DE112008002848T5

DE112008002848T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112008002848T5
Application number: DE112008002848T
Authority: DE
Inventors: Christophe Reuzeau; Ana Isabel Sanz Molinero
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2010-11-25
Also published as: AR069107A1; CA2703827A1; AU2008320931B2; CN101842489B; CN102936605A; BRPI0818482A2; AU2008320931A1; US20110179526A1; MX2010004305A; WO2009056566A2; WO2009056566A3; EP2235183A2; CN101842489A

Abstract

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen durch Modulieren der Expression einer für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB-Domänenprotein kodierenden Nukleinsäure in einer Pflanze.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen oder Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2(DNA-bindend mit einem Finger, Subgruppe C2)-Domänentranskriptionsfaktorpolypeptid oder ein MYB-Domänenprotein (MYB7) kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktorpolypeptid oder ein MYB7 kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale oder verbesserte Wachstumseigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen zur kulturpflanzen- und gartenbaulichen Verbesserung nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und vielen Arte von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für eine korrekte Verankerung in wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf der Basis von dem im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasmas im Europäischen Atlantik.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrema, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
Ein Ansatz zur Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
Es wurde nun gefunden, dass man Ertragsmerkmale oder verschiedene Wachstumseigenschaften in Pflanzen verbessern kann, indem man in einer Pflanze die Expression einer für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktorpolypeptid oder ein MYB7 in einer Pflanze kodierende Nukleinsäure moduliert.
Dof-Domänenproteine (Proteine, die eine Dof-Domäne enthalten) sind pflanzenspezifische Transkriptionsfaktoren mit einer hochkonservierten DNA-bindenden Domäne mit einem einzelnen C2-C2-Zinkfinger. Während des letzten Jahrzehnts wurden zahlreiche Dof-Domänenproteine sowohl in monokotyledonen als auch in dikotyledonen Pflanzen einschließlich Mais, Gerste, Weizen, Reis, Tabak, Arabidopsis, Kürbis, Kartoffel und Erbse identifiziert. Es wurde gezeigt, dass Dof-Domänenproteine bei verschiedenen pflanzenspezifischen biologischen Prozessen als Aktivatoren oder Repressoren der Transkription fungieren. Phylogenetische Studien legen nahe, dass die Dof-Domänenproteine vor der Diversifikation von Angiospermen divergierten; es könnten sich daher nach einer langen Multiplikationsperiode verschiedene Dof-Domänenproteine entwickelt haben, die in der Pflanzenphysiologie verschiedene Rollen spielen. Die hochkonservierte Sequenz der Dof-Domäne kann jedoch Dof-Domänenproteine mit einer ähnlichen Funktion ausstatten. Andererseits ist die Sequenz der Dof-Domänenproteine außerhalb der Dof-Domäne hochdivergent. Es wurde vorgeschlagen, dass die diversifizierten Regionen außerhalb der Dof-Domäne mit verschiedenen Funktionen unterschiedlicher Dof-Domänenproteine verbunden sein können (Yanagiswa, Plant Cell Physiol. 45 (4): 386–391 (2004).
Dof-Domänenproteine zeigen eine sequenzspezifische DNA-Bindungsaktivität. Die Sequenzspezifität wird ausschließlich durch die Dof-Domäne festgelegt (Yanagisawa, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3403–3410; Kisu, Y., Ono, T., Shimofurutani, N., Suzuki, M. und Esaka, M. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 1054–1064.). Für zahlreiche Dof-Proteine (Dof-Domänenproteine) wurden Bindungsstellen in der Ziel-DNA beschrieben (De Paolis, A., Sabatini, S., de Pascalis, L., Contantino, P. und Capone, I. (1996) Plant J. 10: 215–223; Yanagisawa, S. und Izui, K. (1993) J. Biol. Chem. 268: 16028–16036; Mena, M., Vicente-Carbajosa, J., Schmidt, R. J. und Carbonero, P. (1998) Plant J. 16: 53–62). Die meisten Dof-Domänenproteine binden an die Sequenz AAAG oder CTTT in der komplementären Kette. Eine Ausnahme findet man bei dem AOBP-Dof-Domänenprotein von Kürbis, das sich an die AGTA-Sequenz bindet (Kisu et al. 1998. Plant cell physiol. 39, 1054–1064). Die Sequenz (A/T) AAAG stellt ein anerkanntes DNA-Bindungskernmotiv für Dof-Domänen dar.
Die Dof-Domäne besteht aus etwa 50–60 Aminosäuren, die die Konsensussequenz CX2CX21CX2C umfassen, von der vorgeschlagen wurde, dass sie eine Zinkfingerstruktur ähnlich den Cys2/Cys2-Zinkfingerdomänen bildet, wobei die vier konservierten Cysteinreste die Zinkionen koordinieren würden (Uemura et al., 2004 Plant J. 37, 741–749). Die Dof-Domäne ist an basischen Aminosäuren angereichert. Alle Dof-Domänen verfügen über vier konservierte Cysteinreste, wenngleich sich die Aminosäuresequenz der Dof-Domäne und die Anordnung der Cysteinreste von denen anderer Zinkfinger unterscheiden (Yanagisawa, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3403–3410. Yanagisawa, S. (1996) Trends Plant Sci. 1: 213–214. Yanagisawa, S. (2002) Trends Plant Sci. 7: 555–560).
Die Dof-Domänenproteine von Arabidopsis und Reis wurden in 4 orthologe Hauptcluster, die als Aa, Bb, Cc und Dd bezeichnet werden, eingeteilt (Lijavetzky et al. 2003. BMC Evolutionary Biology 3). Auf der Grundlage phylogenetischer Beziehungen wurden in einigen der Hauptcluster Untercluster festgestellt. Außerhalb der Dof-Domäne gibt es zwischen den Mitgliedern in den verschiedenen Clustern nur eine sehr geringe Sequenzkonservierung. Diese große Sequenzdiversität legt differenzierte biologische Rollen für die Dof-Domänenproteine in Pflanzen nahe. Mitglieder im gleichen Cluster oder Untercluster teilen sich jedoch eine Reihe konservierter Sequenzmotive, was auf eine biologische funktionelle Konservierung bei Dof-Proteinen, die zum gleichen Cluster bzw. Untercluster gehören, hindeutet.
In der WO 2007/064724 sind Dof-Domänenproteine offenbart, die zu den Clustern Dd und Bb gehören und sich zur Steigerung des Pflanzenertrags eignen.
Gemäß einer Ausführungsform wurden nun überraschenderweise gefunden, dass man durch das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Dof-Domänenprotein kodiert, das zum Cluster Cc, Untercluster C2 gehört (DOF-C2-Transkriptionsfaktorpolypeptid), Pflanzen mit gesteigertem (bzw. verbessertem) Ertrag, bezogen auf geeignete Kontrollpflanzen, erhält.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze bezogen auf Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktorpolypeptid kodierende Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
Bei MYB-Domänenproteinen handelt es sich um Transkriptionsfaktoren mit einer hochkonservierten DNA-Bindungsdomäne. Die MYB-Domäne wurde ursprünglich im Onkogen (v-myb) des Avian Myeloblastosis Virus beschrieben (Klempnauer et al. (1982) Cell 33, 453–63). Viele Wirbeltiere enthalten drei mit v-Myb verwandte Gene (c-Myb, A-Myb und B-Myb), und andere ähnliche Gene wurden in Insekten, Pflanzen, Pilzen und Schleimpilzen identifiziert. Die kodierten Proteine sind entscheidend für die Steuerung der Proliferation und Differenzierung in einer Reihe von Zelltypen. MYB-Proteine enthalten ein bis vier nicht perfekte direkte Wiederholungen einer konservierten Sequenz von 50–53 Aminosäuren, die für eine an der DNA-Bindung beteiligte Helix-Kehre-Helix-Struktur kodiert (Rosinski und Atchley (1998) J. Mol. Evol. 46, 74–83). Drei in regelmäßigen Abständen befindliche Tryptophanreste, die in der dreidimensionalen Helix-Kehre-Helix-Struktur einen Tryptophancluster bilden, sind charakteristisch für eine MYB-Wiederholung. Die drei Wiederholungen in c-Myb werden als R1, R2 und R3 bezeichnet; und Wiederholungen aus anderen MYB-Proteinen werden entsprechend ihrer Ähnlichkeit zu R1, R2 bzw. R3 kategorisiert. Da es außerhalb der MYB-Domäne nur eine sehr geringe Sequenzkonservierung gibt, wurden die MYB-Proteine auf der Basis der außerhalb der MYB-Kodierungsregion identifizierten konservierten Motive in Untergruppen zusammengefasst (Jiang et al. (2004) Genome Biology 5, R46).
AtMYB7 gehört zur R2R3-MYB-Genfamilie (Li und Parish, Plant J. 8, 963–972, 1995), bei der es sich um eine große Genfamilie (mit 126 beschriebenen Genen in Arabidopsis thaliana (Zimmerman et al., Plant J. 40, 22–34, 2004)) handelt. Die Mitglieder dieser Gruppe sind an verschiedenen Prozessen einschließlich dem Sekundärmetabolismus, der Zellmorphogenese, der Steuerung der Meristembildung, der Blüten- und Samenentwicklung, dem Zellzyklus, Abwehr- und Stressreaktionen, der Licht- und Hormonsignalvermittlung beteiligt (Chen et al., Cell Res. 16, 797–798, 2006). Es wurden beschrieben, dass AtMYB7 unter Stress vermehrt exprimiert wird (Ma und Bohnert, Genome Biology 8: R49, 2007); seine genaue Funktion in der Pflanze ist jedoch noch unbekannt. Es wird weiterhin postuliert, dass die AtMYB7-Expression eine Rolle bei der biotischen Stresstoleranz spielt ( WO 02/16655 und WO 03/000898 ). In der WO 2007099096 wird ein Reis-MYB-Protein offenbart, dass sich für die Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen eignet.
Überraschend wurde es jetzt in einer anderen Ausführungsform entdeckt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein MYB7-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter vegetativer Biomasse und gesteigerter Auflaufvitalität, gegenüber Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten gesteigerte Biomasse und gesteigerte Auflaufvitalität.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Homologon/Homologa
”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bestens bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Überblick über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(a)/Paralog(a)
Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologa sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen, und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8(%G/Cb)2 – 820/Lc
3) oligo-DNA- oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(l_n)

