CN101736014A - 水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，属于基因工程领域。水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的核苷酸序列及其表达OsPIN2蛋白氨基酸序列在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号为AK101191。该基因的工程应用为水稻中的首次报道，参与水稻生长素的运输，增大水稻根系、分蘖数、分蘖角度、氮素利用效率以及最终产量。

Description

水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用

技术领域

本发明公开了水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，属于基因工程技术领域，具体地讲涉及水稻中编码生长素运输蛋白及其调控的基因应用。

背景技术

氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中很多生命物质的组成成分，比如：氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干重的1.5-2％和植物总蛋白的16％(Frink CR.，Waggoner PE.and Ausubel JH.Nitrogen fertilizer：retrospect and prospect.Proc.Nati.Acad.Sci.USA.1999.96：1175～1180.)。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30％(彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh，Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002，35(9)：1095～1103.)，成为世界第一大消费国。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70％。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。水稻虽然喜铵作物，但是已经有研究表明一定量的硝态氮能够促进水稻对铵的吸收，而且在水稻生长发育的后期田里和旱作水稻主要以硝态氮为主。

水稻的根系发育受硝酸盐调控，其中主要硝酸盐促根系生长的机制是硝酸盐调控了生长素的运输分布。研究表明细胞和细胞之间的IAA极性运输是IAA运输蛋白来完成的。其中IAA内流运输蛋白有AUX1和LAX(AUX1-like)基因家族，外流运输蛋白基因有PIN基因家族(Eiichi.Regulation of rootgrowth by plant hormones-roles for auxin and gibberelin.Critical Reviews in Plant Science，2005，24(4)：249-265.)。拟南芥PIN1突变体对IAA的运输能力下降且不能形成正常的花序(Okada K，JunichiU，Komaki MK，Bell CJ and Shimura Y.Requirement of the Auxin Polar Transport System in Early StagesofArabídopsis Floral Bud Formation.The Plant Cell，1991，3(7)：677-684.)，PIN2突变体导致根系向重力性消失(Muller A，Guan CH，Galweiler L，Tanzler P，Huijser P，Marchant A，Parry G，Bennett M，Wisman M and Palme K.AtPIN2defines a locus of Arabidopsis for root gravitropism control.The EMBOJournal.1998，17(23)：6903-6011.)水稻中OsPIN1在植株的地上地下部均有表达，而OsPIN2只在根尖及根茎结合处表达(Wang JR，Hu H，Wang GH，Li J，Chen JY and Wu P Molecular Plant.Expression ofPIN Genes in Rice(Oryza sativa L.)：Tissue Specificity and Regulation by Hormones.2009，2(4)：823-831.)。通过转基因的方法过量或抑制表达OsPIN1都要会导致水稻根冠比的变化(XuM，Zhu L，Shou H and Wu P.Plant Cell Physiol.A PIN1family gene，OsPIN1，involved in auxin-dependentadventitious root emergence and tillering in rice.2005，46(10)：1674-1681.)，但并未报道对氮素利用效率及产量性状的改善。本发明首次公开了过量表达生长素运输蛋白基因OsPIN2对水稻根系、株型的调控有很大作用，能够提高水稻对氮肥的利用率、改善水稻株型、增加水稻的产量。

发明内容

技术问题：

本发明的目的旨在提供水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，该基因在水稻中过量表达可以增大水稻根系、分蘖数量、分蘖角度、氮素利用效率和最终水稻产量。

技术方案

本发明提供了水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，基因登录号是AK101191，该基因在调节作物根系发育，分蘖数目、分蘖角度，提高氮肥利用效率及最终产量方面的应用。包括：

1)总RNA的提取水稻日本晴种子经质量比30％NaClO消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2国际水稻所IRRI营养液中，四叶一心时换为国际水稻所IRRI全营养液，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂，加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1‰)，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；

2)总cDNA合成每个RNA样品2μg，加入50μmolL^-1Oligo dT18，加1‰DEPC水补足10μL，70℃下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor 0.5μL和5xRT buffer 5μL，10mM dNTP2.5μL，M-MLV反转录酶1μL，1‰DEPC水补足25μL，42℃水浴60min后，70℃水浴10min终止反应；

3)OsPIN2基因的cDNA全长的获得

用以上获得的水稻日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框(从起始密码子ATG至3’端非编码区)，引物序列为：

PIN2-F：5’-ATGATCACCGGACGCGACATC-3’；

PIN2-R：5’-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3’

PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为2203bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与pMD-19载体连接，酶连体系总体积10μL，包含5μL连接液，1μL的pMD-19载体，3-4μL的PCR纯化产物，用水补足10μL，然后16℃连接过夜；

再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有安苄100μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsPIN2基因登录号为AK101191，OsPIN2的cDNA全长序列包括开放阅读框(ORF)1896bp及3’端非编码区UTR 307bp；将测序正确的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存备用，获得含有目的基因OsPIN2 cDNA全长序列的重组质粒，命名为pPIN2inT；

4)超量表达载体pUbi-PIN2的构建

根据水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框(从起始密码子ATG至终止密码TAG)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为：

overPIN2-F：5’-CTGAGGATCC ATGATCACCGGACGCGACATC-3’BamHI

overPIN2-R：5’-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT-3’BamHI

用以上获得的pPIN2inT质粒为模板，PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为2200bp。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI进行单酶切，同时用BamH I单酶切植物过量表达载体pCAMBIA 1390-ubi质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamH I酶切验证片段大小无误后，并经过BglII单酶切找出以正向连入表达载体的克隆，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，提取阳性克隆质粒命名为pUbi-PIN2；

最后通过电击法将pUbi-PIN2质粒转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μgmL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamH1单酶切验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用；

5)转基因植株的获得

侵染愈伤组织和共培养：将水稻愈伤组织从继代培养基中挑出放入离心管中，取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心1min，去上清，用含200μmolL^-1乙酰丁香酮As的30ml感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60小时；

洗菌和抗生素筛选培养：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水清5次，每次不停的振荡5min，再用含500mgL^-1羧苄青霉素car的无菌水浸泡40-60min，最后置于无菌滤纸上沥干2h，第一轮筛选：将晾干的愈伤组织转入含250mgL^-1羧苄青霉素car和50mgL^-1潮霉素Hyg的选择培养基上进行第一次选择，30℃，光照培养14d；第二轮筛选：将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含250mgL^-1羧苄青霉素car和80mgL^-1潮霉素Hyg的选择培养基上，30℃，光照培养10d然后转移到组培室中培养4d；

抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入装有分化培养基的分化灌中，放入恒温培养室中，组培室培养条件为24-30℃，14h光/8h暗，待苗长至5cm，放入生根培养基中壮苗；

剪取并收集待检测苗1cm长的新鲜绿色叶片，平放于含潮霉素80mgL^-1培养基上，30℃，16h/8h光/暗培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死，通过潮霉素筛选得到阳性T0植株；

T0代种子发芽后得到T1代转基因苗，提取转基因T₁代苗不同株系的根部和叶片的总RNA，反转录总cDNA，采用引物AK101191，F：5′-ATATTGTCAGATGCAGGGCTAG-3′，R：5′-TCCTACTTGATCTCATTTCCC-3′进行半定量PCR鉴定，结果具有495bp条带的，即为得到的稳定遗传的转基因株系。

有益效果：

1、通过系统研究，首次提供了水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的生物学功能，发现超表达植株具有更强大的根系与分蘖能力(图6)。

2、利用特异引物研究OsPIN2在水稻中的表达，发现OsPIN2只在根部表达(图1)，将OsPIN2超表达后提高了氮素利用效率(表1)。

3、OsPIN2超表达后增大了水稻的分蘖数目与分蘖角度，有利于改善水稻株型使产量得到提高(表1)。

Reed等(1998)研究发现，地上部产生的IAA向根中的运输对于侧根的生长具有重要作用。利用特异引物发现OsPIN2只在根部表达，在叶片中不表达或表达量很低(图1)。通过转基因手段获得的OsPIN2超表达材料使得OsPIN2不仅在根系表大量增加并且在叶片中也发生表达(图2)，由此使水稻植株体内生长素的运输分配发生变化，转基因材料(O8)获得了更强大的根系(图6)，有利于水稻对养分尤其是氮素的吸收和利用，提高氮素利用效率。此外，转基因材料(O8)平均分蘖数为53，与野生型相比分蘖数提高60％(表1)；分蘖角度也比野生型增大(图3)。分蘖力和分蘖角度是影响水稻株型的两个最重要的因素。其中茎蘖数的多少，决定了叶面积指数、穗数及单株有效穗；分蘖角度，影响到株内和株间对光、气等条件的竞争，对水稻的产量、抗性等也具有一定的影响。本发明公开的OsPIN2超表达材料(O8)与野生相比产量提高25％(表1)，有可能是由于OsPIN2在地上地下部超表达使水稻株型得到一定改善，从而使产量得到提高。

