CN111690664B

CN111690664B - 白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用

Info

Publication number: CN111690664B
Application number: CN202010699518.4A
Authority: CN
Inventors: 刘雪梅; 胡晓晴; 李豆; 张磊; 朱明政
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111690664A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用。本发明利用嵌合抑制基因沉默技术(CREST)，将所述基因BpSPL2与SRDX抑制区融合后导入到白桦，获得的转基因植株与野生型相比，可以提前2‑3天生根。生根率也显著高于野生型，在正常生长条件下，野生型可产生4‑6条不定根，而抑制表达植株不定根数量可达7‑9条，提高量达到41.6％‑66.9％。与之相反，过表达BpSPL2转基因白桦不定根发生推迟2‑3天，生根率也小于野生型。因此可将调控白桦不定根发育的关键调节基因BpSPL2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

Description

白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用。

背景技术

植物外植体不定根的形成是植物离体组织存活的关键，也是园艺和林业作物无性系扦插繁殖的重要过程，然而不定根的发生对于林木扦插过程是一个限制因素，并且目前对不定根发生调控的分子机制研究较少。因此，了解诱导不定根形成的分子机制对于林木遗传资源的可持续高效利用具有重要意义。

白桦(Betula platyphylla Suk.)是我国是东北地区次生林的先锋树种，在生态、观赏和实用经济价值方面起重要作用。但20世纪80年代以来，白桦天然林遭受的破坏日益严重，导致大量珍稀的基因资源丢失，白桦人工林良种严重供应不足，因此，提高白桦苗木的生产力，形成速生丰产技术体系，将产生深远的积极影响。白桦由于生根难，很难用扦插进行无性繁殖，极大限制了对白桦的利用。

SPL(SQUAMOSApromoter-bindingprotein-like)是植物特有的一类转录因子，均具有含76个氨基酸的高度保守区段，以此同下游花发育相关基因 SQUAMOSA及其同源基因启动子区域结合并调控表达，被命名为SBP结构域，包含一个锌指结构和一个核定位信号，参与转录因子进入细胞核的过程。迄今为止，已发现SPL可调节多个重要的生物过程，如发育阶段转变、叶片、花和果实的发育、赤霉素响应及体内铜离子稳态平衡等发育及生理生化过程。

目前常采用基因敲除、反义技术、RNA干涉技术等对这些基因的生物学功能进行鉴定分析，但基因家族的转录因子成员之间编码序列同源性很高，单个基因的功能缺失经常会因为同源基因的功能补偿作用而失败(基因功能冗余现象)。嵌合抑制子基因沉默技术CREST(ChimericRepressorSilencingTechnology) 将SRDX序列与转录因子融合表达会抑制该转录因子以及与该转录因子的编码蛋白具有相同结合结构域的相应基因的表达，虽然该转录因子的原始激活区域依然存在，但是SRDX序列会将其转变成转录抑制子，因此可克服基因家族内的基因冗余现象起到显性抑制作用。

因此，如何将白桦基因BpSPL2的转录因子应用在调控白桦不定根发育中，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了BpSPL2基因的新用途，尤其涉及BpSPL2在调控植物不定根中的用途。

本发明另一个目的是提供一种促进不定根发育的白桦及其培育方法，为白桦不定根发生、发育的遗传改造提供了新的思路。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用

优选的，所述融合抑制表达是通过采用嵌合抑制子基因沉默技术实现的。

优选的，所述调控白桦不定根发育的方法，包括以下步骤：

将所述白桦BpSPL2基因去掉终止密码子TGA后的1563bp序列与抑制子 SRDX融合后连入植物表达载体pROKⅡ中，构建得到重组表达载体(图1)，采用农杆菌介导法导入白桦，使得转基因白桦中的BpSPL2基因功能被抑制，促进白桦不定根的发生。

优选的，所述融合抑制表达载体具体构建方法，具体包括以下步骤：

步骤1：将白桦BpSPL2基因去掉终止密码子TGA后的1563bp序列；

步骤2：以构建含有白桦BpSPL2基因ORF序列的pMD18-T载体质粒为模板，BpSPL2F和BpSPL2-SRDXR为引物，获得BpSPL2-SRDX目的融合片段；

