CN109207487B - 一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用 - Google Patents

一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用 Download PDF

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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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Abstract

本发明公开了一种油菜耐渍基因BnaLPP1的制备方法，步骤是：1、以淹水胁迫处理的油菜芽为材料，采用植物总RNA抽提试剂盒提取总RNA，采用反转录试剂盒，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段；2、扩增程序：共35个循环，利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pTOPO载体连接，得到重组质粒pTOPO‑BnaLPP1，转化大肠杆菌感受态细胞，测序，核苷酸序为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及氨基酸序列SEQ ID NO.3；3、对测序的结果与模板序列进行比对，采用胶回收试剂盒回收目的基因和表达载体。4、接着用T4连接酶，扩繁后提取重组质粒。5、对重组质粒进行酶切验证。该基因的应用。方法易行，操作简便，实现在油菜中的快速、准确分离。提高作物耐渍能力，对提高作物产量意义重大。

Description

一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程和转基因技术领域，更具体涉及一种油菜耐渍基因BnaLPP1，同时还涉及一种油菜耐渍基因BnaLPP1的制备方法，还涉及一种油菜耐渍基因BnaLPP1的用途。
具体涉及油菜耐渍基因BnaLPP1及其应用。
背景技术
渍害是制约长江流域农业生产的主要因素之一，由于长江流域湿润多雨的气候特点，加上栽培模式等因素的影响，更加导致了渍害程度加深。如何解决渍害问题是实现农业可持续发展的重要挑战。
由于传统作物耐渍育种周期长，成效缓慢且受耐渍种质资源狭窄等因素的制约，使得当前耐渍育种进展缓慢。当前迅速发展的生物技术育种，尤其是转基因技术打破了物种间的限制，为高效耐渍育种提供了新的途径，但耐渍基因资源的获得是耐渍转基因作物新品种的关键。油菜是世界上重要的油料作物之一，在我国油菜主要分布于长江流域,在该地区主要为水稻油菜的轮作制度，油菜渍害发生十分普遍，占长江流域总面积10-20％以上。从耐渍油菜品种中挖掘优异的耐渍基因材料，并克隆耐渍基因在植物耐渍育种中具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处，是在于提供了一种油菜耐渍基因BnaLPP1，这项研究对阐明植物耐渍机制以及利用耐渍基因提高作物耐渍能力有重要意义。超表达该基因可以有效提高淹水胁迫下植株存活率85％左右，并且其生长量比野生型提高65％。
本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜耐渍基因BnaLPP1的制备方法，方法易行，操作简便，实现该基因在油菜中的快速、准确分离。
本发明还有一个目的是在于提供了一种油菜耐渍基因BnaLPP1在提高植物耐渍中的应用，在渍害发生时，可以提高作物耐渍能力，对提高作物产量意义重大。
为了实现上述的目的，本发明采取以下技术方案：
依据前期油菜渍害胁迫响应转录组学测序结果(Comparison of TranscriptomesUndergoing Waterlogging at the Seedling Stage Between Tolerant and SensitiveVarieties of Brassica napus L.,Journal of Integrative Agriculture,2015,14(9):1723-1734)，鉴定到渍害胁迫诱导表达基因BnaLPP1，申请人以油菜芽为材料，分离出BnaLPP1基因，将该基因构建表达载体，转化到拟南芥后，可显著提高植株的耐渍能力。利用本发明所述基因，构建各种植物表达载体，可广泛应用于转基因植物和作物耐渍新品种的培育。
一种油菜耐渍基因BnaLPP1的制备方法，其步骤是：
1、以淹水胁迫处理一小时的油菜芽为材料,采用植物总RNA小量(10mg)抽提试剂盒(Magen)提取总RNA，采用反转录试剂盒(TIANGEN)，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 10μl,上游引物5’–ggatccATGAATTGCATTCCGTTACTAC–3’10μM 0.5μl，下游引物5’–ggtaccTCATCCACACTCTCACGACGA–3’10μM 0.5μl，cDNA1μl，ddH2O 8μl，总体积为20μl；