附图说明

图1：OsPIN2在水稻不同部位(叶片，根)表达特征。

1：叶片2：根

图2：T2代OsPIN2超表达材料(O8、O13、O14)的分子鉴定，三个超表达株系(O8、O13、O14)不仅在根部OsPIN2表达量比野生型强，而且在叶片中也获得了OsPIN2的表达。

图3：T2代OsPIN2超表达材料(O8)与野生型(日本晴)相比分蘖角度增大。

图4：T2代OsPIN2超表达材料(O8)与野生型(日本晴)相比分蘖数目提高，相对于野生型分蘖数目增大60％。

图5：T2代OsPIN2超表达材料(O8)与野生型(日本晴)相比产量提高25％，左侧是单株T2代OsPIN2超表达材料收获得到的种子，右侧是同时种植的日本晴野生型单株收获的种子。

图6：T2代OsPIN2超表达材料与野生型(日本晴)，从左至右依次为日本晴野生型、OsPIN2超表达材料(O8)的三株苗(种子收获后)。

具体实施方式

(一)OsPIN2基因(登录号为AK101191)在水稻中表达特征

1)总RNA的提取 水稻日本晴种子经质量比30％NaClO消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2国际水稻所IRRI营养液中，四叶一心时换为国际水稻所IRRI全营养液(Mao D R.The methods of plant nutrition research.Beijing：Beijing AgriculturalUniversity Press，1994.)，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂，加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1‰)，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；

2)总cDNA合成 每个RNA样品2μg，加入50μmolL^-1 Oligo dT18，加1‰DEPC水补足10μL，70℃下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor 0.5μL和5xRT buffer 5μL，10mM dNTP 2.5μL，M-MLV反转录酶1μL，1‰DEPC水补足25μL，42℃水浴60min后，70℃水浴10min终止反应(OligodT18由南京金思瑞公司合成；反转录试剂盒购自Fermentas公司，Canada)。

3)半定量PCR 反合成总cDNA第一链后，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL，包含10pmolL^-1正反向引物各1μL，10xPCR buffcr 2μL，2.5mM dNTP1.6μL，Taq酶0.4μL，然后用灭菌水补足20μL(引物由南京金思瑞公司合成；PCR试剂购自Takara公司，大连)。加模板量因其浓度不同而不同，由内参基因水稻细胞骨架蛋白基因(OsActin)的量来校正，基因OsActin与OsPIN2的PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃7min，扩增的PCR产物通过质量比为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。通过澳化乙淀(EB)染色后，在凝胶成像系统成像。基因的序列号和引物设计如下表：

R：5′-TCCTACTTGATCTCATTTCCC-3′

*：参考文献，Xiaorong Fan，Lijun Jia，Yilin Li，Susan J.Smith，Anthony J Miller and Qirong Shen，2007Comparing nitrate storage and remobilization in two rice cultivars that differ in their nitrogen useefficiency，Journal of Experimental Botany 58(7)：1729-40

通过对该基因在水稻不同部位(叶片，根)进行表达分析发现OsPIN2只在根中表达，而在叶片中不表达或表达量很低(图1)。

(二)OsPIN2基因的超量表达植株

1)OsPIN2基因的cDNA全长的获得

用以上获得的水稻日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框(从起始密码子ATG至3’端非编码区)，引物序列为：

PIN2-F：5’-ATGATCACCGGACGCGACATC-3’；

PIN2-R：5’-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3’

PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为2203bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与pMD-19载体连接，酶连体系总体积10μL，包含5μL连接液，1μL的pMD-19载体，3-4μL的PCR纯化产物，用水补足10μL，然后16℃连接过夜；

再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Smith RL，Banks JL，Snavely MD and Maguire ME.Sequenceand topology of the CorA magnesium transport systems of Salmonella typhimurium and Escherichia coli.Identification ofa new class oftransport protein.J Biol Chem.1993，268(19)：14071-80.)，涂在含有安苄100μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsPIN基因在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号为AK101191，，OsPIN2的cDNA全长序列包括开放阅读框(ORF)1896bp及3’端非编码区UTR 307bp；将测序正确的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存备用，获得含有目的基因OsPIN2cDNA全长序列的重组质粒，命名为pPIN2inT；

