CN110628811A - 一种菊花CmSVP基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了菊花CmSVP基因的应用，根据已获得的转录组数据的CmSVP全长序列，设计CmSVP基因的特异性引物；进行PCR扩增；将电泳检测后的目的条带切胶回收纯化；回收后的DNA连接pEASY‑Blunt载体，并转化大肠杆菌感受态，挑取6个单克隆测序，获得pEASY‑Blunt‑CmSVP；测序后的序列通过NCBI网站的Blast程序进行基因比对，利用ORF finder预测菊花CmSVP基因的ORF区及推测的氨基酸序列；利用Expasy在线分析软件分析菊花CmSVP蛋白的理化性质；利用MEGA6.0软件构建不同植物SVP蛋白的系统发育进化树；再将CmSVP基因在菊花中的遗传转化培养植株，获得明显区别与野生型的转基因菊花品种，转基因菊花的开花时间晚于野生型菊花，且其茎的伸长生长优于野生型菊花。

Description

一种菊花CmSVP基因的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种菊花CmSVP基因的应用。
背景技术
“耐寒惟有东篱菊，金粟初开晓更清”，菊花作为我国的传统名花，历来悠久，被视为孤标亮节、高雅傲霜的象征。菊花品种繁多，可用于插花、盆栽、药材等，具有很高的观赏价值和药用价值，而花期问题是影响人们追求四季赏菊最重要的限制因素。菊花的花期主要受温度，光照条件的影响。大部分菊花品种属于典型的短日照植物，需要经过一定时数的短日照才可以进入花芽分化阶段，这极大地限制了其观赏及应用，菊花的四季开放一直是育种学家们的目标。
SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因是MADS-box家族STMADS11亚家族中重要的开花负调控因子，其同源基因广泛存在于各种植物中，现已在多种草本、木本植物中均克隆得到SVP同源基因。SVP主要在营养器官表达，不同物种的SVP基因表达模式相似，而同一物种中同源基因表达呈现多样性。SVP基因作为开花抑制因子，参与自主途径、GA途径及温敏途径，其表达水平直接导致开花时间的改变。同时SVP基因和AP1、AGL24通过功能冗余调控花分生组织特异性和抑制B类，C类和E类基因的表达，从而影响植株花发育，花序建成。
近年来，SVP基因在植物开花响应机制被广泛研究，特别是对温度敏感性的植物。大量的研究表明SVP及其同源基因在不同植物的表达模式及其功能不尽相同。目前菊花CmSVP基因已成功分离并在拟南芥中验证其抑制拟南芥开花并影响其花序发育，该成果已于2017年发表（Gao Yaohui, Gao Yike, Fan Min et al. Overexpression ofChrysanthemum morifolium SVP gene delays blossoming and regulatesinflorescence architecture in transgenic Arabidopsis[J]. Canadian Journal ofPlant Science. 2017, 97:1130-1139.）。而在菊花花期及形态建成中的相关功能未有报道。
本研究从菊花中分离出一个推迟开花时间、并对茎生长具有促进作用的CmSVP基因，并研究对该基因的表达形式进行分析，提出了利用CmSVP基因进行推迟菊花开花时间、并促进其茎的伸长的基因工程改良方法。
CmSVP基因推迟了菊花的开花时间，并对茎的伸长生长具有促进作用，因此该基因可以成为通过基因敲除技术改良花期、培育插花品种的优良候选基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菊花CmSVP基因的应用，该基因技术能够推迟菊花的开花时间，同时能够促进其茎的伸长生长，以对菊花进行的品种改良。
一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于包含以下步骤：
步骤1：将菊花‘粉地毯’作为转基因研究受体材料，通过茎段无菌扩繁，培养条件为长日照（16h光照/8h黑暗），温度为23-25℃；
步骤2 ：CmSVP基因的获得
根据已获得的转录组数据（NCBI登录号为SRP109613）的 CmSVP全长序列，设计CmSVP基因的特异性引物；按照如下体系进行PCR扩增：1μl cDNA模板，
上游引物CmSVP-F（5’-ATGATGGTTAGGGAGAAAGTGC-3’）