2、扩增程序为：98℃2min，98℃10s，55℃15s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸10min，利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pTOPO载体(AidLab)连接，得到重组质粒pTOPO-BnaLPP1，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选菌落做PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳有条带后，测序，PCR测定序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，分子量为1170bp。
3、对测序的结果与模板序列进行比对，比对结果为100％后，提取含有BnaLPP1基因的T-载体(大连宝生物工程有限公司)和植物表达载体PS2300质粒(上海北诺生物科技有限公司)DNA并用BamHI和KpnI两种内切酶对所提的质粒进行双酶切，酶切体系BamHI 1.5μl，KpnI 1.5μl，10×buffer 5μl，质粒DNA 12μl，ddH2O 30μl，总体积50μl在37℃酶切5.5h，并对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。采用胶回收试剂盒(TIANGEN)回收目的基因和表达载体。
4、接着用T4连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为载体PS2300 0.5μl，目的片段3.5μl，T4连接酶0.5μl，T4buffer 0.5μl，总体积5μl，室温(20－25℃，以下相同)连接3h，将连接好的重组质粒PS2300-BnaLPP1转化大肠杆菌DH5ɑ(普通)感受态细胞，挑选菌落做PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳有条带后，扩繁后提取重组质粒。
5、对重组质粒进行酶切验证。在37℃酶切4h，其酶切体系BamHI 0.5μl，KpnI 0.5μl，10×buffer 1μl，质粒DNA4μl，ddH2O4μl，总体积10μl。对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察发现有目的基因条带和表达载体条带，说明目的基因成功连上表达载体。
通过上述技术措施，获得了一种油菜耐渍基因BnaLPP1，其主要特点在于从油菜芽中分离到BnaLPP1基因的cDNA的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，分子量为1170bp。
通过上述技术措施，获得了一种油菜耐渍基因BnaLPP1的编码序列为上述BnaLPP1基因cDNA的核苷酸序列中第1位至第984位所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，分子量为984bp：
通过上述技术措施，获得了一种油菜耐渍基因BnaLPP1的编码序列编码的蛋白质氨基酸序列，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，由327个氨基酸组成。
通过转基因实验表明，BnaLPP1基因能够显著提高拟南芥耐渍性，该基因可用于植物或作物耐渍育种。
所述的油菜耐渍基因BnaLPP1，其引物为：
BnaLPP1-F15’–ggatccATGAATTGCATTCCGTTACTAC–3’
BnaLPP1-R15’–ggtaccTCATCCACACTCTCACGACGA–3’。
由奥科鼎盛(武汉)生物科技有限公司合成。
一种油菜耐渍基因BnaLPP1在提高植物耐渍中的应用，其步骤是：
1.本发明中重组质粒PS2300-BnaLPP1，所述的质粒PS2300-BnaLPP1插入SEQ IDNO.1的BnaLPP1基因cDNA的核苷酸序列或cDNA编码序列中。
2.任何可以将外源基因导入植物的表达载体都可用于本发明。
3.本发明提供的耐渍基因BnaLPP1的作用主要体现在可提高植物耐渍性，可广泛应用于耐渍作物、植物新品种(系)的选育。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明的有益效果在于首次从油菜中克隆到一个新的耐渍基因，进一步转化拟南芥进行耐渍鉴定，结果发现转化BnaLPP1基因的拟南芥株系耐渍性优异，对提高作物耐渍性意义重大。同时BnaLPP1的分子量为1170bp，编码蛋白含有327个氨基酸，方便遗传转化操作，本发明中耐渍基因的获得为耐渍作物和植物新品种(系)培育提供了珍贵的基因资源。本发明对阐明植物耐渍机制以及利用耐渍基因提高作物耐渍能力有重要意义。
附图说明：
图1为一种BnaLPP1基因cDNA编码序列的扩增结果示意图。
M：DL2000 Marker；1-2为BnaLPP1基因PCR产物。
图2为一种导入PS2300-BnaLPP1质粒的农杆菌PCR鉴定示意图
M：DL2000 Marker，1-2均为单克隆摇菌的菌液编号，
图3为一种BnaLPP1基因拟南芥T3代阳性植株分子检测结果示意图。
M：DL2000 Marker，1-12为阳性苗PCR产物，“WT”：野生型拟南芥；“+”：质粒；“-”：空白对照。
图4为一种转化BnaLPP1基因的T3代株系在人工模拟渍害胁迫下的生长状态示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举例子只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
以下的实施例便于更好的理解本发明,并不是限制本发明.下面实施例的实验方法等，若无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：
