CN113980107B - 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用 - Google Patents

一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113980107B
CN113980107B CN202111357960.XA CN202111357960A CN113980107B CN 113980107 B CN113980107 B CN 113980107B CN 202111357960 A CN202111357960 A CN 202111357960A CN 113980107 B CN113980107 B CN 113980107B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
tobacco
gene
ntbhlh137
plant type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111357960.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113980107A (zh
Inventor
白戈
谢贺
杨大海
费明亮
袁诚
童治军
肖炳光
李永平
陈学军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Original Assignee
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences filed Critical Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority to CN202111357960.XA priority Critical patent/CN113980107B/zh
Publication of CN113980107A publication Critical patent/CN113980107A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113980107B publication Critical patent/CN113980107B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用，本发明所涉编码基因：烟草NtbHLH137基因核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；过量表达该基因能增加烟草的节距，改善烟草植株的株型，因此NtbHLH137在烟草株型育种领域有广阔的应用前景。本发明所述的NtbHLH137是植物MYC转录因子基因，调控NtbHLH137的表达能够调节烟株的节间距。因此所述的调控株型的基因NtbHLH137在植物株型育种领域应用前景，其经济效益潜力巨大。

Description

一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种植物编码序列、扩增引物及其在优化株型上的应用。
背景技术
株型一般分为叶型、茎型、穗型和根型等。叶型和茎型明显地影响田间群体结构状况和小气候，研究它们对利用和改善田间小气候、提高光能利用率和作物产量有着重要意义，因此农业气象研究中对株型观测着重于叶型和茎型的作物。观测株型也是栽培和育种工作所必须的。
目前关于株型育种的研究主要集中于玉米及水稻中。在玉米中株型可分为两大类，分别为平展型与紧凑型。细致划分，玉米株型主要可以分为叶型、茎型根型、穗型等形态。其中节间距的长度是重要的株型性状。节间距变大能够改善田间郁闭，增强通风透光情况，能够提高植物下部叶的光合利用效率，从而改善整株的光合利用率，达到增加产量的效果。目前对节间距的研究还比较少，即便存在少量的研究也是关于基因连锁分析层面。
烟草叶片较大，株高较高，造成其下部叶片透光性不是很良好，同时由于烟草叶片开片较大，也会影响烟田的通风情况。但是目前针对烟草株型尤其是节间性状育种的研究还比较少，怎么通过改善烟草的节间长度进而改善烟草的透光性、通风性最终提高烟草的光合利用率及烟草的总产量，是目前烟草育种的一个重要的研究方向。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一种植物编码序列，本发明所述的植物编码序列，其氨基酸残基序列如SEQ IDNo：2所示。
本发明所述的植物编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明涉及含有权利要求1或2所述的植物编码序列的表达载体。
本发明涉及含有权利要求1或2所述的植物编码序列的细胞系。
本发明涉及含有权利要求1或2所述的植物编码序列的宿主菌。
扩增上述的植物编码序列的引物，本发明所述的引物为正向引物：5’-ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTAC-3’、
反向引物：5’-TTAATGGAAAGAACAAAAGTTGTTG-3’。
上述引物的获取PCR扩增产物方法，本发明该方法包括PCR反应：
PCR反应体系为：50ul体系：Template DNA 1μl、primer-F(10uM)1μl、primer-R(10uM)1μl、5×buffer 10μl、dNTP mixture(10mM)1μl、PhusionDNA Polymerase 0.5μl、ddH2O加至50ul；
PCR反应扩增条件为：98℃5min，35个PCR循环(98℃30s；58℃30s；72℃30s)；72℃延伸5分钟，4℃保存。
上述的PCR扩增产物的回收和纯化：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质；
向离心管中加入3倍体积的QG溶液(体积/胶质量)后，在50℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的QG溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.75ml的PE溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的DNA溶液。
上述的植物编码序列在于优化烟草株型中的应用。
本发明的应用方法为过量表达该植物编码序列增加烟草的节间距。
本发明在植物中过量表达所述植物株型相关蛋白编码基因的方法包括如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。
本发明的有益效果为，本发明的植物节间距相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草株型育种提供基因与技术的支持。本发明所述的蛋白NtbHLH137是植物转录因子，可能参与到GA对植物的调控。在烟草中过表达该基因能够增加烟草节间距长度，改善烟草植株的株型，因此所述的株型调控基因NtbHLH137在植物株型育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1NtbHLH137的PCR产物电泳图；
