CN102409059A - 一种提高植物耐旱性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于提高植物抗性领域，具体涉及一种提高植物耐旱性的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种能提高植物抗旱性的新的有效方法。解决该技术问题的技术方案是提供一种提高植物抗旱性的方法，该方法为通过抑制尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)基因在植物体内的表达，从而提高其耐旱性。本发明方法为本领域提高植物抗旱性能提供了新的思路，是一种能提高植物抗旱性的新的有效方法，具有很好的应用前景。

Description

一种提高植物耐旱性的方法

技术领域

本发明属于提高植物抗性领域，具体涉及一种提高植物耐旱性的方法。

背景技术

生物体内大多数蛋白质都以糖蛋白形式存在，它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面。而且，病菌、病毒的侵染，癌细胞的增殖及转移，自身免疫疾病等都与细胞表面的糖密切相关。

糖基转移酶(Glycosyltransferases，GTs)是催化糖基与特异受体分子结合，形成糖苷键的酶。GTs广泛存在于生物体中，在植物中扮演重要角色，负责将活性供体的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类、核酸以及另外一些小分子，完成糖基化反应，以调控植物中从组织结构分子、储藏分子到特异信号分子的作用功能。

尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGTs)是一类C末端有42个一致氨基酸序列的糖基转移酶。而在植物中，Joe Ross等运用TopPred2，SignalP和Psort等预测软件对拟南芥UGTs的分析表明，拟南芥UGTs没有前导系列和停靠序列，这一现象支持植物UGTs是细胞质定位的观点，这也是普遍接受的观点。

水资源短缺是目前制约农业发展的一个全球性问题。据统计，全球约43％的耕地受到干旱、半干旱的威胁。干旱胁迫不仅严重影响作物生长发育、降低作物的产量，同时还限制优良作物品种的推广。因此，提高作物的抗旱能力是现代农业研究工作中的热点问题之一。

植物抗旱方面的研究涉及植物的形态、生理生化及分子生物学等诸多领域。植物在干旱条件下根系及叶片结构的变化，脱落酸(ABA)和气孔关闭的关系，渗透调节物质甘露醇、脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分子化合物与植物抗旱的关系，水孔蛋白、活性氧清除及胚胎发育晚期丰度蛋白对植物抗旱性的影响等抗旱方面的研究一直受到人们的关注。

随着分子生物学研究的发展，人们相继发现并克隆出了一些重要的耐旱基因，获得了烟草、水稻等抗旱转基因植株。并已在水稻上成功的进行了转抗旱基因水稻品系的培育，这为其他植物的转抗旱基因的研究带来了广阔的应用前景。目前，抗旱基因工程中也存在着一些问题。抗旱性是数量性状，由多基因控制，单基因转化能够提高植物的抗旱性，但具体到哪种植物适合哪种基因还有待于进一步研究。

目前利用基因工程技术培育抗旱品种主要有两种策略：增加植物渗透性代谢产物的合成能力，使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质(如甘露醇、甜菜碱、海藻糖等)，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性；增强植物对活性氧自由基的清除能力，使植物在水分胁迫下过度表达一些酶(如SOD，POD，CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，从而提高细胞耐脱水的能力。由于渗透调节是植物主要的耐旱机制，近年来人们已利用植物基因工程手段来增加目标植物中脯氨酸和甜菜碱的合成，在以渗透调节为主的耐旱性转基因植物培育方面取得了可喜的进展。

随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，植物基因工程研究正向纵深发展，抗性基因研究已由抗生物逆性(如抗病、抗虫)向抗非生物逆性(如抗寒、抗旱、抗盐等)转移。使用基因工程技术以期提高植物的抗旱性，培育出抗旱品系也是一个可行之道。但是目提高植物抗旱性的备选基因还较少，且都着重于通过提高表达能够增加抗旱性的基因，本领域需要有提高植物抗旱性的新方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能提高植物抗旱性的新的有效方法。解决该技术问题的技术方案是提供一种提高植物抗旱性的方法，该方法为通过抑制尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)基因在植物体内的表达，从而提高其耐旱性。

其中，上述方法中的抑制UGT基因在植物体内的表达，是用基因反向插入、基因敲除、RNA干扰中的任一种手段进行。

进一步的，上述方法包括以下步骤其特征在于包括以下步骤：a、构建UGT基因反向插入的表达质粒；b、将构建的UGT基因反向插入的表达质粒转入植物中获得转基因基因阳性植株，其UGT基因的表达被抑制，抗旱性得到提高。

其中，上述方法中所述的UGT基因为，其序列为SEQ ID NO.1所示。

其中，上述方法中所述的表达质粒为pCAMBIA2301。

本发明方法具体可通过以下方式实现：

a、获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

b、利用pMD18-T载体克隆UGT71C5基因片段，得到含有反向插入片段的载体。再构建UGT反向插入以抑制其表达的载体pCAMBIA2301-UGT。

c、将抑制表达载体pCAMBIA2301-UGT转化农杆菌，将转化成功的农杆菌转入植物得到转基因阳性种子或植株，所得的转基因阳性种子或植株建立的株系具有较高的抗旱性。

其中上述方法中所述的植物为十字花科植物。

本发明的有益效果在于，本发明方法通过建立了抑制尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶表达的植物株系，所得株系的耐旱性比野生型有明显提高，能够有效提高植物的抗旱性能，为本领域提高植物抗旱性能提供了新的思路，是一种能提高植物抗旱性的新的有效方法，具有很好的应用前景。

附图说明

图1拟南芥UGT71C5基因PCR扩增电泳图。

图2正向插入和反向插入的载体的构建示意图。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行具体说明。

克隆载体pMD18-T：一种能高效克隆由具有3’端加腺嘌呤核苷酸A的Taq聚合酶扩增的PCR产物(TACloning)的专用载体，从Takara公司购买。其他所用的载体、生化试剂，酶制剂，试剂盒均购于Takara公司。

实施例一、UGT71C5基因全长的克隆和载体构建

1、引物设计

利用NCBI数据库查询到UGT71C5基因全长，设计引物，并在上游引物中加入BmaH I酶切位点，下游引物中加入Sma I酶切位点。

上游引物(SEQ ID NO.3)：

5′-CGCGGATCCTAGATGAAGACAGCAGAGCTCATATTCG-3′；

下游引物(SEQ ID NO.4)：

5′-TCCCCCGGGATTATCTTGCTCTGAAAGTGAAATGGTC-3′。

2、从拟南芥cDNA中扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列

PCR反应体系(50μl)：

Template(cDNA)                5.0μl

25mM MgCl2                    4.0μl

10×Taq Buffer                5.0μl

2.5mM dNTP                    5.0μl

20mM上游引物(SEQ ID NO.3)     5.0μl

20mM下游引物(SEQ ID NO.4)     5.0μl

ddH₂O                         26.5μl

Taq酶(5U/μl)                 0.50μl

PCR反应参数：95.0℃预变性3min；95.0℃30s；52.0℃30s；72.0℃40s；重复30个循环；72℃延伸5min。

电泳检测如图1，由电泳图可看出，加入cDNA模板时，在分子量1400bp左右有明显的DNA扩增条带，条带大小与预期大小相符，初步确定扩增条带为目的基因片段拟南芥UGT71C5基因。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到SEQ IDNO.1所示核苷酸序列，与预期一致。

3、利用pMD18-T载体克隆UGT71C5基因片段

连接体系(10μl)，按照Takara pMD18-T载体试剂盒说明书建立，16℃连接过夜。

反应成分                    反应体积

回收PCR片段                 5.8μl

pMD18-T载体                 0.2μl

Soulution I(溶液I)          4μl

将10μl连接产物转入200μl大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中，后将转化后的菌液涂布于LB+Amp平板，37℃过夜培养。

从平板上挑取白色菌落，接种到200μl LB+Amp液体培养基中摇菌培养。用菌落PCR法检测转化子(菌落PCR所使用的上游引物为pMD18-T上游测序引物，配套的下游引物分别是UGT基因的上游引物)，这样可通过菌落PCR结果判断该片段插入的方向。

