CN103421829A - 小麦耐盐基因TaAOC1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因即丙二烯氧化物还原酶基因TaAOC1及含有所述基因TaAOC1的植物表达载体，本发明还公开了所述基因TaAOC1在培育耐盐植物特别是小麦中的应用。实验证明，利用本发明所述转基因转化制备的转基因植株的抗盐能力明显提高，为所述基因广泛用于培育耐盐农作物新品种提供了基础。

Description

小麦耐盐基因TaAOC1及其应用

技术领域

本发明涉及一种小麦耐盐基因及其应用，尤其涉及耐盐基因丙二烯氧化物还化酶基因TaAOC1及其应用，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种，用于在盐碱地种植是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力提高。

在前期研究中，本实验室利用不对称体细胞杂交方法创制渐渗系技术，将小麦近缘优质牧草、单子叶植物耐盐性最强的长穗偃麦草染色质渐渗到普通小麦济南177（JN177），创建一批高产、抗逆、抗病和优质的渐渗系新种质和新品系，从中选育出杂种渐渗系高产、耐盐新品种山融3号（SR3）（鲁审[2004]030），获得研究小麦渐渗系机制和功能基因的“突变体”新材料。转录组分析显示，盐胁迫下，一系列茉莉酸合成途径相关基因在SR3和JN177中被诱导，而且SR3中的诱导幅度大于JN177，这暗示JA途径可能与SR3抗逆性存在一定的关联；其中，该途径关键酶丙二烯氧化物环化酶（AOC）基因TaAOC1在盐胁迫下诱导非常显著，而且SR中的上调幅度明显高于JN177；TaAOC1的过表达提高了拟南芥的JA含量和耐盐能力，首次发现可以通过遗传操作提高拟南芥的JA合成。因而TaAOC1对深入认识JA合成途径与植物耐逆应答反应之间的关系具有重要意义。然而，经检索关于丙二烯氧化物环化酶（AOC）基因TaAOC1的cDNA核苷酸序列以及该基因在培育抗盐植物中的应用在本发明申请前还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种小麦耐盐基因——丙二烯氧化物还化酶基因TaAOC1及其应用。

本发明所述的小麦耐盐基因TaAOC1，其特征在于：该基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还提供了含上述小麦耐盐基因——丙二烯氧化物还原酶基因TaAOC1的植物表达载体pSTART或pGA3626，其中所述载体pSTART的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还公开了上述小麦耐盐基因TaAOC1以及所述植物表达载体pSTART或pGA3626在培育耐盐植物中的应用。

其中：所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

将本发明所述小麦耐盐基因导入植物细胞，植物即可获得耐盐能力，若在盐渍化土壤中种植，可实现植物耐盐及重复利用次质土壤目的。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaAOC1的植物表达载体（pSTART或pGA3626）进行加工，如可以加入选择标记（Bialaphos等）或者具有抗性的抗生素标记物（卡那霉素）等，事实上任何一种可以将外源基因导入植物中的表达载体都可以应用本发明。基于此，本发明提供的基因可广泛用于培育耐盐农作物品种。

本发明的有益效果是：利用植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦丙二烯氧化物还原酶基因TaAOC1，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入小麦和拟南芥，经过实验比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高，为该基因广泛用于培育耐盐农作物新品种提供了基础。

附图说明

图1TaAOC1基因全长cDNA序列的扩增结果，显示山融3号中TaAOC1基因开放阅读框的扩增获得720bp的片段。

其中：M为λDNA/(EcoRⅠ+HindⅢ)Marker（下同）。

图2TaAOC1转基因小麦植株T0代PCR鉴定

其中：其中1，10,11为阳性植株。

图3TaAOC1转基因小麦植株T1代PCR鉴定

其中：其中1至4,6至12,15,16为阳性植株。

图4山融3号胁迫根系中TaAOC1的QRT-PCR分析。

图5山融3号激素处理根系中TaAOC1的QRT-PCR分析。

图6山融3号中TaAOC1的各组织部分QRT-PCR分析。

图7TaAOC1转基因小麦植株QRT-PCR鉴定和幼苗期在NaCl处理后的生长情况。

其中：JN17：济南17；OX：过表达转基因植株（下同）。

图8TaAOC1转基因拟南芥植株QRT-PCR鉴定。

其中：VC：空载体对照；OE：过表达转基因植株（下同）。

图9TaAOC1转基因拟南芥在NaCl土壤处理后的生长情况。

图10TaAOC1转基因拟南芥植株中信号途径标记基因的QRT-PCR分析。

具体实施方式

实施例1、TaAOC1的克隆

1.1植物材料的处理

1)将小麦种子（山融3号）在4℃春化20天

2)用70%酒精处理种子2-3分钟。

3)弃去酒精，用无菌水洗3-5次，每次充分振荡混匀。

4)用无菌水浸泡种子，避光，25℃，40-60rpm/min，摇床孵育过夜。

5)将种子正面向上，摆放在用无菌水充分润湿的滤纸上，避光萌发。

6)3天后将种子转移到培养篮中，1/2Hoagland，水培，置于23℃，长日照的培养间生长至两叶一心期。

1.2小麦RNA提取

1)将超低温冻结的30-50mg RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。

2)将粉末状RNA提取样品小心而快速的转移到液氮预冷的2ml离心管中，加入适量的1.5ml RNAiso Reagent，震荡混匀，此时裂解液呈透明状，室温静置5分钟。

