CN116064573A - 一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用。本发明通过过表达MdTCP17基因在植物中的表达，增加MdTCP17基因在植物中的表达量和MdTCP17蛋白的含量，进而抑制植物不定根的发生和伸长，降低不定根的数目，说明MdTCP17基因可以抑制植物不定根的发育，可用于指导培育不定根发育能力强的植物品种，降低植物育苗成本，提高植物育种效率，缩短生产年限。

Description

一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用。
背景技术
苹果(Malus domestica)，属于蔷薇科(Rosaceae)苹果属植物，作为重要的温带果树作物之一，不仅具有较高的观赏价值，同时其营养价值和带来的经济效益也是不可忽视的。苹果是世界范围内种植的主要经济果树之一，我国是世界第一大苹果主产国，产量和面积均占世界的一半以上，规模优势明显，但我国苹果种业发展中存在育种效率低、自主知识产权品种占比少和种苗无性繁殖效率低等问题，与欧美等国尚存在一定差距。
不定根再生是植物快速繁殖的有效途径，也为不定根发育的研究提供了有效的实验体系。目前，中国的矮砧密植苹果园栽培面积占总面积的比例仅为15％左右，且以矮化中间砧为主，其中优良矮化砧木的高效繁育技术尚未建立和推广，是造成这一局面的主要原因之一，优良砧木的推广至关重要，而不定根的诱导是砧木繁育的关键所在。
近年来发现TCP转录因子除了在植物发育过程中对细胞增殖和侧生器官的重要调控作用外，它们还能参与植物激素信号传导等过程。但是TCP家族其他成员并未报道参与根系生长发育。因而，研究TCP基因对不定根发生的调控机制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用，所述MdTCP17基因可以抑制植物不定根的发育，通过抑制MdTCP17基因的表达，促进植物不定根的发生和伸长。
本发明提供了一种抑制不定根发育的MdTCP17基因，所述MdTCP17基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdTCP17基因编码的MdTCP17蛋白，所述MdTCP17蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明还提供了干扰上述技术方案中所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列，如SEQID NO.3所示。
本发明提供了一种重组表达载体，包括上述技术方案所述的MdTCP17基因或干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的MdTCP17基因、干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列或所述重组表达载体。
本发明还提供了以所述MdTCP17基因为靶点在调控不定根的发育、植物无性繁殖和辅助植物分子育种中的一项或多项中的应用。
优选的，所述调控不定根的发育包括：通过抑制所述MdTCP17基因的表达在下述Ⅰ～Ⅲ中任一项或多项中的应用：
Ⅰ：促进植物不定根的发生；
Ⅱ：促进植物不定根的伸长；
Ⅲ：增加植物不定根的数目；
或通过促进所述MdTCP17基因的表达在下述A～C中任一项或多项中的应用：
A：抑制植物不定根的发生；
B：抑制植物不定根的伸长；
C：减少植物不定根的数目；
优选的，所述植物包括园艺植物和/或林木植物。
本发明还提供了一种培育不定根发育能力强的植物的方法，抑制目的植物中MdTCP17基因的表达或降低目的植物中MdTCP17蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。
优选的，所述不定根发育能力强的植物为通过向所述目的植物中导入干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列得到的植物。
有益效果：
