CN105420257A

CN105420257A - 玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN105420257A
Application number: CN201510925503.4A
Authority: CN
Inventors: 张举仁; 刘秀霞; 李朝霞
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明公开了一种玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用，是从玉米中克隆基因ZmsPLA2-2，以正义或反义形式将该基因重组到植物表达载体中，利用转基因技术将融合基因导入植物，通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。其中所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2的cDNA序列如SEQ？ID？No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或早熟禾，或牧草，或玉米，或棉花。本发明的应用对提高在干旱胁迫下作物产量有重要意义。

Description

玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明属植物生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。

背景技术

磷脂作为细胞膜的骨架成分，在细胞膜感受刺激并传递信息进入细胞的过程中发挥十分重要的作用。当细胞膜上的受体接受外界信号后，受体激活相关酶将磷脂转变为信号分子，如磷酸肌醇(phosphoinositides,PIs)、三磷酸肌醇(IP3)、二酯酰甘油(diacylglycerol，DAG)、磷脂酸(phosphatidicacid，PA)、游离脂肪酸(freefattyacid，FFA)等，进而引发细胞内的一系列反应。磷脂信号参与光合作用、激素信号等调控，影响植物生长发育过程及抗逆性。

磷脂酶A(phospholipaseA，PLA)家族由磷脂酶A1(PLA1)和磷脂酶A2(PLA2)两类组成。二者分别在sn-1和sn-2位上催化磷脂的水解。其中PLA2催化磷脂生成sn-1位带酰基链的溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，广泛存在于细菌、植物、哺乳动物组织的细胞和分泌物中。在植物中，PLA2参与了多种生命活动，如衰老、损伤、胁迫应答、病原体防御和诱导次级代谢物积累等。PLA2可分为五种类型：分泌型PLA2(sPLA2s)，胞质Ca²⁺依赖型PLA2(cPLA2s)，Ca²⁺不依赖型PLA2(iPLA2s)，PAF酰基水解酶(PAF-AH)和溶酶体PLA2s。植物中未发现胞质Ca²⁺依赖型cPLA2，其PLA2主要是sPLA2和与动物iPLA2同源的类patatinPLA2(PAT-PLA2)。PAT-PLA2是PLA2和PLA1活性兼有的脂酰水解酶。植物特异性的PLA2是sPLA2。不同种类的PLA2结构、功能各有不同，但其生理生化特性却有许多相似之处。

sPLA2基因的序列已经从多种植物中克隆得到。1999年，Kim等和等分别从康乃馨和水稻中克隆到可能的sPLA2基因全序列(序列号分别为AF064732，AJ238116和AJ238117)。2003年，Lee等和Bahn等对拟南芥数据库搜索发现与动物sPLA2同源的同工酶有4个，分别为AtPLA2-α(At2g06925)、AtPLA2-β(At2g19690)、AtPLA2-γ(At4g29460)和AtPLA2-δ(At4g29470)。其中，AtPLA2-α和AtPLA2-γ有了较详细的研究。2010年，Liao和Burns从甜橙中克隆到两个sPLA2基因CssPLA2-α和CsPLA2-β，并发现光调控这两个基因的表达。

植物sPLA2在氨基酸水平与动物sPLA2的相似性较低(约15％)，它们之间的Ca²⁺结合环和活性位点元件相似性为50％。植物sPLA2可分为两个亚型：第一亚型有AtPLA2-α、榆树的sPLA2、水稻的sPLA2-II和sPLA2-III、番茄和康乃馨sPLA2s，亚型内的氨基酸序列相似性为47％；第二亚型有AtsPLA2-β、-γ、-δ和水稻的sPLA2-I，亚型内的氨基酸序列相似性为54％。亚型之间的氨基酸序列相似性为29％。植物sPLA2包含PLA2的特征性结构域PA2C。该结构域由Ca²⁺结合环(YGKYCGXXXXGC)和催化位点元件(DACCXXHDXC)组成。催化位点元件有极保守的His/Asp二价体。在植物的Ca²⁺结合环上发现动物sPLA2中两个保守氨基酸残基，Tyr和Gly，它们参与氢键形成。在植物的sPLA2上也发现了介导蛋白分泌的N-端信号肽。洋葱表皮细胞的瞬时表达分析发现AtPLA2-β和AtPLA2-γ的确分泌到细胞间隙中。另外，AtPLA2-β、水稻sPLA2-I、甜橙CsPLA2-β分别在C-端有KTEL、KLEL和KFEL，这与内质网滞留序列KDEL和HDEL极为相似。所有已鉴定的植物sPLA2s中都包含12个极为保守的半胱氨酸残基，后者可能形成六对二硫键。动物sPLA2s的研究已表明这些半胱氨酸残基对酶的结构和活性极为重要。sPLA2在内质网中切除信号肽后，以成熟形式分泌到细胞间隙。AtPLA2-β和AtPLA2-γ的成熟形式的酶活性分别比加工前提高了2倍和1.3倍。这种变化归因于加工过程中酶分子的结构重排。植物sPLA2最早从榆树种子胚乳中纯化得到(etal.,1998)。它是一种15kD左右低分子量的水溶性蛋白，对热、酸、有机溶剂极不敏感，但对二硫键还原剂极为敏感，活性需碱性pH和Ca²⁺。AtPLA2-α和AtPLA2-β在沸水处理5分钟后仍然保持80-95％的活性，而在还原剂-5mMDTT存在时，活性仅为原来的35-65％。AtPLA2-α、AtPLA2-β、AtPLA2-γ和AtPLA2-δ酶活的最适pH范围分别为pH6～11、pH6～7、pH7～9和pH8～9，而细胞间隙的pH为pH5～6，这表明AtPLA2-γ和AtPLA2-δ可能在亚细胞定位处是失活的，其激活需要升高pH。Ca²⁺浓度影响sPLA2s的酶活，随着Ca²⁺浓度升高到10mM，AtPLA2-α的特异活性持续升高，而AtPLA2-β、AtPLA2-γ、AtPLA2-δ在微摩浓度的Ca²⁺下酶活性已达到平台值。榆树的sPLA2酶活性与Ca²⁺的关系与AtPLA2-α相似。AtsPLA2s酶活性需要的Ca²⁺浓度及pH值不同，暗示在植物受外界刺激时sPLA2s的活性可能受Ca²⁺水平和pH值变化的调节。

关于PLA2的上游信号人们知之甚少，对哪种PLA2参与了某一特定的应答反应也了解很少。有工作表明PLA2在植物对蓝光、生长素、非生物胁迫和病原体刺激的应答中被激活。对于PLA2下游靶基因的研究，较多地依赖于从sPLA2的生化和分子特征分析推测。(1)PLA2可能在细胞内外的信号传导中发挥作用。PLA2的产物之一溶血磷脂酰胆碱在细胞中可快速移动，可能是胞质内和细胞间信号传导的信使。有证据表明动物细胞中溶血磷脂酰胆碱激活蛋白激酶，植物中也有多不饱和脂肪酸和溶血磷脂可激活蛋白激酶的报道。(2)PLA2调控气孔开放。蓝光和红光可通过激活H⁺-泵诱导气孔开放，而这种效应可被sPLA2的抑制剂抑制，说明sPLA2可能参与保卫细胞的光信号转导。与该设想一致的是在拟南芥中通过改变AtsPLA2-β基因的表达水平观察到气孔开放的变化，也证明AtsPLA2-β调控光诱导的气孔开放。(3)PLA2可能参与介导生长素诱导的细胞伸长。AtsPLA2-β在幼苗和生长活跃组织中表达强度较高，且受生长素诱导。Günther等(2007)指出PLA2在生长素调节的基因表达中发挥重要作用。生长素激活PLA2，从而提高溶血磷脂和FFA的水平，激活H⁺泵。后者诱导质外体酸化，促进细胞伸长。在幼苗和生长活跃组织中AtsPLA2-β表达强度较高，且被生长素诱导。AtsPLA2-β的过表达的确可以促进细胞伸长，产生伸长的叶柄和花序茎，而对该基因的RNAi导致细胞伸长延滞。AtsPLA2-β通过介导生长素诱导的细胞伸长在根的向地性反应中起着重要作用。与之相一致的是，某些生长素依赖型的基因表达，其诱导可被PLA2抑制剂抑制，说明PLA2在生长素调控的基因表达中发挥重要作用。在拟南芥根的研究中发现PLA2是生长素流入载体PIN-FORMED蛋白运输到质膜所必需的。(4)PLA2在植物衰老中的作用。植物中PLA2的产物溶血磷脂如溶血磷脂酰胆乙醇胺和溶血磷脂酰肌醇可特异抑制PLDα活性。已知PLDα引起细胞膜损害而促进植物衰老。这表明溶血磷脂可能影响植物的衰老。外源施用LPE的确可延迟不同植物器官的衰老。(5)PLA2在植物防御中有重要作用。PLA2作用于膜脂后可产生游离的亚麻酸和亚油酸。它们可作为十八碳烯酸途径中脂氧合酶的底物，产生脂质过氧化物，并进一步产生茉莉酸(jasmonic,JA)。JA是植物防御反应中的重要调节子，作为系统胁迫信号分子可以激活多种植物防御反应相关基因的表达，促进植保菌素积累和病原相关蛋白的合成等，并可启动苯丙氨酸裂解酶基因的转录，调控查尔酮合成酶、营养贮藏蛋白、富含羟脯氨酸的细胞壁蛋白等相关伤害防御基因的表达。尽管已知植物PLA2有如此重要的生理功能，但是对于低分子量的分泌型PLA2(sPLA2)及其编码基因的性质了解很少。目前已从拟南芥(Leeetal.,2003)、康乃馨(carnation)(etal.,1999)、水稻(Kimetal.,1999)、甜橙(Citrussinensis)(LiaoandBurn,2010)中克隆到sPLA2基因序列。

由sPLA2产物调控的下游信号可能包括蛋白激酶，H⁺－ATPase和PLDα，这些信号途径介导如细胞伸长、重力反应、衰老、种子成熟、气孔开放和防御及胁迫应答等过程。PLA2的水解产物脂肪酸和溶血磷脂已被证明可激发质膜上的一些酶如H⁺-ATPase、NADH氧化酶和蛋白激酶，从而引发许多生理反应，如：活化膜上的H⁺、K⁺、Ca²⁺流动、产生活性氧，调节抗逆基因的表达，调节胞内的pH值等。

栽培植物的抗旱性提高无疑具有重要的经济价值和生态意义，是农业领域中的关注课题。采用生物技术提高植物抗旱性已有众多工作，但仍是植物生物技术和农业领域的研究热点，开发具有能显著提高植物抗旱性的基因有重要意义。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。

本发明所述的玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用：

其中，所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2的cDNA序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；该基因编码的氨基酸序列中含有sPLA2典型的PA2c结构域。该基因cDNA序列长575bp，推测其包含32bp的5′非翻译区(5′UTR)和107bp的3′非翻译区(3′UTR)以及一个474bp的ORF。该ORF编码157个氨基酸，其分子量和等电点分别为16.5kDa和5.16。在氨基酸水平上ZmsPLA2-2及ZmsPLA2-1、与其他植物的sPLA2有较高相似性。ZmsPLA2-2在氨基酸水平上与水稻sPLA2-II相似性最高，为77％。但ZmsPLA2-2与ZmsPLA2-1的相似性为26％，与ZmsPLA2-3的相似性为49％。

所述的玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列可以正义形式或反义形式构建融合基因，后者用于植物转基因。所述的植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花，或牧草，或早熟禾；所述改变植物抗旱性是指提高或降低植物的抗旱性。

本发明所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在提高植物抗旱性中的应用方法大体是：从玉米中克隆ZmsPLA2-2基因，构建用于植物转化的表达载体，利用转基因技术生产转基因植株；通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。具体是：

玉米ZmsPLA2-2克隆和表达分析

首先，从玉米基因组DNA或cDNA中克隆出ZmsPLA2-2基因，后者表达后产生一个157氨基酸的蛋白。具体步骤为：用水稻sPLA2基因家族的sPLA2-II在玉米的EST库进行BLAST，得到序列CO442459。序列分析表明这条EST序列包含完整的ORF。采用PCR方法从玉米郑58的cDNA文库中克隆出完整的cDNA序列，测序鉴定得的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，即确定为ZmsPLA2-2基因的cDNA形式。利用获得的cDNA序列设计引物，采用PCR方法从玉米郑58基因组中扩增出ZmsPLA2-2基因的基因组序列。

将ZmsPLA2-2基因cDNA的5’端序列在NCBI中进行BLAST，获得了一系列不同长度的序列。取基因的起始密码子5’上游的2000bp的序列为启动子区域，利用plantCARE在线软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行分析，确定了在ZmsPLA2-2基因的启动子区域，DNA正链上分布有ABA、MeJA相关顺式元件各1个；负链上分布有可能的干旱胁迫相关顺式元件4个，热胁迫相关顺式元件1个，ABA相关顺式元件1个，MeJA相关顺式元件1个。提示ZmsPLA2-2基因的表达可能受干旱胁迫、热胁迫、ABA、MeJA等信号的诱导，与植物抗逆性密切相关。

为了确定ZmsPLA2-2基因的表达与植株生长发育和抗逆性的关系，提取正常栽培条件下生长的玉米郑58的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊和籽粒的mRNA，使用随机六引物反转录合成cDNA。根据已知序列的3’非翻译区或非保守区设计引物，进行RT-PCR，结果表明ZmsPLA2-2在根和雄穗中表达量较低，在其他器官中表达量都较高。以Ubiquitin为内参基因，用2^－△△CT的方法计算每个基因的相对表达量。在渗透胁迫处理条件下，ZmsPLA2-2基因表达量最高上调2倍左右，它的表达受渗透胁迫诱导，即它参与了植株对渗透胁迫的响应。在冷胁迫处理条件下，ZmsPLA2-2表达强度也上调，在4℃处理6h时表达量最高，在叶和根中上升到正常水平的1.5倍和2倍左右。非生物逆境诱导条件下基因表达的水平的变化肯定了ZmsPLA2-2基因的表达与植株抗逆性密切相关。

玉米ZmsPLA2-2基因植物表达载体的构建

在植物中高效表达ZmsPLA2-2，需要将ZmsPLA2-2基因重组到植物表达载体中并应用于植物转基因，产生工程植株。本发明提供一个玉米ZmsPLA2-2基因构建融合基因和植物表达载体的方案，通过玉米、棉花、早熟禾等植物的遗传转化，产生抗旱性状发生改变的工程植株，进而创制具有重要利用价值的新种质。

本发明所说的融合基因是由ZmsPLA2-2基因编码框与启动子和转录终止区连接形成的基因表达结构，ZmsPLA2-2编码框可正向或反向位于启动子3′端、转录终止区5′端。启动子可具有不同的启动特性，如胁迫诱导型启动子RD29A启动子、组成型启动子Ubiquitin1启动子。

本发明通过PCR扩增出5’端带有KpnI酶切位点、3’端带有SacI酶切位点的ZmsPLA2-2正义基因或5’端带有SacI酶切位点、3’端带有KpnI酶切位点的ZmsPLA2-2反义基因，经KpnI和SacI双酶切后回收该片段。同时对植物表达载体pCPE(改造的mini-Ti质粒)进行KpnI和SacI双酶切，回收载体片段。将二者混合后进行连接反应，得到质粒pCPE-ZmsPLA2-2(±)。质粒pCPE-ZmsPLA2-2(±)的目的基因区含有1个BamHI酶切位点。用限制性内切酶BamHI进行酶切鉴定，除载体条带外，质粒pCPE-ZmsPLA2-2(+)应有一条230bp电泳条带，质粒pCPE-ZmsPLA2-2(-)应有一条383bp电泳条带。挑选出重组正确的质粒用于植物遗传转化。

玉米ZmsPLA2-2基因转化植物

本发明中，用含有玉米ZmsPLA2-2基因的植物表达载体转化植物。根据转基因受体材料的特点选用不同的转基因方法以批量获得转基因植株。以下以玉米为例简述转基因植物获得及筛选过程。

常用的玉米转化方法有3类：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、电融合法、硅碳纤维法等将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。3)种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法进行遗传转化为例予以说明。

玉米自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.5mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养。每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

本发明中，采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl12.5MCaCl₂、20μl0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

本发明中，在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。再将材料转入加有选择剂(如0.08％除草剂草甘膦)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株通过数代分子检测和自交结实产生纯系，然后通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。

本发明中转基因植株的鉴定采用PCR检测法筛选，Southernblotting验证。即提取除草剂抗性小苗叶片DNA用于PCR检测。根据筛选标记基因和目的基因ZmsPLA2-2的序列设计引物，分别进行PCR检测。检测ZmsPLA2-2正义基因：上游引物：5’CGGTCGTTCATTCGTTCTAG3’，游引物：5’AGTCATTGTTGTGGGTGTCG3’。从转基因植株中扩增出ZmsPLA2-2正义基因的715bp目的条带或反义基因的1044bp的目的条带。而未转基因的对照植株(阴性对照)未出现相同大小的目的条带。可以推断这些PCR阳性植株基本是转基因植株。再取后者叶片提取DNA用于Southernblotting验证，选取转基因植株自交繁殖。

玉米ZmsPLA2-2转基因植株的选择及利用

本发明中，为了了解转基因的表达强度和植株抗逆性变化的关系，选取PCR阳性的遗传稳定的T2代转基因植株和未转基因对照为材料，提取叶片RNA，通过RealtimeRT-PCR检测目标基因的表达强度。在玉米转基因材料检测中，以玉米Ubiquitin基因为内标基因。在玉米转ZmsPLA2-2正义基因株系中，ZmsPLA2-2基因的表达强度是对照植株的1.7-5.33倍；在玉米转ZmsPLA2-2反义基因株系中，ZmsPLA2-2基因的表达强度仅为对照植株的0.24-0.58倍。这表明在这些转基因株系中外源基因得到了有效的表达。

本发明中，转基因植株后代选择和抗旱性测定分阶段进行。以下以转基因玉米为例。

在正常生长条件下，3叶期转基因植株和受体自交系(未转基因对照)植株在表型上有一定差异，转ZmsPLA2-2正义植株的地上和地下部分均比受体自交系发达，而ZmsPLA2-2反义株系表型上与对照差异不大。测定正常生长条件下3叶期植株的生物量，得出ZmsPLA2-2正义基因植株整体生长较快，地上部分和地下部分积累的干物质都显著高于对照自交系的。当植株长到10-14叶期时，转基因植株和受体自交系植株在表型上的差异已不再明显，挑选苗期生长快的转基因株系进行抗逆性测定。

将生长至3叶期的T2代转基因玉米和受体自交系小苗进行干旱致死实验。大部分玉米小苗经过6天的干旱胁迫处理后，叶片已接近干枯，茎基部变软，挑出因干旱胁迫频临死亡的小苗恢复浇水，观察不同株系小苗的恢复情况。不同株系抗干旱胁迫能力的差异非常明显，经受相同程度的干旱胁迫后再恢复浇水，有的株系大部分植株恢复正常生长，有的株系则全部死亡。恢复浇水2天，转ZmsPLA2-2正义基因株系中大部分植株叶片全展开，恢复正常生长；而反义株系大部分植株已干枯死亡。

在玉米植株长至10叶期时开始控制土壤含水量，相对含水量维持在50％-55％之间，进行干旱胁迫处理，8天后恢复正常浇水，植株一周后开始抽雄。在干旱胁迫过程中观察了转基因玉米植株和受体自交系植株的表型变化；并于干旱胁迫处理的0、2、4、6、8天和恢复浇水后一周分别取材测定各项生理指标。在正常生长条件下转ZmsPLA2-2(±)基因株系的形态特征和生长发育速率与WT相比差别不大。经受4天的干旱胁迫后，受体自交系植株和转ZmsPLA2-2反义基因植株的叶片严重卷曲、变黄，而ZmsPLA2-2正义植株叶片萎蔫程度较轻，叶色较为翠绿。

本发明中，分别测定了不同处理条件下玉米叶片细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量。正常生长条件下，转基因株系和受体自交系植株的丙二醛含量和细胞膜离子渗漏无明显差别。随着干旱胁迫时间的延长，丙二醛含量和细胞膜离子渗漏率明显升高，其中转ZmsPLA2-2正义株系的升高幅度均较小。胁迫8天后，受体自交系的丙二醛含量和细胞膜离子渗漏率为21.86nmol/gFW和41.7％，转ZmsPLA2-2正义基因株系的丙二醛含量和离子渗漏率显著低于受体自交系的，ZmsPLA2-2反义基因株系的丙二醛含量和离子渗漏率显著高于受体自交系的。即在干旱胁迫过程中，正义株系的细胞膜损伤较轻，膜脂氧化程度较低，具有较强的抗旱能力。

为了解干旱胁迫条件下叶片水分的丧失程度，测定了不同玉米株系叶片中的相对含水量。在干旱胁迫前，各株系间相对含水量RWC没有显著差异，在干旱胁迫后，所有株系叶片相对含水量均降低，但在胁迫2天后，不同株系叶片中RWC下降幅度有所不同。同ZmsPLA2-2正义株系相比，受体自交系、反义株系的叶片水分流失都较多。在干旱胁迫的第8天，ZmsPLA2-2正义株系的叶片RWC显著高于受体自交系的，ZmsPLA2-2反义株系显著低于受体自交系的。恢复正常浇水后，ZmsPLA2-2正义株系的RWC仍然高于受体自交系的，但是其反义株系叶片含水量也较快回复。在干旱胁迫处理之前，玉米叶片可溶性总糖含量在转基因株系和受体自交系之间的差异不明显。干旱胁迫处理引起所有株系叶片中可溶性糖含量上升，但上升幅度不同。干旱胁迫条件下，转ZmsPLA2-2正义基因株系叶片中积累了比受体自交系更多的可溶性糖含量；同受体自交系相比，转ZmsPLA2-2反义基因株系具有更少的可溶性糖。这些结果表明ZmsPLA2-2正义基因株系叶片在干旱胁迫条件下具有更好的保水能力，较好保持正常的细胞膨压，有利于植株的生长。

本发明在防雨大棚中对开花前玉米植株进行连续6周的干旱胁迫，然后恢复正常浇水。在此期间观察了转基因植株与受体自交系植株在干旱胁迫下的表型变化：ZmsPLA2-2正义株系植株的叶片较为伸展，表现出比受体自交系明显较好的抗旱性。干旱胁迫下ZmsPLA2-2反义株系表现出了与WT类似的症状，叶片卷曲严重，叶色变浅。干旱胁迫后ZmsPLA2-2正义株系的平均穗长明显大于受体自交系的，而反义株系的平均穗长显著小于受体自交系的。从单穗粒重来看，ZmsPLA2-2正义株系的单穗粒重明显高于受体自交系的，而反义株系的单穗粒重明显少于受体自交系的，差异达到显著或极显著程度(P<0.05或P<0.01(n＝6))。从百粒重来看，各转基因株系与受体自交系之间虽有差异，但达不到差异显著程度。这些结果表明，转ZmsPLA2-2正义基因植株对开花前遇到的干旱胁迫具有明显提高的抗性，生殖器官发育受影响较小，使籽粒产量显著高于受体自交系的。

本发明提供了一种玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。综合干旱胁迫条件下玉米不同株系植株的生理指标和产量上的差异可得出：转ZmsPLA2-2正义基因株系在遇到干旱胁迫时细胞可溶性物质增加幅度较大，减少了细胞水分的流失，能够更好的保持细胞的含水量，细胞膜损伤小，光合能力较强，植株的生长发育受影响较小，因此籽粒产量高，表现出明显改善的抗旱性，比起受体自交系植株能够更好地适应干旱胁迫环境；相反，ZmsPLA2-2反义株系在遇到干旱胁迫时，细胞溶质增加幅度较小，细胞水分流失多，细胞膜损伤大，光合能力减弱，植株减产，导致植株抗旱性变差。这表明通过在玉米中过表达ZmsPLA2-2基因可明显改变玉米的抗旱性，为植物抗逆育种提供了启发性实例，对提高作物经历干旱胁迫后的产量具有重要意义。

具体实施方式

实施例1：转ZmsPLA2-2基因创造玉米抗旱自交系

1)受体系统的建立

以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2等的自交种子。先用70％乙醇浸泡种子10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30-40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在MS培养基上于黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖生长锥用于农杆菌介导的玉米遗传转化。

2)农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒pCPE-ZmsPLA2-2(+)或pCPE-ZmsPLA2-2(-)，带有除草剂草甘膦抗性基因epsps)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于玉米转化。

3)玉米无菌苗转化

(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使无菌苗裸露茎尖浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理8-12分钟。

(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，无菌苗插入改良MS培养基上于黑暗条件下培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

4).转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，添加0.1-0.2％Tween-20的512.5mg/L草甘膦(40％有效成分)的水溶液，喷洒12天后受体自交系小苗(对照)受害严重，20天后死亡率在90-95％。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

5)转基因植株后代分析

T1代植株长到3叶期用0.1-0.2％Tween-20的1250mg/L草甘膦(40％有效成分)的水溶液，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。PCR检测引物序列为：检测epsps：上游引物5’TGACGCACAATCCCACTATCC3’,下游引物5’CTTCGCGCTCATTCTCTAAT3’；检测ZmsPLA2-2正义基因：上游引物5’CGGTCGTTCATTCGTTCTAG3’,下游引物5’AGTCATTGTTGTGGGTGTCG3’；检测ZmsPLA2-2反义基因：上游引物5’TGCTAACTTGCCAGTGTTTCTC3’,下游引物5’GTGGGTGTTGTTACTGATGGAG3’。PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μl，Mg²⁺(25mM)1.5μl，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl，dNTP(10mMeach)0.5μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.125μl，DNA模板1μl，无菌双蒸水17.375μl，共计25μl。检测epsps、ZmsPLA2-2正义基因的PCR反应程序：预变性95℃5min；变性95℃1min，退火56℃1min，延伸72℃1min，循环35次；过度延伸7min。检测ZmsPLA2-2反义基因的程序：预变性95℃5min；变性95℃1min，退火56℃1min，延伸72℃65s，循环35次；过度延伸7min。

T2代植株除套袋自交结籽外，继续采用PCR技术检测外源基因，优良株系采用Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高光效高产株系进入生物安全性试验和玉米育种实验。

生物量测定方法为：选取T2代转基因种子和对照自交系(WT)种子播于大小一致的塑料盘中，盘中装有等量的质地均匀蛭石，每盘播种20粒，每株系每盘种5粒，4次重复。待植株长至3叶期，观察植株生长状态。漂洗根系，对植株照相。然后将根系和地上部分分别收集，80℃烘箱烘干至恒重后称重。

6)转基因植株后代抗旱性测定

转基因植株苗期干旱胁迫处理：选取大小均匀的T2代转基因种子和受体自交系种子播种于大小一致的塑料盘中，盘中装有等量的质地均匀的壤土，每盘播种20粒，每株系至少种3盘。正常浇水，待小苗长至3叶期，选取长势一致的塑料盘进行抗旱性观察试验。干旱胁迫处理的方法是一次性浇足水分后停止浇水，一直到多数株系的植株叶片干枯、茎基部变软，再恢复浇水，观察各株系在恢复浇水后的生长状况。

转基因植株开花前干旱胁迫处理：玉米开花前干旱胁迫试验在自然条件下进行，胁迫处理期间避免植株淋雨。选取T2代转基因种子和受体自交系种子播种于大小一致的大花盆中，植株长至5叶期时，每盆留苗2株，即受体自交系1株，转基因小苗1株。植株在正常浇水条件下长至10叶，然后选取长势一致的玉米植株分为两组，一组处于干旱条件下生长，土壤绝对含水量保持在15-17％左右，持续处理一周，然后恢复正常浇水。另一组保持在充足浇水条件下生长，作为对照。每组设6次重复。干旱处理组在控水浇灌前期，植株在白天9～18时间叶片萎蔫，夜晚叶片恢复伸展；在控水浇灌后期，叶片持续萎蔫。恢复正常浇水一周后，植株开始抽雄。将植株控制浇水第1天(叶片在上午8时左右开始萎蔫)记为干旱胁迫处理0天，分别在处理的0、2、4、6、8天和恢复正常浇水一周后取样，测定RWC、细胞膜离子渗漏率、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量以及光合作用指标等。干旱处理后于开花期测量株高和绿叶数，统计开花及吐丝时间间隔(Anthesis-silkinginterval，ASI)。

经历8天干旱胁迫的玉米植株，恢复浇水一周后开始抽雄，在此期统计植株株高和持绿叶片数。在正常浇水条件下，转基因玉米植株的生长发育与未转基因对照自交系之间存在的表型差异不明显。

开花期前干旱胁迫处理8天，所有株系的平均株高均显著降低，但不同玉米株系之间降低的幅度不同。相比于正常浇水条件下的同系植株，ZmsPLA2-2正义基因株系株高的降低幅度(22.7％和22.6％)显著低于同条件下受体自交系的(28.7％)；而ZmsPLA2-2反义株系的株高降低幅度(35.1％和33.5％)显著高于同条件下受体自交系的。经历干旱胁迫后，不同株系之间持绿叶片数差异显著，转ZmsPLA2-2正义基因植株的绿叶数目明显高于受体自交系、转反义基因植株的。开花前的干旱胁迫对玉米植株的雌雄穗发育产生了深刻的影响。干旱处理后，所有玉米株系的开花时间推迟，造成了植株正常花粉数量降低和不育花粉数量升高，雌雄穗发育不协调。干旱胁迫对转ZmsPLA2-2正义基因植株开花-吐丝时间间隔的影响要小于对受体自交系的，而对ZmsPLA2-2反义植株ASI的影响要大于对受体自交系的。

在干旱胁迫后，受体自交系植株花粉量少，ZmsPLA2-2反义植株的与受体自交系类似，而转ZmsPLA2-2正义基因植株花粉量较多。取不同株系的花药采用碘-碘化钾方法染色进行细胞学观察，可看出受体自交系植株的花粉粒中仅有小部分被染为蓝色，大部分呈现浅黄褐色。被染为蓝色的花粉为富含淀粉的花粉，其生活力强，呈现黄褐色的花粉发育不良，授粉后结籽率较低。反义植株的花粉粒也是只有少部分被染为蓝色，大部分呈浅黄褐色。而转正义基因植株的雄穗能正常散粉，多数花粉形态正常，大部分被染为深蓝色。表明受体自交系和反义植株的花粉败育率高，而转正义基因植株在经过干旱胁迫处理后其花粉发育多数正常，生活力强。

测定转基因玉米和受体自交系在正常生长条件、干旱胁迫条件以及复水条件下的净光合速率和气孔导度，得出在胁迫6天时，转ZmPLA2-2正义基因株系的净光合速率降低为胁迫前的45.7～51.2％，显著高于同条件下受体自交系的；而ZmPLA2-2反义株系的净光合速率(为0天时的28.7～29.4％)低于同条件下受体自交系的。在整个干旱胁迫过程中，气孔导度的变化趋势同净光合速率的变化趋势相似，转ZmPLA2-2正义株系的气孔导度显著高于同条件下受体自交系和反义株系的。气孔导度下降导致CO₂供应减少，可能是干旱胁迫过程中光合作用下降的一个重要因素。此外，在恢复浇水7天后，所有株系的净光合速率和气孔导度都有所增加，其中转ZmPLA2-2正义基因株系的净光合速率和气孔导度仍高于同条件下受体自交系的。干旱胁迫下更强的光合能力和复水后更强的恢复能力表明转ZmsPLA2-2正义基因提高了植株抗旱能力。

防雨棚干旱处理试验：待玉米植株长至10叶期，控制防雨棚中的土壤相对含水量，维持其在50％-55％左右，使植株遭受干旱胁迫，持续6周后浇充足水分，让植株在正常栽培条件下发育成熟。观察干旱处理过程中不同株系植株的生长发育速率及形态差异。待果穗成熟后，对果穗性状进行观测统计，分析干旱胁迫后不同株系果穗性状及产量。结果表明，ZmsPLA2-2正义株系的平均穗长明显大于受体自交系的，ZmsPLA2-2反义株系的平均穗长显著小于受体自交系的。从单穗粒重来看，ZmsPLA2-2正义株系的单穗粒重明显高于受体自交系的，反义株系的单穗粒重明显低于受体自交系的，差异达到显著或极显著程度(P<0.05或P<0.01(n＝6))。其中一些转基因过表达株系比受体自交系增产30％以上，一些转基因抑制表达的株系单穗粒重比受体自交系减少40％以上。从百粒重来看，各转基因株系与受体自交系之间虽有差异，但达不到差异显著程度。从这些结果判断，转ZmsPLA2-2正义基因玉米对干旱胁迫表现出明显提高的抗性，生长和生殖器官发育受影响较小，从而籽粒产量显著高于受体自交系的。

本发明通过在玉米中过表达ZmsPLA2-2基因创造出抗旱性明显改善的玉米育种材料。

实施例2：转ZmsPLA2-2基因创造棉花耐旱新材料

1)ZmsPLA2-2基因转化载体的构建和农杆菌转化

将ZmsPLA2-2基因编码框与胁迫诱导型的启动子Prd29B或组成型启动子PCaMV35S融合，采用常规基因重组技术将融合基因插入到植物表达载体pCambia1300-PCaMV35S::bar中，分别产生转化载体pCambia1300-PCaMV35S::ZmsPLA2-2-PCaMV35S::bar和pCambia1300-Prd29B::ZmsPLA2-2-PCaMV35S::bar。然后采用氯化钙法制备根癌农杆菌菌株LBA4404的感受态细胞。取50μl感受态细胞悬液，在室温下加入1μg重组质粒DNA，混匀后冰浴30min，置液氮速冻1min，经37℃保温3min后，加入1mlYEP培养基摇匀，28℃下振荡(150rpm)培养3h。5000rpm离心3min收集菌体，加入100μlYEP液体培养基重悬，涂布于含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2-3d，待转化菌落长到合适大小，挑取单菌落进行培养和鉴定，挑选质粒稳定的LBA4404克隆用于棉花遗传转化。

2)棉花遗传转化

棉花种子经硫酸脱绒后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％升汞浸泡15min，然后用无菌水洗涤5遍。消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于30℃温箱中萌发。2-3天后下胚轴长到1-2cm，将萌发种子插到MS固体培养基中继续培养，取株高7～10cm小苗用于茎尖转化。

挑取LBA4404单克隆培养物，接种到加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的液体YEP培养基中于27℃、180rpm振荡培养。菌液用4000r/min离心5分钟，倒掉上清液，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到OD₆₀₀为0.8左右备用。在浸染前向此细菌悬液加入100μmol/L的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。

棉花小苗转化时，去掉种皮和一片子叶，裸露出小苗茎尖。若苗端已有小叶出现，则用镊子剥去。轻轻划伤顶端分生组织后，将蘸有农杆菌菌液的棉球(由灭菌脱脂棉制备)放到小苗顶端，然后将小苗置于真空干燥器中，辅以0.5×10⁵Pa的负压处理10-12分钟。浸染过的幼苗于21℃左右暗培养3天，然后在光下培养2～3天后移栽入花盆。花盆下部为壤土，上部为6～8cm厚的蛭石，隔天浇灌1/2MS无机盐溶液。

3)转化植株的筛选与PCR检测

转化小苗在花盆中生长1-2周后(长出1-2片新叶)，将蘸有0.1％草丁膦溶液的棉球置于小苗茎尖进行除草剂筛选，24小时后重复一次。约2周后统计存活植株。采用CTAB法微量提取存活植株基因组DNA，采用PCR扩增检测转基因是否存在，筛选出转基因植株。

4)转基因棉花的抗旱性检测

未转基因受体品种和转基因株系的T2代种子经过硫酸脱绒和0.1％升汞消毒后，在铺有三层滤纸的培养皿中于30℃培养箱中萌发。2-3天后下胚轴长到1-2cm，将萌发后的小苗转入装满Hogland营养液的体积约2升的塑料盒中继续培养，每盒培养16株植株。小苗长至3叶期时，营养液换为含有12％PEG6000的Hogland营养液进行渗透胁迫处理，观测植株生长状况。多数转基因株系的植株长势明显好于受体品种的，受害轻，表明转基因表达提高了棉花的抗渗透胁迫能力。

为了确定干旱胁迫后转基因株系与未转基因受体品种的表型及生长差异，将它们的种子播在同一个装满蛭石的无盖大盒子里。出苗后间苗，每株系保留2株，每天浇灌1/2MS营养液。四周后，停止浇营养液，进行干旱胁迫2周，统计植株叶片数和株高，然后轻轻的分离棉花根系，烘干后测定根和地上部的生物量。

蕾期和开花期是棉花对水分需求量比较大的关键时期。转基因株系与未转基因受体品种在蕾期和开花期的抗旱性检测以盆栽植株为材料进行，生长条件为昼/夜温度约20/35℃，大气相对湿度约40-55％。将同龄的不同基因型的小苗同期移栽到土壤一致的的花盆中，每盆1株，为1个重复。这些植株分为3组，每组每株系3盆。第一组在刚刚出现花蕾时，一次性浇足营养液，然后不再浇水，直至未转基因受体植株叶片发生严重萎蔫。在蕾期干旱胁迫处理前和胁迫处理后分别测定未转基因受体植株和转基因植株的叶片相对含水量、叶绿素含量、光合作用指标、可溶性糖和游离氨基酸含量以及细胞溶质势。第二组植株从第一朵花出现开始，每天控制浇水量，使土壤绝对含水量保持在16％左右，持续干旱胁迫3周，然后恢复正常浇水。第三组一直正常浇水，作为未处理对照。在干旱胁迫过程中，分别在干旱处理前、处理第7、14和21天时测定植株光合效率、气孔导度和蒸腾速率。在收获期测定株高，统计分支数、单株开花数、单株结铃数和籽棉产量。结果显示干旱胁迫不同程度地影响了各株系植株的分支数、单株开花数和结铃数；干旱胁迫后部分转基因植株的分支数比未转基因受体品种多15％-35％，差异达到显著水平；单株开花数比未转基因受体品种多5％-20％；干旱胁迫导致不同基因型棉花单株籽棉产量下降，而部分转基因株系仅下降了15％-20％，而同条件下的受体品种下降了30％以上。生理参数的测定也支持这些结果。

综合转基因棉花耐旱性检测结果，得出转ZmsPLA2-2基因创造出棉花耐旱新材料，这对提高干旱胁迫下棉花产量具有重要意义。

实施例3：转ZmsPLA2-2基因创造草地早熟禾耐旱新材料

草地早熟禾(PoapratensisL.)是温带地区最重要的草坪草草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方及中部地区、南方部分冷凉地区被广泛用作建坪草种。草地早熟禾也有其自身的缺点，如抗旱力不强、耐高温能力差、不耐炎热、易受病虫危害等，在盛夏季节生长停止，甚至部分死亡。这些缺点极大地制约了草地早熟禾在夏季炎热地区的广泛利用。由于草地早熟禾具有孤雌生殖的特性，采用常规育种技术改良这些不利性状难度大，成功率低，因此采用基因工程手段培育草地早熟禾新品种的工作受到国内外学者的重视。本发明通过转ZmsPLA2-2基因创造草地早熟禾耐旱种质。

1)转化载体的构建：遗传转化所用质粒的构建同实例1所示，选择标记基因也可为除草剂抗性基因als(抗除草剂氯磺隆)、bar(抗除草剂草丁膦)等。

2)草地早熟禾转化受体的建立:草地早熟禾种子经70％酒精2分钟、0.2％氯化汞14min灭菌，无菌水冲洗3～5遍，播于湿润的无菌滤纸上萌发。10～15d后转入诱导培养基(MS培养基+3mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)上诱导基部膨大，培养18d后转入丛生芽发生培养基(MS培养基+2mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)诱导形成丛生芽。丛生芽块转入继代培养基上继代培养。培养温度24±2℃，光强500～1000Lx，光照14h/d。为了使丛生芽块能长期继代培养，通过多种激素组合的比较试验得出：MS培养基+3mg/L6-BA+0.07mg/L2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂为适宜继代培养基。当2,4-D浓度较高时，丛生芽块基部产生愈伤化组织，分化小芽能力低。当2,4-D浓度较低时，小苗容易老化，不易产生新芽。即使在适宜继代培养基上，继代5次后的丛生芽块小苗老化，增生能力降低。要保持草地早熟禾丛生芽处于幼嫩状态，可在继代4～5次后将丛生芽分成单芽或者2～3mm小块接种在诱导培养基上诱导膨大，然后再转入丛生芽发生培养基上产生丛生芽块。取在继代培养基上暗培养5d左右的丛生芽块作为转化受体。

3)草地早熟禾丛生芽块遗传转化

挑取农杆菌(携带转化用质粒)单克隆培养物，接种到含有利福平25mg/L、卡那霉素50mg/L的液体YEP液体培养基中28℃下振荡(180r/min)培养至对数生长期。菌液4000r/min离心,倒掉上清液,菌体用液体培养基(改良MS培养基+2mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖)重悬，稀释浓度至OD₆₀₀＝0.6备用。在浸染前向此细菌悬液加入0.2％(终浓度)的乙酰丁香酮(AS)。将草地早熟禾丛生芽块切去叶片，剥除叶鞘，然后切成1mm左右的小芽块，并尽量暴露出芽尖分生组织，放入培养皿中，倒入农杆菌菌液，在0.05MP负压处理下浸染4-6min。倒出菌液后，用无菌滤纸吸干残留菌液，再将小芽块转入丛生芽发生培养基上在24±2℃暗培养3天。

将共培养后的芽块转到加有100mg/L头孢霉素的丛生芽发生培养基上抑制农杆菌生长，10d后再将丛生芽块分成单芽置于含有0.1-0.2％除草剂草丁膦(浓度因基因型不同而有较大差异)的丛生芽发生培养基上筛选抗性小芽，连续筛选3代，每代筛选15d。筛选3代后获得的抗性小苗转入丛生芽发生培养基上进行恢复和增殖培养。然后转入生根培养基中，约8～15d后长出根。当根生长到2～5cm长时，放在自然光下培养1～2d，去掉封口膜炼苗1～2d后移栽入花盆。花盆下部为土壤，上部为6～8cm厚的蛭石，每5d浇一次1/2MS营养液，隔天浇水一次。移栽成活率为95％～99％。成活2月后取叶片进行PCR检测。

4)转化植株的分子检测

用CTAB法提取草地早熟禾再生植株叶片DNA，以后者为模板进行PCR反应检测转基因。对转基因植株进行分株繁殖或姊妹交结籽。无性克隆苗或子代小苗继续喷洒除草剂草丁膦(0.15％浓度)进行筛选，抗性植株采用PCR检测转基因、RT-PCR测定转基因表达水平，选出转基因表达水平高的植株进行分株繁殖。后者用于抗性检测实验。

5)转基因株系的抗旱性检测

将稳定的转基因株系和受体品种的植株进行克隆，选取大小相近的小苗分别移栽到大小一致的小花盆中，在适宜条件下生长。当植株产生3-4个分蘖时，将它们分成2组，每株系每组8盆，以受体品种的小苗为对照材料。一组保持正常浇水，一组停止浇水进行持续干旱。在干旱胁迫15天后恢复浇水，统计植株成活率。在干旱处理期间，分别在处理1、3、7、15天取样测定叶绿素含量，观察植株萎蔫及干枯程度。根据成活率和植株在干旱处理及复水过程中的变化，确定植株的抗旱性。经过比较分析，本发明从12个稳定的转基因株系中筛选出3个抗旱性比受体品种显著提高的株系。

Claims

1.玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2的cDNA序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花，或早熟禾，或牧草；所述改变植物抗旱性是指提高或降低植物的抗旱性。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以正义形式或反义形式构建的融合基因。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在提高植物抗旱性中的应用方法是：从玉米中克隆ZmsPLA2-2基因，构建用于植物转化的表达载体，利用转基因技术获得转基因植株，通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。