3)12,000g4℃离心5分钟。

4)小心吸取上清液，移入新的2ml离心管中（切勿吸取沉淀）。

5)加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应防止离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5分钟。

6)12,000g4℃离心15分钟。

7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中（切忌吸出白色中间层）。

8)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

9)12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现白色沉淀。

10)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。

11)室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用于后续试验或于-80℃保存。

12)RNA质量检测：a)通过测定OD₂₆₀、OD₂₈₀、OD₂₃₀的吸收值计算RNA的含量及纯度；b)1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解；c)RNA直接进行PCR检测是否存在DNA污染。

1.3cDNA第一链的快速扩增

1)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl。

模板RNA（total RNA）        5μg

Oligo（dT）18primer(50μM)  1μl

RNase free dd H₂O           Up to13.5μl

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)42℃保温1小时。

6)70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用1μl～5μl。

1.4TaAOC1全长克隆

1)引物序列：

TaAOC1-1：CCAAGAATATCATCATCCGCTAG

TaAOC1-2：ACCGACATTCATTCAACACCA

2)PCR反应体系（20μL）：

3)PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

4)扩增片段的回收后与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。结果见图1。

实施例2、小麦转化及转基因植株筛选

2.1小麦种子的萌发

1)取饱满完好的小麦种子进行灭菌，用70%乙醇浸泡30sec，再用0.1%HgCl2浸泡15min。浸泡期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底，然后用无菌水冲洗4-5次。

2)灭菌后种子放在无菌的培养皿中，加适量无菌水15-35℃黑暗条件下萌发。

2.2小麦的转化

1）转化前一天，取2ml活化的农杆菌加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD600=1.0-1.2。

2）离心收集菌体，并重悬于浸染液（含0.2%AS）中，使OD600=0.8。

3)用刀片剥离备用黄化苗的胚芽鞘及幼叶使之暴露茎尖生长点，并用解剖针尖轻微挫伤其生长点细胞。

4)将配制好的菌体浸染液用1ml注射器缓慢滴加在无菌苗露出的生长点顶端，浸泡并缓慢渗入。

5)黑暗条件下，温度控制在17-28℃共培养2-4d，至植株顶端重新长出新叶。

6)将植株用清水洗掉菌体，移栽到装有灭菌蛭石的花盆中，保持适宜温度(18-23℃)和湿度，最后将存活植株温室盆栽。

2.3小麦转化阳性株系筛选

1)CTAB法提取小麦的基因组DNA，载体引物和基因下游引物进行PCR扩增检测。

2)T0代种子种植后长出幼苗（其中1，10,11为阳性）。结果见图2。

3)阳性植株收获的T1代种子种植后长出幼苗（其中1至4,6至12,15,16为阳性）。结果见图3。

4)提取野生植株和转基因植株的RNA进行real-time PCR检测，结果见图7小图。

实施例3、TaAOC1的胁迫表达分析

3.1胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177种子正常萌发，Hoagland培养液培养至两叶一心期时（约3周时间）开始进行干旱（18％PEG）、盐胁迫（200mM NaCl）、H₂O₂（10mM）处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上。

3.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA同上。

3.3PCR反应及电泳

1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下：

QRT-1：CGTCTTCGAGGGCGTCTACG

QRT-2：GCAGGTCGGGGATGCCCTTGA

2)PCR体系：

3)PCR程序：

95℃5min；40cycles95℃30s,60℃30s,72℃30s；72℃5min.

4)QRT数据分析。结果见图4。

实施例4、TaAOC1的激素处理表达分析

4.1胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177种子正常萌发，Hoagland培养液培养至两叶一心期时（约3周时间）开始进行JA（100mM）、ABA（100mM）处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上。

4.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA同上。

4.3PCR反应及电泳

同上，结果见图5。

实施例5、TaAOC1的组织表达分析

5.1胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177种子正常萌发，Hoagland培养液培养至两叶一心期时（约3周时间）开始进行不同组织取样，Trizol法提取RNA同上。

5.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA同上。

5.3PCR反应及电泳

同上，结果见图6。

实施例6、双子叶植物表达载体的构建

植物表达载体pSTART是含有35S启动子和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶XbaI和BamHI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含XbaI和BamHI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因,体系同1.5。

用限制性内切酶XbaI和BamHI对载体pSTART和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，与酶切的目的基因扩增片段相连。