图2为pdonr-zeo载体图；
图3为NtbHLH137基因植物表达载体PB2GW7图；
图4为转NtbHLH137基因的烟草株系NtbHLH137基因表达水平柱状图；
图5为NtbHLH137基因过量表达的烟草植株节间距变长对照图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明的第一目的在于提供一种烟草通过改善节间长度进而改善烟草株型的基因NtbHLH137；第二目的在于提供所述的烟草改善株型基因NtbHLH137的克隆方法，第三目的在于提供所述的烟草改善株型基因NtbHLH137的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草改善株型基因NtbHLH137的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、NtbHLH137基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtbHLH137基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草改善株型基因NtbHLH137在优化烟草株型中的应用。
本发明提供了一种新的植物决定节间长短蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物节间相关蛋白，名称为NtbHLH137，其来源于云烟87栽培烟草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID No：2；
2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物间距长短相关的蛋白质。
序列表中的序列2由366个氨基酸组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
NtbHLH137的编码基因(NtbHLH137)也属于本发明的保护范围。
NtbHLH137的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
含有本发明NtbHLH137的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增NtbHLH137中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了利用该基因改善烟草株型的方法，是在植物中过量表达上述植物相关蛋白编码基因。
过量表达上述植物改善株型相关蛋白编码基因NtbHLH137可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。本发明过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达NtbHLH137即可。
利用任何基因过表达或者基因修饰方法该NtbHLH137使植物表现为节间距增加；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的NtbHLH137转入植物中，植物就表现出节间距增加。
本发明的NtbHLH137基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物节间距长度来筛选转化植株。携带有本发明NtbHLH137基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
具体为：
本发明所述的烟草株型相关基因NtbHLH137的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
所述的烟草株型相关基因NtbHLH137编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明所述的烟草节间距相关基因NtbHLH137的克隆方法，包括以下步骤：
A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、NtbHLH137基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtbHLH137基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。
B步骤中所述的引物为：
正向引物：5’-ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTAC-3’
反向引物：5’-TTAATGGAAAGAACAAAAGTTGTTG-3’
B步骤中所述的PCR反应体系和扩增条件如下：
表1 PCR反应体系与条件
B步骤中所述的测序的具体操作为送交invitrogen公司进行测序。
B步骤中所述的回收和纯化PCR扩增产物的具体操作如下：
凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质。
向离心管中加入3倍体积的QG溶液(体积/胶质量)后，在50℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的QG溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.75ml的PE溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的DNA溶液。
本发明所述的烟草节间距长度相关基因NtbHLH137的应用，其特征在于所述的烟草节间距相关基因NtbHLH137在优化烟草株型中的应用。
所述获得优化株型的烟草植株的方法包括以下步骤：
A、构建载体：
根据烟草基因组中筛选出的NtbHLH137基因序列设计引物，并根据Gateway系统中的BP反应要求，在正向引物前加上5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3’序列，在反向引物前加5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC3’序列。PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。通过BP反应将这些片段克隆到pDONR-Zeocin载体中，然后通过LR反应将这些片段分别克隆到各自目的载体中。
采用技术构建载体，其原理可简述如下：
BP反应
(1)在200μl离心管中准备8μl的反应体系，包括：1～7μl的attB-PCR产物(约15～150ng，浓度≥10ng/μl)、1μl的pDONR载体(150ng/μl)和适量的TE缓冲液(pH8.0)，在室温下混匀；
(2)将BP ClonaseTMII酶混合物在冰上静置2min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；
(3)向(1)准备的样品中加入2μl的BP ClonaseTMII酶混合物，轻轻地将体系混匀；
(4)将BP ClonaseTMII酶混合物放回到-20℃或者-80℃保存；
(5)将反应体系放在25℃温浴1h；
