CN103694325A

CN103694325A - 淫羊藿EsSVP蛋白、编码该蛋白的基因及其应用

Info

Publication number: CN103694325A
Application number: CN201310370795.0A
Authority: CN
Inventors: 李志能
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103694325B

Abstract

本发明提供淫羊藿EsSVP蛋白、编码该蛋白的基因及其应用，所述淫羊藿EsSVP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次克隆获得淫羊藿EsSVP基因，并通过转基因技术，在植物（拟南芥、矮牵牛）中验证了该基因的功能。对于淫羊藿花期和花瓣、萼片的性状及其调控机制方面的研究提供参考和依据，为进一步改良观赏性植物，如淫羊藿的观赏性状提供可能。

Description

淫羊藿EsSVP蛋白、编码该蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及淫羊藿EsSVP蛋白、编码该蛋白的基因及其应用。

背景技术

淫羊藿隶属毛茛目、小檗科Berbridaceae，该属植物花型奇特，花色、叶色丰富，多数为常绿草本，具有非常优良的园林观赏特性，自然生境多为林下、草丛或灌丛，其耐阴性和适应性强（Stearn,2002），在欧美及中国部分地区已广泛应用于盆栽、专类园、岩石园、花境和地被（任璘等，2008）。中国是淫羊藿种质资源较为重要的起源中心之一，在已知的50多个品种中，原产于中国的就多达40多种，约占总数的80%，丰富优良的野生资源为开发淫羊藿属植物作为新型观赏植物提供了可能。

淫羊藿属是古老的基部真双子叶植物，在进化上属于双子叶植物和单子叶植物分离后的第一个分枝，是古老的二倍体（2n＝2x＝12），是小檗科唯一具有二基数花的属，花被共6轮，两两对生，成花时每两轮接近排列成一轮，呈3轮：外萼片、内萼片和花瓣(Terabayashi,1979)。然而，目前尚未发现有关淫羊藿花瓣、萼片的性状及其调控机制方面研究的报道。

花发育相关基因中大部分来自于一个保守的转录因子基因家族—MADS-box基因家族。MADS的名称来源于MCM1（Minichromosomemaintenance gene）（来自啤酒酵母）（Passmore et al.1988）、AG（来自拟南芥）（Yanofsky et al.1990）、DEF（DEFICIENS）（来自金鱼草）（Schwarz-Sommer et al.1992;Sommer et al.1990）和SRF（Serumresponse factor）（来自现代人）（Norman et al.1988）四个最早被鉴定的该家族成员的首字母。

目前已经从被子植物各大类群中分离到了大量的MIKC^c型MADS-box基因，并对这些基因的系统发育关系进行了重建，研究表明，被子植物中的这些MADS-box基因可被划归至12个主要的基因亚家族（gene subfamilies）中：AP1/SQUA、AP3/PI、AG/STK、SEP、AGL6、GGM13、SVP/STMADS11、SOC1/TM3、AGL12、AGL17、AGL15和FLC（Becker and Theissen2003）。在许多双子叶植物如拟南芥、番茄和金鱼草中,大多数SVP基因在花分生组织的确定和控制开花时间中发挥作用。SVP在周围寒冷环境下受温度影响上调表达，导致晚花（Lee et al.，2007）；此外它还受自主途径和赤霉素途径的下调表达。svp突变体早花，然而拟南芥中组成型表达抑制开花，影响花器官发育，主要表现在促使花向茎状结构转变并且形成叶片状花萼(Hartmann et al.,2000;Gregis et al.,2006)。交互作用模型表明，SVP/AGL24/SOC1复合体在抑制花分生组织早期分化和决定花器官发育的时间上起着决定性作用(Gregis et al.,2009;Liu et al.,2009;Lee andLee,2010)。

发明内容

本发明的目的是提供淫羊藿EsSVP蛋白、编码该蛋白的基因及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的淫羊藿EsSVP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供淫羊藿EsSVP蛋白的编码基因，即EsSVP基因。该基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有EsSVP基因的载体、宿主细胞及工程菌。

本发明还提供EsSVP基因在改良植物花瓣性状中的应用。

本发明还提供EsSVP基因在调控植物花期、花萼形状、大小、厚度及花瓣开合程度中的应用。所述植物为拟南芥或矮牵牛等。

本发明还提供EsSVP基因在制备转基因植物中的应用。

本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有EsSVP基因的载体转入植物组织中，筛选转基因植株。