酶切体系，

1)质粒或基因扩增产物XbaI和BamHI双酶切

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART大片段和目的基因条带，回收。

2)经酶切的载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

3)连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan50μg/ml的

LB固体平板上37℃培养16小时左右。

4)重组子的鉴定

A.载体特异引物的合成

为了鉴定目的基因的插入方向，根据35S启动子序列设计一个载体特异引物，序列如下：GTT GGG GTT TCT ACA GGA CGT

B.重组质粒的PCR验证

挑取在kan培养基上的抗性单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用载体特异引物和基因的下游引物进行PCR扩增，体系同1.5。PCR反应条件如下：预变性94℃5min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

C.质粒酶切鉴定

提质粒进行XbaI和BamHI酶切，酶切体系同上。1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例7、单子叶植物表达载体的构建

植物表达载体pGA626是含有ubiquitin启动子表达载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含HindIII和BamHI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因,用限制性内切酶HindIII和BamHI对载体pGA626和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，与酶切的目的基因扩增片段相连。转化大肠杆菌感受态，用载体上的引物tttagccctgccttcatacg和基因下游引物进行PCR鉴定，用HindIII和BamHI进行酶切验证，相关方法同实施例6。

实施例8、农杆菌感受态的制备与转化

8.1农杆菌EHA105感受态的制备

1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml

2)利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

3)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD600达0.5。

4)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

5)将菌体重悬于冰浴的10ml0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

6)再悬浮于1ml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml

7)Eppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

8.2冻融法转化根癌农杆菌EHA105

1)在室温下融化两管农杆菌感受态细胞，分别加入1μg表达载体质粒DNA和1μg空载体，混匀后冰浴30min。

2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃温浴3min。

3)加入无抗生素的YEP800μl，28℃震荡培养3hr。

4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

8.3菌体PCR鉴定

菌体PCR方法及程序同上。

实施例9、拟南芥转化及筛选

9.1拟南芥种植

取拟南芥(哥伦比亚野生型)种子,置于垫有滤纸的平皿内,用少量蒸馏水润湿滤纸,于4℃冰箱进行春化处理,3-5天后播种于育苗盘内，放置于人工气候箱内（16h光照，22℃/8h黑暗，18℃），生长6－8周后，待抽苔开花时用于转化。9.2拟南芥转化

1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD600=1.0-1.2。

2)离心收集菌体，并重悬于浸染液（5%蔗糖，0.04%Silwet L-77）中，使OD600=0.8。

3)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

4)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，继续置人工气候箱使其生长。

5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。

6)大约一个月后收获种子。

7)空载体的转化同上。

9.3拟南芥转化阳性株系筛选

1)收获的T0代种子消毒后（75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3－5次），铺于含50μg/mL Kan的MS筛选培养基上。

2)4℃春化48h，移到培养室（16h光照/8h黑暗，22℃恒温）生长7-10天。将抗性绿色小苗移到土中继续生长。

3)等植物绝大多数花苞已经结荚时，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获T1代种子。

4)重复步骤1）－3），将单株收获的T1代种子继续在含卡那的MS培养基上进行筛选，挑选抗性比为3:1的单插入独立株系移栽，并单株收获种子得到T2，继续重复步骤1）－3），直至T2代单株种子在卡那抗性培养基上不再分离，至此得到纯合的T2代植株用于后续的进一步研究。空载体纯合体的筛选方法同上。

5)提取空载体对照及不同转基因株系的总RNA并逆转录合成cDNA。

6)PCR扩增：以上述不同材料的第一链cDNA为模板，进行QRT-PCR验证表明，TaAOC1在转化植株中正常表达。结果见图8。

实施例10、转TaAOC1拟南芥耐盐性分析

10.1植株抗盐性分析

1)将空载体对照、两个株系的转TaAOC1拟南芥种子经消毒（方法同上）后，铺入不含任何胁迫成分的MS培养基中萌发；

2)将萌发7天的幼苗转移至含100mM和150mM NaCl的MS培养基中垂直培养，观察幼苗生长差异。以不含任何胁迫成分的MS培养基为对照结果见图9。

10.2转TaAOC1拟南芥幼苗中信号途径相关Marker基因分析

1)拟南芥种子消毒、萌发、培养（方法同上）；

2)对照及转基因株系，未处理和NaCl处理6h的植株，提取总RNA，逆转录形成cDNA，进行RT-PCR分析。方法同实施例2，结果见图10。

实施例11、转TaAOC1小麦耐盐性分析

将对照、两个株系的转TaAOC1小麦种子经消毒（方法同上）后，萌发，之后转移至在Hoagland培养液中培养10天，方法见1.1；

将萌发10天的幼苗转移至含150mM NaCl的Hoagland培养液中培养，观察幼苗生长差异。结果见图7。

Claims (7)

1.一种小麦耐盐基因TaAOC1，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaAOC1的植物表达载体pSTART，其中该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求1所述基因TaAOC1的植物表达载体pGA3626。

4.权利要求1所述基因TaAOC1在培育耐盐植物中的应用。

5.权利要求2所述植物表达载体pSTART在培育耐盐植物中的应用。

6.权利要求3所述植物表达载体pGA3626在培育耐盐植物中的应用。

7.如权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦或拟南芥。

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