步骤3：将所得BpSPL2-SRDX目的融合片段和pROKⅡ载体分别经BamHI 和KpnI酶双酶切后连接；连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，得到阳性单克隆pROKⅡ-BpSPL2-SRDX；

步骤4：采用液氮法将所得的pROKⅡ-BpSPL2-SRDX表达载体转入农杆菌感受态细胞中，筛选出阳性农杆菌，再用所得阳性农杆菌侵染白桦，得到促进不定根发生的白桦。

优选的，BpSPL2F引物如SEQIDNO:3所示；BpSPL2-SRDXR为引物如 SEQIDNO:4。

优选的，得步骤3所述转基因苗后，还包括从DNA和RNA水平上进行转基因检测。

优选的，宿主菌可以为大肠杆菌或农杆菌。

本发明提供了一种调控白桦不定根发生基因BpSPL2的新用途。利用CREST 技术将所述基因BpSPL2的核苷酸序列与SRDX融合，进而抑制BpSPL2功能表达。BpSPL2-SRDX融合核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。

在本发明的实施例中，对所述基因BpSPL2的功能进行研究，将WT和 BpSPL2-SRDX转基因白桦同时通过微扦插的方式放入含有0.4mg/L IBA的WPM 培养基中，4周后对BpSPL2-SRDX转基因白桦进行观察和分析，对不定根数量统计发现，BpSPL2-SRDX转基因白桦不定根数量平均值为8条根，WT不定根数量平均值为5条根，说明BpSPL2-SRDX转基因植株不定根数量多于野生型。

在不定根形成时间上，BpSPL2-SRDX转基因植株不定根发生时间最早，大约8d左右开始出现不定根，野生型11天左右出现不定根，并且BpSPL2-SRDX 株系的生根率也高于野生型。相反，在本发明的另一实施例中，过表达晚于野生型生根，约13天左右出现不定根，并且生根率约低于野生型55.7％。因此可将调控白桦不定根发育的关键调节基因BpSPL2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用嵌合抑制基因沉默技术(CREST)，将所述基因BpSPL2与SRDX 抑制区融合后导入到白桦，获得的转基因植株与野生型相比，可以提前2-3天生根。生根率也显著高于野生型，在正常生长条件下，野生型可产生4-6条不定根，而抑制表达植株不定根数量可达7-9条，提高量达到41.6％-66.9％。与之相反，过表达BpSPL2转基因白桦不定根发生推迟2-3天，生根率也小于野生型。因此可将调控白桦不定根发育的关键调节基因BpSPL2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

附图说明

图1为重组载体表达载体pROKⅡ-BpSPL2-SRDX构建示意图；

图2为pROKⅡ-BpSPL2-SRDX农杆菌菌液PCR电泳图谱；M，DNA Maker DL2000；+：阳性对照；1-4：挑取的4个单克隆；

图3为BpSPL2-SRDX转基因株系的获得过程示意图，其中，A，农杆菌侵染后的选择培养；B，C转BpSPL2-SRDX白桦抗性愈伤；D，转BpSPL2-SRDX 白桦抗性不定芽；E，转BpSPL2-SRDX植株；

图4为35S:BpSPL2-GFP过表达转基因株系的获得过程示意图，其中，A，农杆菌侵染后的选择培养；B，C转35S:BpSPL2-GFP白桦抗性愈伤；D，转 35S:BpSPL2-GFP白桦抗性不定芽；E:转35S:BpSPL2-GFP植株；

图5为转基因白桦的DNA和RNA水平检测结果图；a为35S:BpSPL2过表达植株的PCR检测图；b为35S:BpSPL2过表达白桦RNA水平上BpSPL2表达量的qRT-PCR鉴定；c为BpSPL2-SRDX抑制表达植株的PCR检测图；d为 BpSPL2-SRDX抑制表达白桦RNA水平上BpSPL2-SRDX表达量的qRT-PCR鉴定；

图6为转基因白桦根系观察结果图。A为野生型、过表达(OE)及抑制表达(DR)转基因白桦在含有0.4mg/LIBA的WPM培养基中生长5d、7d及28d 的生根情况；B为生根率；C为不定根数量；D为总根长；E为根的干重。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

抑制融合表达载体pROKⅡ-BpSPL2-SRDX的构建

1.BpSPL2-SRDX融合片段的获得

将白桦BpSPL2基因去掉终止密码子TGA后的1563bp序列，然后以含有 BpSPL2基因ORF序列的pMD18-T质粒为模板，BpSPL2F(SEQIDNO:3)和BpSPL2-SRDXR(SEQIDNO:4)为引物，通过PCR扩增得到含有BamHI和KpnI 酶切位点的BpSPL2-SRDX目的融合片段。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带，以获取该目的片段。

PCR扩增反应体系：无菌水30.75μL，TaqBuffer5μL，MgCl23μL，dNTPs4μL，引物F、R各2μL，模板2μL，Taq酶1.25μL。

反应程序：98℃预变性3min，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min， 72℃延伸7min，共计35个循环。

2.BpSPL2-SRDX序列与pROKⅡ载体的连接

(1)采用凝胶回收试剂盒对BpSPL2-SRDX目的条带进行纯化回收，按照限制性内切酶的说明书对纯化的产物进行双酶切(BamHI和KpnI酶)。同时，使用质粒提取试剂盒提取pROKⅡ质粒，并对质粒进行双酶切(BamHI和KpnI酶)，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测及纯化。

(2)将纯化回收的BpSPL2-SRDX基因序列与pROKⅡ载体的酶切产物，按照T4DNA连接酶的酶切体系(10×T4 DNA ligase buffer 1.0μL、T4 DNA ligase 1.0μL、目的片段：载体(摩尔质量)＝3:1、ddH₂O补充至10μL)条件进行连接， 4℃反应过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆并进行菌液PCR，获取阳性单克隆pROKⅡ-BpSPL2-SRDX后从其中提取质粒。

3、工程菌制备

采用液氮法将制备好的pROKⅡ-BpSPL2-SRDX抑制表达载体质粒转入EHA105农杆菌感受态细胞中，具体操作包含

(1)将农杆菌感受态EHA105菌株取出在冰上融化，向20μL的感受态中加入2μLpROKⅡ-BpSPL2-SRDX质粒，用枪头轻轻混匀，冰浴10min；

(2)液氮速冻5min,迅速放在37℃水浴锅中5min,拿出后继续冰浴3-5min；

(3)加800μL无抗生素的LB液体培养基于离心管中，在28℃培养箱(180 rpm/min)中振荡培养2-3h；

(4)将离心管从摇床取出后，5000rpm/min离心5min,保留100mL上清轻轻吹打混匀，涂布在LB固体平板中(50mg/L Kan,50mg/L Rif)，28℃倒置培养 48-72h后长出单菌落。随机挑取4个单克隆进行菌液PCR检测(图2)，检测为阳性的农杆菌可以用于后续的叶盘法的遗传转化。

实施例2

pROKⅡ-BpSPL2-SRDX和pGWB5-BpSPL2-GFP转基因白桦的获得

1、叶盘法遗传转化

(1)农杆菌工程菌液制备：于实验前一天挑取pROKⅡ-BpSPL2-SRDX或 pGWB5-BpSPL2-GFP(本实验室保存)农杆菌单菌落，用LB液体培养基28℃培养过夜，第二天测定菌液OD₆₀₀为0.8-1.0时将菌液稀释20倍，28℃继续培养直至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8之间，用液体WPM(6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L) 将菌体重悬，作为侵染工程菌液。

(2)外植体的选择：选取叶色鲜绿、叶面积较大的生根苗叶片，一般顶端第三、第四片叶子。

(3)外植体的切割：分生能力最强的部位在距叶柄基部0.3cm附近，即总叶脉的分叉处。切割时保证叶片受到较少的机械损伤。侵染10min，取出叶片用无菌滤纸吸去多余菌液。

(4)共培养：培养基WPM+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L，外植体与农杆菌共同暗培养2-3d。

(5)脱菌及选择培养：将共培养叶片放入200mg/L头孢霉素的无菌水中洗菌，用吸水纸吸去多余水分，将叶片放于选择培养基上(同共培养培养基)培养，头孢噻肟钠浓度为400mg/L，Kan浓度为50mg/L。

(6)脱分化：选择培养15d开始(20d以上)，陆续的可以看到在伤口处有愈伤组织膨大，将其移至WPM+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.02mg/L+GA₃ 0.5mg/L 培养基中，待愈伤长出抗性芽后，当抗性芽长成3-4cm的小植株后，将其剪下放入生根培养基中生根培养。

如图3所示，本发明成功获得pROKⅡ-BpSPL2-SRDX转基因白桦植株。依据上述步骤，获得pGWB5-BpSPL2-GFP转基因植株(图4)。

2、转基因白桦的PCR检测

(1)BpSPL2转基因白桦在基因组水平上的PCR鉴定

分别以野生型(WT)、过表达、抑制表达白桦为材料，CTAB法提取白桦基因组DNA。对于过表达植株来说，使用pGWB5-BpSPL2-GFP载体质粒为阳性对照，WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测(检测引物为2F:TCCAGTTGTGCTCTCTCTCTTCT；GFPR:CGTCCATGCCGTGAGTGA。) 对于抑制表达植株来说，使用pROKⅡ-BpSPL2-SRDX载体质粒为阳性对照， WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测(检测引物为 2F:TCCAGTTGTGCTCTCTCTCTTCT； 2-SRDXR:TCAAGCGAAACCCAAACG)。如图5a所示，pGWB5-BpSPL2-GFP 过表达DNA水平上的PCR，片段长度是部分基因片段加上部分GFP标签序列，位置在1319bp。如图5b所示，pROKⅡ-BpSPL2-SRDX抑制表达DNA水平上的 PCR，片段长度是部分基因片段加上SRDX序列，位置在510bp。

(2)BpSPL2转基因大青杨RNA水平上的PCR鉴定

分别提取WT、过表达、抑制表达白桦的RNA反转录成cDNA，过表达植株进行BpSPL2基因的表达量分析，结果见图5c，过表达株系的BpSPL2基因的表达量均高于野生型对照。(内参引物为18s-F： GAGGTAGCTTCGGGCGCAACT；18s-R：GCAGGTTAGCGAAATGCGATAC； BpSPL2定量引物为qBpSPL2F：CGGTGAGGTTGGTAGTGGCTC； qBpSPL2R:AAATCTTGACTGTTGGCTTCCATAG)。抑制表达植株进行 BpSPL2-SRDX表达量分析，其引物为 qSRDXF:TCTACCGAATATGGACCCACGG；qSRDXR:TCAAGCGAAACCCAAACGGA。

实施例3

转基因白桦调控不定根发生的表型观察

生长状态一致的野生型、过表达(OE3、OE5)和抑制表达(DR1、DR4) 转基因白桦微扦插到含有0.4mg/L IBA的WPM培养基中，4周后观察观测不定根的数量，生根时间、生根率和不定根表型。每株系进行3次独立的实验，并且每次实验进行生物学重复40次。对不定根数量进行统计，结果如图6所示， BpSPL2-SRDX抑制表达植株不定根数量平均值为8根，WT不定根数量平均值为5根，说明BpSPL2-SRDX植株不定根数量多于野生型。

在不定根形成时间上，BpSPL2-SRDX转基因植株不定根发生时间最早，大约8d左右开始出现不定根，野生型11天左右出现不定根，并且BpSPL2-SRDX 株系的生根率也高于野生型。相反，过表达晚于野生型生根，约13天左右出现不定根，并且生根率约低于野生型55.7％。因此可将调控白桦不定根发育的关键调节基因BpSPL2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagtctt ggagttgcag ttcagaaggg aaaggccttt tgctttctga tgaaatggat 60

ttacaagttg atgcttttgc tagaagtaaa aagacattaa tggaatggga caataaaccc 120

acttattatt ttgaaagcaa tggacttgtt tctgatagag aagcggttga gggcatggaa 180

ctcttggatt tgggattctc tgacttggtg agaaaacctt ttcatgggaa ccgaggaatg 240

gagatgttaa gcggtgaggt tggtagtggc tctagtcaaa gagcagtcac tcctacgtgt 300

atggttactt ccaattcatg ttttgaggaa gtgggttctg aagcaaagct ttcaagttct 360

tctatggaag ccaacagtca agatttatca ctgattgatt tgaagctagg gacattggct 420

gattgcaaag atgcagagaa tatcaaggta ttgaaagaga aaccggtttt gtcatctgta 480

agtccatgtt tgcagaggaa gagagcgcgc aaaacaagtt cacactctca gactgccttc 540

tgccaagtcc atggttgtaa caaggatttg agctcctcaa aggattacca caaaaggcat 600

aaagtttgtg atgttcactc taagactgcc aaagttattg ttaacggcat tgaacaaagg 660

ttttgtcaac agtgtagcag gtttcatctg ctggttgaat ttgatgatgg taagcgaagc 720

tgtcgtaaac gcctagcagg ccacaatgaa cgtcgacgga agcctcaatt agataccctt 780

tctggcactc aatacttggg gacttccttg caaaagagga caccccttgt tttcccagac 840

atatttcgag ctggcattat ttgtccagga aaaaatgaag aagccaattg gtttagacat 900

accaaattag aaggggagtc aatatacagt cctcaatcag caataccaat cacaaatggg 960

catttgcttc caaaatcttt tctccatctc catggcattg ggaaacaaca ttgttctgga 1020

gttccttcat caggatctga agactatact tttactgcat caaccgtcca ggaattacct 1080

ggggcctcaa tttccagttg tgctctctct cttctgtcag ctcaatcaca ggacttgtca 1140

agccatttga ctggacgtcc aatggctagt ccccagatta tgcaaggtcg ctctgcccat 1200

cacattcttg gtcaaactga taaacctgta agggtaagct ctgtggaaca atatggatca 1260

aatggactct attcatatgg gatgaactcc atggaagttg ataagatagg atcagtaatg 1320

ctttctgatg ctagtcatgc tgctgatttt caagttcaca ccgatggaat ttttcaagag 1380

tcagatattt tgaatgccaa ctatttttct tctaccgaat atggacccac ggttgattgg 1440

cttcaattgt catcacatct tcaaagagtg gagcgacaga gaaattccat ccaagtaaag 1500

caggaaaatg gggactcttg ctatttccca acctttagag cagtgtgcaa ccaacaaggt 1560

gtgctggatc tggatctaga actccgtttg ggtttcgctt ga 1602

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Ser Trp Ser Cys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Asp Glu Met Asp Leu Gln Val Asp Ala Phe Ala Arg Ser Lys Lys Thr

20 25 30

Leu Met Glu Trp Asp Asn Lys Pro Thr Tyr Tyr Phe Glu Ser Asn Gly

35 40 45

Leu Val Ser Asp Arg Glu Ala Val Glu Gly Met Glu Leu Leu Asp Leu

50 55 60

Gly Phe Ser Asp Leu Val Arg Lys Pro Phe His Gly Asn Arg Gly Met

65 70 75 80

Glu Met Leu Ser Gly Glu Val Gly Ser Gly Ser Ser Gln Arg Ala Val

85 90 95

Thr Pro Thr Cys Met Val Thr Ser Asn Ser Cys Phe Glu Glu Val Gly

100 105 110

Ser Glu Ala Lys Leu Ser Ser Ser Ser Met Glu Ala Asn Ser Gln Asp

115 120 125

Leu Ser Leu Ile Asp Leu Lys Leu Gly Thr Leu Ala Asp Cys Lys Asp

130 135 140

Ala Glu Asn Ile Lys Val Leu Lys Glu Lys Pro Val Leu Ser Ser Val

145 150 155 160

Ser Pro Cys Leu Gln Arg Lys Arg Ala Arg Lys Thr Ser Ser His Ser

165 170 175

Gln Thr Ala Phe Cys Gln Val His Gly Cys Asn Lys Asp Leu Ser Ser

180 185 190

Ser Lys Asp Tyr His Lys Arg His Lys Val Cys Asp Val His Ser Lys

195 200 205

Thr Ala Lys Val Ile Val Asn Gly Ile Glu Gln Arg Phe Cys Gln Gln

210 215 220

Cys Ser Arg Phe His Leu Leu Val Glu Phe Asp Asp Gly Lys Arg Ser

225 230 235 240

Cys Arg Lys Arg Leu Ala Gly His Asn Glu Arg Arg Arg Lys Pro Gln

245 250 255

Leu Asp Thr Leu Ser Gly Thr Gln Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gln Lys

260 265 270

Arg Thr Pro Leu Val Phe Pro Asp Ile Phe Arg Ala Gly Ile Ile Cys

275 280 285

Pro Gly Lys Asn Glu Glu Ala Asn Trp Phe Arg His Thr Lys Leu Glu

290 295 300

Gly Glu Ser Ile Tyr Ser Pro Gln Ser Ala Ile Pro Ile Thr Asn Gly

305 310 315 320

His Leu Leu Pro Lys Ser Phe Leu His Leu His Gly Ile Gly Lys Gln

325 330 335

His Cys Ser Gly Val Pro Ser Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Thr Phe Thr

340 345 350

Ala Ser Thr Val Gln Glu Leu Pro Gly Ala Ser Ile Ser Ser Cys Ala

355 360 365

Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gln Ser Gln Asp Leu Ser Ser His Leu Thr

370 375 380

Gly Arg Pro Met Ala Ser Pro Gln Ile Met Gln Gly Arg Ser Ala His

385 390 395 400

His Ile Leu Gly Gln Thr Asp Lys Pro Val Arg Val Ser Ser Val Glu

405 410 415

Gln Tyr Gly Ser Asn Gly Leu Tyr Ser Tyr Gly Met Asn Ser Met Glu

420 425 430

Val Asp Lys Ile Gly Ser Val Met Leu Ser Asp Ala Ser His Ala Ala

435 440 445

Asp Phe Gln Val His Thr Asp Gly Ile Phe Gln Glu Ser Asp Ile Leu

450 455 460

Asn Ala Asn Tyr Phe Ser Ser Thr Glu Tyr Gly Pro Thr Val Asp Trp

465 470 475 480

Leu Gln Leu Ser Ser His Leu Gln Arg Val Glu Arg Gln Arg Asn Ser

485 490 495

Ile Gln Val Lys Gln Glu Asn Gly Asp Ser Cys Tyr Phe Pro Thr Phe

500 505 510

Arg Ala Val Cys Asn Gln Gln Gly Val Leu Asp Leu Asp Leu Glu Leu

515 520 525

Arg Leu Gly Phe Ala

530

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat ggagtcttgg agttgcag 28

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtacctc aagcgaaacc caaacggagt tctagatcca gatccagcac accttgttgg 60

ttgcac 66

Claims

1.白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用，其特征在于，所述白桦BpSPL2基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2第1～521位所示。

2.根据权利要求1所述的白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）将白桦BpSPL2基因去掉终止密码子TGA后的1563bp序列与抑制子SRDX融合后连接植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

2）将步骤1）制备的重组表达载体导入宿主菌，得到工程菌；

3）利用农杆菌介导的方法将步骤2）所述工程菌侵染白桦的叶片组织，共培养后脱菌，得到抗性愈伤组织；

4）将所述抗性愈伤组织经分化和生根培养后，得到促进不定根发育的转基因白桦。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤2）中宿主菌为大肠杆菌或农杆菌。