本发明具有以下优点：

本发明首次克隆获得淫羊藿EsSVP基因，并通过转基因技术，在植物（拟南芥、矮牵牛）中验证了该基因的功能。对于淫羊藿花期和花瓣、萼片的性状及其调控机制方面的研究提供参考和依据，为进一步改良观赏性植物，如淫羊藿的观赏性状提供可能。

附图说明

图1为本发明淫羊藿EsSVP基因的cDNA序列分析结果。

图2为淫羊藿EsSVP蛋白序列比对结果及系统发育树；其中，A为EsSVP氨基酸序列与拟南芥SVP、AGL24、SOC1、番茄StMADS11、StMADS16、大麦HvBM1、HvBM10、水稻OsMADS22、OsMADS47、OsMADS55序列比对结果；B为基于MIKC结构域的核苷酸序列构建的NJ树，其他物种基因包括：拟南芥SVP(NM_127820)、AGL24(NM_118587)、番茄StMADS11(AF008652)、StMADS16(AY643736)、水稻OsMADS22(AB107957)、OsMADS47(AY345221)、OsMADS55(AY345223)、大麦HvBM1(AJ249142)、HvBM10(EF043040)、包菜BcSVP(DQ922945)、桉树EgrSVP(AY273873)、梅花PmDAM6(AB437345)、乳浆草EeDAM2(EU339320)、枳CtSVP(FJ373211)、蓝宝石龙血树PkMADS1(AF060880)、苹果MdMADS20(EB137980)、MdMADS25(CO723380)、MdMADS201(CO899324)、拟南芥FLC(NM_001085094)、AP1(NM_105581)和SOC1(NM_130128)作为外类群。

图3为EsSVP实时定量PCR分析结果，Actin基因作为内参。

图4为35S::EsSVP超量表达转化拟南芥表型分析结果；(A-B)野生型(Columbia)(左)与35S::EsSVP异位表达，35S::EsSVP5#(A)长日照条件下(14小时光照/10小时黑暗，右)抑制开花，35S::EsSVP1#(B)短日照条件下(10小时光照/14小时黑暗，右)提前开花。箭头示花分生组织。(D-F)与野生型对照(C)相比，35S::EsSVP1#(D)花分生组织诱导出2个具有较长花柄的二级花分生组织和1个花序分生组织，且二级的花序分生组织显示出与主花序相同的模式；35S::EsSVP2#(E)具较长果柄的果实着生较多的毛状体；35S::EsSVP4#(F)开放的叶片状花萼，绿色的花瓣。(G-H)主花诱导出5枚花萼5枚花瓣(G，箭头所示)，4枚额外的花分生组织从花瓣状花萼的腋下长出(H，箭头示主花)。(J-L)35S::EsSVP4#花和花萼，与野生型(I)相比，4枚(J)和5枚(K)开放的花瓣状花萼；与野生型（L，左）白色花瓣相比，绿色花瓣(L，右).(M)35S::EsSVP2#具长果柄的果荚上着生较多的毛状体、叶片状花萼开放状(箭头所示)。(N)成熟果荚宿存花萼。

图5为35S::EsSVP1#超量表达转化拟南芥野生型在短日照(10小时光照/14小时黑暗)条件下实时定量PCR检测结果；SVP(A)和EsSVP(B)相对表达量。三个重复，Tubulin作为内参。

图6为35S::EsSVP超量表达转化拟南芥野生型在长日照(14小时光照/10小时黑暗)条件下EsSVP实时定量PCR检测结果；(A)株系2、3、4、6、8，(B)株系5、7、11，WT为对照，三个重复，Tubulin作为内参。