下游引物CmSVP-R（5’-TCAACCTGAGTATGGTAATCCTAAC-3’）(10μmol·L−1)，12.5μl PCRMIX，ddH2O补足至25μl，反应程序为94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ for 30s，35个循环，72℃ 10min，然后4℃保存；将电泳检测后的目的条带切胶回收纯化；回收后的DNA连接pEASY-Blunt载体，并转化大肠杆菌感受态，挑取6个单克隆测序，获得pEASY-Blunt-CmSVP；
测序后的序列通过NCBI网站的Blast程序进行基因比对，利用ORF finder预测菊花CmSVP基因的ORF区及推测的氨基酸序列；利用Expasy在线分析软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析菊花CmSVP蛋白的理化性质；从GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载多个物种的SVP同源基因蛋白序列，用ClustalW进行不同植物物种间蛋白的多序列同源比对，并分析菊花CmSVP蛋白的保守位点；利用MEGA6.0软件构建不同植物SVP蛋白的系统发育进化树。
步骤3，植物表达载体的构建,其中 pCAMBIA1304-CmSVP植物表达载体的构建如下：
根据CmSVP基因序列设计PCR引物，分别在上游及下游引物的5’端引入NcoI和BstEII酶切位点，以pEASY-Blunt-CmSVP质粒为模板，利用高保真Taq酶，
上游引物CmSVP-NcoI-F（CATGCCATGGATGATGGTTAGGGAGAAAGT）
下游引物CmSVP-BstEII-R（GGGTATACCTCAACCTGAGTATGGTAATC）
进行PCR扩增，反应程序为98℃ 2min，98℃ 30s， 68℃ 6min 30s，35循环，4℃保存；
将扩增后的PCR产物经电泳检测后切胶回收纯化，连接pEASY-Blunt载体。连接产物转化大肠杆菌并经过蓝白斑筛选，挑取单克隆测序，测序正确的菌液质粒命名为pEASY-CmSVP；
按照如下体系对上述获得的菌液质粒进行双酶切：20μl pCAMBIA-1304（pEASY-CmSVP质粒），2.5μl NcoI，2.5μl BstEII，5μl Cutsmart，20μl ddH2O；然后回收酶切后的pEASY CmSVP小片段及pCAMBIA-1304的大片段，并按照如下体系进行连接：pCAMBIA-1304大片段1μl，pEASY-CmSVP小片段7.5μl，T4 DNA连接酶 0.5μl，T4 ligase buffer 1μl，37℃连接过夜；
连接产物转化大肠杆菌感受态：挑取单克隆进行菌液PCR验证；选取有目的条带的菌液测序，测序正确的命名为pCAMBIA-1304-CmSVP质粒，并对其通过冻融法转化农杆菌感受态。
步骤4，CmSVP基因在菊花中的遗传转化：
对地被菊‘粉地毯’进行遗传转化，利用以pmi为安全标记的菊花遗传转化体系进行实施，并根据实验调整筛选标记及浓度，以潮霉素为筛选标记的地被菊‘粉地毯’叶盘转化的基本培养基配方如下：
M1培养基：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，PH5.8-6.0
M2培养基：M1培养基+400mg/L Car，PH5.8-6.0
M3培养基：M2培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M4培养基：M1培养基+300mg/L Car+6mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M5培养基：MS培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0；
在上述培养基内进行培养使其长成完整的植株；
取上述生根的抗性苗少量叶片，利用Edward方法粗提菊花叶片DNA，利用筛选标记hpt基因引物进行PCR扩增，检测筛选阳性苗；检测引物为
Hyg-F(CGTCTGTCGAGAAGTTTC)与
Hyg-R(TACTTCTACACAGCCATC)
将上述鉴定为阳性的转基因苗扩繁至7-10株，并且生根后转移到营养土：珍珠岩=2：1的栽培基质中，放于温室中培养，直至开花；
观察记录野生型菊花和转基因菊花的花期（统计自移植至现蕾及第一朵花开需要的天数）及其它重要的表型性状，获得明显区别与野生型的转基因菊花品种，转基因菊花的菊花的现蕾时间晚于野生型菊花，且其茎的伸长生长优于野生型菊花。
