194 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz, wie von SEQ ID NR: 194 repräsentiert.

InterPro	Enolase
	Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	e-Wert/Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 194 [Start-Ende]T
IPR000941	PRODOM	PD000902	Q7XBE4_EEEEE_Q7XBE4;	5e–163/[154–442]T
Familie	PRINTS	PR00148	ENOLASE	5,2e–52/[38–52]T
				5,2e–52/[113–129]T
				5,2e–52/[170–183]T
				5,2e–52/[328–339]T
				5,2e–52/[351–365]T
				5,2e–52/[380–397]T
	PIR	PIRSF001400	Enolase	5,5e–272/[2–442]T
	PANTHER	PTHR11902	ENOLASE	6e–123/[4–221]T
	PFAM	PF00113	Enolase_C	1,5e–215/[148–443]T
	PFAM	PF03952	Enolase_N	3,5e–68/[4–140]T
	TIGRFAMs	TIGR01060	eno: phosphopyruvate hydratase	3,1e–242/[5–443]T
	PROSITE	PS00164	ENOLASE	8e–5/[351–364]T

4.3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 248 repräsentiert, sind in der Tabelle C4 dargestellt. Tabelle C4: InterPro-Scan-Ergebnisse (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 248 repräsentiert.

InterPro

IPR002524

Kation-Efflux-Protein

Biologischer Prozess: Kationentransport (GO:0006812), Molekulare Funktion: Kationen-Transporter-Aktivität (GO:0008324), Zelluläre Komponente: Membran (GO:0016020)

Methode	Zugangs-Nr.	Kurz-Name	Lokalisierung
PANTHER	PTHR11562	KATION-EFFLUX-PROTEIN/ZINKTRANSPORTER	1e–106[33–204]T
PANTHER	PTHR11562	KATION-EFFLUX-PROTEIN/ZINKTRANSPORTER	1e–106[251–397]T
Pfam	PF01545	Cation_efflux	6,4e–73[58–397]T
TigrFAMS	TIGR01297	CDF: Cation Diffusion Facilitator-Familie tr	4,3e–85[54–398]T

4.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)

Die Proteinsequenzen, welche die 6-PGDH repräsentieren, werden als Suchinstanz zur Durchsuchung der InterPro-Datenbannk verwendet (Tabelle C5). Tabelle C5

Methode	Zugangs-Nummer	Kurz-Name	Lokalisierung
InterPro	IPR006113	6-Phosphogluconatdehydrogenase, decarboxylierend
HMMTigr	TIGR00873	gnd: 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, decar	[5–473]
InterPro	IPR006114	6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, C-terminal
HMMPfam	PF00393	6PGD	[182–472]
InterPro	IPR006115	6-Phosphogluconat-Dehydrogehase, NAD-bindend
HMMPfam	PF03446	NAD_binding_2	[3–178]
InterPro	IPR006183	6-Phosphogluconat-Dehydrogenase
FPrintScan	PR00076	6PGDHDRGNASE	[4–27]
			[69–98]
			[122–147]
			[171–199]
			[253–280]
			[361–383]
InterPro	IPR008927	6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, C-terminal-like
superfamily	SSF48179	6-Phosphogluconat-Dehydrogenase C-terminal Domänen-ähnlich	[180–477]
InterPro	IPR012284	Fibritin/6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, C-terminale Verlängerung
Gene3D	G3DSA:1.20.5.320	ohne Beschreibung	[440–471]
InterPro	IPR013328	Dehydrogenase, multihelikal
Gene3D	G3DSA:1.10.1040.10	ohne Beschreibung	[184–439]
InterPro	IPR016040	NAD(P)-bindend
Gene3D	G3DSA:3.40.50.720	ohne Beschreibung	[2–183]
superfamily	SSF51735	NAD(P)-bindend Rossmann-Faltungs-Domänen	[3–179]
InterPro	NULL	NULL
HMMPanther	PTHR11811	6-PHOSPHOGLUCONAT-DEHYDROGENASE	[183–479]
SignalPHMM	signalp	Signalpeptid	[1–19]