图7为35S::EsSVP25#超量表达矮牵牛W115表型分析结果；(A-B)侧面和顶部观35S::EsSVP花分生组织(右)，野生型对照WT(左)，花萼增大成叶片状，花冠筒比对照颜色更绿，花瓣并未完全开放；(C)叶片状花萼基部离生,花瓣宿存；(D,H)5枚基部离生纯绿色花萼特写，对照花萼基部围合且呈现部分白色；(E)缩短的雌蕊和非正常形态子房特写，花粉管不易从变长且膨大的子房顶端脱落；(F-G)果实外部及其纵切形态比较，35S::EsSVP果实更加长而窄一些；(I)叶片状花萼特写比较；(J-L)柱头顶视和石蜡切片侧视图，柱头顶端表面有一定程度下陷(红色星号所示)；(M,N)雌蕊不同发育阶段石蜡切片,较早期、较短花粉管阶段（M），花粉管伸长，胚珠逐渐成熟(N)；(O-P)成熟子房石蜡切片纵切图，与对照（O）相比，子房变长而窄，胎座基部伸长。放大倍数均为25倍。

图8为35S::EsSVP矮牵牛叶片、花萼、花瓣、雌蕊半定量和实时定量PCR分析结果；株系25、6、37及CK分别为强表型、中等表型、弱表型及野生型W115。矮牵牛Actin作为内参，三个重复，半定量为28个循环。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1淫羊藿EsSVP基因的克隆

1基因克隆

1.1总RNA的提取

（1）取淫羊藿叶片，在180-200℃烘烤过的研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入DEPC处理过的离心管中，待液氮挥发后，按1ml试剂/100mg材料的比例加入适量的Trizol（植物RNA提取试剂），涡悬混匀，室温放置30min。

（2）12000rpm离心10min，吸上清液至另一离心管。

（3）向上清液中加0.2倍Trizol体积的三氯甲烷，并充分混匀，室温放置5min。

（4）12000rpm离心10min，并保留水相，将其吸至另一离心管。

（5）向水相中加等体积的异丙醇，并充分混匀后，在-20℃下放置2h。

（6）12000rpm，4℃，离心30min，弃上清，并保留沉淀。

（7）75％乙醇洗沉淀两次，然后风干沉淀。

（8）将沉淀溶解于适量的含DEPC的ddH₂O中。

（9）电泳检测总RNA的质量并用紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。

1.2cDNA第一链的合成

（1）初始反应体系的建立（表1）。

表1初始反应体系

3’CDS（20pmol/μl）	1μl
		mRNA	4μl

（2）70℃变性2min，取出后置于冰上，向初始反应体系中加入表2中所列试剂。

表2反应体系中添加的试剂

5×first-strand缓冲液	4μl
		0.1M DTT	1μl
RNase抑制剂	1μl
		Superscript III反转录酶(200U/μl)	1μl

（3）42℃水浴60min，进行cDNA第一链的合成。

（4）70℃变性15min，使Superscript III反转录酶失活。

（5）反转录产物可在-20℃保存。

1.3基因3’端的基因克隆

（1）反应体系：以2μl的cDNA第一链为模板；10μM正向基因特异引物GSP5-3（5’-GCAACCTCAGCATCACAAAGAATAGAAAGC-3’）、10μM反向引物CDSIII（5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N–1N-3’）各1μl；10×PCR缓冲液5μl；2mM dNTP2μl；1U ExTaq DNA聚合酶；用无菌去离子水将体系补至50μl。

（2）PCR反应条件：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，10个循环；每个循环减1℃。94℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸1分钟，25个循环；72℃延伸10分钟。