本发明提供了一种抑制不定根发育的MdTCP17基因，并具体公开了其核苷酸序列。本发明通过在植物中的过表达MdTCP17基因，增加MdTCP17基因在植物中的表达量和MdTCP17蛋白的含量，进而抑制植物不定根的发生和伸长，减少不定根的数目，说明MdTCP17基因可以抑制植物不定根的发育，可用于指导培育不定根发育能力强的植物品种，降低植物育苗成本，提高植物育种效率，缩短生产年限。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为MdTCP17基因在M.9-T337和圆叶海棠中核苷酸序列比对结果；
图2为MdTCP17基因的亚细胞定位结果；
图3为MdTCP17转基因苹果阳性株系鉴定和不定根发生表型统计；
图4为过表达MdTCP17转基因杨树株系及野生型形态表型观察。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制不定根发育的MdTCP17基因，所述MdTCP17基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具体如下：5’-ATGATAACAAATTCAAGGGACAAGGGTTTCCAAGCAAAGCAAGAGGGCCACAACAACAACAATAACAATGACGGGAGCAACAATAGTAGTTTTCATAAGGCATCATCATCAAGTACTACTACTTCAAGGCAATGGTCTGGATTTAGAAATCCAAGGATCGTACGTGTTTCGCGTACTTTCGGTGGGAAAGATAGGCACAGCAAGGTTTCCACAGTGAGGGGATTGAGGGACAGGAGAATTAGGCTTTCAGTACCAACGGCCATTCAATTATATGATCTTCAAGATAGGCTTGGTCTTAGCCAACCTAGCAAGGTAATAGACTGGCTGCTTGACATTACGGAACAAGATATCGATAAGCTCCCTCCACTTCAAGTTCCTCATGGATTTGGTCATCAATTTCATCAACCAATGCTAAATCCTCATCAAGTTAGTAATTCTCTTGTTGCTCCTTTCTTTGATGTAAATTCTACTTTTATGGAGGCAGACCAAGTTGATCATCAAGAAGTTCGTGATCAAGCAAAAGGCAAGTCGATCAAGACAAACGACGGACAAGATGATCAAAATCGTCATGATCACGAAGGAAATGTTGGACAACTCTTAGCTCAAAAGCTATTTCCCATAGGCTCTTCTTCCATACCTGGCATGCTAAATAATGCAATGGCATACAACTACTATCACAACTATTCAGAGCCTTCAACGCTATCTCTAGCGCAGTTTGGTAGCCATGGATTTCCACAAGTACCACAATTAGATCAGCATCATAGTCACATGATGAGTACTAATGCCTTATCATTTTCAACTCCAATGCCATCTGTTTCTCAATTATTCTTCCGTCCACCTACAGCAACACCGATGCTTTTCGGTTCATATCCTCCATATATTACCAATCCAATAGTGGAGGGTACTAGTACTGCTACCGATCAGCCTCGACAAACCAACCATTTCCAATTTTTGAGCTCACCAAGTAATTCACAAAATTTCCTAGCTAACAATGCTCTCATGCCTCCTCTTCATTCAGTTAGCTCATCCTTGAAATCCTTTCCATCATTGGTTCATCCCAAGCAGCAGCTCCATTTGAATTCACAAAATAACAATGGAAGCCAACCAAATAAAGACGTTCCATAA-3’。
本发明的发明人从苹果中分离并鉴定的一个调控不定根发育的基因MdTCP17。实验发现苹果中过表达MdTCP17能够明显抑制苹果不定根形成，而抑制MdTCP17表达促进不定根形成。在杨树中异源过表达MdTCP17抑制杨树不定根的形成，主要抑制了不定根数目。结果表明MdTCP17在调控不定根发育中发挥重要作用。