一种油菜耐渍基因BnaLPP1的制备方法，其步骤是：
1、以淹水胁迫处理1小时的油菜芽为材料，采用植物总RNA小量抽提试剂盒(Magen)提取总RNA，采用cDNA试剂盒，反转录合成cDNA第一链，
2、扩增该基因片段，PCR反应体系为I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 10μl，上游引物5’–ggatccATGAATTGCATTCCGTTACTAC–3’10μM 0.5μl，下游引物5’–ggtaccTCATCCACACTCTCACGACGA–3’10μM 0.5μl，cDNA1μl，ddH2O 8μl，总体积为20μl；、扩增程序为：98℃2min，98℃10s，55℃15s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸10min；
3、利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pTOPO载体连接，得到重组质粒pTOPO-BnaLPP1，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选菌落做PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳有条带后，测序。PCR测定序列如SEQ ID NO.1。
4、分离到BnaLPP1基因的cDNA的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，分子量为1170bp；所述的油菜耐渍基因BnaLPP1的编码序列为上述基因中第1位至第984位所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，分子量为984bp：所述的油菜耐渍基因BnaLPP1的编码序列编码的蛋白质氨基酸序列，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，由327个氨基酸组成。
实施例2：
一种油菜耐渍基因BnaLPP1表达载体的构建方法，其步骤为：
1、提取含有BnaLPP1基因的T-载体和植物表达载体PS2300质粒DNA并用BamHⅠ和KpnⅠ两种内切酶对所提的质粒进行双酶切，酶切体系BamHⅠ1.5μl，KpnⅠ1.5μl，10×buffer5μl，质粒DNA12μl，ddH2O 30μl，总体积50μl在37℃酶切5.5h，并对酶切产物进行纯化。
2、接着用T4连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为载体PS2300 0.5μl，目的片段3.5μl，T4连接酶0.5μl，T4buffer0.5μl，总体积5μl，室温连接3h，将连接好的重组质粒PS2300-BnaLPP1转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，挑选菌落做PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳有条带后，扩繁。
3、同时对重组质粒在37℃酶切5.5h，其酶切体系BamHⅠ1.5μl，KpnⅠ1.5μl，10×buffer 5μl，质粒DNA12μl，ddH2O 30μl，总体积50μl。并对双酶切产物进行电泳检测。
实施例3：(农杆菌拟南芥转化与培养方法)
一种油菜耐渍基因BnaLPP1在提高植物耐渍中的应用，其步骤是：
1.将重组质粒PS2300-BnaLPP1转入感受态农杆菌GV3101(TRANSGEN)中，见图2，菌液PCR后跑琼脂糖凝胶电泳后，验证得到重组质粒PS2300-BnaALAAT1成功转入农杆菌；
2.制备农杆菌浸染液，采用蘸花法浸染拟南芥花序；
3.将浸染的植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中常规培养，待拟南芥成熟后分单株收获种子；
4.收获的拟南芥种子4℃处理、灭菌后，在含抗生素Kan(50μg/ml)的1/2MS固体培养基中播种筛选阳性苗，并将阳性苗移栽至培养基质(蛭石：营养土为1：1体积比混合)中种植，待幼苗长大后，剪取植株叶片提取DNA，用实施例1中BnaLPP1基因上下游引物扩增表达载体PS2300-BnaLPP1中BnaLPP1基因片段；
5.连续用抗生素Kan筛选，并进行目标基因PCR检测(见图3)，直到获得T3代转BnaLPP1基因拟南芥纯系。
实施例4：(转BnaLPP1基因耐渍性鉴定)
一种油菜耐渍基因BnaLPP1在提高植物耐渍中的应用，其步骤是：
1.将实施例3中获得的T3代转BnaLPP1基因拟南芥纯系植株和野生型拟南芥(Col-0)种子播种于1/2MS固体培养基中；
2.一周后移至培养基质(蛭石：营养土为1：1体积比混合)中，在人工培养温室(22℃)中培养，待幼苗长至一个月后，挑选长势一致的幼苗放入物料盒中，用水没过植株上方1cm并避光生长1周；
3.将幼苗从水中拿出，放温室正常生长1周后，结果发现，转BnaLPP1基因拟南芥淹水处理后，长势明显好于野生型拟南芥，调查淹水处理后恢复生长一周后植株的存活率，野生拟南芥85％的植株已经死亡，15％的存活植株也有不同程度的叶片发黄干枯；而转BnaLPP1基因拟南芥耐渍性良好，恢复生长一周后，植株基本都长出新的叶芽，能够继续存活(见图4)。对比两者长势水平，转BnaLPP1基因拟南芥植株生长量比野生型拟南芥提高了65％。