（3）结果检测：取PCR产物5μl，电泳检测。

1.4PCR回收产物的纯化

将上述PCR产物中800-1000bp的条带割胶，使用Axygen公司凝胶回收试剂盒过柱回收。回收程序依据试剂盒提供方法进行。

1.5PCR回收产物的连接

连接反应体系见表3。

表3连接反应体系

3’RACE PCR回收产物	4.5μl
		缓冲溶液I	5μl
PMD19-T	0.5μl

4℃过夜，进行连接反应。

1.6大肠杆菌感受态的制备

（1）从-70℃取出甘油保存的菌种DH5α，融化后，用接种环蘸取细菌培养液，在LB固体培养基平板上划线，37℃，培养过夜。

（2）挑取单菌落至少量LB液体培养基中，37℃，震荡培养，过夜。

（3）取1ml细菌培养液至100ml LB培养基中，37℃，震荡培养6个小时左右，使细菌培养液的OD₆₀₀达到0.5后取出。

（4）将细菌培养液冰浴10min，同时将离心管置于-20℃预冷。

（5）将菌液分装至2个50ml的离心管中，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。

（6）向细菌沉淀中加入50ml0.1M CaCl₂（4℃预冷），重悬沉淀。

（7）4000rpm，4℃，离心10min，弃上清。

（8）加入25ml0.1M CaCl₂，重悬沉淀。

（9）4000rpm，4℃，离心10min，弃上清。

（10）向每管中加入2.5ml0.1M CaCl₂（含15%甘油）。

（11）重悬沉淀后，分装至1.5ml离心管中，100-150μl/管。

（12）液氮速冻后，放于-70℃超低温冰箱保存，备用。

（13）留出一管进行转化效率检测。

1.7连接产物的转化

（1）从-70℃超低温冰箱中取出感受态细胞，放在冰上，加入5μl连接产物，混匀，冰浴30min。

（2）将含有感受态细胞和连接产物的离心管置于42℃恒温水浴锅中，热激60s，不要摇晃。然后，立即冰浴2min。

（3）加入750μl LB培养基，混匀，置于37℃摇床上，约150rpm，培养45-60min。

（4）4000rpm，离心5min。

（5）在含氨苄青霉素的LB平板上涂上X-Gal（20mg/ml）40μl，晾干。

（6）从离心后的离心管中吸去500μl上清后，用剩余的上清液将菌体混匀，并加入IPTG（200mg/ml）20μl，涂于LB平板上。

（7）将平板于37℃培养12-16h。

1.8菌落PCR法鉴定阳性克隆

（1）用牙签挑取白色菌落于含有0.5ml LB的1.5ml离心管中，在37℃摇床内，震荡培养至少6h以上。

（2）用通用引物M13F/M13R进行PCR扩增。取1-1.5μl菌液作为模板，退火温度为52℃。阳性克隆的PCR产物根据所获得的基因大小进行预测。

1.9测序及序列分析

（1）可以挑选含不同长度插入片段的克隆首先进行测序。

（2）将所测得的序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索，首先确定这些基因是否为MADS-box、YABBY和MIXTA基因，并初步归类。

1.10基因5’端的获得

（1）初始反应体系的建立（表4）。

表4初始反应体系

5’CDS（20pmol/μl）	1μl
		SMART II A oligo	1μl
mRNA	3μl

（2）70℃变性2min，取出后置于冰上，向初始反应体系中加入如表5中所列试剂。

表5反应体系中添加的试剂

5×first-strand缓冲液	2μl
		0.1M DTT	1μl
dNTP(10mM)	1μl
		Superscript III反转录酶(200u/μl)	1μl

（3）42℃水浴60min，进行cDNA第一链的合成。

（4）70℃变性15min，使Superscript III反转录酶失活。

（5）反转录产物可在-20℃保存。

1.11cDNA第一链的PCR扩增

（1）反应体系：以2μl cDNA第一链为模板；10μM正向引物SMART IV TM Oligonucleotide（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’）2μl；10μM反向基因特异性引物GSP3-5（5’-GCTTTCTATTCTTTGTGATGCTGAGGTTGC-3’）2μl；5×PCR缓冲液10μl；2mM dNTP2μl；1U ExTaq DNA聚合酶；用无菌去离子水将体系补至50μl。

（2）反应条件：94℃变性3分钟；94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

（3）结果检测：取PCR产物5μl，电泳检测。

1.12PCR产物的回收、连接、转化以及阳性克隆的鉴定

回收合适大小的PCR产物，并连接到pMD19-T载体上，4℃过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，在含Ampr的LB培养基上，并用IPTG/X-GAL筛选，得到的克隆通过菌落PCR（M13F/M13R或者基因特异性引物组合），选择插入片段较长的阳性克隆进行测序。淫羊藿EsSVP基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

淫羊藿EsSVP基因cDNA全长为1027bp，包含一个678bp的完整开放阅读框架，编码226个氨基酸。5’端有87bp长的非翻译区，3’端包含241bp的非编码序列（图1）。

淫羊藿EsSVP全长蛋白质序列与拟南芥SVP、AGL24、SOC1同源性分别为68%、54%和35%，与番茄StMADS11、StMADS16同源性分别为52%和55%，与大麦HvBM1、HvBM10同源性分别为52%和51%，与水稻OsMADS47、OsMADS22、OsMADS55同源性分别为54%、50%和51%（图2A和图2B）。淫羊藿EsSVP基因的核苷酸序列与拟南芥SVP、AGL24、SOC1同源性分别为70%、64%和49%，与番茄StMADS11、StMADS16同源性分别为66%和67%，与大麦HvBM1、HvBM10同源性分别为61%和60%，与水稻OsMADS47、OsMADS22、OsMADS55同源性分别为62%、59%和61%，与桉树EgrSVP同源性高达72%。

各类基因的系统发育分析除了来自于本发明所获得的基因及蛋白序列之外，其他数据均来自NCBI中公开发表的数据。基于MIKC结构域的核苷酸序列，用MEGA4.0构建NJ树(Tamura et al,2007)，自展分析执行1000次重复。

系统进化分析表明，淫羊藿EsSVP基因属于拟南芥SVP类基因，与桉树EgrSVP、水稻OsMADS22、OsMADS47、OsMADS55、大麦HvBM1、HvBM10进化关系较近。

实时定量PCR分析淫羊藿EsSVP基因的表达模式发现，EsSVP在淫羊藿果实中完全不表达，在根和花中有少量表达，在花中的表达量是根中的2.72倍，叶柄中表达量是根中的460多倍。叶片中表达量最高，是根中表达量的近740倍，是花中表达量的270多倍，是叶柄中表达量的近1.6倍。（图3）

实施例2农杆菌介导的淫羊藿EsSVP基因转化（拟南芥）

1表达载体的构建

根据实验要求，本实施例中利用了载体pMV和pBI121上的多克隆酶切位点特性，将克隆载体上的cDNA片断酶切并直接连接到表达载体中。

2农杆菌GV3101和EHA105电激感受态细胞的制备和表达载体的转化

（1）挑取新鲜的农杆菌GV3101和EHA105单菌落于10mL LB液体培养基中，28℃振荡培养至对数晚期；

（2）取1mL菌液加入100mL新鲜LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5-1.0；

（3）将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30分钟；

（4）4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体，弃上清；

（5）沉淀用50mL预冷的HEPES灭菌蒸馏水重悬；

（6）4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体，弃上清；

（7）重复操作（5）、（6）两次，每次HEPES减半；

（8）用含10％甘油的灭菌蒸馏水重悬菌体，按每管50μl体积分装至1.5ml Eppendorf管中，即为农杆菌感受态细胞，分装后直接使用或于-70℃保存备用；

（9）取50μl上述制备的感受态细胞，加入0.5μg质粒，轻轻混匀，置于冰上；

（10）2500伏电击5ms，立刻加入500μl LB液体培养基；

（11）28℃，150rpm，恢复培养4个小时；

（12）涂布适量的细胞于筛选LB固体培养基平板上，超净台吹干表层液体，28℃培养2-3天。

3农杆菌介导的拟南芥转化（花芽浸泡法）

待拟南芥花序抽苔约1cm高时，剪去主花序。待植株发出侧生花序，并生长至花蕾未展开时，进行转化实验。接种含有表达载体的农杆菌克隆于5mL LB液体培养基（含100μg/ml Rif，100μg/ml Kan）中，28℃，200rpm中振荡培养过夜；按1:50的比例转接到200mL LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养5小时；5000rpm，离心15分钟，收集菌体；重悬于缓冲液(5%蔗糖，0.03%Silwet L-77)中，调OD₆₀₀至0.8。将花序倒置放入混好的农杆菌菌液中10秒，用保鲜膜覆盖整个花序，24小时后取下保鲜膜，继续培养于培养室（22℃，14小时光照/10小时黑暗），直至收获种子(Clough and Bent,1998)。

4拟南芥阳性苗的筛选

（1）将收获的转化拟南芥种子在70％乙醇中浸泡2分钟，去上清；

（2）次氯酸钠溶液浸泡5分钟进一步进行消毒处理，用无菌水漂洗3－5次；

（3）将拟南芥种子播于含50μg/mL抗生素Kan的1/2MS培养基平板上；

（4）如果穿梭载体上具Kan抗性的报告基因，将培养平板置于光照培养室（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养7-10天；选择经过Kan筛选后长势良好，真叶叶片及生长点呈深绿色且根部可以扎入培养基的植株，初步确定为阳性苗，移栽入土中。

5实时定量RT-PCR

以转基因植株和以箭叶淫羊藿各器官为材料，用Trizol试剂盒提取总RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)进行cDNA第一链的反转录。将cDNA第一链稀释10倍后作为模板进行PCR反应。然后利用SYBR Premix Ex Taq(Bio-Rad,USA)反应试剂盒，在实时定量PCR仪Eco^TM Real-Time PCR System(USA)上完成反应。分析所获得的数据并计算样品中目的基因浓度。PCR反应体系为10μl，共设置3个重复，反应条件为40个循环，95℃60秒，95℃5秒，60℃34秒。

6转基因表达结果

35S::EsSVP超量表达转化拟南芥，长日照条件下35S::EsSVP5#抑制开花，其表达量是对照的5.89倍（图4A，图6B）。短日照条件下35S::EsSVP1#提前开花（图4B），EsSVP外源基因在35S::EsSVP1#表达量是野生型的1000多倍（图5B），而SVP内源基因的表达量与对照相比下调40%多（图5A），很可能是转录后基因沉默现象。35S::EsSVP1#花分生组织诱导出2个具有较长花柄的二级花分生组织和1个花序分生组织，并且二级的花序分生组织显示出与主花序相同的模式（图4D）；主花诱导出5枚花萼、5枚花瓣（图4G）；4枚额外的花分生组织从花瓣状花萼的腋下长出（图4H，箭头示主花）。35S::EsSVP2#表达量是对照的22700多倍(图6A)，具长果柄的果荚上着生较多的毛状体、叶片状花萼开放状（图4E，M）。35S::EsSVP4#表达量是对照的22700多倍90000多倍(图6A)，诱导出基部分离的叶片状花萼,绿色的花瓣（图4F，J-L）。成熟的果荚具宿存的花萼（图4N）。35S::EsSVP6,8#表达量分别是WT的118000倍和4800多倍(图6A)，具有与35S::EsSVP2#，4#类似的表型，较长的花柄上着生离生的、叶片状花萼。35S::EsSVP3#表达量是WT的8000多倍，长日照条件抑制开花，但没有35S::EsSVP5#晚花那么明显。35S::EsSVP7，11#表达量分别是WT的140多倍和60多倍（图6B），但是花型和花期方面没有明显的变异。

实施例3农杆菌介导的淫羊藿EsSVP基因转化（矮牵牛）

1农杆菌介导的矮牵牛转化（叶盘转化法）

外植体采用温室栽培，取生长健壮的野生型矮牵牛W115叶片，具体转化操作方法参见Horsch et al.1985。

2组织石蜡切片

采用FAA固定液固定不同发育阶段的雌蕊，石蜡切片的制备方法参见Horsch,R.B.等(1985），切片厚度8-mm，采用伊红-甲苯胺蓝染色(Igersheim and Cichocki,1996)。

35S::EsSVP超量表达转化矮牵牛，没有影响聚伞状分支，并且对开花时间有很小的影响或基本没有影响，但是很明显改变了花的发育。花萼增大，有时有叶片大小（图7A、C、D、H）。花冠筒变绿，花瓣不能完全开放（部分的丢失了花瓣的特征）（图7A、B），花是雌性不育的。花瓣宿存，跟转化拟南芥有类似的表型。

淫羊藿EsSVP基因半定量及实时定量结果表明，除了在花瓣中25#>37#>6#,在叶片、花萼及雌蕊中的表达量25#>6#>37#。在强表型35S::EsSVP25#中表达量为花萼>花瓣>叶片>雌蕊，花萼中表达量是花瓣中的4.4倍，是叶片中的5.4倍，是雌蕊中的12.3倍。在中等表型6#中表达量为花萼>叶片>雌蕊>花瓣，在弱表型37#中表达量为花瓣>花萼>叶片>雌蕊。叶片中，25#表达量是6#的1.88倍，是37#的13.5倍。花萼中，25#表达量是6#的6.7倍，是37#的13.7倍。花瓣中，25#表达量是37#的2.5倍，是6#的近6倍。雌蕊中，25#表达量是6#的近2倍，是37#的近11倍多（图8）。表达量结果跟表型较为一致，35S::EsSVP25#为强表型，淫羊藿EsSVP基因在花萼和花瓣中表达量均高于6#和37#，花萼片状增大，花瓣不能完全开放。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

1.Stearn WT.The genus Epimedium and other herbaceous berberidaceae in cluding the genusPodophyllum.The Bath Press,2002:35.

2.任璘，戴思兰，王瑛.淫羊藿属植物种质资源及其园林应用.武汉植物学研究，2008,26(6):644-649

3.Terabayashi S.1979.Studies in the morphology and systematics of Berberidaceae.III.Floralanatomy of Epimedium grandiflorum Morr.ssp.sempervirens(Nakai)Kitam.AndVancouveria hexandra(Hook.)Morr.et Decne.Acta Phytotax.Geobot.30:153–168.

4.Passmore S,Maine GT,Elble R,Christ C,Tye BK.1988.A Saccharomyces cerevisiaeprotein involved in plasmid maintenance is necessary for mating of MAT alpha cells.J MolBiol.204:593-606.

5.Yanofsky MF,Ma H,Bowman JL,Drews GN,Feldmann KA,Meyerowitz EM.1990.Theprotein encoded by the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS resembles transcriptionfactors.Nature.346:35-39.

6.Schwarz-Sommer Z,Hui I,Huijser P,Flor PJ,Hansen R,Tetens F,

WE,Saedler H,Sommer H.1992.Characterization of the Antirrhinum floral homeotic MADS-box geneDEFICIENS:evidence for DNA binding and autoregulation of its persistent expressionthroughout flower development.EMBO J.11:251-261.

7.Norman C,Runswick M,Pollock R,Treisman R.1988.Isolation and properties of cDNAclones encoding SRF,a transcription factor that binds to the c-fos serum response element.Cell.55:989-1003.

8.Becker A,Theissen G.2003.The major clades of MADS-box genes and their role in thedevelopment and evolution of flowering plants.Mol Phylogenet Evol.29:464-489.

9.Lee J H,Yoo S J,Park S H,Hwang I,Lee J S,Ahn J H.Role of SVP in the control offlowering time by ambient temperature in Arabidopsis.Genes Dev.2007,21:397-402

10.Hartmann U,Hohmann S,Nettesheim K,Wisman E,Saedler H,Huijser P.2000.Molecularcloning of SVP:a negative regulator of the floral transition in Arabidopsis.The Plant Journal21,351–360.

11.Gregis V,Sessa A,Colombo L,Kater MM.2006.AGL24,SHORT VEGETATIVE PHASE,andAPETALA1redundantly control AGAMOUS during early stages of flower development inArabidopsis.The Plant Cell18,1373–1382.

12.Gregis V,Sessa A,Dorca-Fornell C,Kater MM.2009.The Arabidopsis floral meristemidentity genes AP1,AGL24and SVPdirectly repress class B and C floral homeotic genes.ThePlant Journal60,626–637.

13.Liu C,Xi WY,Shen LS,Tan CP,Yu H.2009.Regulation of floral patterning by floweringtime genes.Developmental Cell16,711–722.

14.Lee J,Lee I.2010.Regulation and function of SOC1,a flowering pathway integrator.Journalof Experimental Botany61,2247–2254.

15.Tamura K.,Dudley J.,Nei M,Kumar S.2007.MEGA4:molecular evolutionary geneticanalysis(MEGA)software version4.0.Molecular Biology and Evolution24:1596-1599.

16.Clough,S.J.and Bent,A.F.(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16,735-743.

17.Horsch,R.B.,Fry,J.E.,Hoffman,N.L.,Eicholtz,D.,Rogers,S.G.,and Fraley,R.T.(1985).Asimple and general method for transferring genes into plants.Science227:1229-1231.

18.Igersheim A.,Cichocki O.(1996)Asimplemethod formicrotome sectioning of prehistoriccharcoal specimens embedded in2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA).Rev PalaeobotPalynol2:389–393.

Claims

1.淫羊藿EsSVP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在改良植物花瓣性状中的应用。

7.权利要求2或3所述基因在调控植物花期、花萼形状、大小、厚度及花瓣开合程度中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或矮牵牛。

9.权利要求2或3所述基因在制备转基因植物中的应用。

10.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求4所述的载体转入植物组织中，筛选转基因植株。