本发明还提供了上述技术方案所述的MdTCP17基因编码的MdTCP17蛋白，所述MdTCP17蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具体为：MITNSRDKGFQAKQEGHNNNNNNDGSNNSSFHKASSSSTTTSRQWSGFRNPRIVRVSRTFGGKDRHSKVSTVRGLRDRRIRLSVPTAIQLYDLQDRLGLSQPSKVIDWLLDITEQDIDKLPPLQVPHGFGHQFHQPmLNPHQVSNSLVAPFFDVNSTFMEADQVDHQEVRDQAKGKSIKTNDGQDDQNRHDHEGNVGQLLAQKLFPIGSSSIPGmLNNAMAYNYYHNYSEPSTLSLAQFGSHGFPQVPQLDQHHSHMMSTNALSFSTPMPSVSQLFFRPPTATPmLFGSYPPYITNPIVEGTSTATDQPRQTNHFQFLSSPSNSQNFLANNALMPPLHSVSSSLKSFPSLVHPKQQLHLNSQNNNGSQPNKDVP*。
本发明还提供了干扰上述技术方案中所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO.3所示。本发明所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具体为：5’-ATGATAACAAATTCAAGGGACAAGGGTTTCCAAGCAAAGCAAGAGGGCCACAACAACAACAATAACAATGACGGGAGCAACAATAGTAGTTTTCATAAGGCATCATCATCAAGTACTACTACTTCAAGGCAATGGTCTGGATTTAGAAATCCAAGGATCGTACGTGTTTCGCGTACTTTCGGTGGGAAAGATAGGCACAGCAAGGTTTCCACAGTGAGGGGATTGAGGGACAGGAGAATTAGGCTTTCAGTACCAACGGCCATTCAATTATATGATCTTCAAGATAGGCTTGGTCTTAGCCAACCTAGCAAGGTAATAGACTGGCTGCTTGACATTACG-3’。
本发明提供了一种重组表达载体，包括上述技术方案所述的MdTCP17基因或干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列。本发明用于制备所述重组表达载体的初始载体优选包括质粒载体，进一步优选包括pCAMBIA2300或pK7GWIWG2D(II)，更优选包括35S：pCAMBIA2300-GFP或pK7GWIWG2D(II)。本发明所述pC2300优选用于过表达，所述pK7GWIWG2D(II)优选用于干扰表达。本发明所述包括35s启动子的35S：pCAMBIA2300-GFP可以提高基因的表达水平。
本发明所述重组载体优选包括pC2300-GFP-MdTCP17或pK7GWIWG2D(II)-MdTCP17。本发明所述pC2300-GFP-MdTCP17优选为将SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列导入载体pC2300得到的重组载体；所述pC2300-GFP-MdTCP17可以表达SEQ ID NO.2所示的MdTCP17蛋白。本发明所述pK7GWIWG2D(II)-MdTCP17优选为将SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列导入pB7GWIWG2(II)中得到的重组载体所述pK7GWIWG2D(II)-MdTCP17可以干扰MdTCP17基因表达。本发明采用所述重组载体(pK7GWIWG2D(II)-MdTCP17)进行所述干扰表达后，可以促进植物不定根的发生，增加不定根的数量，辅助植物的无性繁殖和培育不定根发育能力强的植物，为诱导砧木繁育以及植物分子育种提供技术支持。
本发明还提供了一种工程菌，包括上述技术方案所述的MdTCP17基因、干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列或所述重组表达载体。本发明用于制备所述工程菌中的原始菌株优选为农杆菌，进一步优选为根癌农杆菌，更优选为EHA105。本发明所述工程菌优选通过将所述重组表达载体转入到原始菌株中获得。本发明对所述转入方式没有特殊限定，采用本领域中常规转入方式即可。本发明所述工程菌可用于遗传转化，辅助培育不定根发育能力强的植物。
本发明以上述技术方案所述MdTCP17基因为靶点在调控不定根的发育、植物无性繁殖和辅助植物分子育种中的一项或多项中的应用。本发明以所述MdTCP17基因为靶点干扰所述MdTCP17基因的表达，降低植物中MdTCP17基因的表达量；以所述MdTCP17基因为靶点过表达所述MdTCP17基因，提高植物中MdTCP17基因的表达量；进而可以达到调控植物中不定根的发育的作用，为植物的无性繁殖和植物分子育种提供技术辅助。
本发明优选通过抑制所述MdTCP17基因的表达在下述Ⅰ～Ⅲ中任一项或多项中的应用：Ⅰ：促进植物不定根的发生；Ⅱ：促进植物不定根的伸长；Ⅲ：增加植物不定根的数目。本发明优选还包括通过促进所述MdTCP17基因的表达在下述A～C中任一项或多项中的应用：A：抑制植物不定根的发生；B：抑制植物不定根的伸长；C：减少植物不定根的数目。
在上述应用中，本发明所述植物优选包括园艺植物和/或林木植物；所述园艺植物优选包括苹果、梨和葡萄，更优选为苹果；所述林木植物优选为杨树。
本发明还提供了一种培育不定根发育能力强的植物的方法，抑制目的植物中MdTCP17基因的表达或降低目的植物中MdTCP17蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。本发明所述不定根发育能力强的植物优选为通过向所述目的植物中导入干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列得到的植物。本发明所述干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。本发明所述目的植物优选包括园艺植物和/或林木植物；所述园艺植物优选包括苹果、梨和葡萄，更优选为苹果；所述林木植物优选杨树。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
MdTCP17基因的克隆
分别取苹果砧木M.9-T337和圆叶海棠的带茎尖茎段样本，液氮研磨，使用CTAB的方法分别提取苹果砧木M.9-T337和圆叶海棠的带茎尖茎段样本的总RNA；在2％琼脂糖凝胶上验证总RNA的完整性；采用微量紫外分光光度计NanoDrop 2000c(NanoDropTechnologies，Wilmington，DE，USA)检测其质量。采用Takara的反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)进行反转录，得到cDNA。
以cDNA为模板克隆MdTCP17基因的编码区。克隆使用的Topo载体试剂盒，购于杨凌米瑞德生物试剂经营部；使用的大肠杆菌感受态DH5α购于天根公司。
PCR扩增体系：0.2μL DNA聚合酶(如LATaq)，上游引物和下游引物各1μL，dNTP 2μL(2.5mM)，Buffer根据酶种类调整，cDNA模板2.5ng左右，以ddH2O补足至25μL。其中：上游引物F：5’-ATGATAACAAATTCAAGGGAC-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物R：5’-TGGAACGTCTTTATTTGGTTGG-3’(SEQ ID NO.5)。将混合好的PCR反应体系，离心，置于冰上数分钟后再放进PCR仪，程序按照试剂盒进行，得到PCR扩增产物。
在得到的PCR扩增产物中加入0.2μL rTaq，72℃延伸20min，得到加A尾的克隆产物。将得到的克隆产物进行跑胶，并按照Topo载体试剂盒使用说明进行切胶回收，得到MdTCP17片段。
将MdTCP17片段连接到pMD18-T中，得到连接产物，将连接产物转化大肠杆菌DH5α、挑取单克隆、摇菌、测序。具体步骤如下：
转化大肠杆菌DH5α：将5μL连接产物加到大肠杆菌感受态细胞中(1.5mL离心管)，冰上放置30min。42℃水浴90s(切勿超过90s)，迅速放回冰上放置2min以上。加入LB液体培养基1mL(或者SOC培养液500mL)，在37℃培养箱200rpm震荡1h，即，将连接载体转入到了大肠杆菌中。
挑取单克隆、摇菌和测序：将转化后的大肠杆菌涂板并在37℃培养箱中培养一天后挑菌斑，超净工作台上用镊子夹取灭菌白枪头，蘸长出的菌斑，每个克隆载体挑8个斑，放至加有40μL含氨苄的LB液体培养基中，在37℃培养箱中200rpm震荡1h至菌液浑浊。取0.5μL上述菌液做菌液PCR。将确认阳性克隆的40μL菌液超净工作台上分装至2个灭菌1.5μL离心管，并各加1mL含氨苄的LB液体培养基，37℃、200rpm震荡至菌液浑浊后，送测。
获得的两条序列经比对正确后，大肠杆菌菌液需加总浓度20％～30％的甘油，封口膜封口标记后-80℃超低温冰箱保存。质粒提取按照试剂盒步骤操作，-20℃冰箱保存。其中从苹果砧木M.9-T337中克隆得到的核苷酸序列命名为MdTCP17-T337，如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。从圆叶海棠中克隆得到的核苷酸序列命名为MdTCP17-MP，如SEQ ID NO.6：5’-ATGATAACAAATTCAAGGGACAAGGGTTTCCAAGCAAAGCAAGAGGGCCACAACAACAACAATAACAATGACGGGAGCAACAATAGTAGTTTTCATAAGGCATCATCATCAAGTACTACTACTTCAAGGCAATGGTCTGGATTTAGAAATCCAAGGATCGTACGTGTTTCGCGTACTTTCGGTGGGAAAGATAGGCACAGCAAGGTTTCCACAGTGAGGGGATTGAGGGACAGGAGAATTAGGCTTTCAGTACCAACGGCCATTCAATTATATGATCTTCAAGATAGGCTTGGTCTTAGCCAACCTAGCAAGGTAATAGACTGGCTGCTTGACATTACGGAACAAGATATCGATAAGCTCCCTCCACTTCAAGTTCCTCATGGATTTGGTCATCAATTTCATCAACCAATGCTAAATCCTCATCAAGTTAGTAATTCTCTTGTTGCTCCTTTCTTTGATGTAAATTCTACTTTTATGGAGGCAGACCAAGTTGATCATCAAGAAGTTCGTGATCAAGCAAAAGGCAAGTCGATCAAGACAAACGACGGACAAGATGATCAAAATCGTCATGATCACGAAGGAAATGTTGGACAACTCTTAGCTCAAAAGCTATTTCCCATAGGCTCTTCTTCCATACCTGGCATGCTAAATAATGCAATGGCATACAACTACTATCACAACTATTCAGAGCCTTCAACGCTATCTCTAGCGCAGTTTGGTAGCCATGGATTTCCACAAGTACCACAATTAGATCAGCATCATAGTCACATGATGAGTACTAATGCCTTATCATTTTCAACTCCAATGCCATCTGTTTCTCAATTATTCTTCCGTCCACCTACAGCAACACCGATGCTTTTCGGTTCATATCCTCCATATATTACCAATCCAATAGTGGAGGGTACTAGTACTGCTACCGATCAGCCTCGACAAGCCAACCATTTCCAATTTTTGAGCTCACCAAGTAATTCACAAAATTTCCTAGCTAACAATGCTCTCATGCCTCCTCTTCATTCAGTTAGCTCATCCTTGAAATCCTTTCCATCATTGGTTCATCCCAAGCAGCAGCTCCATTTGAATTCACAAATAACAATGGAAGCCAACCCAAATAAAGACGTTCCATAA-3’。
将MdTCP17-T337和MdTCP17-MP比对发现，MdTCP17的核苷酸序列在圆叶海棠和M.9-T337中在3’端存在3处碱基差异，见图1。圆叶海棠和M.9-T337的MdTCP17编码区同源性高。因M.9-T337中的碱基序列与NCBI数据库中的基因序列号(XM_008395015.3)同源性比较高，后续MdTCP17功能验证试验使用M.9-T337中的MdTCP17编码区序列，即SEQ ID NO.1所示的MdTCP17-T337，最终将其命名为MdTCP17。
实施例2
MdTCP17基因重组表达载体的构建
构建过表达载体：将实施例1中克隆得到的SEQ ID NO.1所示的MdTCP17-T337的编码区(CDS)连接到pCAMBIA2300载体的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，得到pC2300-GFP-MdTCP17过表达载体。
构建干扰载体：将SEQ ID NO.3所示的MdTCP17的一部分cDNA片段插入到pK7GWIWG2D(II)载体中，得到pK7GWIWG2D(II)-MdTCP17干扰表达载体。
农杆菌转化：将过表达载体和干扰载体用液氮速冻法分别转入农杆菌EHA105株系，具体方法如下：取5μL过表达载体质粒和5μL干扰表达载体质粒(约1-2μg)分别加入到100μL农杆菌感受态细胞中混匀。冰浴30min，液氮速冻5min，再37℃水浴5min，冰浴2min。加入800μL液体LB培养基，28℃摇床200rpm培养4～6h。吸取200μL菌液涂在含抗生素的固体LB培养皿上，28℃恒温培养箱培养48h。培养至有菌斑长出后，挑单克隆菌斑，阳性检测确认转化成功后扩繁菌液即可用于后续基因遗传转化。
实施例3
MdTCP17亚细胞定位
将实施例2中制备得到的过表达载体转入到农杆菌菌株EHA105中，转化方法同实施例2中的农杆菌转化方法。将活化好的农杆菌挑菌，并用液体LB于28℃培养16h，至OD值达到0.8。将农杆菌菌液5000转离心5min，倒掉上清加入重悬液并5000转离心5min，倒掉上清后加重悬液(取10mmol/L 0.097gMES，0.4064gMgCl2·6H2O，定容至200mL，并用NaOH调节pH＝5.6，加入200μL乙酰丁香酮(AS)(母液浓度为100μmol/L))，调OD值至0.5，并室温静置2小时，用已消毒的1mL注射器，取下针头，在烟草植株叶片背面扎2～3个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间。注射完毕后，将烟草置于22℃人工培养室中培养2d。在488nm处激发共聚焦激光扫描显微镜检测GFP荧光(Zeiss LSM 510Meta，Jena，Germany)。
结果如图2所示，其中：GFP是绿色荧光，DAPI是细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚，BF是明场，Merge是GFP、DAPI和BF三个视野的组合。由图2可以得出：35S：pC2300-GFP的融合表达载体只能在细胞核中能观察到绿色荧光，细胞的其他部位均无荧光信号，细胞核用DAPI进行染色，细胞核呈现蓝色，将GFP和DAPI组合后发现，绿色荧光和蓝色荧光可以重合在一起，说明MdTCP17定位于细胞核内，进而充分证明MdTCP17蛋白可以在细胞核内发挥其转录因子的功能。
实施例4
MdTCP17调控苹果不定根发生
将实施例2中已转入过表达载体和干扰载体的农杆菌在LB固体培养基(含利福平和载体相应抗生素)上划线，利福平抗生素浓度为50μg/ml，28℃培养。将活化好的农杆菌挑菌，并用液体LB于28℃培养16h，至OD值达到0.8。将农杆菌菌液5000转离心5min，倒掉上清加入重悬液并5000转离心5min，倒掉上清后加重悬液调至OD值达到0.8，将带有菌液的重悬液进行苹果转基因。
以嘎啦实生苗GL3(沈阳农业大学张志宏课题组惠赠)为转基因材料。利用农杆菌介导转化体系获得转基因苹果植株，叶盘法进行苹果转化。取刚展开的新叶(厚的叶片较好)，将取下的叶子放入上述菌液中，用手术刀片在菌液里横切叶片中脉3～4刀，用农杆菌浸染8～10min，将叶片放到滤纸上，然后用灭菌滤纸吸干多余菌液，将叶片接种到不含抗生素的培养基上，培养基配方为4.43g/LMS、2mg/L噻苯隆(TDZ)、0.5mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。使叶片与固体培养基贴合紧密，培养箱21℃黑暗条件下共培养3d，3d后洗菌，转移至含有4.43g/L MS、250mg/L头孢霉素、50μg/L卡那、2mg/L噻苯隆(TDZ)、0.5mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂的培养基上，21℃培养箱暗培养直至再生芽，取叶片上分化出的苹果不定芽，进行扩繁并鉴定是否为阳性苗。
阳性苗鉴定方法：对不同转基因苹果株系提取DNA进行PCR鉴定，MdTCP17过表达株系半定量引物MdTCP17-1的序列为：MdTCP17-1的上游引物：5’-ATGATAACAAATTCAAGGGACA-3’(SEQ ID NO.7)，下游引物：5’-ACGTCTTTATTTGGTTGG-3’(SEQ ID NO.8)。MdTCP17干扰株系半定量引物序列MdTCP17-2的序列为：MdTCP17-2的上游引物5’-GACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC-3’(SEQ ID NO.9)，下游引物：5’-GACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG-3’(SEQ ID NO.10)。PCR鉴定结果如图3所示。根据图3中的(c)可以看出，过表达株系OE2#、OE3#、OE5#、OE7#、OE11#和干扰株系i1#中有较亮条带，以水做阴性对照和野生型‘GL3’为阳性对照的泳道中无条带，说明这些转基因株系是阳性的。
对野生型GL3、MdTCP17过表达株系OE5#和干扰株系i1#提取RNA进行RT-qPCR鉴定，MdTCP17-3的定量上游引物为：5’-CTTGGTCTTAGCCAACCTAGCA-3’(SEQ ID NO.11)，下游引物为：5’-GAGGAACTTGAAGTGGAGGGA-3’(SEQ ID NO.12)。结果如图3d所示，MdTCP17的表达量在过表达MdTCP17株系中显著升高。
将获得的MdTCP17转基因材料在扩繁培养基上培养一个月，每升扩繁培养基配方为4.43g MS粉、30g蔗糖、7.8g琼脂、0.2mg 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和0.2mg IBA。
将鉴定出的阳性转基因苹果苗转移至生根培养基(含50ng/L卡那霉素)中培养，生根培养基配方是每升含2.215g MS粉，20g蔗糖，8g琼脂，1mg吲哚丁酸(IBA)。在上述的生根培养基上培养16天。并对野生型‘GL3’和MdTCP17转基因植株(包括过表达株系和干扰株系)拍照进行不定根表型鉴定，获得的表型鉴定结果如图3中的(a)和(b)所示，其中(a)为植株的表型结果，MdTCP17-OE-5#为过表达株系，MdTCP17-RNAi-1#为干扰表达株系；(b)为植株不定根的数量统计结果。
根据图3中的(a)和(b)可以得出，MdTCP17过表达株系的不定根发生被明显抑制，MdTCP17干扰株系中的不定根发生相对于过表达株系有所恢复，且不定根根长明显长于野生型，这些结果证实了MdTCP17对不定根发生起抑制作用，且主要对不定根伸长(不定根原基形成后纵向生长分化)起抑制作用。
实施例5
将实施例3中转化成功的农杆菌在LB固体培养基(含利福平和载体相应抗生素)上划线，利福平抗生素浓度为50μg/ml，28℃培养，菌液重悬步骤同实施例4。杨树转基因使用的是叶盘转化法，将培养20～30d的杨树野生型苗子的叶片切下，将叶片的边缘去掉后切成正方形块状放入含有过表达载体的农杆菌侵染液中，侵染时间为8～10min，将菌液用高温灭菌过的滤纸吸干，黑暗条件下共培养3d，在愈伤诱导培养基上培养一个月后转移至不定芽诱导培养基上，直至长出不定芽。愈伤诱导培养基配方为：WPM 2.14g/L、钙盐0.56g/L、蔗糖30g/L和琼脂8.0g/L，pH：5.8～5.85，灭菌后加0.5mg/L NAA、1mg/L6-BA和卡那霉素50mg/L。不定芽诱导培养基配方为：WPM 2.14g/L、钙盐0.56g/L、蔗糖30g/L和琼脂8.0g/L，pH：5.8～5.85，灭菌后加1mg/L6-BA和卡那霉素50mg/L。转基因毛白杨培养于温度22℃、光照16h和8h黑暗条件下的组培室中培养，得到3个过表达MdTCP17转基因株系，分别是MdTCP17-OE-1#、MdTCP17-OE-2#和MdTCP17-OE-3#。将获得的转基因毛白杨在扩繁培养基中培养1-2个月，扩繁培养基配方为WPM 2.14g/L、钙盐0.56g/L、蔗糖30g/L和琼脂8.0g/L，pH：5.8～5.85，灭菌后加0.1mg/LNAA，卡那霉素50mg/L。
将扩繁培养后的过表达MdTCP17-OE-1#、MdTCP17-OE-2#、MdTCP17-OE-3#及野生型毛白杨分别在6-BA处理培养基和对照组培养基中培养，其中6-BA处理组的培养基配方为WPM 2.14g/L、钙盐0.56g/L、蔗糖30g/L和琼脂8.0g/L，pH：5.80～5.85，灭菌后加0.5mg/LNAA和0.1mg/L 6-BA；对照组培养基配方为：外源激素只加0.5mg/LNAA，其他组分与6-BA处理培养基一致。
为了探讨MdTCP17在不定根发育过程中的作用，在杨树上异源过表达MdTCP17，获得了3个过表达MdTCP17转基因株系，分别是MdTCP17-OE-1#、MdTCP17-OE-2#和MdTCP17-OE-3#，两个处理分别是只加0.5mg/L NAA的对照处理和加0.1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA的6-BA处理。结果如图4所示，在图4中MdTCP17-OE-1#、MdTCP17-OE-2#和MdTCP17-OE-3#分别以TCP17-OE-1#、TCP17-OE-2#和TCP17-OE-3#表示，野生型以Wild type表示。
由图4可以得出，无论是未加6-BA的对照组(图4中的Control)还是外源6-BA处理组(图4中的6-BA)，与毛白杨野生型相比过表达MdTCP17明显抑制了杨树不定根的发生；通过根系指标测定发现不定根的数目明显降低(图4中B)，不定根生根率也明显降低(图4中C)。由此充分说明MdTCP17抑制不定根的发生。另外，比较图4中Control和6-BA两组表型结果图可以得出：6-BA处理后抑制了野生型和过表达MdTCP17转基因株系的不定根发生，相对于野生型，6-BA处理后过表达MdTCP17不定根数目和不定根发生率明显降低，充分说明MdTCP17可以响应CTK信号。
由以上实施例可以得出：MdTCP17基因可以显著抑制苹果和杨树不定根的发生和生长，尤其可以抑制不定根的伸长。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制不定根发育的MdTCP17基因，其特征在于，所述MdTCP17基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的MdTCP17基因编码的MdTCP17蛋白，其特征在于，所述MdTCP17蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。
3.干扰权利要求1所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO.3所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的MdTCP17基因或权利要求3所述的核苷酸序列。
5.一种工程菌，其特征在于，包括权利要求1所述的MdTCP17基因、权利要求3所述的核苷酸序列或权利要求4所述的重组表达载体。
6.以权利要求1所述MdTCP17基因为靶点在调控不定根的发育、植物无性繁殖和辅助植物分子育种中的一项或多项中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控不定根的发育包括：通过抑制所述MdTCP17基因的表达在下述Ⅰ～Ⅲ中任一项或多项中的应用：
Ⅰ：促进植物不定根的发生；
Ⅱ：促进植物不定根的伸长；
Ⅲ：增加植物不定根的数目；
或通过促进所述MdTCP17基因的表达在下述A～C中任一项或多项中的应用：
A：抑制植物不定根的发生；
B：抑制植物不定根的伸长；
C：减少植物不定根的数目。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物包括园艺植物和/或林木植物。
9.一种培育不定根发育能力强的植物的方法，其特征在于，包括：抑制目的植物中MdTCP17基因的表达或降低目的植物中MdTCP17蛋白的含量，得到所述不定根发育能力强的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述不定根发育能力强的植物为通过向所述目的植物中导入干扰所述MdTCP17基因表达的核苷酸序列得到的植物。
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