上述结果可以表明，BnaLPP1基因能够显著提高拟南芥耐渍性，该基因可用于植物或作物耐渍育种。
上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaattgca ttccgttact acgctcatcc aaatcagaga cttcaaaccc tataaacctc 60
caagaacaag agccgcagag agggaggatg caggagatag atcttggtat ccacacaata 120
aggagccatg gagtcggcgt cgcctctaaa cacaaacacg actggattat actcgtgatc 180
ttggtggcca tcgagatcgg tttgcagctc atatctcctt tctacagata cgttgggaga 240
gacatgatga ctgatcttaa ataccctttt aacgacaaca ccgttcctgt ctggtcagta 300
ccaatctacg ctgtgctgct cccgatcata gtgttcgtct gtttctacat gaagagaaca 360
tgcgtgtacg atcttcacca cagcattctc gggctgctct tcaccgtctt gataactggt 420
atcatcactg actccatcaa gctcgccacg ggacgccctc gtcctaactt ctactggcgt 480
tgcttccctg acgggaatga ggtgtacaac gcgttgggtg gtgtgatatg ccatggtaaa 540
ccaggagagg ttaaagaagg tcacaaaagc ttcccgagtg gacacacgtc ttggtctttc 600
gcgggacttg gctacctctc gctttacttg tctggtaaag tcaaggcctt caacagagaa 660
gggcatgttg ctaagctctg ccttgtgttc gctcctcttc tcgcggcttg tctcgtgggg 720
atatcgcgtg tggatgacta ctggcatcat tggcaagacg tatttgctgg agctcttatt 780
ggtctctttg tggctgcctt ttgttaccgt cagttttatc ctaatcctta ccatgaagaa 840
gggtggggtc cttatgctta tttcagagcg gcgcaggagc gtggacaagc gcagaatgga 900
gatgtgttga ggacaatgtc tttgcaggtg gaaccaactt ctcttgaaaa catggagtct 960
ggcacttcat ctgttcgaag atgattagtt cctcttcttt cttcatttga ttatttggta 1020
tttttcattt tggtcgtcgt gagagtgtgg atgaggtagt tgcatgtgta ttttttaacc 1080
tttaactagt actcttacat ttgtatgtaa atctattctt catatcttgg tttttggcat 1140
tttttttata atcagagtca ggaagatggc 1170
<210> 2
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaattgca ttccgttact acgctcatcc aaatcagaga cttcaaaccc tataaacctc 60
caagaacaag agccgcagag agggaggatg caggagatag atcttggtat ccacacaata 120
aggagccatg gagtcggcgt cgcctctaaa cacaaacacg actggattat actcgtgatc 180
ttggtggcca tcgagatcgg tttgcagctc atatctcctt tctacagata cgttgggaga 240
gacatgatga ctgatcttaa ataccctttt aacgacaaca ccgttcctgt ctggtcagta 300
ccaatctacg ctgtgctgct cccgatcata gtgttcgtct gtttctacat gaagagaaca 360
tgcgtgtacg atcttcacca cagcattctc gggctgctct tcaccgtctt gataactggt 420
atcatcactg actccatcaa gctcgccacg ggacgccctc gtcctaactt ctactggcgt 480
tgcttccctg acgggaatga ggtgtacaac gcgttgggtg gtgtgatatg ccatggtaaa 540
ccaggagagg ttaaagaagg tcacaaaagc ttcccgagtg gacacacgtc ttggtctttc 600
gcgggacttg gctacctctc gctttacttg tctggtaaag tcaaggcctt caacagagaa 660
gggcatgttg ctaagctctg ccttgtgttc gctcctcttc tcgcggcttg tctcgtgggg 720
atatcgcgtg tggatgacta ctggcatcat tggcaagacg tatttgctgg agctcttatt 780
