CN103966236A - 小麦耐盐基因TaCYP81及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦耐盐基因TaCYP81,其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;本发明公开了含有所述基因的植物表达载体pROK2-TaCYP81和pGA3626-TaCYP81。同时本发明还提供所述基因TaCYP81在培育抗盐植物中的应用;实验证明,获得的转基因植株耐盐能力明显提高,预示其可广泛用于培育耐盐农作物尤其是耐盐小麦品种。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域,尤其涉及一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81及其应用。
背景技术
土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展,土壤盐渍化愈来愈严重,已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多,而土壤盐渍化更为严重,已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此,除了缓解土壤盐渍化以外,培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。
利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中,以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植,是一项具有广阔应用前景的技术。
目前,利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展,克隆了大量相关基因,并将这些基因转入植物中,用于耐盐机制研究。一些实验表明,将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中,其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。
然而,虽已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因,但有关CP450类基因特别是小麦耐盐基因TaCYP81及其在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81及其应用。
本发明的技术方案是:从小麦中分离得到一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81,然后将该基因转化到拟南芥中以实现研究CP450类基因的功能以及植物的耐盐机理,从而为其在培育抗盐植物中的应用提供基础,并正在尝试在小麦上应用此基因实现小麦耐盐性的提高。
本发明所述的耐盐基因名称为小麦耐盐基因TaCYP81,所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了含上述的小麦耐盐基因TaCYP81的植物表达载体pROK2-TaCYP81(拟南芥)或pGA3626-TaCYP81(小麦)。
本发明所述小麦耐盐基因TaCYP81在培育耐盐植物中的应用,以及本发明所述植物表达载体pROK2-TaCYP81或pGA3626-TaCYP81在培育抗盐植物中的应用。
其中,所述植物优选是拟南芥或普通小麦。
将本发明所述小麦耐盐基因TaCYP81导入植物细胞,植物就可以获得盐胁迫的耐受能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选,可以对含有所述基因TaCYP81的植物表达载体(pROK2-TaCYP81或pGA3626-TaCYP81)进行加工,如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素,卡那霉素,庆大霉素等)等。
任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用,本发明优选的载体是pROK2或pGA3626。
本发明提供的小麦耐盐基因TaCYP81可广泛用于培育耐盐农作物品种,特别是小麦。
本发明的有益效果:利用植物基因工程技术,本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaCYP81,并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥,经过比较分析证明,转基因植株的耐盐能力明显提高,预示其可广泛用于培育耐盐农作物品种,尤其是在培育耐盐小麦品种中将有重要作用。已经得到小麦转基因T2代,将会深入研究该基因对于改善小麦耐盐性的重要作用。
附图说明
图1TaCYP81基因全长cDNA序列的扩增结果
其中:SR3为山融3号小麦,JN177为济南177小麦,M为λDNA/(BamHⅠ+Sac)Marker;下同;
结果显示:分别在山融3号和济南177中获得开放阅读框长约1500bp的PCR产物。
图2山融3号和济南177盐胁迫0h、1h、6h和24h下TaCYP81在根(R)和叶(L)的RT-PCR分析。
其中:Actin为内参。
图3pBI221-TaCYP81在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。
图4BamHI和SacI双酶切中间载体pEASY-T1-TaCYP81和pROK2质粒。
图5pROK2-TaCYP81表达载体的验证
其中:1、2分别为pROK2-TaCYP81两个阳性克隆。
图6盐胁迫对转基因拟南芥株系与对照株系的生长的影响
其中:OE1为pROK2-TaCYP81转基因拟南芥株系1,OE2为pROK2-TaCYP81转基因拟南芥株系2。
图7pGA3626-TaCYP81小麦转基因过表达系T2代检测结果。
其中:C为阳性对照,箭头所示为小麦过表达阳性株系。
具体实施方式
实施例1、TaCYP81的克隆
1.1提取小麦Total RNA
1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中,在液氮中充分研磨成粉末;
2.待液氮挥发干,立即转移到2ml的离心管中,每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液,融化后,用加样枪反复吸吹,剧烈振荡混匀样品,使样品充分裂解,室温放置5分钟;
3.加入0.2ml氯仿(chloroform),剧烈振荡混匀15秒,室温放置10分钟;
4.4℃,12000rpm离心15分钟;
5.用移液器小心吸出上层水相,加入新的1.5ml的离心管中,加入500μl的异丙醇(1:1体积),充分混匀,-20℃,沉淀30min或过夜;
6.4℃,12000rpm离心10min,小心弃去上清液;
7.RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃,8000rpm离心10min收集沉淀;
8.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀;
9.去上清,RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟,RNA略显透明,加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存);
10.紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
注:a)用紫外分光光度计检测RNA的产量,在260nm处的吸光度,1OD=40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值,检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9~2.1之间)。
b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水,加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色,另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。
1.2cDNA反转录
反转录酶:M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。
2.65℃变性5min,迅速插入冰中,然后依次加入:
5×First-Strand Buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
RNaseOUT(Invitrogen) 1μl
3.轻轻混匀,37℃反应2min;
4.加入1μl M-MLV RT,混匀,37℃反应50min;
5.70℃温育15min使M-MLV RT失活;
6.加入1μl RNase H(Invitrogen),37℃反应20min;
7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。
1.3开放阅读框的克隆和序列测定
1.引物序列:根据测序结果,设计基因上下游引物,扩增基因的开放阅读框。
其中引物如下:
TaCYP81-F:ATGGATAAGGCATACATTGC
TaCYP81-R:TCAGAGGCTCTCAAGCACGTC
2.PCR反应体系(50μl):
3.PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45sec,55℃复性45sec,72℃延伸1.5min,循环35次;72℃延伸7min。
4.扩增片段,琼脂糖凝胶电泳,结果如图1.
5.切胶回收后与pEASY-T1载体连接并转化大肠杆菌DH10B,测序由华大基因(山东)公司完成。
1.4基因表达分析(RT-PCR和real-time PCR)
a.胁迫下RNA的提取
山融3号和济南177小麦种子正常萌发,Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)
开始施加盐胁迫(200mM NaCl),分别在处理后的0、1、6、24小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。
b.反转录(RT)产生cDNA
反转录产生cDNA,方法同上。
c.PCR反应及电泳
1.以cDNA为模板,进行PCR反应。引物如下
TaAct-S:5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’
TaAct-A:5’-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3’
2.PCR体系:
3.PCR程序:
95℃5min,25~30cycles95℃20s,57℃60s,72℃60s;72℃7min.
根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数,调整cDNA模板的加入量。
4.1%琼脂糖凝胶电泳。结果见图2,在小麦SR3和JN177中的该基因的表达受到盐胁迫的强烈诱导,说明该基因是一个盐胁迫响应基因。
实施例2、植物表达载体的构建(35S启动子)
2.135S启动子植物表达载体的构建
利用植物表达载体pROK2,选用SacI和BamHⅠ分别对pROK2和含有目的基因的pEASY-T1载体进行双酶切,分别回收载体大片段和目的基因小片段,用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。
(1)质粒pROK2空载体和pEASY-T1的SacI和BamHⅠ双酶切
碱裂解法提取pROK2空载体和pEASY-T1质粒,各取10μg酶切,酶切体系如下:
于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液,将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pROK2中14kb的载体大片段和pEASY-T1中大约1.5kb的目的基因条带,回收该条带。
(2)pROK2质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。
(3)经酶切和脱磷的pROK2载体片段(约14kb)和pEASY-T1双酶切回收片段(约1.5kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。
(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,转化菌在含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。
(5)重组子的鉴定
①质粒的PCR验证
挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜,碱变性法提取质粒,用基因特异引物进行PCR扩增,体系如下:
PCR反应条件如下:预变性94℃3min,35个循环为:94℃30sec,55℃30sec,72℃1min,最后,72℃延伸10min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
②质粒酶切鉴定
提质粒进行SacI和BamHI双酶切,酶切体系同上。0.8%琼脂糖凝胶电泳,检测是否含有预期分子量大小的片段,验证载体的正确构建。
结果见图4、图5,成功构建pROK2-TaCYP81载体。
实施例3、农杆菌感受态的制备与转化
3.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备
(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落,接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中,200rpm/min,28℃培养过夜。
(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD600达0.5。
(3)菌液冰浴30min,4℃,5000rpm离心10min,收集菌体。
(4)将菌体重悬于冰浴的10ml0.15mol/L的NaCl中,离心收集菌体。
(5)再悬浮于1ml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中,以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中,置液氮中速冻1min,-70℃保存备用。
3.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105
(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞,加入1μg表达载体质粒DNA,混匀后冰浴30min。
(2)置液氮速冻1min,迅速移至37℃保温3min。
(3)加入无抗生素的YEP800μl,28℃震荡培养3小时。
(4)7000rpm离心30s收集菌体,涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上,28℃倒置暗培养2-3天。
3.3菌体PCR鉴定
实施例4、转基因功能验证-拟南芥转化及筛选、表型鉴定
4.1拟南芥种植
将种子放入EP管中,70%乙醇中浸泡5min,然后清洁剂(20%漂水(白猫,上海),0.1%Triton)洗涤10-15min,无菌水冲洗4次,4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5%agarose(冷却至40度以免把种子烫死,加agarose是为了有利于种子散开),铺于1/2MS固体培养基上,超净台上吹干,(可多吹一会,以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽)。转入人工气候室中培养一周左右,可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot,70℃烘干2小时以上(杀死虫卵等,否则会长虫),然后将pot放在营养液中,使其充分吸水,将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中,盖上保鲜膜,转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇在pot底下的铁盘子里)。
4.2拟南芥转化
(1)当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时,将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。
(2)转化前一天,取2ml活化的农杆菌AGL1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中,过夜培养至OD600=1.0-1.2。
(3)离心收集菌体,并重悬于浸染液(5%蔗糖,0.04%Silwet L-77)中,使OD600=0.8。
(4)将花序浸入浸染液30秒,其间前后摆动花序,使花序上形成一层膜。
(5)用保鲜膜覆盖花序,暗培养一天后揭去保鲜膜,至于19-22℃培养室培养。
(6)隔5-7天再同法浸染一次。
(7)大约一个月后收获种子。
4.3拟南芥转化阳性株系筛选
(1)收获的T0代种子消毒后(75%乙醇5min,清洁剂洗涤10-15min,无菌水冲洗3-5次),铺于含50μg/ml Kan或50μg/ml Hygo的MS筛选培养基上(方法同上)。
(2)4℃春化48h,移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。
(3)等植物绝大多数花苞已经结果荚,用小绳将植物单株绑起,以便单株收种子T1代种子。
(4)PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板,使用基因特异引物
TaCYP81-F:ATGGATAAGGCATACATTGC
TaCYP81-R:TCAGAGGCTCTCAAGCACGTC
(5)T1种子处理同前,在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。
(6)得到纯合系后,选出两个表达量合适的株系OE1、OE2进行拟南芥过表达系表型鉴定,结果见图6,pROK2-TaCYP81过表达拟南芥系在对照情况与pROK2系生长无差异,但在盐胁迫处理下,pROK2-TaCYP81过表达系生长状况明显好于pROK2对照系,说明该基因的过表达提高了拟南芥的耐盐性。
实施例5、小麦耐盐基因TaCYP81在培育耐盐小麦品种中的应用
TaCYP81在小麦中受到盐处理的强烈诱导,说明它是一个小麦盐胁迫响应基因;而且该基因在拟南芥中过表达后,可以明显改善拟南芥的耐盐性,充分说明该基因对于改善小麦的耐盐性也有重要意义,可以应用于培育耐盐小麦品种。
为了更直接地研究该基因对提高小麦耐盐性的重要性,我们选取HindIII+BamHI构建了小麦过表达载体pGA3626-TaCYP81,借助我实验室小麦转化平台,成功转化小麦,如图7所示,获得50多株小麦转基因阳性植株,接下来将会对该基因过表达系的表型进行鉴定和分析。
Claims (7)
1.一种小麦耐盐基因TaCYP81,其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种含有权利要求1所述基因TaCYP81的植物表达载体pROK2-TaCYP81。
3.一种含有权利要求1所述基因TaCYP81的植物表达载体pGA3626-TaCYP81。
4.权利要求1所述基因TaCYP81在培育抗盐植物中的应用。
5.权利要求2所述植物表达载体pROK2-TaCYP81在培育抗盐植物中的应用。
6.权利要求3所述植物表达载体pGA3626-TaCYP81在培育抗盐植物中的应用。
7.如权利要求4、5或6所述的应用,其特征在于:所述植物是拟南芥或普通小麦。
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