优选地，步骤3中测序正确的pCAMBIA-1304-CmSVP质粒通过冻融法转化农杆菌感受态具体步骤为：
（1）将-80℃保存的农杆菌感受态置于冰上融化，待完全融化后立刻加入质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min；
（2）液氮速冻1 min，37℃金属浴热激5 min，然后再冰浴2 min；
（3）无菌条件下，加入700μl液体LB培养基（无抗生素），28℃，180 rpm震荡培养4-5 h；
（4）室温5000 rpm离心1min，去掉上清液，保留200μl，用枪头轻轻吹打混匀后涂布于5LB固体培养基（附加50 mg/L Rif和50 mg/mL Kan）上，28℃倒置暗培养2-3天，直至长出单克隆菌斑；
（5）挑取单菌斑利用菌液PCR进行阳性鉴定，PCR检测为阳性的菌斑摇菌后，用于后续转基因试验，或1：1加入灭菌的30%甘油，于-80℃保存备用。
优选地，步骤4中分别在M1、M2、M3、M4、M5培养基内进行培养的具体方法为：
（1）取经测序鉴定为阳性农杆菌pCAMBIA-1304-CmSVP，若是在-80℃中保存，需在LB固体培养基（50mg/L Kan+50mg/L Rif）上划线活化。待长起单菌落后，接种于3mL同样含双抗的LB液体培养基中小摇过夜。将浑浊的菌液按照1：100的比例转入含两抗的LB培养液中继续扩大培养，28℃，180 rmp避光震荡培养至OD600=0.4-0.6之间；
（2）将菌液放入50ml的离心管中，5500r/min，常温离心15min，收集菌体，弃去上清液，用1/2MS （1/2MS+30g/L蔗糖，PH5.8）培养基重悬至OD600=0.4-0.6之间；
（3）以无菌的苗龄为30d左右的‘粉地毯’幼苗为试材，选取中上部分厚实健壮的叶片，避开主叶脉切成边长为0.5cm的方块，并在方块中间划切几道。叶片近轴面朝下，平铺在M1培养基上，于正常的光照培养下培养20h，不超过24h；
（4）经过预培养的‘粉地毯’叶盘完全浸入在农杆菌重悬液中，轻轻晃动10min。取出叶盘并用无菌滤纸将叶盘表面的菌液吸干。然后将叶盘平铺在M1培养基上，暗培养2d；
（5）共培养后的叶盘周围可以看到星点状的菌落，将叶盘放于含有400mg/L Car的无菌水中，冲洗3次，并且用无菌滤纸吸取水份，将叶盘转移至M2培养基上，正常培养4d；
（6）经过脱菌的叶盘转移到M3较低筛选压的培养基上，进行筛选培养15d后可以看到叶盘膨大，边缘形成少量愈伤组织。将叶盘转接至较高筛选压d的M4培养基上，每15d转接到新鲜的培养基上；
（7）筛选培养约45-60d，叶片边缘的愈伤组织分化出抗性芽，待抗性芽继续生长到1cm的时候，切下来放至M5生根培养基上。约20d，抗性芽生根，30d后长成完整的植株。
优选地，步骤4中鉴定为阳性的转基因苗扩繁至7-10株，并且生根后转移到营养土培养的条件为：栽培条件为在长日照（16h光照/8h黑暗）下生长4个月，之后转移到短日照条件（12h光照/12h黑暗）下促进开花；温度在23-25℃。
本发明的有益效果为：
通过本申请得到的菊花CmSVP基因推迟了菊花的开花时间，并对茎的伸长生长具有促进作用；
该基因可以成为通过基因敲除技术改良花期、培育插花品种的优良候选基因。
附图说明
图1A CmSVP基因RT-PCR结果。
图1B CmSVP基因序列。
图1C CmSVP基因保守结构域。
图1D不同物种SVP蛋白的多序列比对。
图1E CmSVP与其它植物的SVP家族、MADs-box家族因子的系统进化树分析
CmSVP (Chrysanthemum x morifolium), JcSVP (Jatropha curcas), PmSVP1(Prunus mume), DlSVP1 (Dimocarpus longan), CaJOINTLESS (Capsicum annuum),PeSVP (Populus euphratica), PtSVP (Populus trichocarpa), GmSVP (Glycine max),AcSVP1 (Actinidia chinensis), AdSVP1 (Actinidia deliciosa), SiJOINTLESS(Sesamum indicum), SiSVP (Sesamum indicum), AtSVP(Arabidopsis thaliana),BjSVP (Brassica juncea), NnSVP(Nelumbo nucifera), CaAGL24 (Capsicum annuum),BjAGL24 (Brassica juncea), AtAGL9 (Amborella trichopoda), CaFLC (Coffea Arabica), CfFLC (Cardamine flexuosa), CmTFL1(Chrysanthemum x morifolium)。