Beispiel 5: Topologie-Voraussage der Polypeptidsequenczen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Orts-Zuordnung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
5.1. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie von SEQ ID NR: 248 repräsentiert ist, sind in der Tabelle D1 wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 3 repräsentiert, handelt es sich vorhergesagtermaßen um das Cytoplasma. Tabelle D1: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 248

Länge (AA) 398

Chloroplasten-Transitpeptid 91%
Weitere Merkmale der, durch SEQ ID NR: 248 repräsentierten Polypeptidsequenz umfassen:

• Molekulargewicht: 43827 Da
• Theoretischer pl: 6.6
• Membranprotein

Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1 bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5 bereitgehalten auf dem Server der University of Alberts, Edmonton, Alberts, Canada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark PSORT (URL: psort.org)
• PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

5.2. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
Die Proteinsequenzen, die das 6-PGDH repräsentieren, werden zur Suche mit TargetP 1.1 verwendet. Die Organismengruppe ”Pflanze” wird gewählt, es werden keine Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wird angefordert.
Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1 bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der University of Alberts, Edmonton, Alberts, Canada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

Beispiel 6: Klonieren der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird
6.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
SEQ ID NR: 1
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein MSR-Polypeptid codiert, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 184; sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagctggctcgggaa-3' und (SEQ ID NR: 185; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaa gctgggtgttctggttcaaacttgccc-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pOs_MSR, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 1 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 196) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::MSR (2) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
SEQ ID NR: 101
Eine Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Medicago truncatula-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 186; Sense): 5'-ggggaca agtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggctcttcagcttcttct-3' und (SEQ ID NR: 187; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttgatcatc ttacttccttggtt-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pMt_MSR, hergestellt wird Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 101 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 188) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::MSR (2) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
SEQ ID NR: 163
Eine Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Triticum aestivum-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 189; Sense): 5'-ggggacaagt ttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggcgccgcgccgt-3' und (SEQ ID NR: 190; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtactactggggctt aaacttcagagac-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pTa_MSR, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Entry-Klon, welcher mindestens einen Teil von SEQ ID NR: 171 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza safiva-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 188) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::MSR (2) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
SEQ ID NR: 23
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein MSR-Polypeptid codiert, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 191; Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcaggtcctcgtcgt c-3' und (SEQ ID NR: 192; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaa gctgggtgtgcttgagggaagactgact-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pAt_MSR, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 1 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 188) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor, der im Wesentlichen wie von pGOS2::MSR (2) repräsentiert beschaffen war, gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
6.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren: 5'-ggggaca agtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggcgacgat-3 (SEQ ID NR: 243; Sense) und (SEQ ID NR: 244; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgg gttttagtagggctccacgg-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pEnolase\TM, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 193 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 241) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::ENOLASE (5) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
6.3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei eine Arabidopsis thaliana-Setzlings-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 278; Sense, Startcodon in Fettdruck): 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGGAGTCTTCAAGTCCCC AC-3' und (SEQ ID NR: 279; rückwärts, komplementär): 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAA AGCTGGGTTAGCTTTTAGCGCTCGATTTG-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pZAT, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR 246 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 32) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::ZAT (8) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
6.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)
Klonierung von SEQ ID NR: 280:
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: 280 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Sämlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi-Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm09718 (SEQ ID NR: 283; Sense, Startcodon in Fettdruck): 5'-gggg acaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggct gtcactagaattggt-3' und prm09719 (SEQ ID NR: 284; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaag aaagctgggtattaccgaaaatttgaagcat-3', welche die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich von Invitrogen erworben.
Der Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 280 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 6) für samenspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::6-PGDH (9) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 7: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen behalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Weizen
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, das von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und Welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ausäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ausäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Alfalfa
Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igem Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
Beispiel 8: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
8.1 Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden, wurden in regelmäßigen Intervallen mit Wasser versorgt, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren, und um die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung zu erfüllen.
Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation unter Befolgung desselben Auswertungsvorgehens, wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Dürre-Screen
Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in dem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte geht, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann wieder zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Salzstress-Screen
Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden Samen-bezogene Parameter gemessen.
8.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
8.3 Gemessene Parameter
Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Frühwuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Frühwuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Messungen von Samen-bezogenen Parametern
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen, welche nach dem Trennungsschritt verblieb, bestimmt. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der Anzahl an gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
Beispiele 9: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
9.1. Methioninsulfoxid-Reductase (Msr)
PGOS2:: SEQ ID NR: 1 – Nicht-Stress-Bedingungen
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, welche eine MSR-Nukleinsäure, die den längsten offenen Leserahmen von SEQ ID NR: 1 umfasste, unter der Steuerung des konstitutiven Promotors pGOS2 bei Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend dargestellt. Die Leistung der Pflanzen hinsichtlich verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften wird aus Parametern abgeleitet, welche wie in Absatz 7.3 beschrieben gemessen werden.

Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Area max (oberirdische Biomasse), Emergenz-Wuchskraft (Frühwuchskraft oder EmerVigor), Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds), Flowerperpan (Anzahl an Blüten pro Rispe), WurzelDickMax (maximale Biomasse des Bereichs der Wurzeln, einschließlich dicker Wurzeln), Zahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen), Gesamtzahl an Samen (Gesamtzahl Samen) und Ernteindex pro Pflanze beobachtet (Tabelle E1). Tabelle E1: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Pflanze, die unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen.

Ertragsbezogene Eigenschaft	% Erhöhung in der transgenen im Vergleich zur Kontrollpflanze.
Area Max	5,2
Flowerperpan	8,9
WurzelDickMax	7,5
EmerVigor	16
Ernteindex	13
totalwgseeds	19
Gesamtzahl Samen	13
Anz. gefüllter Samen	20

PGOS2:: SEQ ID NR: 101 – Nicht-Stress-Bedingungen
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, und welche eine MSR-Nukleinsäure, die den längsten offenen Leserahmen Von SEQ ID NR: 101 umfasste, unter der Steuerung des konstitutiven Promotors pGOS2 exprimieren, bei Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt. Die Leistung der Pflanzen hinsichtlich verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften wird aus Parametern abgeleitet, welche im Wesentlichen wie in Absatz 7.3 beschrieben gemessen werden.
Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für den Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen), Samenfüllrate (Füllrate) und den Ernteindex pro Pflanze beobachtet (Tabelle E2). Tabelle E2: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Pflanze, die unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen.

Parameter % Erhöhung in der transgenen im Vergleich zur Kontrollpflanze

totalwgseeds 17,1

Anz. gefüllter Samen 13,5

Füllrate 14,0

Ernteindex 12,3
PGOS2:: SEQ ID NR: 171 – Nicht-Stress-Bedingungen
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, welche eine MSR-Nukleinsäure, die den längsten offenen Leserahmen von SEQ ID NR: 171 umfasste, unter der Steuerung des konstitutiven Promotors pGOS2 exprimieren, bei Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt. Die Leistung der Pflanzen hinsichtlich verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften wird aus Parametern abgeleitet, welche im Wesentlichen wie in Absatz 7.3 beschrieben gemessen werden.
Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für die Samenfüllrate (Füllrate) und den Ernteindex pro Pflanze beobachtet (Tabelle E3). Tabelle E3: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen.