^a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
^b nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau.
^c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
^d oligo, Oligonukleotid; l_n, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes, kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden, oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder künstlich hergestellt. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismus (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Genshuffling/gerichtete Evolution
Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die diejenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, exprimieren können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, der in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Nukleotidsequenzen gelegenen Promotor können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man den Promotor funktionsfähig mit einem Reporter-Gen verknüpft und das Expressionsausmaß und/oder das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bestens bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase. Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert. ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/500000 Transkripte pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel, oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle.
Funktionsfähig verknüpft
Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
Konstitutiver Promotor
Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2C unten.
Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promotor
Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in Tabelle 2A unten angeführt: Tabelle 2A: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27 (2): 237–48
Arabidopsis-PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161 (2): 337–346
in Wurzeln exprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987
auxininduzierbares Gen des Tabaks	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988
wurzelspezifische Gene aus Tabak	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990
G1-3b-Gen aus B. napus	United States Patent No. 5,401,836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 aus Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Das LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse-I-Patatingen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1 Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei ”leaky”-Expression) transkriptionell aktiv. Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in Tabelle 2B unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Offenbarung ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen als wäre sie hier vollständig beschrieben. Tabelle 2B: Beispiele für samenspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14 (3): 323–32, 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promotor aus Gerste	Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248 (5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste-DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116 (1): 53–62, 1998
blz2	EP 99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
α-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
α-Kafirin aus Sorghumhirse	DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-artiges Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Tabelle 2C: Beispiele für konstitutive Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2 (6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25 (5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10 (1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
Nos	Shaw et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
Terminator
Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Modulation
Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend geändert ist, dass das Expressionsausmaß erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine Art Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” bedeutet eine Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation des letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie es hier verwendet wird steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegel hinaus geht.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren getrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, die das interessierende Polypeptid kodiert, aufwärtsreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO 9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise hergeleitet sein von Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Genen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen
Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz zugegeben werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in Pflanzen- und Tier-Expressionskonstrukten steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebenen bis zu 1000fach (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intron-Steigerung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind im Stand der Technik bekannt. Für eine allgemeine Information siehe: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ein ”endogenes” Gen betrifft nicht nur das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form gefunden wird (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen, (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure bzw. Gen) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Eine transgene Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” der Expression soll eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung ist in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge der im Wesentlichen durchgehenden Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen (u. a. mit der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann von der Nukleinsäure, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer Nukleinsäure hergeleitet werden, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann. Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäure, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Anforderung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA) kloniert wird, in einer Pflanze.
In einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einem Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann), der vorzugsweise eine Hairpin-Struktur bilden kann. Der inverted repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fragment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker, etc.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebracht sind (RISC). Der RISC spaltet zudem die mRNA-Transkripte, wodurch im Wesentlichen die Anzahl der mRNA-Transkripte in Polypeptide translatiert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten können beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ) herangezogen werden.
Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, aber eine oder mehrere einiger bekannter ”Gen-Silencing”-Verfahren kann zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) getriggert, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird weiter durch die Pflanze in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der zu einem Polypeptid zu translatierenden mRNA-Transkripte verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht einem Zielgen.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäure-Sequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäure verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Reduktion der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Triggern der Co-Suppression gibt.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotid-Sequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem zu silencenden endogenen Gen. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nichtkodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleinsäuresequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß der Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz Antisense-Orientierung aufweist (wie auch mRNA 5' und 3' UTR). Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotid-Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotid-Sequenz) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukloeotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bestens bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen umfassen, Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch produziert werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die aus der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, ist zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung). Die Produktion der Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die Nukleinsäuremoleküle, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Silencen verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden, oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Anzielen ausgewählter Zellen modifiziert werden und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch auf Zellen übertragen werden, und zwar mit den hier beschriebenen Vektoren.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch mit Ribozymen durchgeführt werden. Die Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz spalten können, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die ein Polypeptid codieren, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, zur Auswahl einer katalytischen mRNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen ausgewählt werden (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Das Gensilencing kann ebenfalls durch Insertionsmutagenese erzielt (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. von Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben wurden.
Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Das Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutationen und/oder Verkürzungen können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), die aber ihre normale Funktion nicht ausüben können (beispielsweise als signalgebender Ligand).
Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens komplementär sind (beispielsweise Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifach helikale Strukturen erzeugt werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass sich von Menschenhand gemachte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, eignet.
Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Genvarianten identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder RNA-Translation. Die meisten Pflanzen-mikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Mismatches. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie durch Bindung an ihre Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht. MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC), da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und die Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Herkömmliche Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer vollständigen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung beispielsweise eines geeigneten Promotors erzielt wird.
Selektionsmarker(gen)/Reportergen
”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren erfolgreich Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Die Cotransformation setzt 2 Vektoren ein, die simultan zur Transformation eingesetzt werden, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält, oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien, erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette veranschaulicht. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäure-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat und geht verloren. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen, springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/lox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist der Marker zwischen den loxP-Sequenzen integriert, wird er entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
Transgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
(b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129 (1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben tansgene Pflanzen. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungstagging
T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) in der genomischen Region des interessierenden Gens von bis zu 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer Konfiguration, so dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium Infektion und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
TILLING
Der Begriff TILLING ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bestens bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5 (2): 145–50) erwähnt.
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom, an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen verwendet wird, wie Hefe und das Moos Physcomitrella. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10): 3077–84) sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030–4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132–8), und es gibt Ansätze, die gewöhnlich anwendbar sind, ungeachtet des Zielorganismus (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einher geht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro m² für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten m² dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde gut balancierte Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit eine Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen erreicht im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien) und oft einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen.
Erhöhen/Verbessern/Fördern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro m²; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
Greenness Index
Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen, und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen, wird der Greenness Index der Pflanzen in der erste Bildnahme nach dem Trockenstress gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (bspw. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (bspw. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (bspw. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (bspw. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (bspw. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (bspw. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (bspw. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (bspw. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (bspw. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (bspw. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression der Nukleinsäure, die für einen DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
Die Ausdrücke „Steigern der Ertragsmerkmale/gesteigerte Ertragsmerkmale” und „Verbessern der Ertragsmerkmale/verbesserte Ertragsmerkmale” haben äquivalente Bedeutungen und werden hier miteinander austauschbar verwendet.
Die Ausdrücke „Verbessern der Ertragsmerkmale/verbesserte Ertragsmerkmale” und „Verbessern der Pflanzenwachstumseigenschaften/verbesserte Pflanzenwachstumseigenschaften” haben äquivalente Bedeutungen und werden hier miteinander austauschbar verwendet.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein solches MYB7-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Nukleinsäure” oder ”DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Gen” oder „MYB7-Nukleinsäure” oder „MYB7-Gen” bezeichnet.
Der Ausdruck „DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf alle Polypeptide, die Merkmal (i) und Merkmal (ii) wie folgt enthalten:

(i) eine DOF-Domaine mit in zunehmender Präferenz wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu den entweder durch SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 wiedergegebenen DOF-Domänensequenzen; und
(ii) Motiv I: ERKARPQKDQ (SEQ ID NO: 37) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv II: YWSGMI (SEQ ID NO: 38) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen und/oder mit in zunehmender Präferenz drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).

Die Ausdrücke „DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid”, „DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Protein”, „DOF-C2-Transkriptionsfaktor”, „DOF-C2-Polypeptid” und „DOF-C2-Protein” haben, so wie sie hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung und sind miteinander austauschbar.
Darüber hinaus können DOF-C2-Polypeptide eines, zwei, drei, vier oder alle der folgenden Motive umfassen:

– Motiv III: RLLFPFEDLKPLVS (SEQ ID NO: 39) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv IV: INVKPMEEI (SEQ ID NO: 40) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv V: KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH (SEQ ID NO: 41) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv VI: MELLRSTGCYM (SEQ ID NO: 42) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv VII: MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO: 43) mit null, einer oder mehreren Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz neun; acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).

Ein bevorzugtes bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Polypeptid umfasst eine wie in Merkmal (i) beschriebene Dof-Domäne und umfasst sowohl Motiv I als auch II. Besonders bevorzugt umfasst es Motiv I, Motiv II und Motiv III. Weiter bevorzugt umfasst das Polypeptid auch Motiv III. Weiter bevorzugt umfasst das Polypeptid auch Motiv IV. Ganz besonders bevorzugt umfasst das Polypeptid eine wie in Merkmal (i) beschriebene Dof-Domäne und Motiv I, Motiv II, Motiv III, IV und V.
Die SEQ ID NO: 2 (kodiert durch SEQ ID NO: 1) ist ein Beispiel für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid, das die wie oben definierten Merkmale (i) und (ii) umfasst, d. h. mit wenigstens 60% Sequenzidentität zur entweder durch SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 wiedergegebenen Dof-Domäne; und Motiv I und in diesem Fall zusätzlich Motiv II. Weitere Beispiele für DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptide, die wie oben definierte Merkmale (i) und (ii) umfassen, sind in Tabelle A1 angeführt.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle A” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle A1 und/oder A2 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle A1” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle A1 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle A2” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle A2 gemeint ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle A”. Tabelle A1. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle A” Tabelle A2.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle B” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle B1 und/oder B2 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle B1” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle B1 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle B2” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle B2 gemeint ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle B” Tabelle B1. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle B” Tabelle B2.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle C” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle C1 und/oder C2 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle C1” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle C1 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle C2” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle C2 gemeint ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle C” Tabelle C1. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle C” Tabelle C2.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle D” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle D1 und/oder D2 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle D1” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle D1 gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle D2” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle D2 gemeint ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle D” Tabelle D1. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle D” Tabelle D2.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle 2” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle 2A und/oder 2B und/oder Tabelle 2C gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle 2A” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle 2A gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle 2B” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle 2B gemeint ist. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck „Tabelle 2C” ist so zu verstehen, dass damit der Inhalt von Tabelle 2C gemeint ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle 2” Tabelle 2A. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle 2” Tabelle 2B. Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „Tabelle 2” Tabelle 2C.
Die in Tabelle A1 angeführten Polypeptide sind Beispiele von „Paraloga und Orthologa” eines durch SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptids aus verschiedenen Pflanzenursprüngen, die zu der orthologen Hauptgruppe Cc, den Untergruppen C2 und C2.1 und C2.2, wie in 2 und 3 von Lijavetzky et al. 2004 definiert, gehören. Bevorzugte für die Durchführung der Erfindung geeignete Polypeptide gehören zur orthologen Gruppe C2 (die C2 von Arabidopsis und C2.1 und C2.2 von Reis umfasst), wie von Lijavetzky et al. 2004 definiert. Ein bevorzugtes DOF-C2-Polypeptid der Erfindung ist ein Paralog oder ein Ortholog eines der in Tabelle A1 angeführten Polypeptide.
Alternativ dazu hat das Homolog des DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid in zunehmender Präferenz wenigstens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen Aminosäure und umfasst Merkmal (i) und Merkmal (ii) wie folgt:

(i) eine DOF-Domaine mit in zunehmender Präferenz wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu den entweder durch SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 wiedergegebenen DOF-Domänen; und
(ii) Motiv I: ERKARPQKDQ (SEQ ID NO: 37) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv II: YWSGMI (SEQ ID NO: 38) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen und/oder mit in zunehmender Präferenz drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).

Ein wie hier definiertes „MYB7-Polypeptid” bezieht sich auf ein R2R3-MYB-Polypeptid, das zwei SANT-Domänen (SMART entry SM00717, Myb_DNA-binding domain (Pfam entry PF00249, Homeodomain_like (Superfamily entry SSF46689)) enthält, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem R2R3-MYB-Polypeptid nicht um das durch SEQ ID NO: 141 kodierte OsMYB4 oder um das OsMYB4 mit der SEQ ID NO: 142 handelt.
Darüber hinaus umfasst ein „MYB7-Polypeptid” weiterhin vier oder mehr der Motive 1 bis 7, vorzugsweise fünf oder mehr der Motive 1 bis 7, besonders bevorzugt sechs oder mehr der Motive 1 bis 7, ganz besonders bevorzugt alle der Motive 1 bis 7.
Motiv 1 (SEQ ID NO: 55): (T/S)X(E/Q/D)EDXXLXX(Y/H)IXXXG; wobei X in Position 2 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für K, Q, A, P, T, I oder S, besonders bevorzugt für K oder Q, steht; wobei X in Position 6 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für Q, E, D, A oder S, besonders bevorzugt für Q, E oder D, steht; wobei X in Position 7 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für R, L, K, M oder I, besonders bevorzugt für R, L oder K, steht; wobei X in Position 9 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für I, V, T, G, L oder A, besonders bevorzugt für I, V oder T, steht; wobei X in Position 10 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für N, D, A, S, K oder G, besonders bevorzugt für N, D, A oder S, steht; wobei X in Position 13 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für R, K, Q, E, T oder N, besonders bevorzugt für R, K, Q oder E, steht; wobei X in Position 14 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für V, K, A, S, T, E oder N, besonders bevorzugt für V, K, A oder S, steht; und wobei X in Position 15 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für Y, H, N oder D, besonders bevorzugt für H oder Y, steht.
Motiv 2 (SEQ ID NO: 56): (E/Y/P/H/L)(G/S)(C/N/S/R/G)W(R/N)(S/T/A/L/N)(L/I)P(K/R/T/A/S)(A/S/K/N/L/R). Vorzugsweise ist Motiv 2 EG(C/N)WR(S/T/A)LP(K/R)(A/S).
Motiv 3 (SEQ ID NO: 57): RCGKSCRLRWXNYLRP, wobei X für eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise I, M, L oder T, steht.
Motiv 4 (SEQ ID NO: 58): RTDNE(I/V)KN(Y/H/F)WN. Vorzugsweise ist Motiv 4 RTDNEIKNYWN.
Motiv 5 (SEQ ID NO: 59): (T/S)(H/N/R)(I/V/L)(K/R/S)(R/K)(K/R)(L/I)XXXG(I/L/T)(D/T)(P/L), wobei X in Position 8 für eine beliebige Aminosäure stehen kann und vorzugsweise für I, L, V, T, A oder R, besonders bevorzugt I, L, V oder T, steht; wobei X in Position 9 für eine beliebige Aminosäure stehen kann und vorzugsweise für S, N, R, G, A, V, K oder Q, vorzugsweise S, N, R, G oder A, steht; wobei X in Position 10 für eine beliebige Aminosäure stehen kann und vorzugsweise für R, K, Q, M oder T steht. Vorzugsweise ist Motiv 5 TH(I/V/L)(K/R)(R/K)(K/R)(L/I)XXXG(I/L)DP.
Motiv 6 (SEQ ID NO: 60): X(P/L/Q/W)(D/E/V)(L/I)NL(E/D)LX(I/L/V)(S/D/N/G)(L/P/I)(P/S/A/V/T), wobei X in Position 1 für eine beliebige Aminosäure stehen kann und vorzugsweise für F, G, C, L, D oder Y steht und wobei X in Position 9 für eine beliebige Aminosäure stehen kann und vorzugsweise für R, K, G, T, C, D oder S steht.
Motiv 7 (SEQ ID NO: 61): (F/Y/C/D)(R/S/T)(S/T/G/R)(L/I)(E/P)(M/T)K
Alternativ dazu hat das Homologon eines MYB7-Proteins in zunehmender Präferenz wenigstens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der durch SEQ ID NO: 50 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein wie oben umrissene konservierte Motive enthält, und mit der Maßgabe, dass das Homologon nicht für das in SEQ ID NO: 142 angeführte OsMYB4 steht.
Die Gesamtsequenzidentität wird unter Einsatz eines globalen Abgleichalgorithmus wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit den voreingestellten Parametern, bestimmt. Verglichen mit der Gesamtsequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn ausschließlich konservierte Domänen bzw. Motive in Betracht gezogen werden. Lokal abgeglichene Algorithmen wie BLAST lassen sich zur Bestimmung der Sequenzähnlichkeit in einer konservierten Region des Polypeptids wie einer DOF-Domäne in einem DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid einsetzen.
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Stammbaums wie dem in Figur X gezeigten zur Anwendung kommt, einen Cluster in der Gruppe C2, die die durch SEQ ID NO: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfasst, und nicht mit einer anderen Gruppe.
Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden. Für lokale Abgleichungen eignet sich insbesondere der Smith-Waterman-Algorithmus (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195–7).
Alternativ dazu lässt sich ein für die Verfahren der Erfindung geeignetes DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid identifizieren, indem man einen Sequenzvergleich mit einem bekannten DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid durchführt und die Sequenzähnlichkeit feststellt. Die Sequenzen können unter Anwendung eines der im Stand der Technik bekannten Verfahren wie dem BLAST-Algorithmus (für die lokale Abgleichung) oder dem BestFit-Algorithmus (für die globale Abgleichung) abgeglichen werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass es bei einer gegebenen Sequenz zu einem Alignment kommt, wird als Basis für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide genommen. Ein Parameter, mit dem eine solche Wahrscheinlichkeit typischerweise wiedergegeben wird, wird als e-Wert bezeichnet. Der E-Wert ist ein Maß für die Verlässlichkeit des S-Scores. Der S-Score ist ein Maß für die Ähnlichkeit der Abfrage zur gezeigten Sequenz. Der e-Wert beschreibt, wie oft erwartet werden kann, dass ein gegebener S-Score zufällig auftritt. Der Cut-Off des e-Wertes kann bis zu 1,0 betragen. Die typische Schwelle für einen zuverlässigen (echten) Hit, der eine signifikante Sequenzhomologie zu der abgefragten Sequenz zeigt und von einer BLAST-Suche herrührt, liegt unter 1.e-5 (e⁵); in einigen Fällen nimmt man eine noch niedrigere Schwelle, zum Beispiel 1.e-10 (e¹⁰) oder noch niedriger.
Vorzugsweise hat ein in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes DOF-C2- Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid mit zunehmender Präferenz einen e-Wert von weniger als 1.e-10, 1.e-15, 1.e-20, 1.e-25, 1.e-50, 1.e-75, 1.e-100, 1.e-150, 1.e-200, 1.e-300, 1.e-400 und 1.e-500 bei einem Abgleich mit einem der Polypeptide von Tabelle A1.
Es versteht sich, dass eine für ein erfindungsgemäßes DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodierende Nukleinsäure nicht auf Sequenzen des natürlichen Ursprungs beschränkt ist. Die Nukleinsäure kann für ein „de novo” entwickeltes DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodieren.
Weiterhin verfügen DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptide typischerweise über eine DNA-bindende Aktivität und haben ein nukleares Lokalisationssignal und eine Aktivierungsdomäne. Das Vorhandensein einer Aktivierungsdomäne und einer DNA-bindenden Aktivität lässt sich vom Fachmann unter Anwendung von Routinetechniken und -vorschriften leicht bestimmen. Experimentelle Vorschriften zum Messen der DNA-bindenden Aktivitäten von Dof-Domänenpolypeptiden wurden beschrieben (Umemura et al. 2004; Yanagisawa, S. und Sheen, J. (1998) Plant Cell 10: 75–89; Plesch, G., Ehrhardt, T. und Mueller-Roeber, B. (2001) Plant J. 28: 455–464).
Bevorzugte für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptide sind dazu in der Lage, sich an DNA-Fragmente und/oder Genpromotorregionen zu binden, die die Sequenz (A/T)AAAG (SEQ ID NO: 44) enthalten, die das anerkannte DNA-Bindungskernmotiv für Dof-Domänen darstellt.
Darüber hinaus liefern DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide bei einer Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 5 und 6 umrissen Pflanzen mit erhöhten (bzw. verbesserten) Ertragsmerkmalen, insbesondere Gesamtgewicht der Samen, Gesamtanzahl an Samen pro Pflanze, Anzahl an gefüllten Samen, Anzahl an Blüten pro Rispe und Harvest Index.
Die vorliegende Erfindung wird erläutert, indem man Pflanzen mit der durch SEQ ID NO: 1 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf alle wie hier definierten für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktoren kodierende Nukleinsäuren oder DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide anwenden.
Darüber hinaus weisen MYB7-Polypeptide (wenigstens in ihrer nativen Form) typischerweise eine DNA-bindende Aktivität und eine Aktivierungsdomäne auf. Dem Fachmann sollte es leicht möglich sein, unter Anwendung von Routinetechniken und -verfahren das Vorhandensein einer Aktivierungsdomäne und einer DNA-bindenden Aktivität festzustellen. Proteine, die mit MYB7-Polypeptiden wechselwirken (zum Beispiel in transkriptionellen Komplexen), lassen sich von einem Fachmann leicht unter Anwendung von Standardtechniken wie einer Zwei-Hybrid-Wechselwirkung identifizieren. Es wird postuliert, dass MYB7-Proteine mit BHLH-Transkriptionsfaktoren wechselwirken (Zimmerman et al., Plant Journal 40, 22–34, 2004).
Darüber hinaus liefern MYB7-Polypeptide bei der Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 8 und 9 umrissen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Auflaufvitalität.
Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 49, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 50 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, oder des MYB7-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2 oder des MYB7-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 50, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz in einer Ausführungsform die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 und in einer anderen Ausführungsform die SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 50, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
Der Ausdruck „Abschnitt” bezieht sich, sowie er hier definiert ist, auf einen Teil einer DNA, die für ein Polypeptid kodiert, welches Merkmal (i) und Merkmal (ii) umfasst, wie folgt:

(i) eine DOF-Domäne mit in zunehmender Präferenz wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur entweder durch SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 wiedergegebenen DOF-Domäne; und
(ii) Motiv I: ERKARPQKDQ (SEQ ID NO: 37) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv II: YWSGMI (SEQ ID NO: 38) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen und/oder mit in zunehmender Präferenz drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).