将通过菌落PCR法确认的含有正向插入片段和反向插入片段的两种大肠杆菌菌落分别接种于LB+Amp液体培养基中，37℃，225rpm振荡培养过夜。加入甘油保存菌液(85％菌液，15％纯甘油)，送Invitrogen公司测序。测序后经分析，克隆到的有正向插入和反向插入的UGT基因均正确无误，进行下一步实验。

4、利用pCAMBIA2301载体克隆UGT片段

载体构建策略如图2，包括UGT正向插入使其过量表达和UGT反向插入以抑制其表达的载体。

首先，分别酶切上一步构建的pMD18-T-UGT正向插入质粒、pMD18-T-UGT反向插入质粒和pCAMBIA2301质粒。

(1)选择pMD18-T-UGT正向或反向插入质粒，单酶切，30℃水浴6h，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

反应成分                            反应体积

10×Tango Buffer                    10μl

Smal I                              2.5μl

T-UGT正向/反向质粒(40ng/μl)        50μl

ddH₂O                        37.5μl

(2)pCAMBIA2301质粒酶切，SmaI 30℃酶切过夜，再加入Ecl136II 37℃酶切4h。为防止载体自连，再加入小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)2μl对质粒末端去磷酸化，37℃保温30min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

反应成分                            反应体积

10×Tango Buffer                    10μl

SmalI                               2.5μl

Ecl136II                            2.5μl

pCAMBIA2301质粒(40ng/μl)           50μl

ddH₂O                               35μl

其次，将产物回收，进行连接，16℃连接4个小时以上。连接体系(20μl)如下：

反应成分                            反应体积

10×Ligase Buffer                   2μl

T4Ligase                            1μl

UGT片段                             10μl

载体片段                            4μl

ddH₂O                               3μl

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用菌落PCR检测插入方向，菌落PCR上游引物为pCAMBIA2301质粒的35S上游引物，配套的下游引物分别是克隆UGT片段所使用的上下游引物(UGT下游引物检测正向过量表达质粒；上游引物检测反向抑制表达质粒)，这样可通过菌落PCR结果判断该片段插入的方向。将上述方法确认含有正向或反向插入片段的大肠杆菌菌落接种于LB+Amp液体培养基中，37℃，225rpm振荡培养过夜。加入甘油保存菌液(85％菌液，15％纯甘油)。

实施例二、将UGT71C5基因转入拟南芥

1、农杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

(1)挑取农杆菌EHA105单菌落接种到含有25μg/ml链霉素(Str)的LB培养基，在28℃条件下过夜培养摇活；

(2)取2ml过夜培养物加入到50ml的LB+Str的液体培养基中，继续摇活培养，直到OD600达0.5；

(3)冰上放置培养液10min，使培养物冷却至0℃；

(4)4℃，8000rpm，离心10min收集菌体；

(5)用1ml冰冷的10mM CaCl2溶液悬浮农杆菌。以100μl分装到1.5ml的EP管中，液氮速冻后放入-80℃保存。

2、转化农杆菌

(1)取出农杆菌感受态于冰上融化；

(2)加入2μl重组质粒，液氮冻5min，然后37℃水浴5min；

(3)加入1ml LB培养基28℃培养3h，低速离心收集菌体，将其涂在LB+Str(25μg/ml)+Kan(50μg/ml)平板上，28℃过夜培养。

3、重组质粒的鉴定

随机挑取重组平板上单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中，于28℃摇床培养过夜。用菌液作模板进行PCR扩增鉴定重组质粒，引物为35S启动子上的引物序列，配套克隆UGT片段所使用的上下游引物之一使用(参照实施例一)。

4、花序浸染法转化拟南芥

(1)28℃条件下大量培养含重组质粒的农杆菌，4℃下6000rpm离心5min收集菌体，用5％的蔗糖溶液重悬农杆菌使OD＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。

(2)在浸染之前加入表面活性剂Silwet-77至浓度0.05％(500μl/L)，如果产生表面活性剂的毒性现象(浸过部分发黄或死亡)，将浓度降至0.02％；

(3)将植株的表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中90s，同时轻轻旋转；

(4)套袋16～24h保持高度的湿润状态(注意：不可暴露在阳光之中)；

(5)隔天浇水，保证水分充足即可；

(6)角果自然开裂后可以收种子(T₀代种子)。

5、转基因种子筛选

将得到的拟南芥种子放置4℃过夜后，接种于MS+Kanr(50μg/ml)平板上，进行转基因植株的筛选。T₀代转基因植株PCR检测：筛选转基因植株后，移栽阳性苗于普通MS培养基5天后转移至土壤栽培，待植株发育至一定阶段后取叶片提取总DNA，用CaMV35S引物以及基因特异性引物搭配检测转基因植株。拟南芥总DNA的提取采取常规CTAB法。

6、转基因拟南芥纯合子的鉴定

由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为了后续生理性状实验及功能研究的需要，将T₀代转基因种子培育至T₂代，利用抗性筛选得到纯合子。根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kan(50μg/ml)平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。分别得到转入了UGT的大于3个独立株系的转基因纯合种子进行下一步试验。

实施例三、转基因植株的耐旱试验

选取正向转入UGT71C5的过量表达株系3个(OE1，OE2，OE3)，抑制表达株系(反向转入UGT71C5)3个(DN1，DN2，DN3)。选取上述株系中在培养条件一致的育苗盘培养1月左右的生长状况较一致的植株，将育苗盘剪开把各株系分成相同的两部分，一部分不浇水处理，另一部分作为对照，仍正常浇水，另选取野生型的植株作为对照。除了水一个因素，其它培养条件严格保证一致。按时观察苗的生长情况并做记录。

表1转入UGT71C5植株的耐旱试验结果

实验结果表明和正常浇水相比，在干旱胁迫条件下，野生型和3个正向转入UGT71C5的过量表达株系(OE1，OE2，OE3)均出现提前枯萎的情况。具体为当停止浇水14天时，3个OE株系的植物叶片发紫，呈完全萎蔫状态；停止浇水15天时，野生型完全萎蔫；而当不浇水处理17天时，抑制表达株系DN(反向抑制表达)才会出现萎蔫。实验结果表明，UGT71C5的过量表达能降低植物对干旱的耐受性，其耐受性甚至低于野生型，而抑制其表达则能提高植物对干旱的耐受性，其耐受性高于野生型和过量表达型。

另外，通过对获得的UGT 4个过量表达独立株系，6个反义抑制独立株系进行种子萌发、离体叶片失水率、根生长和脱水耐受实验。结果表明UGT71C5转基因植物在种子萌发、离体叶片的失水率分析和干旱耐受中均表现出与植物体内ABA水平相关表型，且在分子水平，能影响受ABA调控的一些基因的mRNA表达水平。UGT71C5过量表达转基因植物株系表现出种子的休眠程度降低、离体叶片失水率加强、干旱不耐受、ABA诱导基因Rab18和CYP707A2表达水平的降低等性状上的改变，都符合植物ABA缺陷表型；而抑制表达株系也与ABA过量积累植株表型一致。

由于ABA能促进气孔的关闭以阻止水分的散失。拟南芥和烟草中，ABA缺陷突变体和ABA信号途径突变体和都因为不能有效的关闭气孔而出现干旱不耐受，即出现枯萎的表型。结合离体叶片的分析结果，UGT71C5对干旱耐受特性的影响可能是改变了植物体内ABA的水平，从而调节气孔的关闭程度。如抑制UGT71C5的表达，则能起到提高植物抗旱性的作用。

总的说来，本发明那个方法能够有效提高植物的耐受干旱的能力，具有好的应用前景。

Claims (5)

1.一种提高植物耐旱性的方法，其特征在于：通过抑制尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因在植物体内的表达，从而提高其耐旱性。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述的抑制尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因在植物体内的表达，是用基因反向插入、基因敲除或RNA干扰中的任一种手段进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：a、构建尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因反向插入的表达质粒；b、将构建的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因反向插入的表达质粒转入植物中获得转基因基因阳性植株，其UGT基因的表达被抑制，抗旱性得到提高。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因序列为SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的表达质粒为pCAMBIA2301。

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