Parameter % Erhöhung in der transgenen im Vergleich zur Kontrollpflanze

Füllrate 10,1
PGOS2:: SEQ ID NR: 171 – Stickstoffverwendungs-Mangelbedingungen
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, welche eine MSR-Nukleinsäure, die den längsten offenen Leserahmen von SEQ ID NR: 23 umfasste, unter der Steuerung des konstitutiven Promotors pGOS2 exprimieren, bei Stickstoffverwendungs-Mangelbedingungen sind nachstehend dargestellt. Die Leistung der Pflanzen hinsichtlich verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften wird aus Parametern abgeleitet, welche im Wesentlichen wie in Absatz 7.3 beschrieben gemessen werden.
Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde bei der Grün-Biomasse der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen (nullizygote Pflanzen) beobachtet.
9.2. Enolase (2-Phospho-D-glycerat-Hydrolase)
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine Enolase-Nukleinsäure, die den längsten offenen Leserahmen in SEQ ID NR: 193 umfasst, unter der Steuerung des Reis-GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren und unter Nichtstress-Bedingungen kultiviert werden, sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mehr als 5% wurde bei Ernteindex (Ernteindex), Samenfüllrate (Füllrate), Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds oder Gesamtgewicht an Samen) und der Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen) beobachtet. Siehe Tabelle E4. Tabelle E4

Ertragsbezogene Eigenschaft % Differenz in transgenen gegenüber Kontrollpflanzen

totalwgseeds 18,45

Anz. gefüllter Samen 16,3

Füllrate 17,0

Ernteindex 21,3
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine Enolase-Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, unter der Steuerung des PRO0151-Promotors exprimieren und unter Nichtstress-Bedingungen kultiviert werden, sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mehr als 5% wurde für die oberirdische Biomasse (AreaMax), Emergenz-Wuchskraft (EmerVigor oder Frühwuchskraft), den Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds), und die Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen) beobachtet. Siehe Tabelle E5. Tabelle E5

Ertragsbezogene Eigenschaft % Differenz in transgenen gegenüber Kontrollpflanzen

AreaMax 11,5

EmerVigor 25,8

totalwgseeds 16,55

Anz. gefüllter Samen 15,1
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine Enolase-Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, unter der Steuerung des Reis-GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren und unter den Bedingungen des Dürre-Screens von Beispiel 7 kultiviert werden, sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mehr als 5% wurde für die Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen), die Samenfüllrate (Füllrate) und die Anzahl an Hauptrispen (firstpan oder Erst-Rispen) beobachtet. Siehe Tabelle E6. Tabelle E6.

Ertragsbezogene Eigenschaft % Differenz in transgenen gegenüber Kontrollpflanzen

Anz. gefüllter Samen 16,7

Füllrate 20,4

firstpan 15,96
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine Enolase-Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 193, unter der Steuerung des PRO0151-Promotors exprimieren und unter Nichtstress-Bedingungen kultiviert werden, sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mehr als 5% wurde für den Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds), und Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen), die Samenfüllrate (Füllrate) und den Ernteindex (Ernteindex) beobachtet. Tabelle E7

Ertragsbezogene Eigenschaft % Differenz in transgenen gegenüber Kontrollpflanzen

totalwgseeds 23,18

Anz. gefüllter Samen 22,8

Füllrate 37,6

Ernteindex 32,8
9.3. Zn-Transporter von Arabidopsis thaliana (ZAT)

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine ZAT-like-Zinktransporter codierende Nukleinsäure exprimieren, unter Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mindestens 5% (p ≤ 0,05) wurde für die folgenden Parameter beobachtet: Tabelle E8

Parameter	Gesamt
AreaMax	24,4
EmerVigor	33,9
Wurzel Max	18,3
totalwgseeds	9,0
Anz. gefüllter Samen	8,5
Blüten pro Rispe	6,7
Höhe Max	17,9
WurzelDickMax	19,5
WurzelDünnMax	18,3

9.4. 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH)

Die transgenen Reispflanzen, welche die durch SEQ ID NR: 1 repräsentierte 6-PGDH-Nukleinsäure unter der Steuerung des GOS2-Promotors exprimieren, zeigen eine Erhöhung von mehr als 5% für oberirdische Biomasse (AreaMax), Gesamtgewicht an Samen (totalwgseeds), Anzahl gefüllter Samen (Anz. gefüllter Samen), Samenfüllrate (Füllrate) und Gesamtzahl an Samen (Anz. total Samen), wenn sie unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden (Tabelle E9). Tabelle E9

Parameter	% Erhöhung in der transgenen Pflanze im Vergleich zur Kontrollpflanze
AreaMax	9,1
EmerVigor	23,5
totalwgseeds	20,4
Anz. gefüllter Samen	18,6
Füllrate	3,8
Anz. total Samen	13,4

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, umfasst, wobei das MSR-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A1 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das MSR-Polypeptid mindestens ein konserviertes Proteinmotiv umfasst, aufweisend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen von: (i) Motiv 1, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 173: (Q)(Y)(R)(S) (ii) Motiv 2, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 174: (Y/H/E/D/G)(H/S)(Q/R)(Q/K/R)(Y/F)(L/C/E) (iii) Motiv 3, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 175: (I/V)(V/M/I/A/R/F/T)(T/V/R)(E/D/T)(I/V/I/Q)(L/K/A/V/I)(P/G/T/K)(A/S/P/T/Q) (iv) Motiv 4, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 176 (A/F/T/-)(Q/v/e/s/c/t/-)(F/I/A/-)(G/A/-)(A/L/S/T/-)(G/-)(C/S/-)(F/-)(W/-)(G/R/S/-)(V/S/G/-)(E/-)(L/-)(A/M/G/V/T/-)(F/C/A/Y/-)(Q/W/R/G/-)(R/C/E/-)(V/I/L/S/A/-)(P/H/R/N/S/-)(G/-)(V/L/-)(T/V/I/Y/R/A/-)(K/R/E/S/A/Y/Q/V/-)(T/A/-)(E/S/R/A/-)(V/A/-)(G/-)(Y/-)(T/S/A/V/I/-)(Q/G/A/H/-)(G/-)(N/S/L/H/K/A/D/Q/-)(L/K/S/T/I/V/F/R/M/-)(H/T/A/S/Q/K/E/P/D/-)(N/D/H/R/G/E/M/-)(P/-)(T/S/L/N/D/-)(Y/-)(E/R/K/Y/G/Q/-)(D/A/L/-)(V/E/D/A/I/-)(C/Y/-)(T/S/R/H/G/-)(G/N/S/-)(A/L/V/Q/R/K/T/D/M/-)(T/G/A/-)(Y/D/G/N/S/K/-)(H/-)(S/A/T/V/N/M)(E/Q)(V/S/F/A/G/C)(V/L/D)(R/Q/E/K/Y)(V/I/L/M)(Q/H/E/T/V/I)(Y/F)(D/N)(P/V/L)(K/R/S/Q/A/N)(A/V/L/I/M/Q/E/D/N)(C/I/V/G)(K/P/K/T/G/Q/H)(Y/F)(D/R/S/K/T/E/Q)(D/Q/K/N/T/V/S)(L/I)(L/V)(D/E/S/A/K)(V/F/I/L/M/A/T)(F/H/L)(W/Y)(A/S/Q/K/T/D/N)(R/K/S/M/N)(H)(D/N)(P/S)(T/R)(T/Q/E/A)(L/P/V/I/G/K/F)(N/F/H/M/D)(R/G)(Q)(G/V)(N/P/G/A/E)(D/L)(V/Q/R/L/S)(G)(T/N/A/S/P)(Q)(Y)(R)(S)(G/V/A/C/I)(I/V/L)(Y/F)(Y/T/F/C)(Y/N/H/Q/T/S) (v) Motiv 5, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 177: (G)(W)(P) (vi) Motiv 6, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 178: (L/V)(Y/F/L)(K/D/E/Q/S/R)(S/T/-)(T/S/A/I/L/K/D/-)(T/A/-)(K/-)(F/-)(D/N/-)(S/A/R)(G/P) (vii) Motiv 7, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 179: (G/D/E/N/-)(G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R) (viii) Motiv 8, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 180: (K/R/L/T/W/L/F/I/-)(S/T/R/Q/P/K/G/-)(E/D/N/A/T/K/-)(E/A/Q/A/G/R/-)(E/D/R/-)((W/L/Q/-)(R/K/A/V/E/Q/-)(A/V/K/T/Q/R/-)(V/I/Q/R/K/G/-)(L/A/-)(S/T/E/N/-)(P/D/S/Q/A/N/E/K/-)(E/D/Q/A-)(Q/E/A)(F/Y/R/-)(R/Y/H/K/T/Q/-)(I/V/-)(L/T/A/-)(R/L/-)(Q/K/L/D/R/E/H/-)(K/A/E/H/-)(G/M/S/A)(T/I/S)(E/D/R)(R/A/K/N/Y/T/I/P/F/L)(P/A/K/Q/R/A)(G/F/N)(T/S/K/C)(G/S/E)(E/P/V/R)(Y/F/L)(N/D/W/V/T/L/E)(K/N/Q/D)(F/T/N/V/L/K/E/S)(F/W/Y/K/H/D/S)(T/N/A/G/E/D/K/R)(E/P/A/D/K/Q/V)(G)(I/V/A/T)(Y/F) (ix) Motiv 9, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 181: (C)(A/V/I/R)(G/C/L)(C)(G/A/D/N/K/Q/E)(T/S/A/L/N)(P/A/D/K)(L/V)(Y/F/L)(K/E/D/Q/S/R)(S/-)(T/S/K/D/A/I/L) (x) Motiv 10, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 182: (A/S)(F/Y)(F/Y/W/D)(E/Q/D/R/A) (G/P/T/A)(I/V/L/F)(G/P/A/D)(G/A/P/N/D/K/E)(A/N/T)(I/V/H)(N/K/T/G/V/I/A)(R/Q/S/E/T)(T/K/H/I/E/A/S/N)(P/L/R/T/A/M/V/I/E)(D/E/R/I/G/N)(P/L/A/D/R/W/M)(D/E/S/T/A/G/-)(G/I/S/F/H/-)(R/I/F/P/G/H/L/K/M/-)(R/F/S/G/M/-)(M/V/Y/I/T/-)(P/R/V/-)(R/-)(Q/T/-)(E/A/-)(I/V/S/T/-)(T/L/I/V/H/N/-)(C/-) (xi) Motiv 11, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 183: (G/A/S/I/-)(H/F/-)(L/F/-)(G/F/C/-)(H/F)(V/I/S)(F/T/H/L/V)(K/D/P/M/L/I/R)(G/D/N/T/V)(E/G/R/H)(G/P/N/D/W/S)(F/P/H/Y/I/N/R/S)(S/L/P/A/D/G/K/R-)(T/R/N/V/-)(P/D/A/F/T/-)(T/L/F/S/R)(D/G/L/Y/N)(E/K/A/N/Q/L)(R/K/D/E/A/P)(H/Y/I/L/K/C/F)(C/V/-)(V/L/I/S/M/-)(N/Q/K/L/-)(S/L/Q/R/-)(V/I/A/R/Y/-) wobei die Aminosäure an jeder Position zwischen Klammern angegeben ist, und ”-” für eine Lücke, d. h. die Abwesenheit einer Aminosäure an der Position, steht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassen.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, oder aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Medicago, am stärksten bevorzugt aus Medicago truncatula ist.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein MSR-Polypeptid codiert.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, wie definiert in den Ansprüchen 1, 2 oder 22; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
Konstrukt gemäß Anspruch 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die ein MSR-Polypeptid, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 19 abgeleitet sind.
Verwendung einer Nukleinsäure, die ein MSR-Polypeptid codiert, in der Erhöhung des Ertrags, insbesondere in der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, gewählt aus: (i) einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169 und SEQ ID NR: 171; (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 31, 33, 41, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 165, 167, 169, und SEQ ID NR: 171; (iii) einer Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) einer Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) einer Nukleinsäure, codierend ein MSR-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
Isoliertes Polypeptid, das aus folgendem gewählt ist: (i) eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172; (ii) eine Aminosäuresequenz die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 32, 34, 42, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 166, 168, 170 und SEQ ID NR: 172 oder jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.