图2转CmSVP基因菊花的菊花的获得。
图3转CmSVP基因菊花抗性苗的PCR检测
M为DL2000Maker，1为阳性质粒对照，2为WT对照，3为H2O对照，4~18为转基因抗性苗。
图4转CmSVP基因菊花开花时间、叶片数量及主枝长度。
图5转CmSVP基因菊花主枝长度
A.不同转基因株系的花期比较；B.不同转基因株系节间长度的比较。
具体实施方式
下列实施例中所用方法入无特别说明，均视为常规方法：
第一步：将将菊花‘粉地毯’作为转基因研究受体材料，通过茎段无菌扩繁，培养条件为长日照（16h光照/8h黑暗），温度为23-25℃；
准备菌株和质粒：植物双元表达载pCAMBIA1304，PMD18T-CmSVP质粒、KOD高保真Taq酶外购、其它限制性内切酶、农杆菌感受态。
第二步：CmSVP基因的获得
根据已获得的转录组数据（NCBI登录号为SRP109613）设计CmSVP基因的特异性引物，按照如下体系进行PCR扩增：1μl cDNA模板，1μl上游引物CmSVP-F（ATGATGGTTAGGGAGAAAGTGC）和下游引物CmSVP-R（TCAACCTGAGTATGGTAATCCTAAC）(10μmol·L−1)，12.5μl PCR MIX （高保真)，ddH2O补足至25μl。反应程序为94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ for 30s，35个循环，72℃ 10min，然后4℃保存。将电泳检测后的目的条带切胶回收纯化。回收后的DNA连接pEASY-Blunt载体，并转化大肠杆菌感受态，挑取6个单克隆测序。
测序后的序列通过NCBI网站的Blast程序进行基因比对，利用ORF finder预测菊花CmSVP基因的ORF区及推测的氨基酸序列。利用Expasy在线分析软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析菊花CmSVP蛋白的理化性质。从GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载多个物种的SVP同源基因蛋白序列，用ClustalW进行不同植物物种间蛋白的多序列同源比对，并分析菊花CmSVP蛋白的保守位点。利用MEGA6.0软件构建不同植物SVP蛋白的系统发育进化树。
2.2 植物表达载体的构建，pCAMBIA-1304-CmSVP植物表达载体的构建：
根据CmSVP基因序列设计PCR引物，分别在上游及下游引物的5’端引入NcoI和BstEII酶切位点，以pEASY-Blunt-CmSVP质粒为模板，利用高保真Taq酶引物CmSVP-NcoI-F（CATGCCATGGATGATGGTTAGGGAGAAAGT）和CmSVP-BstEII-R（GGGTATACCTCAACCTGAGTATGGTAATC）进行PCR扩增，反应程序为98℃ 2min，98℃ 30s， 68℃6min 30s，35循环，4℃保存。
扩增后的PCR产物经电泳检测后切胶回收纯化，连接pEASY-Blunt载体。连接产物转化大肠杆菌并经过蓝白斑筛选，挑取单克隆测序，测序正确的菌液质粒命名为pEASY-CmSVP；按照如下体系进行对上述pEASY-CmSVP质粒进行双酶切：20μl pCAMBIA-1304(pEASY-CmSVP质粒)，2.5μl NcoI，2.5μl BstEII，5μl Cutsmart，20μl ddH2O；回收酶切后的pEASY CmSVP小片段及pCAMBIA-1304的大片段，并按照如下体系进行连接：pCAMBIA-1304大片段1μl，pEASY-CmSVP小片段7.5μl，T4 DNA连接酶 0.5μl，T4 ligase buffer 1μl，37℃连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆进行菌液PCR验证。选取有目的条带的菌液测序，测序正确的命名为pCAMBIA-1304-CmSVP。
将上述测序正确的pCAMBIA-1304-CmSVP质粒通过冻融法转化农杆菌感受态：
