CN116589549A - 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用 - Google Patents

枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116589549A
CN116589549A CN202310691066.9A CN202310691066A CN116589549A CN 116589549 A CN116589549 A CN 116589549A CN 202310691066 A CN202310691066 A CN 202310691066A CN 116589549 A CN116589549 A CN 116589549A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ptrzat12
gene
seq
plant
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310691066.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘继红
张杨
肖玮
李春龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202310691066.9A priority Critical patent/CN116589549A/zh
Publication of CN116589549A publication Critical patent/CN116589549A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrZAT12基因是从极抗寒枳（Poncirus trifoliata）中分离、克隆出的转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因分别构建超表达和干涉载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrZAT12基因具有控制植物抗寒性的功能。该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用，申请人从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到1个转录调控因子PtrZAT12，将该基因在枳中沉默表达，获得的转基因植株抗寒性明显减弱。
背景技术
低温(冷害或冻害)极大地限制了植物的地理分布和经济产量。冷害通常是指作物由于遭受12℃以下的零上低温，致使生理功能受损，生长延缓，对作物产质造成严重影响(Thomashow 1999)。而冻害则通常发生在0℃以下，由于温度过低导致植物体内细胞内(间)水结冰导致原生质体脱水，进而引起植株器官受伤甚至死亡(Steponkus et al 1984，Foyer et al 2002)。植物一方面可以通过形态的改变应对外界低温胁迫，包括叶片表面的蜡质层增厚，植物芽表面的鳞片和密毛，提高植物体保温，从而减弱严寒伤害(陈凡2017)；另一方面，植物感知低温信号后，通过转录调控等分子应答途径来调控植物生理生化过程，如提高活性氧清除酶活性，减少体内ROS的积累，或者增加细胞中糖类、脂肪、脯氨酸、多胺、甜菜碱等代谢物质含量，降低冰点(Peng et al 2014，Ding et al 2020，Liang et al2021，Sun et al 2021，Huang et al 2022)，使植株形成低温耐受性。
转录因子是植物应答环境刺激所产生的复杂的调控网络中的关键一员，转录因子可以受胁迫诱导，对刺激信号进行传递放大，通过蛋白互作或者调控靶基因表达应对胁迫反应(Klepikova et al 2019)。植物特异性转录因子在低温胁迫中的调控作用成为近年来的研究热点，为植物遗传改良和创新育种提供一种新的参考(Zhu 2016)。因此，发现并利用转录因子是提高植物抗逆性的更加有效的途径。
C2H2型锌指蛋白参与转录调控，RNA结合、胁迫应答以及细胞凋亡等植物生长发育和细胞进程(Ciftci-Yilmaz and Mittler 2008，-matuk 2012)。大多数植物的锌指蛋白结构中有一个或两个QALGGH基序，该基序在DNA结合活性中发挥关键的作用。已经有较多C2H2型蛋白被报道参与植物逆境调节。在拟南芥中，ZAT10和ZAT12两个C2H2类型的转录因子可以对不同环境刺激(干旱、盐、渗透胁迫、氧化胁迫、低温)产生应答反应(Vogel etal 2005，Mittler et al 2006，Ben Daniel et al 2016)。在大豆中，低温可以诱导SCOF-1表达，超表达GmSCOF-1可以提高冷胁迫应答基因的转录水平，增强转基因植物的低温耐受能力(Kim et al 2001)。从水稻中克隆出一个可以被不同胁迫诱导的C2H2型基因OsZFP252，超表达OsZFP252可以增强植株体内胁迫防御基因的表达，具有较强的胁迫(盐和干旱)耐受能力(Xu et al 2008)。杨树中PeSTZ1可以受不同胁迫(低温、干旱、ABA和高温)诱导，超表达PeSTZ1基因的杨树幼苗中累积的活性氧水平较少，展现出较强的耐寒能力(Heet al2019)。这些研究表明，C2H2型锌指蛋白可以在植物抵御外界不良环境胁迫时发挥重要作用。但是，在柑橘中尚未鉴定到参与低温响应的C2H2型锌指蛋白基因。
由于柑橘植物低温抗性较弱，因此低温是限制柑橘栽培地理分布的主要因素。近年来低温天气频发，降雪和霜冻严重阻碍了柑橘的生长发育，给柑橘产业造成了不可估量的经济损失。对柑橘抗寒机制和抗寒新品种培育的研究对我国农业产业发展具有重要的经济意义。枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)作为目前我国最常见的柑橘砧木，低温驯化后可以耐-26℃，被认为是挖掘抗寒基因的重要资源(2013)。因此，分离并鉴定枳抗寒相关基因是丰富柑橘抗逆基因资源库，及揭示枳低温抗性机制的关键和基础。
发明内容
本发明目的在于提供了一种枳抗寒基因，该基因为一种从极抗寒的枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆出一个转录因子，申请人将其命名为PtrZAT12，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
本发明还有一目的在于提供了一种枳抗寒基因PtrZAT12在控制植物抗寒性状中的应用。将该基因在植物中超表达或沉默表达，可获得抗寒能力增强或减弱的植株。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施
申请人基于植物基因克隆技术从极抗寒枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆出的一个转录因子，申请人将其命名为PtrZAT12，其序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；开放阅读框(ORF)预测，发现该基因是含一个ORF，长度为480bp，编码159个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为17.31kDa，等电点为9.51。
表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质也为本发明的保护范围，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。
本发明的保护范围还包括：
SEQ ID NO.2所示蛋白、编码SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸或表达SEQ IDNO.2所示蛋白的物质在控制植物抗寒性中的应用；
以上所述的应用中，优选的，所述的植物为枳或烟草；
以上所述的应用中，优选的，所述的调控是敲除、抑制或者沉默植物中SEQ IDNO.2所示蛋白的编码基因的表达量来减弱植物的抗寒性。
以上所述的应用中，优选的，所述的沉默是利用权利要求2所述的多核苷酸构建干涉载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在植物中进行干涉。
以上所述的应用中，优选的，所述的调控是增强SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来增强植物的抗寒性。
以上所述的应用中，优选的，所述的增强是构建含有编码SEQ ID NO.2所示蛋白基因的超表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在植物中进行过表达。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
该基因的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
附图说明
图1是本发明的技术流程图。
图2是PtrZAT12响应不同胁迫处理的表达模式示意图；
其中：A是低温(4℃)处理；B是盐处理；C是脱水处理；D是ABA处理。
图3是PtrZAT12亚细胞定位分析；
其中：A是的PtrZAT12基因亚细胞定位载体构建示意图；B是PtrZAT12蛋白亚细胞定位结果。
图4是PtrZAT12基因转基因烟草鉴定及相对表达量分析示意图；
其中：A是本发明的PtrZAT12基因特异引物鉴定阳性烟草；B是PtrZAT12的相对表达量。
图5是本发明转PtrZAT12基因烟草低温处理表型和生理指标测定示意图；
其中：A是低温处理前后转基因烟草(#15，#25)和野生型烟草的表型；B是烟草低温处理前后叶绿素荧光表型图；C是烟草处理前后的Fv/Fm值；D是烟草处理后成活率；E是烟草处理前后相对电导率；F是烟草低温处理前后MDA含量；G是烟草处理后DAB和NBT染色图。
图6是本发明VIGS沉默材料鉴定及相对表达定量分析示意图；
其中：A是是PtrZAT12干涉材料(TRV-PtrZAT12)的鉴定，“M”代表marker，“P”代表阳性质粒，“WT”代表野生型枳，“H2O”代表蒸馏水；B是阳性材料中PtrZAT12表达量。
图7是枳沉默PtrZAT12基因植株(简称TRV-PtrZAT12)抗寒性分析示意图；
其中：A是低温处理处理前后空载TRV和干涉植株TRV-PtrZAT12的表型；B是干涉枳低温处理前后的叶绿素荧光表型图；C是干涉枳低温处理前后的Fv/Fm值；D是干涉枳低温处理前后的相对电导率；E是干涉枳低温处理前后的MDA含量；F是干涉枳低温处理后DAB和NBT染色图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：枳PtrZAT12基因全长cDNA的克隆
以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：
PtrZAT12-F：5’-CACCTGAAGGTCATACTTAGCAAC-3’
PtrZAT12-R：5’-AATCGGTAAATACAGAGGGCTG-3’
采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒对扩增得到产物进行纯化回收，利用DNA无缝克隆技术，将纯化产物连接到pEASY-Blunt载体，连接体系见表3，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞(唯地，中国)，涂板，摇菌，然后进行阳性鉴定(GenStar，中国)，阳性鉴定体系见表4。获得阳性克隆后，送武汉天一华煜基因科技有限公司测序，根据测序结果，获得PtrZAT12的基因全长序列。
测序结果显示，PtrZAT12基因CDS序列长度为480bp，编码159个氨基酸，该蛋白的分子量为17.31kD，等电点为9.51，多核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
表1基因扩增体系
表2基因扩增PCR程序
表3pEASY-Blunt载体连接体系
表4阳性鉴定反应体系
实施例2：不同逆境条件处理下PtrZAT12基因的表达分析
采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PtrZAT12基因的低温表达模式进行分析，实时荧光定量PCR采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂，方法参照说明书。采用QuantStudioTM 7Flex Real-Time PCR荧光定量分析仪进行反应，反应体系参照表5，反应程序参照表6。以枳中Actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt算法对基因表达进行计算。所用引物如下：
Actin-F：5’-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3’
Actin-R：5’-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3’
PtrZAT12-qPCR-F：5’-ATGGCTACCATTGACACCGC-3’
PtrZAT12-qPCR-R：5’-CCCCTGATGAAGCCATCGTC-3’
表5qRT-PCR反应体系
表6qPCR反应程序
本实验结果表明，PtrZAT12基因的表达量持续受低温诱导，在72h时表达量最高，和处理前相比增加了约22倍，之后缓慢降低(图2中A)。盐处理后3h无明显变化，在6h出现上调，约为起始水平的9倍，之后表达量下降(图2中B)。脱水处理过程中，基因表达水平逐渐提高，在脱水后2h达到最大，为起始水平的14倍(图2中C)。当用ABA处理时，该基因的表达无明显变化，对ABA不敏感(图2中D)。综合而言，PtrZAT12基因可以被不同胁迫诱导，可能参与了不同胁迫的调节过程，其中，PtrZAT12受低温诱导表达最为强烈，可能在植物抗寒胁迫中发挥着重要的作用。
实施例3：PtrZAT12基因亚细胞定位
扩增PtrZAT12的ORF区域(不含终止密码子)，设计扩增引物为：
PtrZAT12-YFP-F：5’-GGAATTCATGAAGAGAGATAGAGAAATGGC-3’
PtrZAT12-YFP-R：5’-CGGGATCCAGCGACCCATAACTTCAAATC-3’
以此引物对扩增得到带有同源序列的插入片段，采用One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)，插入连接到载体p101LYFP上，连接体系见表7，YFP蛋白位于基因的3’端，表达是由CaMV35S启动子驱动。之后将对照35S:YFP+mCherry及35S:PtrZAT12-YFP+mCherry分别瞬时转化到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的叶片表皮细胞，激光共聚焦显微镜观察荧光发现对照的荧光充满整个表皮细胞，包括细胞质与细胞核，而转化35S:PtrZAT12-YFP的荧光只集中在细胞核内，并且与核定位标记mCherry的红色荧光重合，表明PtrZAT12定位在细胞核(见图3)。
表7一步法连接酶反应体系
实施例4：植物转化载体构建
1.植物转化载体构建
以枳cDNA为模板，设计引物将PtrZAT12基因全长扩增，引物序列为：
pDONR221-PtrZAT12-F：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGAAGAGAGATAGAGAAATGGC-3’
pDONR221-PtrZAT12-R：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGCGACCCATAACTTCAAATC-3’
扩增回收后与pDONR211载体进行BP反应连接，使用方法参见BPClonaseTMⅡ试剂盒说明书，具体的反应体系见表8，将经过测序正确的阳性克隆菌摇菌。之后用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，并与目的载体pGWB411进行LR反应，方法参照/>LR ClonaseTMⅡ(Invitrogen)试剂盒说明书，LR反应体系见表9，随后即可进行大肠杆菌感受态转化，经阳性鉴定后摇菌，提取质粒，获得最后的超表达载体pGWB411-PtrZAT12，其中扩增片段回收、阳性克隆检测及送样测序等步骤的方法参照实施例1，最后将载体转入农杆菌感受态GV3101备用。
表8BP反应体系
表9LR反应体系
实施例5：烟草的遗传转化及阳性鉴定
1)菌株准备：从-80℃取出保存好的转入过pGWB411-PtrZAT12载体的农杆菌，用无菌接种环沾取少量农杆菌液，在LB固体培养基(含50mg/L壮观霉素、50mg/L利福平)上划线，28℃培养2-3d；挑取单克隆，将单克隆在在新的LB固体培养基(含50mg/L壮观霉素、50mg/L利福平)上再次划线，培养2-3d。用灭菌的手术刀片将菌体刮下，并置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养30min，充分摇散菌体，并用MS液体培养基调整OD600值到0.6-0.8以备侵染用；
2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm2左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；
3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，28℃，200r/min侵染10min。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液。叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的烟草共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，之后在培养室中黑暗培养3d；
4)筛选培养：将共培养3d后的全部外植体转移进灭菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于烟草筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；
5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L Cef的培养基中生根培养。
上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。