ggtctctttg tggctgcctt ttgttaccgt cagttttatc ctaatcctta ccatgaagaa 840
gggtggggtc cttatgctta tttcagagcg gcgcaggagc gtggacaagc gcagaatgga 900
gatgtgttga ggacaatgtc tttgcaggtg gaaccaactt ctcttgaaaa catggagtct 960
ggcacttcat ctgttcgaag atga 984
<210> 3
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Cys Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Lys Ser Glu Thr Ser Asn
1 5 10 15
Pro Ile Asn Leu Gln Glu Gln Glu Pro Gln Arg Gly Arg Met Gln Glu
20 25 30
Ile Asp Leu Gly Ile His Thr Ile Arg Ser His Gly Val Gly Val Ala
35 40 45
Ser Lys His Lys His Asp Trp Ile Ile Leu Val Ile Leu Val Ala Ile
50 55 60
Glu Ile Gly Leu Gln Leu Ile Ser Pro Phe Tyr Arg Tyr Val Gly Arg
65 70 75 80
Asp Met Met Thr Asp Leu Lys Tyr Pro Phe Asn Asp Asn Thr Val Pro
85 90 95
Val Trp Ser Val Pro Ile Tyr Ala Val Leu Leu Pro Ile Ile Val Phe
100 105 110
Val Cys Phe Tyr Met Lys Arg Thr Cys Val Tyr Asp Leu His His Ser
115 120 125
Ile Leu Gly Leu Leu Phe Thr Val Leu Ile Thr Gly Ile Ile Thr Asp
130 135 140
Ser Ile Lys Leu Ala Thr Gly Arg Pro Arg Pro Asn Phe Tyr Trp Arg
145 150 155 160
Cys Phe Pro Asp Gly Asn Glu Val Tyr Asn Ala Leu Gly Gly Val Ile
165 170 175
Cys His Gly Lys Pro Gly Glu Val Lys Glu Gly His Lys Ser Phe Pro
180 185 190
Ser Gly His Thr Ser Trp Ser Phe Ala Gly Leu Gly Tyr Leu Ser Leu
195 200 205
Tyr Leu Ser Gly Lys Val Lys Ala Phe Asn Arg Glu Gly His Val Ala
210 215 220
Lys Leu Cys Leu Val Phe Ala Pro Leu Leu Ala Ala Cys Leu Val Gly
225 230 235 240
Ile Ser Arg Val Asp Asp Tyr Trp His His Trp Gln Asp Val Phe Ala
245 250 255
Gly Ala Leu Ile Gly Leu Phe Val Ala Ala Phe Cys Tyr Arg Gln Phe
260 265 270
Tyr Pro Asn Pro Tyr His Glu Glu Gly Trp Gly Pro Tyr Ala Tyr Phe
275 280 285
Arg Ala Ala Gln Glu Arg Gly Gln Ala Gln Asn Gly Asp Val Leu Arg
290 295 300
Thr Met Ser Leu Gln Val Glu Pro Thr Ser Leu Glu Asn Met Glu Ser
305 310 315 320
Gly Thr Ser Ser Val Arg Arg
325

Claims (1)

1.油菜耐渍基因BnaLPP1在提高植物耐渍性中的应用，其特征在于，所述基因BnaLPP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
CN201811399759.6A 2018-11-22 2018-11-22 一种油菜耐渍基因BnaLPP1及制备方法和应用 Active CN109207487B (zh)

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Comparison of transcriptomes undergoing waterlogging at the seedling stage between tolerant and sensitive varieties of Brassica napus L.;ZOU Xi-ling et al.;《Journal of Integrative Agriculture》;20151231;第14卷(第9期);第1723-1734页 *
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