（1）将-80℃保存的农杆菌感受态置于冰上融化，待完全融化后立刻加入质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min；
（2）液氮速冻1 min，37℃金属浴热激5 min，然后再冰浴2 min；
（3）无菌条件下，加入700μl液体LB培养基（无抗生素），28℃，180 rpm震荡培养4-5 h；
（4）室温5000 rpm离心1min，去掉上清液，保留200μl，用枪头轻轻吹打混匀后涂布于5LB固体培养基（附加50 mg/L Rif和50 mg/mL Kan）上，28℃倒置暗培养2-3天，直至长出单克隆菌斑；
（5）挑取单菌斑利用菌液PCR进行阳性鉴定，PCR检测为阳性的菌斑摇菌后，用于后续转基因试验，或1：1加入灭菌的30%甘油，于-80℃保存备用。
2.4 CmSVP基因在菊花中的遗传转化
地被菊‘粉地毯’的遗传转化体系参考王叶建立的以pmi为安全标记的菊花遗传转化体系（王叶等，2012），并根据实验调整筛选标记及浓度；以潮霉素为筛选标记的地被菊‘粉地毯’叶盘转化的基本培养基配方如下：
M1培养基：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，PH5.8-6.0
M2培养基：M1培养基+400mg/L Car，PH5.8-6.0
M3培养基：M2培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M4培养基：M1培养基+300mg/L Car+6mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M5培养基：MS培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0。
具体方法为：
（1）取经测序鉴定为阳性农杆菌pCAMBIA-1304-CmSVP，若是在-80℃中保存，需在LB固体培养基（50mg/L Kan+50mg/L Rif）上划线活化。待长起单菌落后，接种于3mL同样含双抗的LB液体培养基中小摇过夜。将浑浊的菌液按照1：100的比例转入含两抗的LB培养液中继续扩大培养，28℃，180 rmp避光震荡培养至OD600=0.4-0.6之间；
（2）将菌液放入50ml的离心管中，5500r/min，常温离心15min，收集菌体，弃去上清液，用1/2MS （1/2MS+30g/L蔗糖，PH5.8）培养基重悬至OD600=0.4-0.6之间；
（3）以无菌的苗龄为30d左右的‘粉地毯’幼苗为试材，选取中上部分厚实健壮的叶片，避开主叶脉切成边长为0.5cm的方块，并在方块中间划切几道。叶片近轴面朝下，平铺在M1培养基上，于正常的光照培养下培养20h，不超过24h；
（4）经过预培养的‘粉地毯’叶盘完全浸入在农杆菌重悬液中，轻轻晃动10min。取出叶盘并用无菌滤纸将叶盘表面的菌液吸干。然后将叶盘平铺在M1培养基上，暗培养2d；
（5）共培养后的叶盘周围可以看到星点状的菌落，将叶盘放于含有400mg/L Car的无菌水中，冲洗3次，并且用无菌滤纸吸取水份，将叶盘转移至M2培养基上，正常培养4d；
（6）经过脱菌的叶盘转移到M3较低筛选压的培养基上，进行筛选培养15d后可以看到叶盘膨大，边缘形成少量愈伤组织。将叶盘转接至较高筛选压d的M4培养基上，每15d转接到新鲜的培养基上；
（7）筛选培养约45-60d，叶片边缘的愈伤组织分化出抗性芽，待抗性芽继续生长到1cm的时候，切下来放至M5生根培养基上。约20d，抗性芽生根，30d后长成完整的植株；
对转基因菊花进行筛选：取生根的抗性苗少量叶片，利用Edward方法粗提菊花叶片DNA，利用筛选标记hpt基因引物进行PCR扩增，检测筛选阳性苗。检测引物为：
Hyg-F(CGTCTGTCGAGAAGTTTC)和
Hyg-R(TACTTCTACACAGCCATC)
将上述鉴定为阳性的转基因苗扩繁至7-10株，并且生根后转移到营养土：珍珠岩=2：1的栽培基质中。放于温室中培养，直至开花。栽培条件为在长日照（16h光照/8h黑暗）下生长4个月，之后转移到短日照条件（12h光照/12h黑暗）下促进开花。温度在23-25℃。观察记录野生型和转基因菊花的花期（统计自移植至现蕾及第一朵花开需要的天数）及其它重要的表型性状。
第三步. 对上述方法结果进行分析
CmSVP基因的克隆及序列分析：利用RT-PCR方法，设计特异性引物从菊花‘金不凋’中克隆得到1条特异的约700bp的目的条带（图1A）。测序结果通过BLAST比对表明，该序列与芝麻(Sesamum indicum)和山杨(Populus euphratica)的相似性最高，为70%；与猕猴桃(Actinidia chinensis)和麻疯树(Jatropha curcas)的相似性为67%，说明所克隆得到的为SVP家族的同源基因，命名为CmSVP，（GeneBank登录号为KJ850328）。
利用ORF在线软件分析CmSVP基因序列ORF为672bp，编码223个氨基酸，分子量为54.34KDa，理论等电点为5.2（图1B）。
BLASTX比对显示CmSVP是一个MIKC-II型的MADS-box家族基因，具有MADS-box和K-box两个保守区（图1C）。
CmSVP基因，利用Clustalw将相似性较高的来源于不同植物的SVP基因进行同源性比对，结果显示位于4-61的氨基酸为MADS-box保守区，93-171位点的氨基酸为K-box保守区（图1D）。
利用MEGA6.0构建CmSVP蛋白与其他22个植物的SVP同源蛋白及其它重要开花调控因子的系统发育进化树。结果显示，CmSVP蛋白与其它物种的SVP或JOINTLESS蛋白聚为一类，CmSVP与莲花(Nelumbo nucifera)进化关系最紧密，而且草本植物和木本植物的SVP家族成员亲缘关系较近。然而，CmSVP蛋白与SOC1，FLC和TFL1没有聚类（图1E）。说明CmSVP为SVP转录因子家族基因。
对CmSVP基因在菊花中的功能进行分析：
通过农杆菌介导法侵染菊花叶盘，经过7个月的潮霉素抗性筛选及PCR检测，共得到转CmSVP基因菊花3个株系。菊花‘粉地毯’经过预培养、共培养、延迟培养后转接在含6mg/L潮霉素浓度的培养基上约60d，大部分叶盘褐化、干枯，只有极少数的叶盘边缘出现少量的嫩绿的抗性愈伤组织（图2A）。继续筛选培养约60d，由愈伤组织分化出抗性芽（图2B），待抗性芽长至1cm，将丛生芽分开单株转移到生根培养基中，约40d后逐渐生根（图2C），45d左右生长成完整植株。一共侵染叶盘共700个，共4个叶盘分化出抗性芽，分化率为0.57%。
共获得12棵生根抗性苗，提取抗性苗叶片DNA，以筛选标记基因特异引物进行PCR检测，结果显示共检测出3株抗性苗具有1000bp的目的条带（图3），而野生型和阴性对照无条带。因此初步判定共获得3株转基因株系，转化率为0.43%，阳性率为25%。
对转CmSVP基因菊花的表型分析：
转CmSVP基因菊花在长日照条件下生长3个月后转移至短日照条件下，统计各株系的现蕾时间，其中野生型菊花从移植到现蕾平均需要127.9d，而3个转基因株系分别需要131.2d，133.0d，130.6d，比对照晚大约3~5d（表1）。与对照相比，19#株系花期无明显差异，而20#和21#株系花期推迟，而且主枝的长度有明显的差异，3个转基因株系均比对照的长。但是主枝上的叶片数量并未明显增加，导致主枝长度增加的原因是叶片节间的长度增加。这说明CmSVP基因推迟了菊花的开花时间，对茎的伸长生长具有促进作用，可以成为培育插花品种的优良候选基因。
序列表
<110> 内蒙古科技大学
<120> 一种菊花CmSVP基因的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 667
<212> DNA
<213> Chrysanthemum morifolium(菊花)
<400> 1
atgatggtta gggagaaagt gcagctaaaa aaaattgata atgcaacagc aagaagagtg 60
acattttcca gagaagaaga gggttattta agaaagctga agagcttctg tactttgtga 120
tgctgatgtt gctgttatcc tattctcttc aagtgaaaag cttttttact attcaagctc 180
aagtatgaaa gaagtactga aaggcgtagc tgcactccaa aaatcttgag acgttaaatc 240
aaccttccct tgagttgcag ctggttgaag atgccaacta tgccaagtta agcaaagaag 300
ttgctgaaag aacccttcag ttaaggcggt taccgagggg aggagttgca agggttaggt 360
atcgaagagc tgcatcaact cgagaagtta cttgaagctg gattgagccg tgtagtagca 420
aaaaagagcg aggtgattat gaatgaaatc agtcatcttc aagagaagga actgaagctc 480
aaggaggaga atgacaaact aagacaagag cttctgataa tttctgatgc tggaaacaaa 540
ccattaggga ttctgatgat tatgacgaat catcgaatgt accaatatct gcaactccgc 600
tggtcctcca caagaatatg aaagctccgg tacatctctc aggttaggat taccatactc 660
aggttga 667

Claims (4)

1.一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于包含以下步骤：
步骤1：将菊花‘粉地毯’作为转基因研究受体材料，通过茎段无菌扩繁，培养条件为长日照（16h光照/8h黑暗），温度为23-25℃；
步骤2：CmSVP基因的获得：根据已获得的转录组数据的 CmSVP全长序列，设计CmSVP基因的特异性引物；按照如下体系进行PCR扩增：1μl cDNA模板，
上游引物CmSVP-F（5’-ATGATGGTTAGGGAGAAAGTGC-3’）
下游引物CmSVP-R（5’-TCAACCTGAGTATGGTAATCCTAAC-3’）(10μmol·L−1)，12.5μl PCRMIX，ddH2O补足至25μl，反应程序为94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ for 30s，35个循环，72℃ 10min，然后4℃保存；将电泳检测后的目的条带切胶回收纯化；回收后的DNA连接pEASY-Blunt载体，并转化大肠杆菌感受态，挑取6个单克隆测序，获得pEASY-Blunt-CmSVP；
测序后的序列通过NCBI网站的Blast程序进行基因比对，利用ORF finder预测菊花CmSVP基因的ORF区及推测的氨基酸序列；利用Expasy在线分析软件分析菊花CmSVP蛋白的理化性质；从GenBank上下载多个物种的SVP同源基因蛋白序列，用ClustalW进行不同植物物种间蛋白的多序列同源比对，并分析菊花CmSVP蛋白的保守位点；利用MEGA6.0软件构建不同植物SVP蛋白的系统发育进化树；
步骤3:植物表达载体的构建,其中 pCAMBIA-1304-CmSVP植物表达载体的构建如下：
根据CmSVP基因序列设计PCR引物，分别在上游及下游引物的5’端引入NcoI和BstEII酶切位点，以pEASY-Blunt-CmSVP质粒为模板，利用高保真Taq酶，
上游引物CmSVP-NcoI-F（CATGCCATGGATGATGGTTAGGGAGAAAGT）
下游引物CmSVP-BstEII-R（GGGTATACCTCAACCTGAGTATGGTAATC）
进行PCR扩增，反应程序为98℃ 2min，98℃ 30s， 68℃ 6min 30s，35循环，4℃保存；
将扩增后的PCR产物经电泳检测后切胶回收纯化，连接pEASY-Blunt载体,连接产物转化大肠杆菌并经过蓝白斑筛选，挑取单克隆测序，测序正确的菌液质粒命名为pEASY-CmSVP；
按照如下体系对上述获得的菌液质粒进行双酶切：20μl pCAMBIA-1304（pEASY-CmSVP质粒），2.5μl NcoI，2.5μl BstEII，5μl Cutsmart，20μl ddH2O；然后回收酶切后的pEASY CmSVP小片段及pCAMBIA-1304的大片段，并按照如下体系进行连接：pCAMBIA-1304大片段1μl，pEASY-CmSVP小片段7.5μl，T4 DNA连接酶 0.5μl，T4 ligase buffer 1μl，37℃连接过夜；
连接产物转化大肠杆菌感受态：挑取单克隆进行菌液PCR验证；选取有目的条带的菌液测序，测序正确的命名为pCAMBIA-1304-CmSVP质粒，并对其通过冻融法转化农杆菌感受态；
步骤4:CmSVP基因在菊花中的遗传转化：
对地被菊‘粉地毯’进行遗传转化，利用以pmi为安全标记的菊花遗传转化体系进行实施，并根据实验调整筛选标记及浓度，以潮霉素为筛选标记的地被菊‘粉地毯’叶盘转化的基本培养基配方如下：
M1培养基：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，PH5.8-6.0
M2培养基：M1培养基+400mg/L Car，PH5.8-6.0
M3培养基：M2培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M4培养基：M1培养基+300mg/L Car+6mg/L Hyg，PH5.8-6.0
M5培养基：MS培养基+4mg/L Hyg，PH5.8-6.0；
在上述培养基内进行培养使其长成完整的植株；
取上述生根的抗性苗少量叶片，利用Edward方法粗提菊花叶片DNA，利用筛选标记hpt基因引物进行PCR扩增，检测筛选阳性苗；检测引物为
Hyg-F(CGTCTGTCGAGAAGTTTC)与
Hyg-R(TACTTCTACACAGCCATC)
将上述鉴定为阳性的转基因苗扩繁至7-10株，并且生根后转移到营养土：珍珠岩=2：1的栽培基质中，放于温室中培养，直至开花；
观察记录野生型菊花和转基因菊花的花期（统计自移植至现蕾及第一朵花开需要的天数）及其它重要的表型性状，获得明显区别与野生型的转基因菊花品种，转基因菊花的现蕾时间晚于野生型菊花，且其茎的伸长生长优于野生型菊花。
2.根据权利要求1所述的一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于：步骤3中测序正确的pCAMBIA-1304-CmSVP质粒通过冻融法转化农杆菌感受态具体步骤为：
（1）将-80℃保存的农杆菌感受态置于冰上融化，待完全融化后立刻加入质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min；
（2）液氮速冻1 min，37℃金属浴热激5 min，然后再冰浴2 min；
（3）无菌条件下，加入700μl液体LB培养基（无抗生素），28℃，180 rpm震荡培养4-5 h；
（4）室温5000 rpm离心1min，去掉上清液，保留200μl，用枪头轻轻吹打混匀后涂布于5LB固体培养基（附加50 mg/L Rif和50 mg/mL Kan）上，28℃倒置暗培养2-3天，直至长出单克隆菌斑；
（5）挑取单菌斑利用菌液PCR进行阳性鉴定，PCR检测为阳性的菌斑摇菌后，用于后续转基因试验，或1：1加入灭菌的30%甘油，于-80℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于：步骤4中分别在M1、M2、M3、M4、M5培养基内进行培养的具体方法为：
（1）取经测序鉴定为阳性农杆菌pCAMBIA-1304-CmSVP，若是在-80℃中保存，需在LB固体培养基（50mg/L Kan+50mg/L Rif）上划线活化；待长起单菌落后，接种于3mL同样含双抗的LB液体培养基中小摇过夜,将浑浊的菌液按照1：100的比例转入含两抗的LB培养液中继续扩大培养，28℃，180 rmp避光震荡培养至OD600=0.4-0.6之间；
（2）将菌液放入50ml的离心管中，5500r/min，常温离心15min，收集菌体，弃去上清液，用1/2MS （1/2MS+30g/L蔗糖，PH5.8）培养基重悬至OD600=0.4-0.6之间；
（3）以无菌的苗龄为30d左右的‘粉地毯’幼苗为试材，选取中上部分厚实健壮的叶片，避开主叶脉切成边长为0.5cm的方块，并在方块中间划切几道；叶片近轴面朝下，平铺在M1培养基上，于正常的光照培养下培养20h，不超过24h；
（4）经过预培养的‘粉地毯’叶盘完全浸入在农杆菌重悬液中，轻轻晃动10min；取出叶盘并用无菌滤纸将叶盘表面的菌液吸干,然后将叶盘平铺在M1培养基上，暗培养2d；
（5）共培养后的叶盘周围可以看到星点状的菌落，将叶盘放于含有400mg/L Car的无菌水中，冲洗3次，并且用无菌滤纸吸取水份，将叶盘转移至M2培养基上，正常培养4d；
（6）经过脱菌的叶盘转移到M3较低筛选压的培养基上，进行筛选培养15d后可以看到叶盘膨大，边缘形成少量愈伤组织；将叶盘转接至较高筛选压d的M4培养基上，每15d转接到新鲜的培养基上；
（7）筛选培养约45-60d，叶片边缘的愈伤组织分化出抗性芽，待抗性芽继续生长到1cm的时候，切下来放至M5生根培养基上；约20d，抗性芽生根，30d后长成完整的植株。
4.根据权利要求1所述的一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于：步骤4中鉴定为阳性的转基因苗扩繁至7-10株，并且生根后转移到营养土培养的条件为：栽培条件为在长日照（16h光照/8h黑暗）下生长4个月，之后转移到短日照条件（12h光照/12h黑暗）下促进开花；温度在23-25℃。
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