CN103408646B - 香蕉ERF转录因子MaERF及表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香蕉ERF转录因子MaERF及其表达载体，香蕉ERF转录因子MaERF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过一系列实验获得的香蕉MaERF基因通过实时荧光定量PCR发现可以被尖胞镰刀菌4号小种和低温胁迫诱导高表达，表明该基因可能参与了香蕉的抗逆应答。该基因转化拟南芥，表型并没有明显的变化，但是通过低温和干旱实验表明，转化植株的抗逆性有所提高为研究香蕉对胁迫的响应机理和提高其抗逆性品种的转基因培育奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。

Description

香蕉ERF转录因子MaERF及表达载体

技术领域

本发明涉及香蕉中ERF转录因子基因MaERF的克隆、重组及对逆境胁迫反应功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

乙烯应答因子结合蛋白(ethylene responsive factor binding protein，ERF)是AP2/ERF转录因子超家族的一个亚家族，是植物特有的一类转录因子，特征是其蛋白序列中含有一个高度保守由58或59个氨基酸组成的ERF结构域，此类转录因子广泛参与植物生长发育及应对各种逆境胁迫反应的调控。

ERF亚家族的B2亚群主要与植物抗逆性有关，水稻被稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)侵染OsBIERF1、OsBIERF3、OsBIERF4和OsEBP2等ERF基因的表达被诱导。多数ERF基因过量表达后，能增强病害的抗性；烟草中过量表达OsBIERF3可增强其对多种病害的抗性；烟草中的ERF转录因子Tsil可以被干旱、水淹和盐胁迫诱导表达；Tsil的过量表达，可以提高植株对高盐和病原菌的抗性；茶树ERF基因受低温、乙烯、脱水、NaCl等上调表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供香蕉ERF转录因子MaERF及表达载体。

本发明的技术方案如下：

本发明通过构建香蕉野生型和突变体的抑制差减杂交(SSH)文库筛选到一个AP2/EREBP基因片段，通过RACE技术获得该基因全长，同源比对发现，该基因与已知的两个香蕉ERF基因具有较高的同源性，系统进化树分析表明，该基因属于ERF亚家族的B2亚群，而该亚群均在AP2/ERF结构域的5端含有一个内含子，与该基因结构相符，由此可以推断获得的序列为一个新的香蕉ERF基因。

本发明获得的香蕉MaERF基因通过实时荧光定量PCR发现可以被尖胞镰刀菌4号小种和低温胁迫诱导高表达，表明该基因可能参与了香蕉的抗逆应答。该基因转化拟南芥，表型并没有明显的变化，但是通过低温、干旱和盐碱实验表明，转化植株的抗逆性有所提高。

附图说明

图1：MaERF的cDNA全长扩增结果；

图2：转MaERF基因拟南芥的抗性筛选(潮霉素25mg/L)；

图3：转MaERF基因拟南芥的PCR检测；M为DNA Marker DL2000；1为野生型拟南芥；2-11为抗性植株；

图4：转基因拟南芥的RT-PCR分析；M为DNA Marker DL2000；1为野生型拟南芥；2-7为阳性植株；

图5：转基因拟南芥与野生型拟南芥的耐寒性分析；W为野生型拟南芥，T为转基因拟南芥；

图6：转基因拟南芥与野生型拟南芥的耐旱性分析；W为野生型拟南芥，T为转基因拟南芥；

图7：转基因拟南芥与野生型拟南芥的耐盐性分析；W为野生型拟南芥，T为转基因拟南芥。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：香蕉基因的克隆方法

1、总RNA的提取：

(1)取1ml CTAB提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；

(2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；

(3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；

(4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3；

(5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4℃沉淀过夜；

(6)4℃，10000rpm离心30min；

(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；

(8)将沉淀溶解在100μl STE(65℃预热)中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；

(9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀2h；

(10)4℃，10000rpm离心20min；

(11)沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20μl RNase-free水溶解；

2、MaERF基因的克隆

利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用。

(2)设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物：5’AGCAGTGGTATCAACGCAGAG3’；

3’端引物：5’GCTTAAGCACATTAATCATT3’；

(3)根据引物的Tm值进行PCR扩增，PCR体系及条件为：

表1

94℃5min；94℃30sec，64℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保存；

将获得的产物(图1)连接到克隆载体，经PCR和酶切鉴定后进行测序。

(4)序列分析与同源检索：获得全长的cDNA为1611bp(SEQ ID NO：1)，包括部分起始密码子前的5’UTR和终止密码子后的3’UTR。开放阅读框部分为1128bp，由此推得具375个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，MaERF的AP2/ERF保守域序列与其他ERF转录因子的AP2/ERF保守域序列具有较高的一致性，但是全长氨基酸序列的一致性有限。除了与香蕉ERF3、ERF2(Musa acuminata，MaERF3AFP25470，MaERF2，AFP25469)一致性为65％，53％外，与拟南芥(Arabidopsisthaliana，AtRAP2-12，NP175794)、玉米(Zea mays，ZmERF，ACG32553)、小麦(Triticumaestivum，TaERF，AFP49824)、水稻(Oryza sativa，OsERF，AAF05606)、大豆(Glycinemax，GmERF，XP003528732)ERF氨基酸序列相似性分别为35％、45％、42％、46％，42％。

实施例2：香蕉MaERF基因在逆境胁迫下的表达

病原菌胁迫：香蕉组培袋装苗注入一定量的尖胞镰刀菌4号小种孢子液，分别在处理6，12，24，48，72，96h，剪取根并用液氮迅速冷冻，-80℃保存备用。

低温胁迫：香蕉组培袋装苗在放入4℃条件下，分别在处理1，3，6，12，24，48，72h，剪取根，叶并用液氮迅速冷冻，-80℃保存备用。

利用实时荧光定量PCR仪对各胁迫取样点的cDNA模板进行实时荧光定量PCR分析。正向引物5’CGATCATTTCCGACCTCATT3’，反向引物为5’CCGCTCCTCCTCTTCTTCTT3’。

结果显示，尖胞镰刀菌4号小种侵染后，MaERF基因在根部的表达在72内持续升高，最高为未处理的6.5倍，72h后又开始下降(表2)。4℃处理香蕉组培苗，其根表现为1h MaERF的表达量就有明显升高，24h后开始降低；叶片表现为1h开始升高，12h达到最大值，之后开始降低(表3、4)。表明该基因的表达可受逆境条件诱导。

表2尖胞镰刀菌4号小种侵染不同时间MaERF基因在根部的表达量比较

处理时间	0	12	24	48	72	96
							相对表达量	0.327667	1.001	2.442333	3.022333	3.196667	0.662

表34℃处理不同时间MaERF基因的在根部的表达

处理时间(h)	0	1	3	6	12	24	48	72
									相对表达量	0.517333	1.304333	1.013333	1.067667	1.322667	1.610667	0.811667	0.419333

表44℃处理不同时间MaERF基因在叶片的表达

处理时间(h)	0	1	3	6	12	24	48	72
									相对表达量	0.509333	1.321333	1.002333	1.762333	5.379333	3.834	3.535333	2.183333

实施例3：香蕉MaERF基因植物表达载体CAM35S-GFP-MaERF的构建

1、根据分离出的香蕉MaERF基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′-CGAGCTCATGTGCGGAGGAGCGATCAT-3′

反向引物：5′-GCTCTAGAGTAAACGCTGCTAGCTACCGG-3′

以总RNA反转录的5’Race的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

2、取1μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TakaRa公司产品PMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。

3、用KpnI和XbaI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T Vector载体上切下，与相同酶酶切的Cam35S-gfp连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将构建好的重组子命名为CAM35S-GFP-MaERF。

实施例4：MaERF基因的功能鉴定

1、拟南芥种植

称取适量的拟南芥(ecotype columbia)野生型种子，假如要种100株苗，一般需要500粒种子，以免种子不萌发，每粒种子约重0.02μg，总共需要10μg种子。将种子加去离子水，置于4度冰箱春化，24h后换一次水(4℃预冷)，春化72h之后播种。播种前将种子置于光下放置6h。栽培介质为椰糠，播种前充分吸水，用移液器从水中吸5粒种子，播到培养钵中，尽量使种子分散。播种完覆盖保鲜膜，置于合适条件(湿度60％；温度23℃；光周期16h光/8h暗)下等待发芽，3d左右可以将保鲜膜去掉。种子出芽之后，间苗两次，尽量选取大小一致的苗留下，最终每个营养钵中只剩下一株苗。两天浇水一次，一周浇MS营养液一次。

2、侵染菌液的制备

挑取含有目的基因的阳性菌落，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养约24h，期间对菌液进行PCR鉴定，确保目的基因的存在；吸取培养过的菌液2ml，加入到50mL新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD600约为1.0，离心收集菌体，用适量拟南芥转化液(MS+0.3mg/L6-BA+150g/L蔗糖+15g/L EMS+0.06％silwet L-77，PH＝5.7)重悬菌体，终浓度OD600约为0.8。

3、转化

拟南芥种植约一个月，植株开始陆续开花，挑选生长健壮的植株为待转化植株，转化前不断去除顶端花序，以使植株产生更多的花蕾。转化前一天需将待转化植株充分浇水。将准备好的转化液装在喷壶中，轻轻喷洒在拟南芥花序上，喷至叶片滴水为止，将喷过菌液的植株用保鲜袋包裹，黑暗条件下培养24h，去除保鲜袋，正常培养。视植株生长及开花情况，约一周后可再喷一次，以后正常培养，直至收获T1代种子。

4、转基因植株的筛选

将收获的拟南芥种子至于离心管中，先用1ml0.1％的升汞灭菌2min，然后用无菌水冲洗5-6遍，用枪头吸取种子，播于潮霉素浓度为25mg/L的MS固体培养基上。4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光/8h暗条件下培养。约两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养(图2)。移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，约3d去除，以后管理同上，收获T2代种子，做好标记，继续筛选，至得到纯合转化植株。

5、转基因拟南芥的分子鉴定

提取拟南芥苗期DNA，利用基因特异引物进行PCR检测目的基因存在与否，所用引物为：上游引物5’-GCAACTTCACCGAGGAAGAG-3’和下游引物5’-TTGCACTCCTTGCTGTTCTG-3’；对检测的阳性植株，提取其RNA和DNA，反转录后PCR，检测目的基因是否正常转录，所用引物同上(图3和图4)。

6、转基因拟南芥表型观察

对转基因拟南芥在生长不同阶段进行观察，并用显微镜、相机等工具记录。通过生长期观察，拟南芥生长期间，植株表型没有明显变化，根据MaERF推测功能，对转化植株的抗逆性进行检测。野生型和转基因植株在-12℃处理4h，发现野生型的叶片绝大多数冻伤萎蔫，而转基因植株明显收冻伤程度较轻，大部分叶片生长正常(图5)。野生型和转基因植株在培养于人工气候箱中生长2周后，停止浇水，4周后统计野生型和转基因植株生长情况，结果野生型叶片萎蔫枯黄，转基因植株生长也出现萎蔫，程度稍轻，复水后很快恢复生长(图6)。野生型和转基因植株在培养于人工气候箱中生长2周后，用250mM的NaCI溶液处理4周后，统计结果表明：野生型植株明显萎蔫，基因植株只有部分叶片萎蔫(图7)。

通过一系列实验获得的香蕉MaERF基因通过实时荧光定量PCR发现可以被尖胞镰刀菌4号小种和低温胁迫诱导高表达，表明该基因可能参与了香蕉的抗逆应答。该基因转化拟南芥，表型并没有明显的变化，但是通过低温和干旱实验表明，转化植株的抗逆性有所提高为研究香蕉对胁迫的响应机理和提高其抗逆性品种的转基因培育奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种香蕉抗逆应答ERF转录因子基因MaERF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包含权利要求1所述的香蕉抗逆应答ERF转录因子基因MaERF的表达载体。