2)超量表达载体pUbi-PIN2的构建

根据水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框(从起始密码子ATG至终止密码TAG)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为：

overPIN2-F：5’CTGAGGATCC ATGATCACCGGACGCGACATC-3’(BamHI_)

overPIN2-R：5’-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT-3’(BamHI_)

用以上获得的pPIN2inT质粒为模板，PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为2200bp。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后，切胶回收(凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司)，回收产物用限制性内切酶BamH I(Takara公司，大连)进行单酶切。将过量表达载体pCAMBIA1390-ubi质粒(Chen TL，Lin Y L，Lee YL，Yang NS Chan MT.Expression ofbioactive human interferon-gamma in transgenic rice cell suspension cultures.TransgenicResearch.2004，13：499-510)用BamH I(Promega公司)进行单酶切。然后分别回收酶切后的PCR片段和过量表达载体，将载体进行去磷酸化后(去磷酸化酶购自Takara公司)再次回收。回收后通过T4连接酶(Promega公司)将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素(50μgmL^-1)的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamH I酶切验证片段大小无误后，并经过Bgl II(Takara公司)单酶切找出以正向连入表达载体的克隆，将该菌液送南京金思瑞科技有限公司进行DNA测序，将测序正确的克隆菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，提取阳性克隆质粒命名为pUbi-PIN2。最后通过电击法将pUbi-PIN2质粒转化至根癌农杆菌菌株EHA 105(Xu M，Zhu L，Shou H and Wu P.A PIN1family gene，OsPIN 1，involved in auxin-dependent adventitious root emergence and tillering in rice.Plant Cell Physiol.2005Oct，46(10)：1674-81.)的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素(均为50ugmL^-1)的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamH1单酶切验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用。

3)转基因植株的获得

为了避免转基因过程产生的植物细胞质基因突变，我们进行了不同批次的转基因实验。分别于2006年12月-2007年2月和2007年12月-2008年2月将以上获得的转有pUbi-PIN2质粒的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养3天，经过抗性愈伤组织的选择培养、分化、生根、炼苗得到不同年份不同批次的T0代转基因植株。为了避免植株性状的改变是由于非基因组插入导致的细胞质嵌合体造成的，我们在对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料，并对稳定遗传的T2代材料进行的生理测定。

3.1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；Car(Carbenicillin，羧苄青霉素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-(N-Morpholino)EthaneSulfonic Acid)；N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份)。

3.2)溶液与培养基配方

1)N6培养基母液每升含量(20倍)：

                                            

KNO₃                     56.6g

CaCl₂·2H₂O              3.32g(相当于CaCl₂ 2.506g)

MgSO₄·7H₂O              2.70g

KH₂PO₄                   8.0g

(NH₄)₂SO₄                9.26g

                                            

2)B5微量母液每升含量(100倍)：

                                            

KI                       0.0750g

H₃BO₃                    0.30g

MnSO₄·H₂O               1.0g

ZnSO₄·7H₂O              0.2g

Na₂MoO₄·2H₂O            0.025g

CuSO₄·5H₂O              0.0025g

CoCl₂·6H₂O              0.0025g

                                          

3)有机母液：

                                          

烟酸(Nicotinic acid)     1mg/ml

盐酸吡哆醇(VB₆)          1mg/ml

盐酸硫胺素(VB₁)          10mg/ml

肌醇(myo-Inositol)       10mg/ml

                                          

4)铁盐(100倍)：

                                          

FeSO₄·7H₂O              2.78g

                                          

                                          

Na₂EDTA·2H₂O            3.73g

                                          

5)AA大量元素母液(每升含量)：

                                          

KCl                      2.95g

CaCl₂·2H₂O              0.15g

MgSO₄·7H₂O              0.25g

NaH₂PO₄·2H₂O            0.15g

                                          

6)诱导愈伤组织与继代培养基(每升含量)：

7)水稻愈伤组织与农杆菌共培养培养基(每升含量)：

8)抗性愈伤组织选择培养基(每升含量)：

9)分化培养基配方(每升含量)：

10)生根培养基配方(每升含量)：

11)感菌液配方(每升含量)：

12)农杆菌生长的YEP液体培养基配方(每升含量)：

                                          

酵母提取物               10g

蛋白胨                   10g

NaCl                     5g

pH                       7.0

                                          

3.3)农杆菌介导的水稻转化

诱导愈伤组织：去皮的水稻种子(一盘14粒)入三角瓶，用70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉70％乙醇，用30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。

继代培养：选择小米粒大小的黄色有韧性的脱落下来的愈伤组织，用灭菌的镊子转移到继代培养基生长7-14d。

农杆菌的准备：挑取转有pUbi-PIN2质粒的农杆菌EHA105原液20μL，接种于5ml含50mgL^-1链霉素和50mgL^-1卡那霉素的YEP(Sambrook，etal.分子克隆实验指南.2001)液体培养基中，28℃振荡过夜。取活化菌液500μL，接种于5ml含相同抗生素新鲜的YEP培养基中，继续培养至菌液在600nm波长处的吸光值(OD600)0.8-1.0。

侵染愈伤组织和共培养：将水稻愈伤组织从继代培养基中挑出放入离心管中，愈伤组织的数量量没过50ml离心管锥形部位即可(选择淡黄圆润有韧性的愈伤组织)。取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心1min，去上清。用含200μmolL^-1乙酰丁香酮(As)的30ml感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min。倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min。将愈伤组织置于共培养培养基上(上面垫上一层9cm无菌滤纸)，25℃暗培养60小时。

洗菌和抗生素筛选培养：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水清5次，每次不停的振荡5min。再用含500mgL^-1羧苄青霉素(car)的无菌水浸泡40-60min。最后置于无菌滤纸上沥干2h。第一轮筛选：将晾干的愈伤组织转入含250mgL^-1羧苄青霉素(car)和50mgL^-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上进行第一次选择，30℃，光照培养14d；第二轮筛选：将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含250mgL^-1羧苄青霉素(car)和80mgL^-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上，30℃，光照培养10d然后转移到组培室中培养4d。

抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入装有分化培养基的分化灌中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(30d左右，组培室培养条件为24-30℃，14h光/8h暗)，待苗长至5cm左右，放入生根培养基中壮苗。

转基因苗的锻炼和移栽：将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3d至7d左右，然后洗去琼脂，移栽到温室进行水培或土培生长、检测。

3.4)潮霉素快速检测转基因幼苗得到T0代植株

剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片(两端均留有切口)，平放于含潮霉素(80mgL^-1)培养基上，30℃，16h/8h(光/暗)培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死(郑晔.水稻高效转基因体系的建立及其应用.2008)。通过潮霉素筛选得到阳性T0植株120个株系。2007年4月到11月和2008年4月到11月南京农业大学牌楼温网室进行对超表达材料的种植得到T0代种子。

3.5)OsPIN2超表达株系的分子鉴定

T0代种子发芽后得到T1代转基因苗，提取转基因T₁代苗不同株系的根部和叶片的总RNA，反转录总cDNA，进行半定量鉴定(总RNA的提取，总cDNA的合成，半定量PCR方法同“OsPIN2基因在水稻中表达特征”)，得到稳定遗传的O8、O13、O14转基因株系(图2)。

3.6)超表达株系的扩繁及生理测定

2008年4月到11月和2009年4月到11月南京农业大学牌楼温网室进行对超表达材料的扩繁，得到植株性状稳定遗传的T2代材料。

观察T1代和T2代转基因水稻与野生型水稻的生长差异。从表1可以看出OsPIN2超表达材料比野生型产量提高29％，氮素吸收量比野生型高5倍。

表1.T₂代OsPIN2超表达材料(O8)与野生型表型差异

表型	O8	WT
			单株分蘖数	60a	26b
单株产量(g)	28.8a	22.3b
			植株总氮(mg)	948.7a	189.3b

注释：a，b为极显著差异

综上所述，本发明人提供的OsPIN2基因是首次在水稻中验证其生物学功能，发现它参与生长素运输，影响水稻分蘖角度。该基因在水稻中过量表达可以增大水稻根系、分蘖数量、分蘖角度、氮素利用效率和最终水稻产量。可利用本发明OsPIN2基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

本发明中应用的OsPIN2基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，该基因除了可应用于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等，更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

序列表

<110>南京农业大学

<120>水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用

<130>说明书

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>OsPIN2半定量F

<222>(1)..(22)

<223>

<400>1

atattgtcag atgcagggct ag                                    22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>OsPIN2半定量R

<222>(1)..(21)

<223>

<400>2

tcctacttga tctcatttcc c                                     21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>PIN2-F

<222>(1)..(21)

<223>

<400>3

atgatcaccg gacgcgacat c                                     21

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>PIN2-R

<222>(1)..(23)

<223>

<400>4

ggaatcttta gtaccgccaa ccc                                   23

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>overPIN2-F

<222>(1)..(31)

<223>

<400>5

ctgaggatcc atgatcaccg gacgcgacat c                          31

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>overPIN2-R

<222>(1)..(31)

<223>

<400>6

gtcaggatcc tcctacttga tctcatttcc c                          31

Claims (4)

1.水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用。

2.根据权利要求1所述的水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，其特征在于：该基因在调节作物根系发育，分蘖数目、分蘖角度，提高氮肥利用效率及最终产量方面的应用。

3.根据权利要求1或2所述的水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用，其特征在于：

1)总RNA的提取  水稻日本晴种子经质量比30％NaClO消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2国际水稻所IRRI营养液中，四叶一心时换为国际水稻所IRRI全营养液，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂，加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1‰)，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；

2)总cDNA合成  每个RNA样品2μg，加入50μmolL^-1 Oligo dT18，加1‰DEPC水补足10μL，70℃下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor 0.5μL和5xRT buffer 5μL，10mM dNTP2.5μL，M-MLV反转录酶1μL，1‰DEPC水补足25μL，42℃水浴60min后，70℃水浴10min终止反应；

3)OsPIN2基因的cDNA全长的获得

用以上获得的水稻日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框，引物序列为：

PIN2-F：5’-ATGATCACCGGACGCGACATC-3’；

PIN2-R：5’-GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3’

PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为2203bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与pMD-19载体连接，酶连体系总体积10μL，包含5μL连接液，1μL的pMD-19载体，3-4μL的PCR纯化产物，用水补足10μL，然后16℃连接过夜；

再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有安苄100μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsPIN2基因登录号为AK101191，OsPIN2的cDNA全长序列包括开放阅读框ORF 1896bp及3’端非编码区UTR 307bp；将测序正确的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存备用，获得含有目的基因OsPIN2 cDNA全长序列的重组质粒，命名为pPIN2inT；

4)超量表达载体pUbi-PIN2的构建

根据水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPIN2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为：

overPIN2-F：5’-CTGAGGATCC ATGATCACCGGACGCGACATC-3’BamHI

overPIN2-R：5’-GTCAGGATCCCTATATCCCAAGAAGCACATAGT-3’BamHI

用以上获得的pPIN2inT质粒为模板，PCR程序如下：94℃预变性4min，98℃变性10s，68℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为2200bp，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI进行单酶切，同时用BamH I单酶切植物过量表达载体pCAMBIA1390-ubi质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamH I酶切验证片段大小无误后，并经过Bgl II单酶切找出以正向连入表达载体的克隆，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，提取阳性克隆质粒命名为pUbi-PIN2；

最后通过电击法将pUbi-PIN2质粒转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μgmL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamH1单酶切验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用；

5)转基因植株的获得

侵染愈伤组织和共培养：将水稻愈伤组织从继代培养基中挑出放入离心管中，取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心1min，去上清，用含200μmolL^-1乙酰丁香酮As的30ml感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60小时；

洗菌和抗生素筛选培养：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水清5次，每次不停的振荡5min，再用含500mgL^-1羧苄青霉素car的无菌水浸泡40-60min，最后置于无菌滤纸上沥干2h，第一轮筛选：将晾干的愈伤组织转入含250mgL^-1羧苄青霉素car和50mgL^-1潮霉素Hyg的选择培养基上进行第一次选择，30℃，光照培养14d；第二轮筛选：将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含250mgL^-1羧苄青霉素car和80mgL^-1潮霉素Hyg的选择培养基上，30℃，光照培养10d然后转移到组培室中培养4d；

抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入装有分化培养基的分化灌中，放入恒温培养室中，组培室培养条件为24-30℃，14h光/8h暗，待苗长至5cm，放入生根培养基中壮苗；

剪取并收集待检测苗1cm长的新鲜绿色叶片，平放于含潮霉素80mgL^-1培养基上，30℃，16h/8h光/暗培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死，通过潮霉素筛选得到阳性T0植株；

T0代种子发芽后得到T1代转基因苗，提取转基因T₁代苗不同株系的根部和叶片的总RNA，反转录总cDNA，采用引物AK101191，F：5′-ATATTGTCAGATGCAGGGCTAG-3′，R：5′-TCCTACTTGATCTCATTTCCC-3′进行半定量PCR鉴定，结果具有495bp条带的，即为得到的稳定遗传的转基因株系。

4.权利要求3所述应用获得的含有目的基因OsPIN2 cDNA全长序列的重组质粒pUbi-PIN2。

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