Darüber hinaus kann das Polypeptid in dem obigen „Abschnitt” eines, zwei, drei, vier oder alle der folgenden Motive umfassen:

– Motiv III: RLLFPFEDLKPLVS (SEQ ID NO: 39) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv IV: INVKPMEEI (SEQ ID NO: 40) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv V: KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH (SEQ ID NO: 41) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv VI: MELLRSTGCYM (SEQ ID NO: 42) mit null, einer oder mehreren Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder
– Motiv VII: MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO: 43) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).

Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beisipiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
In einer Ausführungsform kodieren Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 1000 oder mehr aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe C2, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
Bei einer anderen Ausführungsform kodieren für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Abschnitte für ein wie hier definiertes MYB7-Polypeptid und haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise hat der Abschnitt eine Länge von wenigstens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, wobei es sich bei den aufeinanderfolgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuresequenzen handelt, oder einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen kodiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 49.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie hier definiert, mit im Wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel genannten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren.
Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 49 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, volle Länge aufweist und verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe C2, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A von Beispiel angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe C2, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
Bei einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 49 oder eine Spleißvariante einer für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 50 kodierenden Aminosäure.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und irgendeine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe C2, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
Bei einer anderen Ausführungsform haben die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbaren allelischen Varianten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das MYB7-Polypeptid von SEQ ID NO: 50 und einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante von SEQ ID NO: 49 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 50 kodiert.
”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe C2, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
Nukleinsäuren, die für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit Auflaufvitalität und/oder erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag und/oder erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag”, ”Samenertrag” und „Auflaufvitalität” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann.
Insbesondere sind solche erntbaren Teile in einer Ausführungsform Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Samenausbeute im Vergleich zu der Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
Bei einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei diesen erntbaren Teilen um die vegetative Biomasse und/oder Samen, und das Durchführen der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen mit erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Samenausbeute verglichen mit Kontrollpflanzen. Vorzugsweise handelt es sich bei der vegetativen Biomasse um oberirdische Biomasse.
Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Quadratmeter wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Ertrages, insbesondere der Biomasse von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches die Modulation der Expression einer für ein wie hier definiertes MYB7-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7- Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptid kodiert, moduliert.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor hervorgerufen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:

(a) eine Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) funktionsfähig verbunden.
Jede Art von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein samenspezifischer oder ein konstitutiver Promotor ist für die Verfahren besonders geeignet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem samenspezifischen Promotor um den Promotor eines Gens, das für ein spätes Embryogeneseprotein kodiert; besonders bevorzugt ist der Promotor des WSI18-Gens aus Reis. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor auch um einen ubiquitären Promotor. Die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die erfindungsgemäße, ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptid kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 49 noch auf die Expression einer ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, die von einem samenspezifischen Promotor angetrieben wird, oder die von einem wurzelspezifischen Promotor und/oder einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
Der samenspezifische ist vorzugsweise ein ABA-induzierbarer Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der WSI18-Promotor durch eine SEQ ID NO: 47 im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäuresequenz wiedergegeben.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 53 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Promotor durch die SEQ ID NO: 53 dargestellt. Weitere Beispiele für samenspezifische oder konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen”.
Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine SEQ ID NO: 48 im Wesentlichen ähnliche oder dazu identische Expressionskassette, die den WSI18-Promotor, die für das DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodierende Nukleinsäure und die T-zein + T-rubisco-Transkriptionsterminatorsequenz umfasst.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die SEQ ID NO: 54 im Wesentlichen ähnelt oder dazu identisch ist, welche den Reis-GOS2-Promotor und die für das MYB7-Polypeptid kodierende Nukleinsäure umfasst.
Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag und erhöhter Jungpflanzenvitalität bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit gesteigerten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere einer erhöhten vegetativen Biomasse und/oder einer gesteigerten Auflaufvitalität, bereit, welches Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer für ein MYB7-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um irgendeine der Nukleinsäuren handeln, die für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen cotransferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer. Eine bevorzugte Reissorte ist Indica oder Japonica, oder ein Hybrid davon; ein bevorzugter Japonica-Kultivar ist Nipponbare.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
Hier beschriebene Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, oder die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze.
Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den POI kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor- oder MYB7-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden.
Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden. Solche Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt.
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Gegenstände, die wie folgt zusammengefasst werden:

Punkt 1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man die Expression in einer für ein DOF-C2-(DNA-bindend mit einem Finger, Untergruppe C2) Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid kodierenden Pflanzennukleinsäure mit Merkmal (i) und Merkmal (ii) wie folgt moduliert: (i) eine DOF-Domäne mit in zunehmender Präferenz wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der entweder durch SEQ ID NO: 83 oder SED ID NO: 84 wiedergegebenen DOF-Domäne; und (ii) Motiv I: ERKARPQKDQ (SEQ ID NO: 85) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv II: YWSGMI (SEQ ID NO: 86) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen und/oder mit in zunehmender Präferenz drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).
Punkt 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das DOF-C2-Transkriptionsfaktorpolypeptid weiterhin eines, zwei, drei, vier oder alle der folgenden Motive umfasst: Motiv III: RLLFPFEDLKPLVS (SEQ ID NO: 87) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv IV: INVKPMEEI (SEQ ID NO: 88) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz vier, drei, zwei oder einer konservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv V: KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH (SEQ ID NO: 89) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en) Motiv VI: MELLRSTGCYM (SEQ ID NO: 90) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv VII: MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO: 91) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en).
Punkt 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Punkt 4. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Punkt 5. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
Punkt 6. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfasst.
Punkt 7. Verfahren nach einem der Punkte 3 bis 6, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einem Promotor eines ein spätes Embryogeneseprotein kodierenden Gens, am stärksten bevorzugt einem WSI18-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
Punkt 8. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
Punkt 9. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert.
Punkt 10. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid nach den Punkten 1 oder 2 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Punkt 11. Konstrukt nach Punkt 10, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Promotor eines für ein spätes Embryogeneseprotein kodierenden Gens, am stärksten bevorzugt ein Promotor des WSI18-Gens aus Reis, ist.
Punkt 12. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 10 oder 11 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Punkt 13. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 10 oder 11 transformiert ist.
Punkt 14. Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Punkt 15. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, ergibt, oder eine Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Punkt 16. Transgene Pflanze nach Punkt 9, 13 oder 15, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
Punkt 17. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 16, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Punkt 18. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 16 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 17 stammen.
Punkt 19. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags der Pflanze, vorzugsweise Steigerung des Samenertrags und/oder der Jungpflanzenvitalität in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Gegenstand, der wie folgt zusammengefasst wird:

Punkt 20. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das MYB7-Polypeptid zwei SANT-Domänen umfasst.
Punkt 21. Verfahren nach Punkt 20, wobei das MYB7-Polypeptid vier oder mehr der Motive 1 bis 7 umfasst (SEQ ID NO: 55 bis SEQ ID NO: 61).
Punkt 22. Verfahren nach Punkt 20 oder 21, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Punkt 23. Verfahren nach den Punkten 20 bis 22, wobei die Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A2 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Punkt 24. Verfahren nach den Punkten 20 bis 23, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A2 angegebenen Proteine kodiert.
Punkt 25. Verfahren nach den Punkten 20 bis 24, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale eine gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerte Auflaufvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Punkt 26. Verfahren nach einem der Punkte 20 bis 25, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Punkt 27. Verfahren nach einem der Punkte 22 bis 26, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis verknüpft ist.
Punkt 28. Verfahren nach den Punkten 20 bis 27, wobei die Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
Punkt 29. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach den Punkten 20 bis 28 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein MYB7-Polypeptid kodiert.
Punkt 30. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid nach den Punkten 20 oder 21 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäure von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Punkt 31. Konstrukt nach Punkt 30, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Punkt 32. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 30 oder 31 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbessertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Auflaufvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Punkt 33. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 30 oder 31 transformiert ist.
Punkt 34. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbessertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Auflaufvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid nach Punkt 20 oder 21 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Punkt 35. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Auflaufvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein MYB7-Polypeptid nach Punkt 20 oder 21 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Punkt 36. Transgene Pflanze nach Punkt 29, 33 oder 35, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
Punkt 37. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 36, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise vegetative Biomasse sind.
Punkt 38. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 36 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 37 stammen.
Punkt 39. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere bei der Steigerung der Biomasse und/oder Auflaufvitalität in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren veranschaulicht. Es zeigt:
1 die Sequenz und Domänenstruktur SEQ ID NO: 2. Die Sequenz der Dof-Domäne ist in fetten Zeichen gezeigt. Motiv I bis Motiv V sind angegeben.
2A ein multiples Alignment der in Tabelle A1 angeführten DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptide.
2B ein multiples Alignment-Aminosäuresequenzalignment von Dof-Domänen, die in den in Tabelle A1 angeführten DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptiden vorhanden sind.
3 einen phylogenetischen Stammbaum von Arabidopsis- und Reis-DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptiden. Der die Untergruppe C2 umfassende Cluster ist angegeben.
4 den binären Vektor für die erhöhte Expression einer SEQ ID NO: 1 in Oryza sativa unter der Kontrolle eines Reis-WSI18-Promotor (pWSI18).
5 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
6 SEQ ID NO: 50, wobei die beiden SANT-Domänen fett markiert sind und die konservierten Motive 1 bis 7 unterstrichen sind.
7 ein multiples Alignment verschiedener MYB7-Proteine.
8 den binären Vektor zur gesteigerten Expression in Oryza sativa einer MYB7-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis.
9 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich zur Durchführung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
Die DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, beschrieben in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
Bespiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren verwandt sind, identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die voreingestellten Parameter angeglichen werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. So kann zum Beispiel der E-Wert erhöht werden, wenn weniger stringente Übereinstimmungen gezeigt werden sollen. Auf diese Weise kann man kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

Die Tabelle A1 und die Tabelle A2 stellen eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind Tabelle A1: Beispiele für DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Nukleinsäuren und -Polypeptide:

Name	Organismus	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Aminosäure SEQ ID NO:
Arath_DOF_C2_1	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 2
Arath_DOF_C2_2	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 4
Arath_DOF_C2_3	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6
Arath_DOF_C2_4	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 8
Arath_DOF_C2_5	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 10
Arath_DOF_C2_6	Arabidopsis thaliana	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12
Glyma_DOF_C2_1	Glycine max	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO: 14
Glyma_DOF_C2_2	Glycine max	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 16
Glyma_DOF_C2_3	Glycine max	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO: 18
Pissa_DOF_C2_1	Pisum sativum	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 20
Vitvi_DOF_C2_1	Vitis vinifera	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 22
Vitvi DOF_C2_2	Vitis vinifera	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 24
Nicta_DOF_C2_1	Nicotiana tabacum	SEQ ID NO: 25	SEQ ID NO: 26
Horvu_DOF_C2_1	Hordeum vulgare	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 28
Orysa_DOF_C2_1	Oryza sativa	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 30
Orysa_DOF_C2_2	Oryza sativa	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
Orysa_DOF_C2_3	Oryza sativa	SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 34
	Zea mays	SEQ ID NO: 185	SEQ ID NO: 186

Tabelle A2: Beispiele für MYB7-Polypeptide:

pflanzliche Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Protein SEQ ID NO:
Arabidopsis thaliana	49	50
Gossypium hirsutum	62	63
Vitis vinifera	64	65
Solenostemon scutellarioides	66	67
Solanum lycopersicum	68	69
Humulus lupulus	70	71
Populus tremula x Populus tremuloides	72	73
Glycine max	74	75
Brassica rapa subsp. Chinensis	76	77
Brassica rapa var. purpuraria	78	79
Eucalyptus gunnii	80	81
Zea mays	82	83
Dendrobium sp.	84	85
Triticum aestivum	86	87
Hordeum vulgare	88	89
Tradescantia fluminensis	90	91
Picea glauca	92	93
Pinus taeda	94	95
Gossypium raimondii	96	97
Gossypioides kirkii	98	99
Sorghum bicolor	100	101
Gossypium herbaceum	102	103
Physcomitrella patens	104	105
Malus x domestica	106	107
Picea mariana	108	109
Fragaria x ananassa	110	111
Petunia x hybrida	112	113
Lotus japonicus	114	115
Populus x canescens	116	117
Daucus carota	118	119
Fagopyrum cymosum	120	121
Boea crassifolia	122	123
Medicago truncatula	124	125
Arabidopsis thaliana	126	127
Arabidopsis thaliana	128	129
Arabidopsis thaliana	130	131
Oryza sativa	132	133
Oryza sativa	134	135
Oryza sativa	136	137
Oryza sativa	138	139
Antirrhinum majus		140
B. napus	143	144
B. napus	145	146
B. napus	147	148
G. max	149	150
S. lycopersicum	151	152
T. aestivum	153	154
T. aestivum	155	156
T. aestivum	157	158
T. aestivum	159	160
T. aestivum	161	162
P. patens	163	164
P. trichocarpa	165	166
P. trichocarpa	167	168
M. truncatula	169	170
Z. mays	171	172
Z. mays	173	174
Z. mays	175	176
Z. mays	177	178
Z. mays	179	180
Z. mays	181	182
Z. mays	183	184

In einigen Fällen wurden verwandte Sequenzen von Forschungseinrichtungen wie The Institute for Genomic Research (TIGR) provisorisch zusammengebaut und veröffentlicht. Zur Identifikation solcher vewandten Sequenzen entweder durch Schlüsselwortsuche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz kann man sich der Eukaryotic Gene Orthologs(EGO)-Datenbank bedienen.
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 11 stellen zwei Spleißvarianten am Lokus AT4G24060 des Arabidopsis-thaliana-Genoms dar.
Beispiel 2: Alignment von DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptidsequenzen und MYB7-Polypeptidsequenzen
Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgte mit dem AlignX Programm von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (Wenn die Polypeptide angepasst sind).
Was die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide betrifft, so kann man kleine manuelle Änderungen durchführen, um die Anpassung weiter zu optimieren. Die Sequenzkonservierung zwischen DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptiden ist im Wesentlichen in der Dof-Domäne der Polypeptide und befindet sich bei den konservierten Motiven I bis VII, wie sie durch die Konsensus-SEQ ID NO: 37 bis 43 (siehe 2A) wiedergegeben sind. Die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide sind in 2A angeglichen. 2B stellt ein multiples Alignment der DOF-Domänen, wie man sie in den Polypeptiden von Tabelle A1 findet, dar. Eine Konsensussequenz ist angezeigt. Hochkonservierte Aminosäurereste in den Dof-Domänentranskriptionfaktor-Polypeptiden sind in der Konsensussequenz angezeigt.
Ein phylogenetischer Stammbaum von Transkriptionsfaktoren aus der DOF-Familie von Arabidopsis (At) und Reis (Os) ist in 3 gezeigt. Der die DOF-Polypeptide von Untergruppe Cc enthaltende Ast ist durch ein Kästchen umrahmt. 3 wurde mit einem „Neighbour-joining”-Clustering-Algorithmus, wie er von dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, erstellt.
Was die MYB7-Polypeptide betrifft, so wurden kleine manuelle Änderungen durchgeführt, um die Anpassung weiter zu optimieren. Die Sequenzkonservierung zwischen den MYB7-Polypeptiden ist im Wesentlichen in den SANT-Domänen in der N-terminalen Hälfte der Polypeptide, wobei die C-terminale Hälfte gewöhnlich variabler ist, was die Sequenzlänge und -zusammensetzung betrifft. Die MYB7-Polypeptide sind in 7 angepasst.
Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete software) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
Scoring matrix: Blosum 62
First Gap: 12
Extending gap: 2

Für die DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptide: Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Der Identitätsprozentsatz ist über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale (normale Schrift) angegeben. Tabelle B1: MatGAT-Ergebnis für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
1. Arath DOF_C2_1		45.7	35.0	35.8	27.5	90.6	41.0	42.2	33.5	37.6	45.3	41.6	41.5	29.3	35.4	23.9
2. Arath DOF_C2_2	54.5		35.9	32.3	29.3	45.4	35.2	37.3	27.5	34.9	41.1	38.1	38.2	28.2	33.6	25.4
3. Arath DOF_C2_3	50.4	49.1		54.7	31.3	36.3	37.1	37.4	24.8	32.8	36.2	34.8	35.5	28.5	33.8	24.8
4. Arath DOF_C2_4	51.6	43.5	63.1		35.2	36.0	36.8	35.9	28.6	40.2	40.4	37.8	36.9	26.1	34.0	24.2
5. Arath DOF_C2_5	43.2	43.8	43.9	52.0		30.0	31.5	32.9	25.0	31.8	35.4	31.1	31.4	22.7	27.7	22.8
6. Arath DOF_C2_6	90.6	56.5	51.2	48.0	41.8		41.4	43.1	30.4	36.2	43.3	39.9	40.4	30.3	36.8	23.2
7. Glyma DOF_C2_1	58.4	50.6	50.7	55.6	46.4	55.6		89.7	27.2	41.5	59.6	45.0	49.0	30.4	37.6	26.8
8. Glyma DOF_C2_2	59.4	49.4	50.7	54.5	48.1	57.6	91.8		27.8	42.8	61.2	46.5	50.2	30.8	37.9	25.5
9. Glyma DOF_C2_3	40.0	34.4	32.2	36.3	33.3	36.0	35.3	36.0		33.6	32.9	42.0	33.8	19.3	23.4	19.8
9. Pisa DOF_C2_2	51.0	45.7	44.2	54.1	47.6	48.2	55.2	56.9	45.8		48.6	47.7	44.2	27.1	31.2	23.6
11. Vitvi DOF_C2_1	54.2	51.7	49.6	58.9	51.7	54.1	69.0	73.1	44.1	66.3		54.7	60.8	31.0	38.0	23.1
12. Vitvi DOF_C2_2	48.1	46.0	44.4	50.7	41.2	45.9	52.9	54.2	51.0	60.6	62.1		45.7	26.1	32.1	22.8
13. Nicta DOF_C2_1	54.8	49.4	50.1	51.4	47.3	52.0	63.1	66.7	43.9	63.0	75.2	55.7		30.8	35.5	25.1
14. Horvu DOF_C2_1	37.3	37.9	38.1	34.5	33.3	40.3	38.1	37.7	22.5	34.1	38.1	32.0	38.3		58.3	22.1
15. Orysa DOF_C2_1	45.3	48.0	48.3	46.1	40.3	48.8	50.1	48.3	29.9	40.3	48.5	38.7	46.9	63.3		27.0
16. Orysa DOF_C2_2	37.6	42.6	42.5	40.1	34.0	38.4	36.5	35.1	28.1	33.4	35.1	30.9	35.9	31.1	38.9
17. Orysa DOF_C2_3	49.7	49.5	49.5	43.4	39.2	52.9	50.8	48.9	28.8	43.1	49.7	40.2	47.6	56.8	71.4	37.0

Der Identitätsprozentsatz zwischen den DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 27,5% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 (in Tabelle B1 fett dargestellt) betragen. Die prozentuale Identität mit dem ähnlichsten paralogen Polypeptid zu SEQ ID NO: 2 beträgt 45,7%. Die Identität von SEQ ID NO: 2 zur gespleißten Variante Arath_DOF_C2_6 beträgt 90%. Die Identität zwischen den orthologen DOF_C2-Polypeptiden in Tabelle B1, die einen dikotyledonen Pflanzenursprung haben, liegt im Bereich von 25–45%. Die Identität zwischen SEQ ID NO: 2 und den in Tabelle B1 gezeigten orthologen DOF_C2-Polypeptiden, die einen monokotyledonen Pflanzenursprung haben, liegt im Bereich von 23,9– 35,4.
Bezüglich der MYB7-Polypeptide: Die Ergebnisse der Software-Analyse zur globalen Ähnlichkeit und Identität über die gesamte Länge der Polypeptidsequenzen sind in Tabelle B2 gezeigt. Die prozentuale Identität ist unterhalb der Diagonalen in fett angegeben, und die prozentuale Ähnlichkeit ist über der Diagonalen aufgeführt (normale Schrift).
Die prozentuale Identität zwischen den MYB7-Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann, verglichen zur SEQ ID NO: 50, lediglich 28,7% Sequenzidentität betragen.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird vom European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.

Die Ergebnisse des Interpro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle C1 angegeben. Tabelle C1: InterPro-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2.

InterPro-Zugangsnummer	Referenzdatenbank	Zugangsnummer in der Referenzdatenbank	Name der Domäne	e-Wert [Aminosäurekoordinaten der Domäne im Abfragepolypeptid]
IPR003851	PFAM	PF02701	zf-Dof	2.2e-39 [48-110]T
	PROFILE	PS50884	ZF_DOF_2	28.910 [53-107]T
	PROSITE	PS01361	ZF_DOF_1	8e-5 [55-91]T

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 50 sind in Tabelle C2 aufgeführt. Tabelle C2: InterPro-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 50. Angeführt sind die Aminosäurekoordinaten (Start- und Stoppreste).

Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	Aminosäurekoordianten auf SEQ ID NO: 50
HMMPfam	PF00249	Myb_DNA-binding	T[14-61] 4.3E-9 T[67-112] 1.1E-10
HMMSmart	SM00717	SANT	T[13-63] 1.3E-13 T[66-114] 1.8E-17
ProfileScan	PS00037	MYB_1	T[17-25] 0.0
ProfileScan	PS00334	MYB_2	T[89-112] 0.0
ProfileScan	PS50090	MYB_3	T[9-61] 17.269 T[62-112] 16.619
Superfamily	SSF46689	Homeodomain_like	T[14-62] 4.31E-17 T[63-116] 4.99E-15

Beispiel 5: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren Primer-sense wie in SEQ ID NO: 44; sense, gezeigt:
und Primer-revers (SEQ ID NO: 45; revers, komplementär):
die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Terminologie – ”entry clone”, pSEQIDNO:1, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein WSI18-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 47) für die spezifische Expression in Samen befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pWSI18::SEQIDNO:1 (4) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 6: Topologie-Vorhersage für Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).

Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 50 veranschaulicht wird, sind in Tabelle D1 dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 50 kann das Cytoplasma oder der Kern sein, es wird kein Transitpeptid vorhergesagt. Tabelle D1: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 50

Länge (AA)	269
Chloroplasten-Transitpeptid	0,195
Mitochondriales Transitpeptid	0,082
Signalpeptid des sekretorischen Wegs	0,022
Anderes subzelluläres Ziel	0,914
Vorhergesagte Lokalisierung	/
Verlässlichkeitsklasse	2
Vorhergesagte Länge des Transitpeptids	/

Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:

• ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada, gehostet wird;
• TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird

Beispiel 7: Funktionsassay für das MYB7-Polypeptid
Die MYB7-Proteinaktivität lässt sich wie von Li und Parish (1995) beschrieben untersuchen. Kurz gesagt wird die für MYB7 kodierende Sequenz im Leserahmen mit der T7-Gen-10-Leitsequenz kloniert und in E. coli exprimiert. Die Proteine werden aufgereinigt und in einem mobilitätsverzögernden Assay unter Verwendung von mit ³²P markierten c-myb-Bindungsstellen (MBS) und der Bindungsstelle des Mais-P-Genprodukts (PBS) analysiert. Auf diese Weise wurde gezeigt, dass MYB7 von Arabidopsis thaliana sich nicht mit hoher Affinität an die MBS-Bindungsstelle band, jedoch eine Bindungspräferenz für die PBS-Bindungsstelle hatte.
Beispiel 8: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm05966 (SEQ ID NO: 51; sense, Startcodon fettgedruckt):
und prm05967 (SEQ ID NO: 52; revers, komplementär):
die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pMYB7, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 49 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit dem Zielvektor p00640, der für die Transformation von Oryza sativa (japonica cv Nipponbare) verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 53) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::MYB7 (8) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 9: Pflanzentransformation
Reistransformation
Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen wird für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps-/Canolatransformation
Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Alfalfatransformation
Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige- Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Baumwolltransformation
Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden mit 3%iger Natriumhypochloridlösung 20 Minuten lang oberflächensterilisiert und mit destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann zum Keimen in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Die Hypokotylen von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gegeben. Zum Inokulieren der hypokotylen Explantate wird eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformierten Übernachtkultur) verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und unter Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige- und Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂ sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten verbliebener Bakterien übertragen. Nach zwei bis drei Monaten (wobei alle vier bis sechs Wochen Subkulturen angefertigt werden) werden einzelne Zelllinien isoliert und weiter zur Gewebeamplifikation auf selektivem Medium kultiviert (30°C, Fotoperiode 16 h). Die transformierten Gewebe werden anschließend weitere 2 bis 3 Monate lang auf nichtselektivem Medium kultiviert, wodurch man somatische Embryos erhält. Embryos mit gesundem Aussehen und einer Länge von wenigstens 4 mm werden auf Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, ergänzt mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure, übertragen. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen werden im 2- bis 3-Blatt-Stadium in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen übertragen. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend zum weiteren Kultivieren ins Gewächshaus umgesetzt.
Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
7.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen wurden in regelmäßigen Abständen gegossen, so dass gewährleistet ist, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren und die Bedürfnisse der Pflanze hinsichtlich der Vollendung von Wachstum und Entwicklung erfüllt wurden.
Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Screening unter Trockenheitsbedingungen in Verbindung mit DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Proteinen wurde folgendermaßen durchgeführt:
Die Nachkommen von mit pWSI18::SEQIDNO:1 transformierten und aus T2-Samen herangezogenen Reispflanzen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung in Verbindung mit DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptiden wurde wie folgt durchgeführt:
Die Nachkommen von mit pWSI18::SEQIDNO:1 transformierten und aus T2-Samen herangezogenen Reispflanzen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufwies. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
Screening unter Trockenheitsbedingungen in Verbindung mit MYB7-Polypeptiden wird wie folgt durchgeführt:
Die Nachkommen von mit pGOS2::MYB7 transformierten und aus T2-Samen herangezogenen Reispflanzen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichen. Anschließend werden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, werden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgt wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstumsund Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
Screening auf Effizienz der Stickstoffausnutzung in Verbindung mit MY87-Polypeptiden wird wie folgt durchgeführt:
Die Nachkommen von mit pGOS2::MYB7 transformierten und aus T2-Samen herangezogenen Reispflanzen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
7.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
7.3 Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Anstieg der Gesamtwurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als ein Anstieg des Wurzel/Spross-Index (der als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird) ausgedrückt.
Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
Die Ergebnisse der Untersuchung von eine DOF-C2-Transkriptionsfaktornukleinsäure unter der Kontrolle des WSI-18-Promotors (SEQ ID NO: 47) oder des RCc3-Promotors exprimierenden transgenen Reisplfanzen sind in Tabelle 2A beschrieben. Bei wenigstens einem der folgenden Parameter wurde ein Anstieg von wenigstens 5% beobachtet: Auflaufvitalität (Jungpflanzenvitalität), Gesamtsamenertrag, Gesamtzahl an Samen, Anzahl an gefüllten Samen, Anzahl an Blüten pro Rispe und Harvest Index.

Die Leistung von mit dem Vektor pWSI18::SEQIDNO:1 transformierten und unter Nichtstressbedingungen herangezogenen Pflanzen ist unten in Tabelle D2 gezeigt. Tabelle D2. Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung von mit dem SEQ ID NO: 1 umfassenden Pflanzentransformationsvektor wie in Beispiel 5 beschrieben transformierten transgenen Pflanzen.

Ertragsmerkmal	% Anstieg bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
Jungpflanzenvitalität	9
Gesamtgewicht an Samen	11
Anzahl an gefüllten Samen	12
Anzahl an Blüten pro Rispe	6
Harvest Index	8
Gesamtanzahl an Samen	6

Beispiel 12: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
Die Untersuchung von eine MYB7-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen exprimierenden transgenen Reispflanzen (der Nachkommenschaft von mit pGOS2::MYB7 transformierten und aus T2-Samen herangezogenen Pflanzen) ergab einen Gesamtanstieg von mehr als 5% bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax) mit einem p-Wert von 0,0012 und bei der Auflaufvitalität (Jungpflanzenvitalität) mit einem p-Wert von unter 0,00001.
Zusammenfassung
Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-(DNA-bindend mit einem Finger, Untergruppe C2)Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale haben. Die Erfindung betrifft außerdem Konstrukte, die das DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder das MYB7-Polypeptid umfassen und sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen durch Modulieren der Expression einer für ein DOF-C2-Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB-Domänenprotein kodierenden Nukleinsäure in einer Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man a) in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-(DNA-bindend mit einem Finger, Untergruppe 2)Domänentranskriptionsfaktor-Polypeptid umfassend Merkmal (i) und (ii) wie folgt: (i) eine DOF-Domäne mit mit zunehmender Präferenz wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der entweder durch SEQ ID NO: 35 oder SEQ ID NO: 36 wiedergegebenen DOF-Domäne; und (ii) Motiv I: ERKARPQKDQ (SEQ ID NO: 37) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit mit zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv II: YWSGMI (SEQ ID NO: 38) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen und/oder mit mit zunehmender Präferenz drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en) moduliert; oder b) in einer Pflanze die Expression einer für ein MYB7-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure moduliert, wobei dieses MYB7-Polypeptid zwei SANT-Domänen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei a) dieses DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid weiterhin eines, zwei, drei, vier oder alle der folgenden Motive umfasst: Motiv III: RLLFPFEDLKPLVS (SEQ ID NO: 39) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv IV: INVKPMEEI (SEQ ID NO: 40) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder; Motiv V: KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH (SEQ ID NO: 41) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv VI: MELLRSTGCYM (SEQ ID NO: 42) mit null, einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en); und/oder Motiv VII: MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO: 43) mit null, einer oder mehreren Aminosäuresubstitution(en) und/oder mit in zunehmender Präferenz neun, acht, sieben, sechs, fünf, vier, drei, zwei oder einer nichtkonservativen Aminosäuresubstitution(en) oder b) dieses MYB7-Polypeptid vier oder mehr der Motive 1 bis 7 (SEQ ID NO: 55 bis SEQ ID NO: 61) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, oder einer Nukleinsäure, die für ein MYB7-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–4, wobei a) die Nukleinsäure, die für ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann, oder b) die Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A2 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–5, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 angegebenen Proteine kodiert.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale a) einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und b) gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerte Auflaufvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–7, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit a) einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einem Promotor eines für ein spätes Embryogeneseprotein kodierenden Gens, am stärksten bevorzugt mit einem WSI18-Promotor aus Reis, oder b) einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 2–9, wobei die Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 2–10 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid oder ein Klasse-MYB7-Polypeptid nach den Ansprüchen 3 oder 4 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 12, wobei a) eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Promotor eines für ein spätes Embryogeneseprotein kodierenden Gens, am stärksten bevorzugt ein Promotor des Reis-WSI18-Gens, ist oder b) eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, und a) vorzugsweise gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen oder b) vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Auflaufvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Vitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid kodiert, oder eine Nukleinsäure, die ein MYB7-Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigerter Vitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3 kodiert, ergibt, oder eine Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen oder vegetative Biomasse sind.
Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 19 stammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die ein DOF-C2-Transkriptionsfaktor-Polypeptid oder ein MYB7-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags in Pflanzen, vorzugsweise Steigerung des Samenertrags und/oder Steigerung der Biomasse und/oder Vitalität in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.