CN109553671B

CN109553671B - 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用

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Publication number: CN109553671B
Application number: CN201910066515.4A
Authority: CN
Inventors: 刘继红; 王敏; 戴文珊
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-01-24
Also published as: CN109553671A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrTZF1基因为一种从极抗寒枳中分离、克隆出的一个C3H型锌指蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。将该基因构建超表达和RNAi载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrTZF1基因具有提高植物抗寒性的功能。该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到一个C3H型锌指蛋白PtrTZF1，还涉及该基因在植物抗寒遗传改良中的应用，将该基因在烟草和柠檬中超表达，获得的转基因植物抗寒性明显提高。

背景技术

低温是影响作物产量以及限制植物地理分布的重要因子之一。低温会破坏细胞结构，影响其关键的生理功能。低温胁迫引起渗透胁迫，这会导致膨压丧失，破坏膜的稳定性、使蛋白质失活或变性、积累活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)产生氧化损伤，进而导致光合作用被抑制、代谢功能紊乱和细胞结构遭到破坏。最终影响植物的生长发育，严重时会导致植株完全死亡(Krasensky and Jonak,2012；Vogel et al.,2005；Yadav,2010)。

柑橘是全球重要的果树之一，而大多数柑橘品种受低温影响只能在热带和亚热带区域种植。在美国最大的柑橘产区福罗里达州，柑橘产业经常受严重冻害而重组，一百年前商业柑橘种植面积扩大到了佛罗里达州的北半岛，但现在主要的种植区域只能局限在南半岛(Champ et al.,2007)。因此，培育抗低温冻害品种是柑橘育种的重要目标之一。柑橘存在着多胚性、高度杂合、雄性不育等因素，很难用传统的杂交方法获得新的抗性品种。随着各种分子生物技术的迅猛发展，通过遗传改良增强柑橘抗寒性已成为可能。而且，增加植物抗寒性最基本的途径为改变基因表达，所以在柑橘抗寒研究中最首要的工作是筛选、克隆和鉴定抗寒相关基因。

CCCH(C3H)型锌指蛋白广泛存在于生物界中，其典型特征是包含1-6个C3H结构域，C3H结构域是由一个由锌离子协调三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的锌指结构保守域，该结构域的共有基序为C-X_4-17-C-X_4-6-C-X₃-H(X为任意氨基酸)。在C3H型锌指蛋白中有一类比较特殊的类型，即TZF(tandem CCCH zinc finger)蛋白，植物的TZF蛋白广泛参与了植物的生长发育以及外界环境适应。AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6参与了光、脱落酸和赤霉素介导的种子萌发调控(Bogamuwa and Jang,2013)。但是在现有的技术上尚未见TZF参与柑橘低温应答的报道。

枳是柑橘产业中应用较广泛的一种砧木，极抗寒，经充分低温驯化后能抵御-26℃的低温，是柑橘抗寒育种宝贵的种质资源，同时也是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料(Sahin-Cevik,2013)。因此，克隆枳抗寒有关基因是柑橘抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种枳抗寒基因，该基因是从极抗寒的枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆出的一个C3H型锌指蛋白，该蛋白拥有一个串联的C3H保守域，是典型的TZF蛋白，申请人将其命名为PtrTZF1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。

本发明另一个目的在于提供了枳抗寒基因PtrTZF1在植物抗寒中的应用，将该基因转化进其他植株中进行超表达，可明显提高植株的抗寒能力。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人基于植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrTZF1，申请人利用qRT-PCR技术分析了在不同逆境条件处理下PtrTZF1基因的时空表达，分析结果表明PtrTZF1基因相对表达量在低温胁迫时最高。当低温处理植株时，随低温处理时间延长，PtrTZF1基因的表达量也逐渐增加，到6h时表达量达到了最大值(48倍)，随后缓慢降低，说明PtrTZF1对于低温胁迫有十分强烈的响应，表明PtrTZF1基因是一个潜在的抗寒育种基因。所述基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的核苷酸序列对应SEQ ID NO.1的197-2164bp，它包含1968bp的开放阅读框，编码655个氨基酸，等电点为6.32，预测的分子量为71.81kDa。以引物(5’-CACATAAAAAGGCCCTCACC-3’和5’-GAGCAGGGCCCTCATTTATCC-3’)，以枳cDNA为模板，利用PCR技术克隆得到上述基因PtrTZF1的cDNA全长序列。

枳抗寒基因PtrTZF1在植物抗寒中的应用，利用本发明提供的基因构建超表达和干涉载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬或枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrTZF1基因具有提高抗寒性的功能。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次报道了TZF类基因参与植物对低温胁迫的应答，明确了其抗寒功能；该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

附图说明

图1为PtrTZF1响应不同胁迫处理的表达模式示意图；

其中：图1中A是低温(4℃)处理；图1中B是脱水处理；图1中C是盐处理；图1中D是ABA处理。

图2为一种PtrTZF1基因超表达载体构建图。

图3为一种PtrTZF1基因转化烟草过程示意图；

其中：图3中A是共培养的叶片；图3中B是在筛选培养基上长出抗性芽；图3中C是芽伸长培养基上的丛芽；图3中D是生根培养苗。

图4为PtrTZF1基因超表达载体转化烟草再生植株PCR鉴定示意图；

其中：上胶图为35S加PtrTZF1-pBI121-R引物的扩增条带，下胶图为NPTⅡ特异引物扩的增出条带。M：marker；P：质粒；W：water(水)。

图5为鉴定阳性转基因烟草中PtrTZF1的表达量分析示意图。

图6为野生型和PtrTZF1转基因烟草苗(#13和#24两个株系)抗冻性比较示意图；

其中：图6中A左是低温处理前转基因和野生型烟草的表型；图6中A右是-2℃处理10h后转基因和野生型烟草的表型；图6中B是处理后烟草的成活率；图6中C是处理后烟草的电导率；图6中D处理后烟草的丙二醛(MDA)的含量。

图7为野生型和PtrTZF1转基因烟草苗(#13和#24两个株系)低温处理后光合效率的比较；

其中：图7中A为低温处理前后叶绿素荧光测定；图7中B为处理前Fv/Fm；图7中C为处理后Fv/Fm。

图8为野生型和PtrTZF1转基因烟草苗(#13和#24两个株系)低温处理后DAB和NBT染色示意图；

其中：图11中A上为DAB染色；图1中1A下为NBT染色；图11中B为H₂O₂含量；图8中C为O₂ ^.-含量；DAB指示H₂O₂含量，染色越深表明H₂O₂越多；NBT染色指示O₂ ^.-含量，染色越深表明O₂ ^.-越多。

图9为转基因柠檬鉴定示意图。

图10为PtrTZF1基因超表达柠檬的表达量分析示意图；

其中：图10中A为半定量分析野生型和超表达柠檬中PtrTZF1基因的表达量；图10中B为实时定量分析野生型和超表达柠檬中PtrTZF1基因的相对表达量。

图11为野生型和PtrTZF1转基因柠檬苗(TG1和TG5两个株系)抗冻性比较；

其中：图11中A为野生型和PtrTZF1超表达柠檬在低温处理前(左)、-4℃处理12h后(中)以及常温恢复3周(右)的表型；图11中B为处理后的电导率；图11中C为处理后的丙二醛(MDA)含量；图11中D为处理后H₂O₂的含量，白色箭头所指为恢复后长出的新苗。

图12为干涉PtrTZF1基因的VIGS材料鉴定示意图；

其中：图12中A为空载(下)和PtrTZF1干涉材料PCR鉴定图；图12中B为干涉材料中PtrTZF1基因表达量的分析；P：质粒；W：water；WT：wildtype(野生型)；R：引物PtrTZF1-TRV2-R。

图13为空载对照(TRV)和PtrTZF1干涉枳(TRV-PtrTZF1)抗冻性比较示意图；

其中：图13中A为低温处理前和低温处理后(-4℃处理48h)空载TRV和干涉植株TRV-PtrTZF1的表型；图13中B为处理后MDA含量；图13中C为处理后相对电导率的值；图13中D为处理前后叶绿素荧光表型；图13中E为处理前最大光合效率Fv/Fm的值；图13中F为处理后最大光合效率Fv/Fm的值。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：枳PtrTZF1基因全长cDNA的克隆

以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：5’-CACATAAAAAGGCCCTCACC-3’和5’-GAGCAGGGCCCTCATTTATCC-3’。

采用AxyPrep-96DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)对扩增得到产物进行纯化回收，纯化产物与

18-T载体(TaKaRa,Japan)进行连接，连接体系见表3，16℃孵育30min后转化大肠杆菌感受态Trans5α。

表1基因扩增体系

表2基因扩增PCR程序

转化后12-16h挑取平板上单克隆于1.5mL离心管，加入含相应抗生素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，而后进行阳性鉴定。试剂采用2×TSINGKE MasterMix(Tsingke，China)，PCR程序见表2，反应体系见表4。获得阳性克隆后，将阳性克隆送至武汉擎科公司测序，根据测序结果，获得PtrTZF1的基因全长序列。

表3

18-T载体连接体系

表4阳性鉴定反应体系

测序结果发现该基因含一个ORF，长度为1968bp，编码655个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为71.81kDa，等电点为6.32，将该基因命名为PtrTZF1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的核苷酸为SEQ ID NO.1所示序列的197-2164bp的编码区。

实施例2：不同逆境条件处理下PtrTZF1基因的表达分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PtrTZF1基因的表达模式进行分析，定量试剂为QuantiNova^TM SYBRGreen PC(QIAGEN，Germany)，方法参照说明书，反应体系见表5。

表5定量PCR反应体系

用Primer 5.0设计PtrTZF1实时定量引物(正向引物：5’-GTTGCAATCTCCAACCGGGC-3’；反向引物：5’-GACTGGTCACTGCTCCACGA-3’)，选用柑橘Actin为内参基因(正向引物：5’-CATCCCTCAGCACCTTCC-3’；反向引物：5’-CCAACCTTAGCACTTCTCC-3’)。反应程序见表6。反应完之后采用2^-ΔΔCt算法对基因表达量进行计算。

表6定量PCR反应程序

结果表明，低温处理后6h，PtrTZF1的表达量迅速上升(约48倍)，12小时到达表达的峰值，随后一致保持着较高的表达量(图1中A)，这与表达谱中的数据吻合。脱水处理下，PtrTZF1的表达量也呈现逐渐升高的趋势(图1中B)。但是，该基因受盐诱导的程度较轻，最高只有2.3倍左右(图1中C)。当用100μmol/L的ABA处理时，PtrTZF1的表达在处理3h后有微弱的升高，而后被抑制(图1中D)。综合而言，PtrTZF1是一个受低温诱导强烈且持续的一个基因，可能在植物抗寒胁迫中具有重要的作用。

实施例3：PtrTZF1基因超表达载体构建

设计引物将PtrTZF1基因全长扩增并插入至pBI121载体上的Xba I和Sma I两个酶切位点中间，引物设计如下，以野生型枳cDNA为模板。

PtrTZF1-pBI121-F:5’-GCTCTAGAATGGAAGGTGAACTCCCCAA-3’

PtrTZF1-pBI121-R:5’-TCCCCCGGGTTATGCCACCATCTGCTCCT-3’

扩增片段回收、pMD18-T载体连接及转化、阳性克隆检测及送样测序。再将PtrTZF1从T载体切下通过T4连接酶连接至pBI121载体上(载体示意图见图2)，构建pBI121-PtrTZF1，并转化至GV3101，用于以下实施例。

实施例4：烟草遗传转化及阳性苗鉴定

1.烟草遗传转化(图3)

1)菌株准备：从-80℃取出保存好的含有pBI121-PtrTZF1载体的GV3101，用接种环沾少量农杆菌液，在LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、25mg/L庆大霉素)上划线，28℃培养2-3d；挑取单克隆，在新的LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、25mg/L庆大霉素)上再次划线，培养2-3d，用灭菌的手术刀片将菌体刮下，并置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养1-2h，充分摇散菌体，并用MS液体培养基调整OD₆₀₀值到0.6-0.8以备侵染用；

2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液,叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，培养室中暗培养3d；

4)筛选培养：共培养3d后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Kan+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；

5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L Cef培养基中生根培养。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

2.阳性苗鉴定

当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CTAB提取液，

2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

6)每管加入20-30μL ddH₂O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱；

7)浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

以上述提取的DNA为模板，用两对引物检测，35S启动子正向引物加基因反向引物，以及NPT II特异引物。引物序列如下：

35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3’

NPT II-F:5’-CGGCTATGACTGGGCACAACA-3’

NPT II-R:5’-CGGCAGGAGCAAGGTGAGATG-3’

通过PCR鉴定获得了多株阳性植株，选取#13和#24系做进一步分析(图4)。半定量分析发现该基因确实在烟草中超量表达(图5)，收获超表达植株T2代种子用于后续分析。

实施例5：转基因烟草抗寒性鉴定

低温处理前，野生型和转基因系(#13、#24)没有明显的表型差异。但是在-2℃低温条件下处理10h后，转基因的表型明显好于野生型(图6中A)。转基因受低温伤害的程度也更低，主要表现在较高的成活率、较低的电导率和MDA含量(图6中B-D)。

叶绿素荧光值表明植物的植物的光合效率，可以从侧面体现植物受胁迫的伤害程度。在处理前，转基因和野生型烟草的叶绿素荧光表型都无明显差异，最大光合效率Fv/Fm也相近。低温处理后最大光合效率都被明显抑制，但是野生型植株被抑制地更严重，Fv/Fm显著低于转基因系(图7)。同时，通过组织化学染色和定量分析检测了处理后转基因和野生型烟草的活性氧积累情况，发现低温处理后的PtrTZF1超表达烟草积累了更少的活性氧，如H₂O₂和O₂ ^.-(图8)。

实施例6：柠檬遗传转化及阳性苗鉴定

1.柠檬遗传转化

1)植物材料准备

把柠檬种子浸泡于1mol/LNaOH中大约15min来去除果胶，然后用水洗净，将种子拿至超净工作台上，用2％的NaClO浸泡灭菌15min，倒掉NaClO用无菌水洗涤3-4次。将灭菌后的种子放置于已加入少许水的灭菌之后的三角瓶中，最后将种子放于4℃冰箱中保存。

在超净工作台上用镊子剥掉种子的外种皮和内种皮，接种于MT固体培养基上，黑暗培养4-6周左右，转化前将其置于光照下7-10d直至实生苗转绿。在此期间制备农杆菌菌液。

2)农杆菌侵染液制备

在无菌操作台上，使用灭菌之后的接种环挑取农杆菌，在含有50mg/L Kan抗生素的培养基上划网格线，将培养基放入28℃培养箱中暗培养2d。挑取单克隆接种于新的含有50mg/L Kan抗生素的培养基上，此次划线比第一次要密集一些，以增大培养基上农杆菌的生长量，然后置于培养箱继续培养2d。取一个灭过菌的100mL的小三角瓶倒入50mL左右的含有20mg/L AS(Acetosyringone,乙酰丁香酮)的MT液体培养基。将已长好的农杆菌刮下溶于含有20mg/L AS的MT液体培养基，28℃条件下，250r/min振荡15-20min(此期间切柠檬上胚轴)。

用分光光度计测量摇匀后的农杆菌菌液的OD值，向菌液中加入MT液体培养基调整浓度至OD₆₀₀值为0.6-0.8(最好接近0.8左右)。

3)外植体准备

在超净工作台上灼烧手术刀和镊子等工具，烧至发红，冷却待用。将柠檬实生苗取出放置于灭菌后的铺有滤纸的大培养皿中进行斜切(使其与菌液的接触面积增大)，将柠檬实生苗切成大约1.5cm左右长的茎段。向灭菌后的三角瓶中加少量MT液体培养基浸没切好的茎段以保湿。

4)侵染与共培养

向装有切好的茎段的三角瓶中加入制备好的农杆菌菌液，震荡大约20min之后完成侵染。倒掉菌液，将茎段取出放在无菌吸水纸上除去茎段表面的菌液。将表面清除菌液后的茎段均匀摆放到铺有小滤纸的共培养培养基(每个皿大约放置20个左右，滤纸可以减少农杆菌污染，使转化率提高)。将共培培养基遮光暗培养，放置于25℃条件下培养3d。

5)筛选培养与再生

将共培培养基中暗培养3d之后的茎段取出放入灭菌后的小三角瓶中，用无菌水浸泡清洗3-5次。倒掉无菌水，把茎段放置于无菌吸水纸上直至吸干水分，然后用镊子将茎段转移到筛选培养基上，黑暗条件下培养45d。等到再生芽长到大于0.5cm时将其切下，放入生芽培养基中。至再生芽长到2cm大小时，转移到生根培养基上。实验中所用培养基配方如表7所示。

表7转化各阶段所用培养基

2.阳性苗鉴定

阳性苗鉴定方法同实施例4，通过两对特异引物，鉴定到多株阳性植株(图9)。然后通过半定量和定量确定了TG1和TG5为超表达系(图10)。

实施例7：转基因柠檬抗寒性鉴定

为验证PtrTZF1是否能够提高柑橘类物种的低温抗性，我们将PtrTZF1在低温较敏感的柑橘种类柠檬中进行超表达。结果发现，超表达该基因未造成植株表型的变化，但是低温处理后野生型的叶片卷曲、萎蔫程度较转基因的严重(图11中A)。转基因植株的相对电导率也显著低于野生型(图11中B)，同时转基因植株积累的MDA和H₂O₂含量更少(图11中C，D)。这些结果表明超表达PtrTZF1基因提高了转基因柠檬的抗寒性。

实施例8：枳干涉遗传转化及阳性苗鉴定

本实施例采用病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)方法将PtrTZF1基因在抗寒性强的枳中进行干涉

1.载体构建

以枳cDNA为模板，设计特异引物扩增PtrTZF1基因3’端非保守区域约350bp左右的片段，并插入到pTRV2载体上BamH I及Sma I两个位点中间。构建好的载体经测序无误后转化进GV3101感受态。构建载体的引物如下：

PtrTZF1-TRV2-F(BamH I):

5’-AGAAGGCCTCCATGGGGATCCAGAAGTCAGCTTCATTCGGGT-3’

PtrTZF1-TRV2-R(Sma I):

5’-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGTGATATGAGCAGGGCCCTCA-3’

2.VIGS侵染

VIGS的侵染转化参照Wang等(2017)的方法，并做部分改进，具体操作如下：

1)农杆菌侵染液制备：

挑取pTRV1、pTRV2、pTRV2-PtrTZF1等农杆菌的单克隆于5mL LB液体培养基(含25mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素)中，28℃，250r/min，充分活化菌体(24-48h)。将活化完成的农杆菌菌液按照1:100的比例接种到含有抗生素的新鲜LB培养基中，28℃，250r/min，培养过夜。4000r/min离心，收集菌体，加入MES缓冲液(10mmol/L MES,10mmol/L MgCl₂,200μmol/L AS,pH＝5.6-5.7)悬浮菌体，并调节OD₆₀₀至1.0。按照1:1的比例混合pTRV1与pTRV2或pTRV2-PtrTZF1菌体重悬液，暗处静置2-3h后即可用于侵染。

2)侵染：

新鲜的枳种子从果实中取出，1mol/L NaOH溶液浸泡15min去除果胶，后用无菌水冲洗干净，平铺于湿润的干净纱布上，放置于培养箱内(28℃，黑暗)催芽，待种子幼芽萌发至1-2cm长时即可用于VIGS侵染。用细针在萌发芽上扎一些小孔(有助于农杆菌侵染)，而后浸泡于配置好的侵染液中，真空抽气装置(GM-1.0A,JINGTENG,China)抽真空1min，迅速放气使农杆菌浸入萌发的种子，此步骤可重复2-3次。而后静置10min，取出种子，在干滤纸上晾干菌液。放入铺有无菌水浸湿滤纸的皿中，暗室放置2-3d。取出种子用清水冲洗干净残留菌液，播于基质中(土壤：蛭石＝3:1)，培养箱中生长25d后进行阳性鉴定。

3.阳性材料鉴定

VIGS沉默的枳阳性植株鉴定，以提取出的枳DNA为模板，采用两对引物鉴定阳性植株(图12中A)，pTRV1正反引物，pTRV2正向引物和pTRV2-PtrTZF1载体构建的反向引物。随后通过实时荧光定量PCR对阳性植株中PtrTZF1基因的表达量进行检测(图12中B)。

TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’

TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’

TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’

实施例9：干涉PtrTZF1枳的抗寒性鉴定

选取干涉效果最好的植株进行低温抗性鉴定，用-4℃低温处理空载对照和干涉植株，48h后观察表型。我们发现干涉植株受低温伤害的程度明显较空载严重，呈现更卷曲的叶片(图13中A)，同时含有较高的MDA含量和相对电导率(图13中B,C)。叶绿素荧光表型和最大光合效率(Fv/Fm)的结果也表明，PtrTZF1的干涉植株受低温伤害更严重(图13中D-F)。综上研究，PtrTZF1是植物抵御低温胁迫的一个正调控因子。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用

<130> 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacataaaaa ggccctcacc ccccttacct tagtctctca cttcacacat gtcatttctc 60

aaaagctaag tctttttgtt cttcttcttc tataaaatta acactcttaa agaatcaaag 120

aatcttatca acttatcaag ctctacttat aggaattggg aattcaaata gtaaaatttg 180

cagctcaaat ttcctcatgg aaggtgaact ccccaagctg aaagatggta ccttgtataa 240

caaatcctca attttgctgg aattgtcagc ttctgacgat atctctgcct ttaagagaga 300

aatagaagag aagggttttg atgttgatga gcccagcttc tggtatggta ggagaattgg 360

gtcaaaaaag atgggatttg aagagaggac cccaatcatg attgctgcca tgtttggaag 420

tgttgcggta ttgaaatatg ttattgaaac aggcaaagtt gatgtgaata gggcctgtgg 480

ttctgatggt ttcactgccc ttcactgtgc tgttgctggt ggttccaact cttcctttga 540

ggtggtcaag ctcttactca gtgcatctgc tgatgttaac tgtgttgatg catatgggaa 600

taagccagtc gatctcattc cagttgctat gaaatcacca ctccattcaa gaaaaagggc 660

aatagagtta ttgttgaaag gcgatcatac tatttttgaa gaggaagaat tggtgaatat 720

ccctgtgcct cagttatcaa aagatggaac tgagaagaaa gagtacccaa ttgatgtatc 780

gttgcctgat ataaacaatg gagtttatgg aactgatgat tttagaatgt acgcttttaa 840

gataaagcca tgctcgaggg cttattcaca tgattggaca gagtgcccat ttgttcatcc 900

gggtgagaat gctaggagga gagatcctag gaagtatcct tacacctgtg tcccctgccc 960

tgagttccgt aagggggcat gccccaaggg ggatggatgt gagtatgctc atggagtttt 1020

tgagtcctgg ctacatcctg cccagtacag aaccagactt tgcaaggatg agatcggctg 1080

cgcgcgcaaa gtctgtttct ttgctcacaa gcccgaagag ttgcgccctg tatatgcatc 1140

cacgggttca gctatgcctt cacctagccc tgtttcagcc agtgcagtgg acatgacgac 1200

tttgagtccc ttgtctcttg ggtcagcatc tatgccattg cccgctactt caactccacc 1260

aatgtctccc ttggctgctg cttcctctcc caagagcgga aacttgtggc agaacaaagt 1320

taatcttact ccaccggcct tgcagttgcc aggtagcagg ttgaagaccg cttttagtgc 1380

aagagatttg gacttgttgc ttgggctaga aaatcgcact agcaatttgc agcagcaaca 1440

attattggat gagatatcta gtttctcctc cccatcttct tggagcaagg aatacagtag 1500

gattggagat gtgaatcgaa accttgacga attttttgaa tctcttgatc cttctatgtt 1560

gtctcaatta cagggaatgt cacagaaaca atcaacgcca actcagttgc aatctccaac 1620

cgggcttcaa atgcgccaaa acatgaacca acttcgtgca agctatccag ctgccaacct 1680

ctcatcctct ccagtgagaa aaccttcatc atttgggttt gattcttcgg ctgcagtggc 1740

agctgcagtg atgaattcaa ggtcttctgc ctttgcaaag cgaagccaga gttttattga 1800

tcgtggagca gtgaccagtc gtgctggtct cagcatggtt tctaacccta cgactatgag 1860

atcctctaat ctatcagatt ggagctcccc tgatgggaaa ctggattggg gagttcaagg 1920

agatgagctg aacaaactta agaagtcagc ttcattcggg tttcgtagca acaatctaac 1980

aaccccaaca acaaaaggct tcactccatc atcatcgaat gttgatgagc cagatgtgtc 2040

ctgggttaac tccttggtga aagatgttac gccagaagga cagggattgt ttggtgcaga 2100

gaagcagcaa tacaatccat ggatggagca aatgtacata gaacaggagc agatggtggc 2160

ataatgaaaa cagctatgtg ctcctacctt attctgacca aattcatatt ctttgaattc 2220

ttgttagatt ccacgtttgt agctaaagtt gtaggagcta aaaaagagag aagatagtga 2280

ggataaatga gggccctgct c 2301

<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Gly Glu Leu Pro Lys Leu Lys Asp Gly Thr Leu Tyr Asn Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ile Leu Leu Glu Leu Ser Ala Ser Asp Asp Ile Ser Ala Phe

20 25 30

Lys Arg Glu Ile Glu Glu Lys Gly Phe Asp Val Asp Glu Pro Ser Phe

35 40 45

Trp Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Ser Lys Lys Met Gly Phe Glu Glu Arg

50 55 60

Thr Pro Ile Met Ile Ala Ala Met Phe Gly Ser Val Ala Val Leu Lys

65 70 75 80

Tyr Val Ile Glu Thr Gly Lys Val Asp Val Asn Arg Ala Cys Gly Ser

85 90 95

Asp Gly Phe Thr Ala Leu His Cys Ala Val Ala Gly Gly Ser Asn Ser

100 105 110

Ser Phe Glu Val Val Lys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Ala Asp Val Asn

115 120 125

Cys Val Asp Ala Tyr Gly Asn Lys Pro Val Asp Leu Ile Pro Val Ala

130 135 140

Met Lys Ser Pro Leu His Ser Arg Lys Arg Ala Ile Glu Leu Leu Leu

145 150 155 160

Lys Gly Asp His Thr Ile Phe Glu Glu Glu Glu Leu Val Asn Ile Pro

165 170 175

Val Pro Gln Leu Ser Lys Asp Gly Thr Glu Lys Lys Glu Tyr Pro Ile

180 185 190

Asp Val Ser Leu Pro Asp Ile Asn Asn Gly Val Tyr Gly Thr Asp Asp

195 200 205

Phe Arg Met Tyr Ala Phe Lys Ile Lys Pro Cys Ser Arg Ala Tyr Ser

210 215 220

His Asp Trp Thr Glu Cys Pro Phe Val His Pro Gly Glu Asn Ala Arg

225 230 235 240

Arg Arg Asp Pro Arg Lys Tyr Pro Tyr Thr Cys Val Pro Cys Pro Glu

245 250 255

Phe Arg Lys Gly Ala Cys Pro Lys Gly Asp Gly Cys Glu Tyr Ala His

260 265 270

Gly Val Phe Glu Ser Trp Leu His Pro Ala Gln Tyr Arg Thr Arg Leu

275 280 285

Cys Lys Asp Glu Ile Gly Cys Ala Arg Lys Val Cys Phe Phe Ala His

290 295 300

Lys Pro Glu Glu Leu Arg Pro Val Tyr Ala Ser Thr Gly Ser Ala Met

305 310 315 320

Pro Ser Pro Ser Pro Val Ser Ala Ser Ala Val Asp Met Thr Thr Leu

325 330 335

Ser Pro Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser Met Pro Leu Pro Ala Thr Ser

340 345 350

Thr Pro Pro Met Ser Pro Leu Ala Ala Ala Ser Ser Pro Lys Ser Gly

355 360 365

Asn Leu Trp Gln Asn Lys Val Asn Leu Thr Pro Pro Ala Leu Gln Leu

370 375 380

Pro Gly Ser Arg Leu Lys Thr Ala Phe Ser Ala Arg Asp Leu Asp Leu

385 390 395 400

Leu Leu Gly Leu Glu Asn Arg Thr Ser Asn Leu Gln Gln Gln Gln Leu

405 410 415

Leu Asp Glu Ile Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Trp Ser Lys Glu

420 425 430

Tyr Ser Arg Ile Gly Asp Val Asn Arg Asn Leu Asp Glu Phe Phe Glu

435 440 445

Ser Leu Asp Pro Ser Met Leu Ser Gln Leu Gln Gly Met Ser Gln Lys

450 455 460

Gln Ser Thr Pro Thr Gln Leu Gln Ser Pro Thr Gly Leu Gln Met Arg

465 470 475 480

Gln Asn Met Asn Gln Leu Arg Ala Ser Tyr Pro Ala Ala Asn Leu Ser

485 490 495

Ser Ser Pro Val Arg Lys Pro Ser Ser Phe Gly Phe Asp Ser Ser Ala

500 505 510

Ala Val Ala Ala Ala Val Met Asn Ser Arg Ser Ser Ala Phe Ala Lys

515 520 525

Arg Ser Gln Ser Phe Ile Asp Arg Gly Ala Val Thr Ser Arg Ala Gly

530 535 540

Leu Ser Met Val Ser Asn Pro Thr Thr Met Arg Ser Ser Asn Leu Ser

545 550 555 560

Asp Trp Ser Ser Pro Asp Gly Lys Leu Asp Trp Gly Val Gln Gly Asp

565 570 575

Glu Leu Asn Lys Leu Lys Lys Ser Ala Ser Phe Gly Phe Arg Ser Asn

580 585 590

Asn Leu Thr Thr Pro Thr Thr Lys Gly Phe Thr Pro Ser Ser Ser Asn

595 600 605

Val Asp Glu Pro Asp Val Ser Trp Val Asn Ser Leu Val Lys Asp Val

610 615 620

Thr Pro Glu Gly Gln Gly Leu Phe Gly Ala Glu Lys Gln Gln Tyr Asn

625 630 635 640

Pro Trp Met Glu Gln Met Tyr Ile Glu Gln Glu Gln Met Val Ala

645 650 655

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacataaaaa ggccctcacc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcagggcc ctcatttatc c 21

Claims

1.一种分离的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在提高植物抗寒能力中的应用，所述的植物为柠檬、枳或烟草。