CN112322654B - 玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用，是从玉米中克隆基因ZmMYB42，以正义形式将该基因或其RNAi结构重组到植物表达载体中，利用转基因技术将融合基因或ZmMYB42RNAi结构导入作物，通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。其中所述玉米转录因子ZmMYB42的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述植物是指栽培的禾谷类作物。本发明的应用对提高在干旱胁迫下作物产量有重要意义。

Description

玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用。

背景技术

MYB类转录因子家族是指含有高度保守的DNA结合域即MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。最早发现的MYB转录因子是禽类成髓细胞瘤病毒的v-MYB、脊椎动物中的参与精子形成过程的A-MYB、在延缓衰老和活化蛋白质中发挥重要作用的B-MYB、和在降低癌细胞活性以及造血神经形成中起调节作用的C-MYB。植物转录因子MYB是植物中最大的转录因子家族之一。植物中最早发现的MYB类转录因子是玉米中与色素合成有关的ZmMYBC1。植物中大多数MYB蛋白在N端含有MYB结构域，根据这个高度保守的结构域的特征可将MYB转录因子分为:1R-MYB/MYB-related(只有单一MYB结构域)型、R2R3-MYB(DNA结合域由两个同源的MYB结构域R2和R3组成)型、3R-MYB(由3个MYB结构域组成)型和4R-MYB(由4个R1/R2的重复组成)型。植物MYB转录因子广泛参与植物根、茎、叶、花的生长发育,参与调控植物生理代谢、细胞的形态和模式建成等过程，参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，一些MYB基因家族对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫过程也有响应。此外MYB转录因子还与某些经济作物的品质好坏密切相关。拟南芥有339个MYB转录因子,其中126个为R2R3-MYB型转录因子。在水稻中MYB转录因子家族含有约230个成员,其中R2R3型MYB蛋白数目最多，达109个。棉花中有超过200个MYB转录因子。玉米MYB家族成员有287个。

MYB蛋白对细胞周期具有重要调节作用。在拟南芥中,MYB转录因子主要通过控制细胞分裂的不同时相实现对细胞周期的控制，进而实现对拟南芥不同生长发育阶段的调控。Haga等发现拟南芥AtMYB3R1和AtMYB3R4通过激活KNOLLE基因正调控细胞核分裂。拟南芥R2R3型转录因子AtMYB59在拟南芥根部大量表达，调节拟南芥细胞周期和根生长。AtMYB59过表达株系与野生型相比,根长变短且根尖分裂细胞中一半左右处于有丝分裂中期；而缺失突变体atmyb59-1与野生型相比根长变长且有较少细胞处于有丝分裂中期,AtMYB59可能通过控制细胞分裂抑制拟南芥根的伸长。Xie等通过对拟南芥整个基因组的微阵列分析以及染色质免疫共沉淀实验发现，AtMYB88和AtMYB124/FLP与多个细胞周期调节基因(包括编码细胞周期蛋白以及细胞周期蛋白依赖性激酶的基因)相互作用,共同控制拟南芥细胞周期进程和细胞分化过程。

MYB转录因子参与植物类黄酮代谢途径、硫代葡萄糖苷的生物合成、花青素的生物合成以及植物次生细胞壁的形成等多种次生代谢反应。Frerigmann等发现AtMYB34、AtMYB51、AtMYB122三个基因协同调控拟南芥吲哚类芥子油苷(IGs)的生物合成。其中AtMYB34调控根部IGs合成,AtMYB51调控拟南芥嫩芽中IGs合成,AtMYB122在IGs合成中起辅助调控作用。花青素和黄酮醇作为次级代谢产物可以增强植物抵御害虫的能力，在拟南芥中这两种物质的合成主要受MYB转录因子的调节。Matsui等发现拟南芥R3-MYB蛋白AtMYBL2可作为一个关键的转录抑制子负调控拟南芥中花青素的合成。AtMYBL2通过与TT8的启动子直接结合抑制DRF和TT8的表达，在高强度光照条件下AtMYBL2的表达水平降低导致花青素大量积累。Onkokesung等发现，过表达AtMYB75拟南芥可以增加花青素和黄酮醇等次级代谢产物，从而增强抵御害虫的能力。Rowan等发现在拟南芥中过表达AtMYB3、AtMYB6和AtMYBL2引起花青素合成下降,推测它们作为抑制子参与花青素合成。有报道AtMYB26、AtMYB46、AtMYB52、AtMYB54、AtMYB103等参与调控拟南芥次生细胞壁的合成。在拟南芥中,MYB转录因子通过复杂的mRNA或蛋白质水平的互作构成了精细的调控网络以激活下游防御基因的表达,从而诱导抗病反应。Froidure等发现AtMYB30可与磷酸酶AtsPLA2-α在体内互作，促使磷酸酶AtsPLA2-α从细胞质转移到细胞核并抑制AtMYB30的转录活性，从而引起拟南芥的抗病能力减弱；Atspla2-α突变体的抗病能力增强，而AtsPLA2-α过量表达植株的抗病能力减弱也说明AtsPLA2-α作为一个负调节因子参与AtMYB30介导的拟南芥抵抗外界病原菌的过程。Jia等发现当用胡麻叶斑病毒感染或SA(水杨酸)和JA(茉莉酸)处理拟南芥时，AtMYB73的表达量上升，若用胡麻叶斑病毒感染atmyb73突变体时,AtPR1、AtPDF1.2和AtNPR1的表达增加，提示AtMYB73通过调控AtNPR1介导的SA和JA信号途径来抵御胡麻叶斑病毒的入侵。Shi等发现拟南芥AtMYB44过表达株系可通过激活抗氧化酶的活性增强植株对灰霉病菌的抗性,明确了AtMYB44作为植物-病原菌互作级联放大系统的一个敏感调节元件在调控拟南芥抗病原菌过程中发挥重要作用。另外，拟南芥atmyb46突变体对灰霉病菌抗性增强，提示AtMYB46可作为灰霉病菌的敏感调节因子负调节抵抗灰霉病浸染的过程。