(6)向反应体系中加入1μl的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37℃温浴10min，以便终止BP反应；
(7)将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的质粒备用。
LR反应
(1)在200μl离心管中准备8μl的反应物，包括：1～7μl的2.2.10.1获得的pDONR-Zeocin质粒(50～150ng)、1μl的目的载体(150ng/μl)和适量的TE缓冲液(pH8.0)，在室温下混匀；
(2)将LRClonaseTMII酶混合物静置在冰上2min融化，轻轻震荡2次以混匀；
(3)加入2μl的LRClonaseTMII酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；
(4)将LRClonaseTMII酶混合物放回到-20℃或者-80℃冰箱保存；
(5)将反应体系放在25℃温浴反应1h；
(6)向反应体系中加入1μl的蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37℃静置10min；
(7)将LR反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行酵母双杂和农杆菌转化等实验。
B、农杆菌转化：
将1μg(200ng/μl)目的质粒加入到100μl感受态农杆菌中，混匀后在冰上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μlLB溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48h。
C、培养转基因植株：
(1)无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；
(2)于75％的酒精中浸泡30-60sec；
(3)再用0.1％的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；
(4)播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天。
(5)待烟草苗长至3-5cm时(20-30天)，取顶芽放于MS+BA0.2 mg/L(壮芽，使其快速成长)培养基上，继代培养。
(6)继代培养14天后(有小叶片即可)，取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7)然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液，加入As25mg/L(40ml中加40ulAs)不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；
(8)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；
(9)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；
(10)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+BA 1.0mg/L+Bar25mg/L+Cef500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。
(11)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的小苗(1cm左右)，转入继代培养基MS+BA0.2-0.1mg/L+Bar25mg/L+Cef500mg/L pH5.8；
(12)至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基MS+NAA0.2-0.1mg/L上，24士1℃、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出粗壮根系。
(13)对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石＝7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。
农杆菌侵染液的制备
(1)取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mg/LKan和50mg/LRif；
(2)挑取单菌斑到含50mg/LKan和50mg/LRif的5mLLB液体培养基中，放入摇床中28℃、200rpm培养过夜(12h-16h)；
(3)保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。
(4)摇菌，LB液体培养基10ml加Kan(所需浓度50mg/L)10ul、Rif(所需浓度50mg/L)10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养(12h-16h)。
(5)当菌液浓度达到OD600＝1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm离心5min；
(6)倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。
(7)重复步骤(6)一次；
(8)用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中(含40ul25mg/L的As)，即为侵染液。放置2h以上，再侵染。
200ml悬菌液
20x大量10ml
200x有机1ml
200x铁盐1ml
200x微量1ml
蔗糖5.6g
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
1.烟草叶片cDNA合成
采用TRIZOL(Invitrogen，USA)试剂提取烟草叶片总RNA，将烟草叶片总RNA定量1μg于1.5ml离心管中，按照invitrogen公司的First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录,最终获得烟草叶片cDNA。
2.NtbHLH137基因的PCR扩增
以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行NtbHLH137基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。
引物为：
正向引物：5’-ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTAC-3’
反向引物：5’-TTAATGGAAAGAACAAAAGTTGTTG-3’
将扩增获得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果为(如图1所示)，获得1104bp大小的片段。
电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送invitrogen测序，验证序列结果，结果表明该序列与基因组数据库中数据完全相同。
实施例2
1.植物表达载体的构建
以实施例2中NtbHLH137全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中。将构建好的BP反应载体通过LR反应将NtbHLH137片段置换到PB2GW7载体中。
gateway反应引物序列如下：
NtbHLH137_F：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGCTGCTTTTTCAGACCAAT TAC-3’
NtbHLH137_R：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATGGAAAGAACAAAAGTTGT TG-3’。
2.农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定
将经过PCR反应及测序，鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌LBA4404，通过菌落PCR确定阳性农杆菌菌株，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种云烟87。
具体方法如下:
(1)无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；
(2)于75％的酒精中浸泡30-60sec；
(3)再用0.1％的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；
(4)播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天。
(5)待烟草苗长至3-5cm时(20-30天)，取顶芽放于MS+BA0.2 mg/L(壮芽，使其快速成长)培养基上，继代培养。
(6)继代培养14天后(有小叶片即可)，取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7)然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液，加入As25mg/L(40ml中加40ulAs)不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；
(8)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；
(9)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；
(10)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+BA 1.0mg/L+Bar25mg/L+Cef500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。
(11)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的小苗(1cm左右)，转入继代培养基MS+BA0.2-0.1mg/L+Bar25mg/L+Cef500mg/L pH5.8；
(12)至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基MS+NAA0.2-0.1mg/L上，24士1℃、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出粗壮根系。
(13)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。
采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，设计Basta抗性基因引物进行PCR扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。
按照实例1中所述方法提取野生型植株和10株转NtbHLH137基因T0代植株的总RNA,进行Real time-PCR分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最高的两株植株拍照，其它转基因植株统计节间表型。
NtbHLH137qRT引物
NtbHLH137_qRT_F：5’-AAGGCCCTCATGTTGGATGA-3’
NtbHLH137_qRT_R：5’-AGTAGGGCTAGTTTGCTGCA-3’
26s内参基因引物
26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’
26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’
实施例3
将野生型烟草云烟87植株和2个转基因系(OE-1、OE_2)转基因烟草种子均匀播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。待幼苗长至5-6片叶时观察植株生长情况，并记录相关数据，其它转基因植株统计节间表型。
NtbHLH137转基因OE-1、OE_2烟草节间长度明显优于野生型烟草植株，其它转基因植株材料节间统计数据表明，不同转基因植株的节间长度也要长于非转基因植株。表明OE-1、OE_2过表达的转基因烟草对日后烟草株型育种具有重要的意义。
SEQ ID No：1:
ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTACAGCACACAAACCCTTTCCTTCTTGACTCAGTTTTTTTGCCAAGTTCTCCTATTAAGATGTCTGGTTTTTTAGAGGAACAAAACAATTCTATAGTGCAGAATTGTTTTACTCAATTTTACCAACCAGAATCTTTTCAGCAGCTCCCAACTGCCAATGTGATTGTTCATGAAAGTAGCTATTGCCTTGACCAAAGTACAAATGTTACACTTAGCCAAAATGAGCTTAATTCTATGACCAACAACAGTAGCAGCAGTGTTAGCTTGGATATGGATTCTTCCTCTGTTACTGATAAAATAGAAAGTGGGAATAAGCCTAATTTTATTCCTATGGACAAGAAAAGAAAATCCAGAGAAGGGTCTTCCTCAATGAGTTCTGCTCATTCTAAGAATGTAAAACAGGTTGATAATGGGAAAAAGAAGAAAAGCAATAGCCAATCAGTAGGCAAAGATGAGAAAAAGGGAAAAGATGACAACAAAAAAGAGGAAAAGAAAGCTAATGAAGAGGCTCCAACAGGCTACATTCATGTTAGAGCAAGAAGGGGTCAAGCAACAGACAGCCATAGTCTTGCTGAAAGGGTGAGGAGAGAGAAAATAAGTGAAAGGATGAAGATACTGCAATCTCTTGTTCCTGGTTGTGACAAGGTGAATAACAAAGTAACTGGGAAGGCCCTCATGTTGGATGAGATAATCAATTATGTCCAATCTTTGCAAAACCAAGTTGAGTTTCTCTCCATGAAACTTGCTTCTTCGAATCCAATGTACTATGACTTTGGCATGGACTTAGATGCACTCATGGTCAGACCTGACCAGAGTTTGAGTGGATTGGGAACACCACTGCCAAACATGCAGCAAACTAGCCCTACTAACATTACATCACAGGCAGCTGAAGTTATTCCTAACATTAATAATAGTGGCTATCCTTTCTTGGATAATTCAGCTTCACTCATGTTTCAACAAGTCCATTTTCCTAATTCCATTTCTCAGGGTAATGGACAGCTCTTATGGGGTGCAGATGACCAAAGACAAAAATTAATTAATCAGTCAGGACTCAGCAACAACTTTTGTTCTTTCCATTAA
SEQ ID No：2:
MAAFSDQLQHTNPFLLDSVFLPSSPIKMSGFLEEQNNSIVQNCFTQFYQPESFQQLPTANVIVHESSYCLDQSTNVTLSQNELNSMTNNSSSSVSLDMDSSSVTDKIESGNKPNFIPMDKKRKSREGSSSMSSAHSKNVKQVDNGKKKKSNSQSVGKDEKKGKDDNKKEEKKANEEAPTGYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKISERMKILQSLVPGCDKVNNKVTGKALMLDEIINYVQSLQNQVEFLSMKLASSNPMYYDFGMDLDALMVRPDQSLSGLGTPLPNMQQTSPTNITSQAAEVIPNINNSGYPFLDNSASLMFQQVHFPNSISQGNGQLLWGADDQRQKLINQSGLSNNFCSFH
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用
<160>12
<210>1
<211>1101
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTACAGCACACAAACCCTTTCCTTCTTGACTCAGTTTTTTTGCCAAGTTCTCCTATTAAGATGTCTGGTTTTTTAGAGGAACAAAACAATTCTATAGTGCAGAATTGTTTTACTCAATTTTACCAACCAGAATCTTTTCAGCAGCTCCCAACTGCCAATGTGATTGTTCATGAAAGTAGCTATTGCCTTGACCAAAGTACAAATGTTACACTTAGCCAAAATGAGCTTAATTCTATGACCAACAACAGTAGCAGCAGTGTTAGCTTGGATATGGATTCTTCCTCTGTTACTGATAAAATAGAAAGTGGGAATAAGCCTAATTTTATTCCTATGGACAAGAAAAGAAAATCCAGAGAAGGGTCTTCCTCAATGAGTTCTGCTCATTCTAAGAATGTAAAACAGGTTGATAATGGGAAAAAGAAGAAAAGCAATAGCCAATCAGTAGGCAAAGATGAGAAAAAGGGAAAAGATGACAACAAAAAAGAGGAAAAGAAAGCTAATGAAGAGGCTCCAACAGGCTACATTCATGTTAGAGCAAGAAGGGGTCAAGCAACAGACAGCCATAGTCTTGCTGAAAGGGTGAGGAGAGAGAAAATAAGTGAAAGGATGAAGATACTGCAATCTCTTGTTCCTGGTTGTGACAAGGTGAATAACAAAGTAACTGGGAAGGCCCTCATGTTGGATGAGATAATCAATTATGTCCAATCTTTGCAAAACCAAGTTGAGTTTCTCTCCATGAAACTTGCTTCTTCGAATCCAATGTACTATGACTTTGGCATGGACTTAGATGCACTCATGGTCAGACCTGACCAGAGTTTGAGTGGATTGGGAACACCACTGCCAAACATGCAGCAAACTAGCCCTACTAACATTACATCACAGGCAGCTGAAGTTATTCCTAACATTAATAATAGTGGCTATCCTTTCTTGGATAATTCAGCTTCACTCATGTTTCAACAAGTCCATTTTCCTAATTCCATTTCTCAGGGTAATGGACAGCTCTTATGGGGTGCAGATGACCAAAGACAAAAATTAATTAATCAGTCAGGACTCAGCAACAACTTTTGTTCTTTCCATTAA
<210>2
<211>366
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
MAAFSDQLQHTNPFLLDSVFLPSSPIKMSGFLEEQNNSIVQNCFTQFYQPESFQQLPTANVIVHESSYCLDQSTNVTLSQNELNSMTNNSSSSVSLDMDSSSVTDKIESGNKPNFIPMDKKRKSREGSSSMSSAHSKNVKQVDNGKKKKSNSQSVGKDEKKGKDDNKKEEKKANEEAPTGYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKISERMKILQSLVPGCDKVNNKVTGKALMLDEIINY
VQSLQNQVEFLSMKLASSNPMYYDFGMDLDALMVRPDQSLSGLGTPLPNMQQTSPTNITSQAAEVIPNINNSGYPFLDNSASLMFQQVHFPNSISQGNGQLLWGADDQRQKLINQSGLSNNFCSFH
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTAC
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TTAATGGAAAGAACAAAAGTTGTTG
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC
<210>7
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGCTGCTTTTTCAGACCAATTAC
<210>8
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATGGAAAGAACAAAAGTTGTTG
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
AAGGCCCTCATGTTGGATGA
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
AGTAGGGCTAGTTTGCTGCA
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
TCTCCCTTTAACACCAACGG

Claims (3)

1.一种基因在优化烟草节间距中的应用，其特征在于，所述基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，过量表达该基因增加烟草的节间距。
CN202111357960.XA 2021-11-16 2021-11-16 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用 Active CN113980107B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111357960.XA CN113980107B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111357960.XA CN113980107B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113980107A CN113980107A (zh) 2022-01-28
CN113980107B true CN113980107B (zh) 2023-08-08

Family

ID=79748898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111357960.XA Active CN113980107B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113980107B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113930433B (zh) * 2021-11-16 2023-04-11 云南省烟草农业科学研究院 一种植物编码序列、扩增引物及其在优化株高上的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164391A (zh) * 2017-06-30 2017-09-15 沈阳农业大学 一种草莓开花基因FvbHLH78及其应用
CN111187776A (zh) * 2020-01-18 2020-05-22 华中农业大学 一种球根花卉休眠解除相关基因及其应用
CN113930433A (zh) * 2021-11-16 2022-01-14 云南省烟草农业科学研究院 一种植物编码序列、扩增引物及其在优化株高上的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110004955A1 (en) * 2008-01-30 2011-01-06 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
DE112012001020T5 (de) * 2011-02-28 2013-12-19 Basf Plant Science Company Gmbh Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu deren Herstellung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164391A (zh) * 2017-06-30 2017-09-15 沈阳农业大学 一种草莓开花基因FvbHLH78及其应用
CN111187776A (zh) * 2020-01-18 2020-05-22 华中农业大学 一种球根花卉休眠解除相关基因及其应用
CN113930433A (zh) * 2021-11-16 2022-01-14 云南省烟草农业科学研究院 一种植物编码序列、扩增引物及其在优化株高上的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lukhovitskaya NI 等."Nicotiana tabacum transcription factor bHLH137-like (LOC107805224), mRNA".《genbank》.2016,ACCESSION NM_001325767. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113980107A (zh) 2022-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106916827B (zh) 一种烟草抗低温胁迫诱导早花基因NtMYB15及其克隆方法与应用
Hosokawa et al. Genetic transformation of gentian using wild-type Agrobacterium rhizogenes
CN110317815B (zh) 一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用
CN113980107B (zh) 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用
CN111153976A (zh) 一种水稻防御机制调控蛋白质及其在育种中的应用
CN113930433B (zh) 一种植物编码序列、扩增引物及其在优化株高上的应用
CN109852634B (zh) 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法
CN116083445A (zh) 一种CrBZR1基因及其应用
CN113234720B (zh) 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用
CN115772212A (zh) 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用
CN116064573A (zh) 一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用
CN116064572A (zh) 一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用
CN109207487B (zh) 一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用
CN108017696B (zh) 菊花CmTFL1c基因及其应用
CN107058340B (zh) 一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用
CN106755070B (zh) 一种创制耐热芥蓝种质的方法
CN115011631B (zh) 调控玉米苗期抗旱性的蛋白及其编码基因和应用
CN113666992B (zh) 一种草莓白粉病抗性基因及其应用
CN114805513B (zh) 烟草NtOEE1基因及其在调控茎叶夹角和株高中的应用
CN114990132B (zh) 柑橘CcLFY基因在调控枝梢发育中的应用
CN116656698B (zh) 玉米基因Zm00001d018037在提高单子叶农作物抗旱性能方面的应用
CN116004672B (zh) 提高植物生物量和产量的磷酸甘油酸激酶基因及其应用
CN116410285A (zh) 烟草转录因子NtbHLH68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用
CN116716337A (zh) 拟南芥基因RecA1在改变植物信号传导相关基因编码mRNA碱基中的应用
CN117587032A (zh) 84K杨PagMYB4基因及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant