CN101525621B - 小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应答非生物胁迫(盐、旱等)抗性基因TaCEO及含有所述基因TaCEO的植物表达载体pBI121/TaCEO；本发明还公开了所述基因TaCEO及含有所述基因TaCEO的植物表达载体在培育抗非生物胁迫(盐、旱等)中的应用。实验证明，本发明所述过表达转基因植株的抗非生物胁迫(盐、旱等)能力明显提高。

Description

小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO及其应用。

背景技术

我国是世界上干旱半干旱地区面积较大的国家，旱地面积占全国总土地面积的52.5％，其中典型地带——黄土高原水土流失区，耕地约占半干旱地区的1/3，坡耕地占到耕地面积的75％，平均单位(667m²)产量低于150kg，不少地方还在100kg以下。但是目前该地区的灌溉面积仅为20％左右，单位面积产量仅为全国平均值的一半，其中典型半干旱地区，如黄土高原丘陵沟壑区，灌溉面积不足10％，单产仅为全国平均的三分之一。与此同时，我国是水资源匮乏的国家之一，人均水资源占有量仅为世界平均数的1/4，且近20年来，随着人口的剧增、耕地锐减、环境资源恶化，水资源的匮乏已经成为制约农业生产可持续发展的最大障碍。而且预计在相当长的时间内这种局面不会有很大的改善。除了干旱之外，壤盐渍化严重影响农作物生长和产量。随着经济的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题；特别是我国人口众多，土壤盐渍化已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。所以，培育耐盐抗旱农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

除了传统育种方法外，利用基因工程和细胞工程等新技术可以快速稳定地获得具有优良耐盐抗旱能力的作物新品种。利用转基因技术将新的耐盐抗旱功能基因转入到作物中，以此高效开发耐盐抗旱转基因作物新品种，用于在盐碱地及干旱地区种植是一项具有广阔应用前景的技术。其前提是，必须较系统地了解植物耐盐抗旱机制，分离高效的与耐盐抗旱相关的基因。

多年来，有关植物耐盐抗旱机制方面的研究已取得了较大的进展，克隆了大量高盐、水分胁迫相关基因，为进一步阐明植物耐盐抗旱的分子机制提供了理论线索和依据。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐抗旱相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的耐盐抗旱能力明显提高。

目前，已发现了一些能显著改变植物耐盐抗旱能力的基因，其中除了耐盐抗旱调节相关的转录因子相关基因外，还包括一些能够通过对转录因子进行修饰化作用以改变其调控能力的功能基因。后者可通过调节转录因子调控能力及其下游抗旱相关基因的表达来调控植物的耐盐抗盐能力。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的抗旱能力。

CEO蛋白是一类非常重要的蛋白质，参与植物对多种非生物胁迫的响应过程。近年来已有试验表明，拟南芥中的CEO蛋白可以提高酵母的抗氧化能力，但有关TaCEO基因在植物抗旱过程中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐抗旱基因——小麦抗非生物胁迫基因TaCEO及其应用。

本发明的技术方案是：从小麦中分离得到了CEO基因——TaCEO，并构建双子叶植物表达载体pBI121/TaCEO转化模式植物拟南芥，以鉴定基因的功能并最终将该基因用于小麦等重要农作物的转化，提高农作物的耐盐抗旱能力。

本发明提供的小麦抗非生物胁迫基因名称为小麦CEO蛋白基因TaCEO即小麦应答非生物胁迫(盐、旱等)抗性基因TaCEO，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述小麦应答非生物胁迫(盐、旱等)抗性基因TaCEO的植物表达载体pBI121/TaCEO。

本发明所述基因TaCEO及含所述基因TaCEO的植物表达载体pBI121/TaCEO在培育耐盐抗旱植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

将本发明所述基因导入植物细胞，使其在植物中过量表达就可以使转基因植物提高耐盐抗旱能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaCEO的植物表达载体pBI121/TaCEO进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐抗旱农作物新品种，并可为深入阐明植物耐盐抗旱机制提供理论依据。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦抗非生物胁迫基因TaCEO，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐抗旱能力明显增强。据此可通过过表达策略开发和培育耐盐抗旱作物新品种。

附图说明

图1TaCEO基因全长cDNA序列的扩增结果

M：DNA分子量标准，此处为DL2000(下同)。

图2TaCEO在多种处理下山融3号中的半定量RT-PCR分析。

P：18％PEG处理；S：200mM NaCl处理；C：4℃低温处理；A：ABA处理；H：H₂O₂处理；M：甲基紫精处理(下同)。

图3TaCEO转基因拟南芥植株PCR鉴定。

OE1，2：两个TaCEO过表达转基因株系；VC：空载体转化株系；WT：野生型；25SPro：35S启动子扩增片段(下同)

图4TaCEO转基因拟南芥植株RT-PCR鉴定。

图5TaCEO转基因拟南芥植株在各种胁迫下种子的萌发率。

图6TaCEO转基因促进拟南芥植株幼苗期根的伸长及侧根的发育。

图7TaCEO转基因拟南芥植株幼苗期在各种胁迫培养基上的生长情况。

图8TaCEO转基因拟南芥植株中胁迫标记基因的半定量RT-PCR结果。

具体实施方式

实施例1、TaCEO的克隆

1.1小麦RNA提取

(1)将PEG渗透胁迫处理的组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml Trizol提取液，剧烈振荡使样品充分裂解，室温放置5分钟；

(3)4℃，12000rpm离心15分钟；

(4)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1.5ml的离心管中，加入200μl氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

醇(1∶1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

(5)4℃，12000rpm离心15分钟；

(6)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1∶1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

(7)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

(8)RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

(9)重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

(10)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

(11)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D＝40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1ul RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。

1.2cDNA 3’和5’末端第一链的快速扩增

5’和3’RACE第一链cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)按Clonetech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南进行。

1.3TaCEO 5’和3’端克隆

(1)根据基因芯片的检测结果，获得TaCEO的部分序列并按照SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南设计两对基因特异引物(序列如下)：

TaCEO-GSP1：5’GAACCTCCACTGAGAAACATTACC3’

TaCEO-GSP2：5’GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC3’引物序列

TaCEO-NGSP1(5’RACE巢式引物)：5’GTTTCCACTAGCAGGTTCATTCA 3’

TaCEO-NGSP2(3’RACE巢式引物)：5’AATAACATACTGGAGGAAGGACAG3’；

(2)按照SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南分别扩增TaCEO的5’和3’末端；

(3)将5’和3’端序列拼接，分别在起始密码上游和终止密码下游设计引物(序列如下)，以5’或3’RACE产物为模板扩增该基因全长。

引物1：GGT ACC ATG GAA AGG AAG ACT G

引物2：CCA GGT TCA GGA GGT GCT GCT C

1.4TaCEO全长克隆

1.引物序列：见1.3部分。

2.PCR反应体系(20μL)：

10×buffer               2μl

模板(5’RACE产物)        1μl

dNTPs(2.0mM each)                        0.5μl

Primer1(5μM)                            1μl

Primer2(5μM)                            1μl

高保真Taq酶(STRATAGEN，Cat No：600380)   0.5μl

ddH₂O                                    14μl

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，57.5℃复性45sec，72℃延伸2min30sec，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段的回收后与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。结果见图1。

实施例2、TaCEO的表达分析

2.1胁迫下RNA的提取

山融3号种子正常萌发，Hoagland培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始进行干旱(18％PEG)、盐胁迫(200mM NaCl)、冷、ABA、H₂O₂和甲基紫精处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上。

2.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA，按说明书操作。

2.3PCR反应及电泳

(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下：

5’端引物：ATGGACTCGGAGCACTGGAT

3’端引物：TCAGTCGTCTCCAAATAAAGTG

(2)PCR体系：

ddH₂O                           12.6μl

10×Taq buffer(Mg2+free)        2μl

MgCl₂(25mM)                     1.2μl

Primer1(5μM)                   1μ1

Primer2(5μM)                   1μl

dNTP(2mM each)                  1μl

Taq polymerase(5U/μl)          0.2μl

模板(逆转录cDNA)                1μl

Total Volume                    20μ1

(3)PCR程序：

95℃3min，25～30cycles 95℃30s，60℃30s，72℃60s；72℃5min，根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳。

结果表明，上述各种胁迫下，TaCEO在根中均上调表达，相反在叶中有的下调表达(PEG、冷、H₂O₂和甲基紫精处理)，有的先下调表达再恢复到对照水平(NaCl和ABA处理)(见图2)。

实施例3、植物表达载体的构建(35S启动子)

植物表达载体pBI121是含有35S启动子和NPTII基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶BamHI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含BamHI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因，体系同1.4。

用限制性内切酶BamHI对载体pBI121和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收、用CIAP脱磷酸，然后与酶切的目的基因扩增片段相连。

酶切体系

(1)质粒BamHI单酶切

10×Buffer                 1μl

质粒                       1~2μl

BamHI                      1μl

加ddH₂O至总体积            20μl

于37℃恒温水浴锅酶切2小时以上。酶切后以0.5×TBE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pBI121大片段和目的基因条带，回收。

(2)回收的载体大片段的脱磷。

(3)经酶切和脱磷的载体片段和目的基因片段以摩尔比1∶4的比例进行16℃连接过夜。

(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(5)重组子的鉴定

①载体特异引物的合成

为了鉴定目的基因的插入方向，根据35S启动子序列设计一个载体特异引物，序列如下：GTT GGG GTT TCT ACA GGA CGT

②重组质粒的PCR验证

挑取在kan培养基上的抗性单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用载体特异引物和基因的下游引物进行PCR扩增，体系同2.3。PCR反应条件如下：预变性94℃3min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

②质粒酶切鉴定

提质粒进行BamHI单酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例4、农杆菌感受态的制备与转化

4.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50g/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

(1)在室温下融化两管农杆菌感受态细胞，分别加入1μg表达载体质粒DNA和1μg空载体，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃温浴3min。

(3)加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3hr。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

4.3菌体PCR鉴定

菌体PCR方法及程序同上。

实施例5、拟南芥转化及筛选

5.1拟南芥种植

取拟南芥(哥伦比亚野生型)种子，置于垫有滤纸的平皿内，用少量蒸馏水润湿滤纸，于4℃冰箱进行春化处理，3-5天后播种于育苗盘内，放置于人工气候箱内(16h光照，22℃/8h黑暗，18℃)，生长6-8周后，待抽苔开花时用于转化。

5.2拟南芥转化

(1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL 1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

(2)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

(3)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

(4)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，继续置人工气候箱使其生长。

(5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。

(6)大约一个月后收获种子。

(7)空载体的转化同上

5.3拟南芥转化阳性株系筛选

(1)收获的T0代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3-5次)，铺于含50μg/mL Kan的MS筛选培养基上。

(2)4℃春化48h，移到培养室(16h光照/8h黑暗，22℃恒温)生长7-10天。将抗性绿色小苗移到土中继续生长。

(3)等植物绝大多数花苞已经结荚时，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获T1代种子。

(4)重复步骤(1)-(3)，将单株收获的T1代种子继续在含卡那的MS培养基上进行筛选，挑选抗性比为3∶1的单插入独立株系移栽，并单株收获种子得到T2，继续重复步骤(1)-(3)，直至T2代单株种子在卡那抗性培养基上不再分离，至此得到纯合的T2代植株用于后续的进一步研究。空载体纯合体的筛选方法同上。

(5)CTAB法提取野生型、空载体对照及不同转基因株系的基因组DNA，提取相应材料的总RNA并逆转录合成cDNA。

(6)PCR扩增：以上述不同材料的基因组DNA为模板，使用基因特异引物、空载体检测特异引物(35S启动子序列)，PCR反应体系和反应条件如前。

(7)RT-PCR验证表明，TaCEO在转化植株中正常表达。

PCR验证结果显示，转化空载体和转化TaCEO的转基因株系均能扩增出35S启动子片段，两个TaCEO过表达转基因株系能扩增出TaCEO片段，表明基因已经成功转如拟南芥(见图3)。

RT-PCR验证结果显示，两个TaCEO过表达转基因株系中TaCEO能正常表达(见图4)。

实施例6、转TaCEO拟南芥胁迫抗性分析

6.1萌发率测定

将野生型对照、空载体对照、两个株系的转TaCEO拟南芥种子经消毒(方法同上)后，铺入含有Mannital、NaCl、ABA和H₂O₂的MS培养基中，25度培养，观察萌发情况，肉眼可见白色胚根开始露出时计数，萌发率的＝胚根露出的种子数/用于萌发试验的种子总数×100％。结果表明，NaCl、ABA、H₂O₂等胁迫条件下，与野生型相比，空载体转基因株系的萌发率没有变化，两个TaCEO过表达转基因株系的萌发率明显提高(见图5)。

6.2植株胁迫抗性分析

(1)拟南芥种子消毒、萌发(方法同上)；

(2)将萌发7天的幼苗转移到不含任何胁迫成分的MS培养基中垂直培养，观察幼苗生长差异。结果表明，与野生型相比，空载体转基因株系的生长状况没有变化，两个TaCEO过表达转基因株系的根叶生长速度明显提高(见图6)。

(3)将萌发7天的幼苗转移至含Mannital、NaCl、H₂O₂和ABA的MS培养基中垂直培养，观察幼苗生长差异。结果表明，与野生型相比，空载体转基因株系的幼苗表型没有显著变化，两个TaCEO过表达转基因幼苗在ABA、甘露醇和NaCl胁迫下生长状态明显较好，叶片较大，根长增加，侧根增多，在H₂O₂胁迫下根没有明显变化，但叶生长状态更好(见图7)。

(4)将土培3周左右的转基因植株及对照控水10天再浇水使其恢复生长3天，观察植株抗旱状况。结果表明，复水后野生型和空载体转基因植株恢复生长能力很差，但两个TaCEO过表达转基因幼苗生长恢复明显。

6.3转TaCEO拟南芥幼苗中抗旱相关Marker基因分析

(1)拟南芥种子消毒、萌发、培养(方法同上)；

(2)经旱、ABA处理后的对照及转基因株系，提取植株总RNA，逆转录形成cDNA，进行RT-PCR分析。方法同实施例2，结果表明，在ABA和甘露醇胁迫下，与对照相比，空载体转化株系中几个非生物胁迫标记基因的表达没有变化，但在两个TaCEO过表达转基因株系中表达量明显提高，表明转基因株系耐盐能力增强(见图8)。

序列表

<110>山东大学

<120>小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO及其应用

<141>2009-2-26

<160>1

<210>1

<211>1737

<212>cDNA

<213>小麦

<221>小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO

<222>(1)…(1737)

<400>1

atggaaagga agactggaat ggtactggat gaacatgtcc tgaaagctac tgatcgcaag 60

aggaaacatg agtcgtctgt gaagagtact ggcacagatg attttgctga ggtctctcag 120

catgctgatg gttctgctgt ccttaagaag tctaaaatga cctcctctgc tggtgatatt 180

ctggagtgct ataagaactt caagacaagc ggttcgcccg tgcgcgtgct ttgttaccac 240

cagggtaaat ggagggactt tccagagcat gttgtgaatc tggtacagca ggacttccag 300

ttgaagaggc caattactaa tgctgtattg aagaaccagc aagtcctgtt ggactttatg 360

cacatggtct gcattgattc ttcgatgacc acaaacaagc caatagcatg gattgatgtt 420

catggtaacc gcttctttcc agagttatgt gctggactgg taacatctaa accatctcag 480

catgggaaaa gtgaccccag tggtaaatct aaagctggtg agtgtgctgg gactttgatt 540

ttgacagctg aagctgaaag ctcgagttca gattctgttg atgcagtact ccctcatgct 600

aagaaggtta ataacatact ggaggaagga caggaggtac ataattatgc tgctgttgaa 660

aataaagctg gtcctgcaat ctgtttgaat gaacctgcta gtggaaacat acatgctgct 720

acttataagc agaaaattgg ccaacctgtt gattcagctg tgcgcaagtt attgcttgaa 780

ggggcaggcc aaccttttag tgaagaaaat attattggca tctacagaac tccactggta 840

gatcagcaag ggcgggctcg cttcaatctt ttccagaagg aacttgaggc caccaaaatg 900

catcgtggca acgcaaatgt gcgctacgcg tggctacctt gttccaagga tactatggag 960

gagatgatga tgcgtggtgt tctggaagtt acaaaaccca tgctggggcc agtgtatggc 1020

attggtacac atcttgctcc agcgaactgt gcccaaacct gcgctagcta ctcagatatt 1080

gacgaaaatg gcatcatgag gatgatgctg tgccgtgtta taatgggtaa tgttgaggtt 1140

gtacttcctg gatcaaagca attccagcca accaatgaaa gatttgatag tggtgtggat 1200

gatcttcaaa agccaaagca ctatatcata tgggatgcta atgtgcatcg acacatctat 1260

gctgaatatg ctgttgttat caaagcacct tccatgacca atgaatactt ggctagagaa 1320

gatactgcat ccaacatatc tgagataaga aattctggtt cagcagaaag tgtaatcaag 1380

gacgatagtt ccgaaaccat ggcatctcca gctgataaac aacaagcacc caggtttggg 1440

cgtgccccaa ctcgaaggcc tcctacttca ccctggatgc ccctcccaat gcttttcgct 1500

gccatctcca caaaagttcc tcgttctgac atggatgtaa tccatggaca ctatgaagaa 1560

ttcaagagga gaaagataag caggcccgag tttgtgagac ggctaagaca gatcttcggc 1620

gacaagctgc tggtttctac agtaatgagg ctgcaaccta aggtagtggc acccatggca 1680

ggtgctgaag tgctaccaag aggagcaccc ggcacgggag ggagcagcac ctcctga    1737

Claims (2)

1.一种小麦应答非生物胁迫抗性基因TaCEO，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaCEO的植物表达载体pBI121/TaCEO。

Images