在长期的进化过程中，植物形成了抵抗非生物逆境胁迫的多种防御机制。MYB转录因子在植物非生物逆境胁迫响应中有重要作用。MYB转录因子可通过直接或间接调控多个抗逆相关基因的表达使植物对外界不良环境做出反应。

高盐是植物面对的主要非生物胁迫之一。植物通过一系列调节机制应对外界高盐胁迫环境，包括提高细胞抗氧化能力、通过积累渗透调节物质提高渗透压以及主动向细胞外排出Na+等。已知拟南芥通过MYB转录因子响应盐胁迫的信号途径非常复杂，很多MYB家族中的转录因子如AtMYB2、AtMYB20、AtMYB73和AtMYB74等参与了这些途径。水稻R2R3-MYB家族转录因子OsMYB84的聚类分析表明，OsMYB84为拟南芥MYB84同源基因，亚细胞定位研究显示OsMYB84为核定位蛋白，器官表达谱和原位杂交分析显示它在水稻叶枕、茎以及根中高表达。OsMYB84表达受到ABA、高盐胁迫的诱导。水稻OsMYB84过表达纯合系植株，与野生型相比，株高明显降低，推测OsMYB84可能通过影响茎和叶枕处侧生分生组织进而改变株高。OsMYB84过表达显著提高了转基因水稻的耐盐性，减少了细胞损伤并提高了种子对ABA的敏感性，表明OsMYB84可能通过依赖ABA信号通路参与水稻盐胁迫响应。Yoo等发现AtMYB2参与调节拟南芥在高盐环境中的胁迫响应。过量表达CaM的一个亚型(GmCaM4)可引起AtMYB2的表达量升高。AtMYB2通过促进P5CS1、P5CS2等基因的表达使脯氨酸合成积累，从而增强拟南芥对盐胁迫的耐受力。在发现多个对高盐胁迫起正向调控的MYB转录因子的同时,一些起负调控作用的MYB转录因子也被发现。Kim等报道，AtMYB73在植物抗盐胁迫反应中起负调控作用。在盐胁迫条件下,atmyb73突变体的存活率比野生型高,但对ABA缺少响应。进一步检测atmyb73突变体中ABA非依赖型盐响应基因SOS1和SOS3表达量变化,发现其表达量显著升高,说明AtMYB73有可能通过SOS途径参与拟南芥对高盐胁迫的响应。

干旱胁迫严重影响植株生长和农作物产量。植物在面对干旱胁迫时会发生多种生理变化,包括呼吸作用增强、光合作用及细胞生长抑制、气孔关闭、叶片提前衰老等。植物细胞中存在应对外界干旱胁迫的复杂信号通路,目前已发现多个MYB转录因子参与拟南芥对干旱胁迫的响应。Nakabayashi等发现AtMYB12和AtMYB75通过调节拟南芥中黄酮类物质的含量使植株适应干旱、高盐的环境。Oh等发现AtMYB6在干旱胁迫环境中具有双重调节作用,其通过调控气孔关闭和根的生长使拟南芥适应干旱环境。Seo等发现AtMYB96通过整合ABA和生长素信号增强拟南芥抵抗干旱胁迫的能力。Lee等发现拟南芥处于逆境胁迫环境中时,AtMYB94在外表皮大量表达,促进了角质层蜡质的合成，从而增强拟南芥应对干旱、高盐等环境因素的能力。

低温胁迫严重影响植物种子萌发、叶片扩张、幼苗生长、开花结种等过程。在长期的进化过程中,植物形成了复杂高效的调控网络,能快速感知低温环境并进行相应生理调节以抵御和适应外界低温环境。在该调控网络中,CBF(C-repeat binding factor)转录因子起着关键性调控作用。Agarwal等发现AtMYB15通过负调控CBFs的表达参与拟南芥抵御低温胁迫过程。在冷处理条件下AtMYB15的表达量升高。atmyb15突变体中CBFs基因表达量升高,拟南芥抗冻能力增强；AtMYB15过表达株系中CBFs基因表达量降低,拟南芥抗冻能力减弱。Chen等发现AtMYB14通过间接调节CBFs的表达参与拟南芥的抗冷胁迫过程。在冷处理条件下AtMYB14的表达量减少,但是在atmyb14缺失突变体中CBFs及其下游基因的表达量显著升高，且拟南芥抗冷能力提高，表明AtMYB14在拟南芥响应低温胁迫过程中起负调控作用。Lee等发现转录因子AtMYB96是连接ABA信号途径和冷信号途径的桥梁。Zhai等发现R3型转录因子AtMYBC1参与了拟南芥低温胁迫应答过程。atmybc1缺失突变体的抗冻能力增强,AtMYBC1过量表达株系的抗冻能力则减弱,说明AtMYBC1在拟南芥抗低温胁迫过程起负调节作用。基因表达分析得出，AtMYBC1通过不依赖CBF途径负调节拟南芥抗低温胁迫响应过程。

单子叶植物叶子的木质部发生伴随着细胞壁的木质化，在叶片发育过程中，需要在叶基部产生苯基丙烷类化合物，这个过程在叶片的舌叶区域完成。正调控转录因子和负调控转录因子都在这一发育梯度上调控苯基丙烷类化合物合成基因的表达。苯丙烷类代谢是植物主要的3条次生代谢途径之一，它起始于苯丙氨酸，经过几个共同步骤后，分成两个主要分支途径，其中一条分支称为黄酮类代谢途径，主要与植物色素合成相关。玉米转录因子ZmMYB家族成员抑制木质素生物合成的明确作用目前仅在R2R3-MYB型因子中发现。R2R3-MYB转录因子作为调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控，ZmMYB31和ZmMYB42参与了玉米木质素含量的负调控(Agarwal等，2016)。MYB31和MYB42在高粱、玉米和水稻等单子叶植物中具有保守性。在玉米叶尖和叶中区域中，46％的区间存在ZmMYB31和ZmMYB42的表达，而叶基部只有8％。这种模式与观察到的苯丙烷类基因在叶舌附近及以上的表达量普遍减少相一致。染色质免疫沉淀(ChIP)实验发现在玉米、高粱和水稻成熟叶组织中，咖啡酸o-甲基转移酶(COMT1)基因是MYB31和MYB42的共同靶点。4-香豆酸-辅酶α连接酶(4CL2)、ferulate-5-羟化酶(F5H)和咖啡基草酸酯酶(CSE)也是MYB31或MYB42基因的靶向靶点。共表达试验和qRT-PCR分析显示，在高粱中MYB42的mRNA水平与COMT1呈负相关，在玉米中也与COMT1和4CL2呈负相关。损伤诱导玉米ZmMYB31和ZmMYB42基因表达的模式是抑制COMT1基因等表达，过表达ZmMYB31和ZmMYB42也下调拟南芥和玉米COMT1等基因的表达。苯丙烷类基因表达减少的原因可能是与负调控因子结合的靶基因比例增加，如COMT1基因在叶尖部位表达量的减少伴随着MYB31(玉米和高粱)或MYB42(高粱和水稻)在表达区域的增加。而苯丙烷类化合物合成基因在叶片基部的相对低表达水平与该途径中多个基因的高水平表达相关。

ZmMYB42基因是玉米中一个R2R3-MYB转录因子，UniProtKB ID：K7V4N7，由GRMZM2G419239/Zm00001d053220基因编码，表达丰度相对较低，经典转录本为:AFW65671(Gramene ID:GRMZM2G419239_T01)。ZmMYB42基因位于玉米Chr4:217139381..217142824位置，主要在玉米植株的地上部分表达，但在初生根和小苗叶片中表达丰度高。推测拟南芥中的AT4G38620为同源基因。在拟南芥中，该基因编码转录抑制因子ATMYB4，参与紫外线防护的调控，即通过抑制反式肉桂酸4-单氧合酶基因CYP73A5的表达而调节紫外线保护剂sinapoylmalate的积累。木质素在植物细胞壁中的积累增加了纤维的强度和硬度，提高水分通过维管系统的运输效率，并保护植物免受病原体的攻击。ZmMYB42参与调控木质素生物合成以及苯丙醇途径，明显影响木质素途径中一些基因的表达，过表达导致转基因植物木质素合成降低。分别过表达ZmMYB31和ZmMYB42的植物，木质素硫代乙醇酸(LTGA)分别降低了3.7倍和1.6倍。如果以鲜重来衡量，这种下降更为明显，过表达ZmMYB31和ZmMYB42导致鲜重分别下降8倍和2.1倍。玉米ZmMYB42在拟南芥中的异源表达也确定了其在苯丙烷类化合物合成途径和细胞壁结构组成中的作用。过表达ZmMYB42植株的总木质素含量只有野生型的一半(Fornale′et al，2006)，植株矮化，叶片弯曲，维管束减少，推测生长减少的原因是由于维管组织和机械组织发育不良。木质素含量降低的突变体也出现类似的表型。ZmMYB42下调木质素途径的几个基因的表达，降低了木质化组织中的木质素含量，调节其他参与合成芥子酸酯和黄酮类化合物合成基因的表达。此外，ZmMYB42影响细胞壁结构和降解性，影响多糖组成，转ZmMYB42基因植株生成的木质素聚合物S-G比降低。

在植株中,MYB42除以抑制方式行使功能外，还可能通过与基因激活因子相互竞争以实现调节目标基因表达水平的作用。ZmMYB5、ZmMYB152和SbMYB60在玉米和高粱中分别作为苯丙类化合物合成代谢的正向调节因子，它们或其同源基因与苯丙类合成基因在叶基区域共表达，尽管表达水平较低，但与MYB42表达区域相重合，并且表达水平也相对应。

栽培植物的抗旱性提高无疑具有重要的经济价值和生态意义，是农业领域中的关注课题。采用生物技术提高植物抗旱性已有众多工作，但仍是植物生物技术和农业领域的热点，发掘具有能显著提高植物抗逆性的基因有重要意义。虽然植物细胞壁木质素含量降低有可能降低植株对虫害和病原物的抗性，促进植株在适宜条件下的生长，但植物抗逆性和生长发育均受到复杂的多条信号和代谢途径调节，某一转录因子的表达水平和表达时空特征的变化往往产生不易预测的效果。另外，由于玉米MYB家族成员众多，蛋白结构和表达谱多样、复杂，利用同源基因研究资料来推定特定MYB基因的功能往往经不起实验验证，可靠结论只有通过基因操作手段才可获得。到目前为止，尚未见到ZmMYB42在玉米、高粱抗逆性中是否具有功能的报道，也未见到ZmMYB42在玉米或高粱等作物中过表达对植株形态特征和抗逆性及产量的影响，无论转基因是用胁迫诱导型启动子还是组成型启动子驱动表达的。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明提供一种玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用。

本发明所述玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用；其中：所述玉米转录因子ZmMYB42基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQID No.2所示；该基因cDNA序列长1329bp，推测其包含192bp的5′非翻译区(5′UTR)和457bp的3′非翻译区(3′UTR)以及一个780bp的ORF。该ORF编码260个氨基酸。所述抗旱育种是指培育在遭受干旱胁迫后产量高于对照的植物新品系，其抗旱性是指植物在苗期、拔节期或灌浆期的抗旱性。

上述的应用中：所述植物是指栽培的禾谷类作物。

其中：所述禾谷类作物优选是玉米或高粱。

本发明所述的玉米R2R3-MYB转录因子基因ZmMYB42有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列可以正义形式或反义形式构建融合基因，或构建基因RNAi结构或基因编辑结构，分别重组入植物表达载体后用于植物转基因。

具体的，将玉米转录因子ZmMYB42基因与胁迫诱导性启动子融合形成胁迫诱导性基因表达结构或ZmMYB42RNAi结构，通过遗传转化导入玉米，实现利用转ZmMYB42基因胁迫诱导性过表达结构创造玉米耐旱自交系。

或者，将玉米转录因子ZmMYB42基因与胁迫诱导性启动子融合形成胁迫诱导性基因表达结构或ZmMYB42RNAi结构，通过遗传转化导入高粱，实现利用转ZmMYB42基因胁迫诱导性过表达结构创造高粱耐旱新育种材料。

上述玉米R2R3-MYB转录因子基因ZmMYB42在植物抗旱育种中应用的方法大体是：从玉米中克隆ZmMYB42基因，构建用于植物转化的表达载体，利用转基因技术生产转基因植株，通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。具体是：

转录因子基因ZmMYB42的表达分析

在玉米耐旱机理研究中，以耐旱自交系Q319和干旱敏感自交系65232为材料，采用芯片杂交技术比较苗期干旱处理(用18％PEG溶液浇灌沙培的3叶期玉米幼苗，分别在处理后12h、24h、48h和恢复浇水后24h)对不同基因型的转录组影响，选出了一批在不同基因型中变化趋势不同的转录因子。然后，采用定量RT-PCR技术对这些基因的表达强度进行验证。从中选出R2R3-MYB转录因子ZmMYB42基因进行研究。在适宜生长条件下ZmMYB42在根中表达丰度高于在叶片的。在根中，耐旱自交系Q319的表达量是干旱敏感自交系65232的3.5倍；在叶中，Q319的表达量是65232的4倍。渗透胁迫处理24h时，在耐旱自交系Q319的根中，表达丰度上升，约为处理前的2.8倍，而在65232的根中表达量下降到0.8倍；渗透胁迫处理48h，根中ZmMYB42的表达丰度在Q319中同24h时相比略有增加，而65232则显著下降，略高于处理前的水平。即它们对渗透胁迫反应有明显差异，可能与其抗旱性关联。

转基因株系的构建

将ZmMYB42基因编码框分别与脱水胁迫诱导的启动子Prd29A/B或组成型启动子PUbiquitin 1融合，重组到植物表达载体中，如构建出转化质粒pCambia1300-Prd29A/PUbiquitin1::ZmMYB42-PCaMV35S::bar，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法将该质粒的T-DNA区转入玉米骨干自交系细胞或高粱茎尖细胞或胚性愈伤组织细胞，转化苗移栽成活后套袋自交，收获种子。通过除草剂筛选和PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子生物学方法检测转化植株后代，获得转基因植株。同时，依据ZmMYB42基因特异序列，构建出RNAi结构并重组到植物表达载体中，进行玉米或高粱遗传转化，获得转基因植株。通过连续3代的自交和分子鉴定，产生了转基因纯合株系。在正常栽培条件下转基因玉米或高粱植株形态和生长发育正常，过表达株系ZmMYB42表达强度显著高于未转基因植株的，而转RNAi结构株系的MYB42表达强度显著低于未转基因对照的。

转基因玉米、高粱植株的性状检测及利用

对获得的转基因纯合植株，首先检测在正常栽培条件下植株是否生长发育正常，进而分析转基因植株和对照植株在胁迫条件下的抗性差异。采用Ubiquitin 1启动子组成型启动转基因ZmMYB42的玉米、高粱植株在适宜生长条件下生长速率略低于未转基因对照，明显高于转RNAi结构的。转入Prd29A/B启动的ZmMYB42或其RNAi结构的植株，在适宜生长条件下形态特征和生长速率与未转基因对照无明显差别，转基因表达水平很低。

耐热性实验：将在32℃(照光，13h/d)/24℃(暗，11h/d)下生长的转基因纯合的玉米或高粱植株移入36℃(照光)下生长2h，再在41℃(玉米)或42℃(高粱)下连续热处理1天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在26℃下恢复生长。在热处理后，转RNAi结构株系的植株和未转基因对照植株几乎全部死亡，而组成型启动子启动的转基因过表达植株受害轻，耐热性显著优于未转基因植株的；诱导性启动子启动的转基因植株受害程度也较轻，也明显低于未转基因对照的。

耐旱性实验：取充分干燥后分别转ZmMYB42基因和其RNAi结构的纯合株系种子播种在土盘中，置适宜条件下生长。植株4叶期时停止浇水，干旱处理6天(玉米)或8天(高粱)，然后恢复浇水，观测植株生长状况和成活率，确定植株的抗旱性。结果表明，ZmMYB42基因过表达明显提高了植株的抗旱性，无论转基因ZmMYB42是由组成型启动子启动或胁迫诱导型启动子启动。降低ZmMYB42基因表达水平的转基因植株，在苗期或拔节期都表现出低于未转基因对照的抗性水平。

将转ZmMYB42基因和其RNAi结构种子及未转基因的对照种子播在花盆和大田，分别在苗期(玉米、高粱)、玉米雌雄穗发育期(9～13叶期)、开花授粉期(玉米、高粱)和灌浆期(玉米、高粱)进行干旱胁迫处理，即通过控制浇水和避免雨淋，保持土壤相对含水量在50-60％左右，持续时间15天，然后恢复正常生长条件，并进行转基因植株性状观察和生理指标的检测，开放授粉，收获玉米果穗或高粱穗，并考种和统计产量。发现转Prd29A驱动的ZmMYB42的过表达株系抗旱性显著高于未转基因对照和转RNAi结构的，不仅植株受害症状轻，胁迫解除后恢复生长快，且单株籽粒产量等经济性状显著优于未转基因对照和转RNAi结构的。而转组成型启动子驱动的ZmMYB42过表达株系抗旱性虽显著高于未转基因对照的，植株受害症状轻，但株高降低，单株产量与未转基因植株的差异不显著。而转RNAi结构的植株抗旱性和籽粒产量明显低于未转基因对照的，也大幅度低于同基因型未经干旱胁迫处理的。

综上，本发明公开了玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用，是从玉米中克隆基因ZmMYB42，以正义形式将该基因或其RNAi结构重组到植物表达载体中，利用转基因技术将融合基因或ZmMYB42RNAi结构导入作物，通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。本发明的应用对提高在干旱胁迫下作物产量有重要意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

实施例1：转ZmMYB42基因创造玉米耐旱自交系

1)ZmMYB42基因转化载体的构建和农杆菌介导的转化

将ZmMYB42基因编码框与胁迫诱导型的启动子Prd29B或组成型启动子Pubiquitin1融合，采用常规基因重组技术将融合基因插入到植物表达载体pCambia1300-PCaMV35S::bar中，分别产生

转化质粒pCambia1300-Prd29B::ZmMYB42-PCaMV35S::bar

或pCambia1300-Pubiquitin1::ZmMYB42-PCaMV35 S::bar。

然后采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，转入重组的转化质粒，筛选出阳性克隆并提取质粒进行T-DNA区测序鉴定。然后培养测序正确的克隆大量提取转化质粒，导入根癌农杆菌菌株LBA4404的感受态细胞中。该过程一般为：取50μl感受态细胞悬液，在室温下加入1μg重组质粒DNA，混匀后冰浴30min，置液氮速冻1min，经37℃保温3min后，加入1mlLB培养基摇匀，28℃下振荡(150rpm)培养3-4h。5000rpm离心3min收集菌体，加入100μl LB液体培养基重悬，涂布于含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB平板上，28℃暗培养2-3天，待转化菌落长到合适大小，挑取单菌落进行培养和鉴定，挑选质粒稳定的LBA4404克隆用于植物遗传转化。

2)玉米转基因植株产生

以我国农业生产上常用的自交系为材料，如郑58、昌7-2、6WC等。在套袋自交授粉后9～12d，幼胚发育至长度约1.0～1.2mm时，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取幼胚接种于附加1～2mg/L2,4-D和500mg/L脯氨酸的改良MS培养基上，7～8d后，用镊子将已膨大的幼胚挟碎，促进愈伤组织的产生。培养4～6周后，得到大量愈伤组织。愈伤组织中选取松脆、淡黄色、胚性最好、可长期继代培养的Ⅱ型愈伤组织进行继代培养。在附加1-2mg/L2,4-D和500mg/L脯氨酸的改良MS培养基上Ⅱ型愈伤组织可长期继代培养，10～15d左右继代一次。培养条件为温度25±1℃，光照强度800-1000lx，光照10～12h/d。用Ⅱ型愈伤组织作为农杆菌介导的遗传转化的受体材料。

将携带转化质粒(Mini--Ti质粒带有选择剂抗性基因和ZmMYB42基因)的根瘤农杆菌，在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体改良MS培养基洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μmol/l的1/2浓度的液体改良MS培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

将继代培养5-7天玉米胚性愈伤组织夹碎成约2mm大小的小块，放在改良MS培养基悬浮的农杆菌菌液中浸泡，并不停振荡。5min后弃去菌液，用无菌滤纸将愈伤组织吸干后置于附加1-2mg/L2,4-D和500mg/L脯氨酸的改良MS培养基上于25±1℃下避光培养3天。然后将玉米愈伤组织用无菌水冲洗3遍，并用无菌滤纸吸干，转入附加cefotaxime 200mg/L的成分不变的培养基上避光培养15天，再转入加有0.09％浓度草丁膦的改良MS培养基中避光筛选，每代15d，筛选2代。经过筛选的抗性愈伤组织在附加0.2-1mg/L6-BA的改良MS培养基上分化，光照16h/d。分化产生的试管苗在改良N6培养基中生根、壮苗后移入花盆。小苗分化和生根过程均采用光照16h/d，温度24±1℃。移栽成活的小苗长到15cm高时定植栽到大田，人工套袋自交结实。

3)转基因植株的抗性检测和选择利用

转化植株子代长出3片叶后，喷洒0.18％浓度的除草剂草丁膦水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转基因植株在喷洒后，一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。取植株叶片进行分子生物学检测确定是否是转基因植株，而后将转基因植株(T1)套袋自交结实，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗性检测。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，最终获得转基因玉米纯合系。

4)转基因植株后代抗旱性测定

转基因植株苗期干旱胁迫处理：选取大小均匀的T2代转基因种子和受体自交系种子播种于大小一致的塑料盘中，盘中装有等量的质地均匀的壤土，每盘播种20粒，每株系至少种3盘。正常浇水，待小苗长至3叶期，选取长势一致的塑料盘进行抗旱性观察试验。干旱胁迫处理的方法是一次性浇足水分后停止浇水，一直到多数株系的植株叶片干枯、茎基部变软，再恢复浇水，观察各株系在恢复浇水后的生长状况。干旱胁迫对转ZmMYB42基因过表达植株的影响要小于对受体自交系的，而对ZmMYB42RNAi植株的影响则大于对受体自交系的。

转基因植株开花前干旱胁迫处理：该试验在自然条件下进行，胁迫处理期间避免植株淋雨。选取T3代转基因种子和受体自交系种子播种于大小一致的大花盆中，植株长至5叶期时，每盆留苗2株，即受体自交系1株，转基因小苗1株。植株在正常浇水条件下长至10叶，然后将花盆分为两组，一组处于干旱条件下生长，土壤绝对含水量保持在15-17％左右，持续处理一周，然后恢复正常浇水。另一组保持在充足浇水条件下生长，作为对照处理。每组设6次重复。干旱处理组在控水浇灌前期，植株在白天9～18时间叶片萎蔫，夜晚叶片恢复伸展；在控水浇灌后期，叶片持续萎蔫。恢复正常浇水一周后，植株开始抽雄。将植株控制浇水第1天(叶片在上午8时左右开始萎蔫)记为干旱胁迫处理0天，分别在处理的0、2、4、6、8天和恢复正常浇水一周后取样，测定RWC、细胞膜离子渗漏率、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量以及光合作用指标等。干旱处理后在开花期测量株高和绿叶数，统计开花及吐丝时间间隔(Anthesis-silking interval，ASI)。经历8天干旱胁迫的玉米植株，恢复浇水一周后开始抽雄，在此期统计植株株高和持绿叶片数。在正常浇水条件下，转基因玉米植株的生长发育与未转基因对照植株之间存在的表型差异不明显。开花期前干旱胁迫处理8天，所有株系的平均株高均显著降低，但不同玉米株系之间降低的幅度不同。相比于正常浇水条件下的同一转化体的后代植株，转ZmMYB42基因株系株高的降低幅度(24.4％和22.3％)显著低于同条件下受体自交系的(30.2％)；而ZmMYB42RNAi株系的株高降低幅度(33.4％和34.5％)大于同条件下受体自交系的。经历干旱胁迫后，不同株系之间的绿叶数差异显著，转ZmMYB42基因植株的绿叶数明显高于受体自交系和转RNAi结构株系的。开花前的干旱胁迫对玉米植株的雌雄穗发育产生了深刻的影响。干旱处理后，所有玉米株系的开花时间推迟，植株正常花粉数量降低和不育花粉数量升高，雌雄穗发育不协调。干旱胁迫对转ZmMYB42基因过表达植株的开花-吐丝时间间隔的影响要小于对受体自交系的，而对ZmMYB42RNAi植株的ASI影响要大于对受体自交系的。

在干旱胁迫后，受体自交系植株花粉量少，ZmMYB42RNAi植株的与受体自交系类似，而转ZmMYB42过表达植株花粉量较多。取不同株系的花药采用碘-碘化钾方法染色进行细胞学观察，可看到受体自交系植株的花粉粒中仅有小部分被染为蓝色，大部分呈现浅黄褐色。被染为蓝色的花粉为富含淀粉的花粉，其生活力强，而呈现黄褐色的花粉发育不良，授粉后结籽率较低。转RNAi结构植株的花粉粒也是只有少部分被染为蓝色，大部分呈浅黄褐色。而转ZmMYB42g不得植株的雄穗能正常散粉，多数花粉形态正常，大部分被染为深蓝色。表明受体自交系和转RNAi结构植株的花粉败育率高，而转ZmMYB42g不得植株在经过干旱胁迫处理后其花粉发育多数正常，生活力强。

测定转基因玉米和受体自交系在正常生长条件、干旱胁迫条件以及复水条件下的净光合速率和气孔导度，得出在胁迫5天时，转ZmMYB42基因过表达株系的净光合速率降低为胁迫前的52.9～54.7％，显著高于同条件下受体自交系的；而ZmMYB42RNAi株系的净光合速率(为0天时的30.1～37.3％)低于同条件下受体自交系的。在整个干旱胁迫过程中，气孔导度的变化趋势同净光合速率的变化趋势相似，转ZmMYB42过表达株系的气孔导度显著高于同条件下受体自交系和转RNAi结构株系的。气孔导度下降导致CO₂供应减少，可能是干旱胁迫过程中光合作用下降的一个重要因素。此外，在恢复浇水7天后，所有株系的净光合速率和气孔导度都有所增加，其中转ZmMYB42基因过表达株系的净光合速率和气孔导度仍高于同条件下受体自交系的。干旱胁迫下更强的光合能力和复水后更强的恢复能力表明转ZmMYB42基因过表达提高了植株抗旱能力。

防雨棚干旱处理试验：待玉米植株长至10叶期，控制防雨棚中的土壤相对含水量，维持其在50％-55％左右，使植株遭受干旱胁迫，持续6周后浇充足水分，让植株在正常栽培条件下发育成熟。观察干旱处理过程中不同株系植株的生长发育速率及形态差异。待果穗成熟后，对果穗性状进行观测统计，分析干旱胁迫后不同株系果穗性状及产量。结果表明，转RD29A/B::ZmMYB42株系的平均穗长明显大于受体自交系的，ZmMYB42RNAi株系的平均穗长显著小于受体自交系的。从单穗粒重来看，转RD29A::ZmMYB42株系的单穗粒重明显高于受体自交系的，而转RNAi结构株系的则明显比受体自交系的低，差异达到显著或极显著程度。其中一些转基因过表达株系比受体自交系增产30％以上，一些转RNAi结构株系单穗粒重比受体自交系减少20％以上。从百粒重来看，不同转基因过表达株系之间虽有差异，但达不到差异显著程度。从这些结果判断，转RD29A/B::ZmMYB42基因玉米对干旱胁迫表现出明显提高的抗性，生长和生殖器官发育受影响较小，从而籽粒产量显著高于受体自交系的。

实施例2：转ZmMYB42基因创造高粱耐旱新材料

1)受体系统的建立

以我国农业生产上所用的高粱品种或不育系、保持系、恢复系为材料。种子用70％乙醇浸泡6分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-10分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内于黑暗条件(25-28℃)下萌发，瓶内放入少量无菌水。2-3天后种子萌动(露白)，将它们播放在改良MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长止3厘米左右时，剥离胚芽鞘及幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

2)茎尖转化和植株再生

构建携带ZmMYB42融合基因的质粒。即ZmMYB42基因与胁迫诱导型启动子RD29A/B或玉米PUbiquitin 1启动子融合，再将融合基因重组到T-DNA区带有植物除草剂抗性基因bar的根瘤农杆菌的Mini--Ti质粒中，获得遗传转化载体。同时构建ZmMYB42RNAi结构，产生由RD29A/B或PUbiquitin启动的ZmMYB42RNAi结构的Mini-Ti质粒，以除草剂抗性基因bar为转基因植株筛选标记。

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因bar和ZmMYB42基因或其RNAi结构)的根瘤农杆菌(如LBA4404等)在附加抗生素的LB培养基中于28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体改良MS培养基(即改良MS培养基成分减半)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)80μmol/L的1/2浓度的液体改良MS培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。转化时将菌液倒在培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理8-12分钟。再将浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发小苗放在固体改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将转化苗放在散射光下培养2-3天促进长大。再将照光培养的转化苗移栽到铺有上层蛭石、下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

3)转基因植株的抗性检测和选择利用

转化植株长出3片叶后，喷洒0.1％除草剂草丁膦水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后3天后停止生长，10天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。取移栽成活植株的叶片进行PCR检测确定候选的转基因植株。然后将候选的转基因植株(T0)套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在温室或具有防护设施的田间，喷洒0.15％除草剂草丁膦水溶液，观测植株抗性。T1代筛选出的抗除草剂植株继续套袋自交，对其子代继续进行抗性检测、PCR检测和RT-PCR检测，确定转基因存在和表达水平(若用胁迫诱导型启动子RD29A/B启动ZmMYB42表达，则在胁迫过程中检测ZmMYB42的表达水平)。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，获得转基因高粱纯合系。

4)转基因植株后代抗旱性测定

转基因植株苗期干旱胁迫处理：选取大小均匀的T2代转基因种子和受体自交系种子播种于大小一致的塑料盘中，盘中装有等量的质地均匀的壤土，每盘播种40粒，每株系至少种6盘。正常浇水，待小苗长至3叶期时进行干旱处理，观察植株长势和抗旱性。干旱胁迫处理的方法是一次性浇足水分后停止浇水，一直到多数株系的植株叶片干枯、茎基部变软，再恢复浇水，观察各株系在恢复浇水后的生长状况。干旱胁迫对转ZmMYB42基因过表达植株的致死率要显著小于对受体植株的，而对ZmMYB42RNAi植株的致死率要大于对受体植株的。将入选的转基因纯合株系播种于大田，采用正常的栽培管理，进行全生育期观察，得出在适宜栽培条件下转RD29A/B::ZmMYB42基因的株系和转RNAi结构株系的籽粒产量和非转基因对照无明显差别；在拔节期干旱处理15天后，转RD29A/B::ZmMYB42基因的株系籽粒产量比非转基因对照显著增加，增加幅度大于15％；而转RNAi结构株系穗粒重比受体自交系减少10％以上。

本发明通过在高粱中过表达RD29A/B::ZmMYB42基因创造出抗旱性明显改善且籽粒产量在水分供给正常条件下与非转基因对照基本相同的高粱育种材料。

序列表

<110>山东大学

<120>玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用

<141>2020-10-15

<160>2

<210>1

<211>1329

<212>cDNA

<213>玉米（Zea mays L.）

<221>玉米转录因子ZmMYB42基因的核苷酸序列

<222>（1）…（1329）

<400> 1

gtttccgttc cagtccacgt ccacccacac ccagagccac ccaacctggc cagtggccac 60

caaccttcgt catctcctca caccgcgacc aaccaaccaa ccgcctagaa aaagaaagcc 120

ccgcgcccac tcgctgcctt ctcaaatcca aacgcgaagt agcaacaagc aaaagcccag 180

atcgataata cgatggggcg gtcgccgtgc tgcgagaagg cgcacaccaa caggggcgcg 240

tggaccaagg aggaggacga gcggctggtg gcctacgtcc gcgcgcacgg cgaagggtgc 300

tggcgctcgc tgcccagggc ggcgggcctg ctgcgctgcg gcaagagctg ccgcctgcgc 360

tggatcaact acctccgccc ggacctcaag cgcggcaact tcaccgccga cgaggacgac 420

ctcatcgtca agctgcacag cctcctcggg aacaagtggt cgctcatcgc cgcgcggctc 480

ccggggcgga cggacaacga gatcaagaac tactggaaca cgcacatccg gcgcaagctg 540

ctgggcagcg gcatcgaccc cgtcacgcac cgccgcgtcg cggggggcgc cgcgaccacc 600

atctcgttcc agcccagccc caacaccgcc gtcgccgccg ccgcagaaac agcagcgcag 660

gcgccgatca aggccgagga gacggcggcc gtcaaggcgc ccaggtgccc cgacctcaac 720

ctggacctct gcatcagccc gccgtgccag catgaggacg acggcgagga ggaggaggag 780

gagctggacc tcatcaagcc cgccgtcgtc aagcgggagg cgctgcaggc cggccacggc 840

cacggccacg gcctctgcct cggctgcggc ctgggcggac agaagggagc ggccgggtgc 900

agctgcagca acgggcacca cttcctgggg ctcaggacca gcgtgctcga cttcagaggc 960

ctggagatga agtgaacgaa acgaagccca cacgtccttt cttctccttt tgttgtcggt 1020

tttagtcttg gcttgttgga tttggataga gctagttggt tactagttgt tagttagaag 1080

atagtgcagg atgatcacta gctactggct acctcaacac agtagctgct cccttcttct 1140

cttccattct atgtaaaaaa gaaacaaaaa tacttagtac ctggttgatg aactttagga 1200

ataatcatgt gtactttctt ctgactccgg gttgcttccc ggattctttg tgttgtaatg 1260

taactactac tactacaagt agtaggaaaa gacaaggaaa gagcaagggg gacagttagc 1320

gtggtgaag 1329

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213>人工序列

<221>玉米转录因子ZmMYB42基因编码的氨基酸序列

<222>（1）…（260）

<400> 2

MGRSPCCEKA HTNRGAWTKE EDERLVAYVR AHGEGCWRSL PRAAGLLRCG KSCRLRWINY 60

LRPDLKRGNF TADEDDLIVK LHSLLGNKWS LIAARLPGRT DNEIKNYWNT HIRRKLLGSG 120

IDPVTHRRVA GGAATTISFQ PSPNTAVAAA AETAAQAPIK AEETAAVKAP RCPDLNLDLC 180

ISPPCQHEDD GEEEEEELDL IKPAVVKREA LQAGHGHGHG LCLGCGLGGQ KGAAGCSCSN 240

GHHFLGLRTS VLDFRGLEMK 260

Claims (1)

1.一种玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用；其中：所述玉米转录因子ZmMYB42基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述抗旱育种是指培育在遭受干旱胁迫后产量高于对照的植物新品系，其抗旱性是指植物在苗期、拔节期或灌浆期的抗旱性；所述植物是指玉米或高粱；所述玉米转录因子ZmMYB42基因在抗旱育种中的应用方法是：将玉米转录因子ZmMYB42基因与胁迫诱导性启动子融合形成胁迫诱导性基因表达结构，通过遗传转化导入玉米，实现利用转ZmMYB42基因胁迫诱导性过表达结构创造玉米耐旱自交系；或者，将玉米转录因子ZmMYB42基因与胁迫诱导性启动子融合形成胁迫诱导性基因表达结构，通过遗传转化导入高粱，实现利用转ZmMYB42基因胁迫诱导性过表达结构创造高粱耐旱新育种材料。