当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：
1)取少量叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表10；
2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；
3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇，v/v)混合抽提液，剧烈混匀10min，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；
4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；
5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3次，弃酒精，于通风橱内风干；
6)每管加入20-30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。
浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo，USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。
表10CTAB提取液配方
利用鉴定引物，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(结果见图4中A)，鉴定植株阳性引物序列为35S-F：5’-CCCACTATCCTTCGCAAGACC-3’和PtrZAT12-R：5’-AATCGGTAAATACAGAGGGCTG-3’；实时荧光定量分析了阳性烟草植株中PtrZAT12基因的相对表达量，结果显示相对WT，PtrZAT12表达量明显升高(图4中B)，依据阳性苗鉴定结果选取了#15和#25超表达植株T2代种子用于后续分析。
实施例8：转基因烟草抗寒性分析
21d苗龄的盆栽转基因烟草和野生型烟草(WT)被用于低温抗性鉴定。低温处理前，野生型和转基因系(#15、#25)没有明显的表型差异。但在-2℃处理6h后，野生型烟草绝大多数的叶片都呈水渍化状态，而转基因系只有部分烟草呈现水渍化(图5中A)。叶绿素荧光成像结果显示，低温处理前，两者所观测到的荧光信号无明显差异，而经过低温处理后，PtrZAT12超表达烟草的叶绿素荧光强度比野生型更高(图5中B)，Fv/Fm值与该结果保持一致(图5中C)。于25℃恢复1d后统计成活率，PtrZAT12超表达烟草仅小部分水渍化的叶片死亡，其存活率为70％～80％，而野生型烟草叶片则大面积水渍化，且未能恢复而死亡，存活率仅为23.7％(图5中D)。PtrZAT12超表达烟草的电导率较野生型低(图5中E)，表明野生型烟草细胞膜受损严重。同时,转基因植株积累的MDA含量更少(图5中F)此外，低温处理后PtrZAT12超表达烟草DAB和NBT染色程度较野生型浅(图5中G)，说明转基因植株中ROS的积累量较少，有着更好的活性氧清除能力。总之，通过表型观察以及生理数据测定表明，超表达PtrZAT12基因在一定程度上增强了烟草对低温的耐受能力。
实施例5：VIGS干涉枳阳性苗鉴定
1.载体构建
以枳cDNA为模板，设计特异引物扩增PtrZAT12基因5’端UTR及非保守区域349bp的片段，并采用One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)，一步法插入连接到pTRV2载体上BamHI及SmaI两个酶切位点之间，具体方法见表7，构建好的载体经测序正确后转入GV3101感受态，构建pTRV2-PtrZAT12农杆菌，同时将pTRV1、pTRV2分别转入GV3101感受态
构建载体的引物如下：
pTRV2-PtrZAT12-F(BamHI)：
5’-AGAAGGCCTCCATGGGGATCCCCGCCGATGGATTGGTGACTCG-3’
pTRV2-PtrZAT12-R(SmaI)：
5’-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGACGAGGAAACGAACTCTA-3’
2.VIGS侵染
1)农杆菌侵染液制备：
将pTRV1、pTRV2、pTRV2-PtrZAT12等农杆菌的分别划线与LB固体培养基(50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中，28℃，培养2d后获得单克隆，之后挑单克隆于5mL含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，220r/min，充分活化菌体(24-48h)。将活化完成的农杆菌菌液按照1:100的比例接种到含有抗生素的新鲜LB培养基中，28℃，220r/min，培养过夜。4000r/min离心，收集菌体，加入MES缓冲液(10mmol/L MES，10mmol/L MgCl2，200μmol/L AS，pH＝5.6-5.7)悬浮菌体，并调节OD600至2.0。按照1:1的比例混合pTRV1与pTRV2或pTRV2-PtrZAT12菌体重悬液，混匀后放于28℃培养箱，静置2-3h后即可用于侵染。
2)侵染：
新鲜的枳种子从果实中取出，1mol/L NaOH溶液浸泡15min去除果胶，后用无菌水冲洗干净，平铺于湿润的干净纱布上，放置于培养箱内(28℃，黑暗)催芽，待种子幼芽萌发至1-2cm长时即可用于VIGS侵染。用注射器针头在萌发幼芽上轻扎一些小孔，完全浸泡于准备好的农杆菌侵染液中，真空抽气10min，迅速放气使农杆菌浸入萌发的种子，重复3次。而后静置15min，将侵染好的种子取出晾在干燥的滤纸上，静置2-3min后平铺于用无菌水浸湿滤纸的大皿中，室温培养室遮光放置2-3d暗培养；取出种子用清水冲洗干净残留菌液，播于基质中(土壤：蛭石＝3:1)，培养箱中生长25d后进行阳性鉴定。
3)阳性材料鉴定
VIGS沉默的枳阳性植株鉴定，以提取出的枳DNA为模板，采用pTRV2正向引物和pTRV2-PtrZAT12载体构建的反向引物阳性植株(图6中A)。也通过实时荧光定量对阳性植株中PtrZAT12基因的表达量进行检测(图6中B)。
TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’
TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’
TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’
TRV2-R:5’-AGTCGGCCAAACGCCGATCTCA-3’。
其中，负对照蒸馏水(H2O)和野生型枳(wt)DNA为模板扩增产物无条带，而干涉系植株DNA扩增出了与正对照TRV2-PtrZAT12质粒(P)大小一致的条带(图6中A)。也通过实时荧光定量对阳性植株中PtrZAT12基因的表达量进行检测，以空载对照植株(TRV2)的PtrZAT12表达水平为1，结果显示，与空载对照植株相比，在干涉植株中，PtrZAT12的表达量被抑制程度在40％-84％范围之间，目的基因的表达显著低于空载对照，表明成功干涉了在枳中的PtrZAT12转录(图6中B)。
实施例6：VIGS干涉枳的抗寒性鉴定
选取干涉效果最好的植株(实施例5中的#25，#27和#48)进行低温抗性鉴定，用-4℃低温处理空载对照和干涉植株，低温处理后发现，干涉系植株叶片受伤害程度比空载叶片严重，呈现萎蔫卷曲(图7中A)，叶绿素荧光表型和最大光合效率(Fv/Fm)的结果也表明，PtrZAT12的干涉植株受低温伤害更严重(图7中B，图7中C)。且含有较高的电导率与MDA含量(图7中D，图7中E)。同时，低温处理后，PtrZAT12的干涉植株叶片的DAB染色与NBT染色也深于对照(图7中F)。这些结果说明干涉PtrZAT12基因，破坏了植株体内活性氧清除系统，使枳在低温处理下活性氧的清除受到了抑制，进而使植物更容易受到低温胁迫的伤害。综上研究，PtrZAT12是植物抵御低温胁迫的一个正调控因子。

Claims (10)

1. 一种从枳（Poncirus trifoliata）中分离出的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸。
3. 根据权利要求2所述的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4. 表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。
5.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的物质在控制植物抗寒性中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述的植物为枳或烟草（Nicotiana tabacum）。
7. 根据权利要求6所述的应用，所述的调控是敲除、抑制或者沉默SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来减弱植物的抗寒性。
8.根据权利要求7所述的应用，所述的沉默是利用权利要求2所述的多核苷酸构建干涉载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在植物中进行干涉。
9. 根据权利要求6所述的应用，所述的调控是增强SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来增强植物的抗寒性。
10. 根据权利要求9所述的应用，所述的增强是构建含有编码SEQ ID NO.2所示蛋白基因的超表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在植物中进行过表达。
CN202310691066.9A 2023-06-12 2023-06-12 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用 Pending CN116589549A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310691066.9A CN116589549A (zh) 2023-06-12 2023-06-12 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310691066.9A CN116589549A (zh) 2023-06-12 2023-06-12 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116589549A true CN116589549A (zh) 2023-08-15

Family

ID=87608230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310691066.9A Pending CN116589549A (zh) 2023-06-12 2023-06-12 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116589549A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1461187A (zh) * 1999-11-19 2003-12-10 独立行政法人农业生物资源研究所 使用花粉特异性的锌指转录因子基因降低花粉受育性的方法
CN103468711A (zh) * 2013-08-20 2013-12-25 深圳大学 一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白与应用
WO2015095186A2 (en) * 2013-12-16 2015-06-25 Koch Biological Solutions, Llc Nitrogen use efficiency in plants
US20150247159A1 (en) * 2012-08-03 2015-09-03 Koch Biological Solutions, Llc Photosynthetic resource use efficiency in plants expressing regulatory proteins
CN109553671A (zh) * 2019-01-24 2019-04-02 华中农业大学 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN114031677A (zh) * 2021-11-01 2022-02-11 华中农业大学 枳转录因子PtrAHL及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1461187A (zh) * 1999-11-19 2003-12-10 独立行政法人农业生物资源研究所 使用花粉特异性的锌指转录因子基因降低花粉受育性的方法
US20150247159A1 (en) * 2012-08-03 2015-09-03 Koch Biological Solutions, Llc Photosynthetic resource use efficiency in plants expressing regulatory proteins
CN103468711A (zh) * 2013-08-20 2013-12-25 深圳大学 一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白与应用
WO2015095186A2 (en) * 2013-12-16 2015-06-25 Koch Biological Solutions, Llc Nitrogen use efficiency in plants
CN109553671A (zh) * 2019-01-24 2019-04-02 华中农业大学 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN114031677A (zh) * 2021-11-01 2022-02-11 华中农业大学 枳转录因子PtrAHL及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANG ZHANG 等: ""A C2H2-type zinc finger protein ZAT12 of Poncirus trifoliata acts downstream of CBF1 to regulate cold tolerance"", 《PLANT J》, vol. 117, no. 5, 28 November 2023 (2023-11-28), pages 1317 - 1329, XP072593407, DOI: 10.1111/tpj.16562 *
张杨: ""枳低温应答转录因子PtrERF9和PtrZAT12抗寒功能鉴定及作用机制研究"", 《万方学位论文》, 23 February 2023 (2023-02-23), pages 3 - 2 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109553671B (zh) 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN112898391B (zh) 枳抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遗传改良中的应用
CN111690664B (zh) 白桦BpSPL2基因在调控白桦不定根发育中的应用
CN114591969B (zh) 一种抗旱基因CrWRKY57及其在植物抗旱改良中的应用
CN111454972B (zh) 枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN114231537B (zh) 可提高植物抗镉胁迫能力的杨树乳胶蛋白mlp基因及其表达的蛋白和用途
CN116655761B (zh) 枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN116064572B (zh) 一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用
CN116064573B (zh) 一种抑制不定根发育的MdTCP17基因、蛋白及其应用
CN116083445A (zh) 一种CrBZR1基因及其应用
CN113151306B (zh) 一种提高梅花花瓣抗寒性的基因PmWRKY57及其应用
CN112851781B (zh) 柑橘bZIP转录因子在缩短植物童期中的应用
CN112553224B (zh) 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用
CN114958869A (zh) 杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因LhWOX4及其应用
CN114480341A (zh) 枳蛋白激酶PtrSnRK2.4在植物抗旱遗传改良中的应用
CN116589549A (zh) 枳转录因子PtrZAT12及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN109295089B (zh) 一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法
CN109182359B (zh) 一种梨抗寒基因PbrBAM3及其表达载体、应用和编码的蛋白质及应用
CN115974992B (zh) 枳转录因子PtrABR1及其在植物抗旱遗传改良中的应用
CN116286876B (zh) 甘蓝型油菜BnaWRKY25.C04基因的应用及方法
CN116063433B (zh) 一种调控油菜种子含油量的基因及应用
CN110904110B (zh) 降低OsHAP3C基因表达在培育抽穗期推后、生育期延长水稻品种中的应用
CN118085051A (zh) 枳转录因子CtrRAV2及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN116622655A (zh) 枳抗寒基因PtrP5CS1及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN106754968B (zh) 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination