CN103468711A - 一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。构建MpZFP重组植物表达载体，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpZFP基因拟南芥，结果表明MpZFP基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性，证明MpZFP基因具有提高植物耐逆性的作用。

Description

一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白质与应用。

背景技术

盐碱、干旱等非生物胁迫影响着农作物的生长发育，严重时甚至导致作物死亡。为了提高农作物产量，培育耐逆性作物品种是主要的应对方法之一。目前，通过基因工程的方法育种已经成为培育耐逆性作物的重要方法之一。高等植物可以通过多种途径来应对环境中的这些不利因素，其中的转录因子由于能够调节多个下游基因的表达，因而成为研究植物耐逆性的关键点之一。现在已经发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，如锌指蛋白类、bZIP类、MYB类、AP2-ERF类等等。

锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)是具有“手指”状结构域的转录因子。其特点是通过半胱氨酸(C)残基和组氨酸(H)残基来结合游离Zn²⁺，形成一种具有“手指”状的蛋白质结构。根据半胱氨酸残基（C）和组氨酸残基（H）的不同组合又可以分为C2H2、C4和C6等亚类。ZFP类转录因子主要是通过与DNA相互作用来调节相关基因的表达，在植物耐盐、干旱、冷、热、病虫害以及生长发育等方面都发挥着重要作用。该类转录因子有锌参与时才具备转录调控活性，α螺旋和一个反向平行的β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA结合。人们从拟南芥、大豆、水稻等作物中都克隆到了锌指蛋白类转录因子，然而尚未从耐盐的非模式植物水黄皮中克隆到与逆境胁迫相关的该类转录因子。

水黄皮为典型的半红树植物，既能生长于海岸或沿河的滩涂地区，又可在远离海边的陆地上生长，对土壤盐度表现出广泛的适应性，因而是研究植物耐逆性的良好材料。同时，作为豆科植物，水黄皮的基因资源将可通过转基因技术应用于大豆或其它农作物的品种改良。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。在本发明中，所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的具体碱基序列长度为543bp，如SEQ ID NO：1所示：

atgaagagag aaagggaagg tgatagcata accatggcca attacttgat gttgctttct  60

cgtggaagtg aatttgagag caacaacaat ttcttcaact cttccaacaa ccgtgtcttc  120

gagtgcaaga catgtaaccg ccaattccaa tcgtttcaag cattgggagg gcaccgtgca  180

agccataaga agccaaggtt gatgggtgat ggccaagtat tgaatgacga tgattcacca  240

ccaaagccta aaacacatga gtgttcaatt tgtggattgg aatttgctgt aggacaagct  300

ttgggaggcc acatgaggag acatagaaag gaagcttcaa atggaaacat aaagagttct  360

aataatttta tgactatgag tggaagtact agtggcggta gtagtgttga tacttcaaca  420

aaaagaggga acaatagcaa gagatcaatt ttgtttcccg atttgaattt gacaccttta  480

gagaatgatt tggagttttt gaagattgga aaaccaactc ctttggttca ttgtttcaat  540

tga                                                                543

在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的基因序列命名为MpZFP。

本发明的第二个目的在于提供一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在本发明中，水黄皮耐逆相关基因MpZFP编码的蛋白质的具体长度为180aa，如SEQ IDNO：2所示：

本发明的第三个目的在于提供一种含有所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的重组载体。

所述重组载体为重组植物表达载体。所述重组载体可以通过将上述水黄皮耐逆相关基因MpZFP插入到克隆载体或表达载体而得到。

适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pMD18-T 、pMD19-T 、pMD20-T 、pMD19-T Simple Vecter、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。

适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pBI121、p13W4、pGEM等。

重组植物表达载体包括但不限于双元农杆菌表达载体、可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用MpZFP构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的第四个目的在于提供含有本发明所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有水黄皮耐逆相关基因MpZFP的重组载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为根癌农杆菌细胞LBA4404-MpZFP。

本发明的第五个目的在于提供所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP及其编码的蛋白质在提高植物耐逆性中的应用，尤其在提高作物耐逆性中的应用。

本发明的第六个目的在于提供一种提高植物耐逆性的方法，将水黄皮耐逆相关基因MpZFP导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP是下述核苷酸序列之一：

1）SEQ ID NO：1所示DNA序列；

2）编码SEQ ID NO：2所示氨基酸残基序列的DNA序列。

所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP通过含有所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的重组植物表达载体导入植物组织或细胞。

所述重组植物表达载体为PBI121-MpZFP。

本发明又一方面，还涉及一种制备本发明所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的方法，包括如下步骤：利用分子生物学方法从水黄皮中克隆耐逆相关基因，命名为MpZFP。

所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP还可以通过人工合成的方法制备，例如：利用核酸合成仪，根据SEQ ID NO：1所示碱基，人工合成水黄皮耐逆相关基因MpZFP。

本发明的技术路线为：

1）利用分子生物学方法从水黄皮中克隆耐逆相关基因，命名为MpZFP；

2）构建MpZFP重组植物表达载体PBI121-MpZFP，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpZFP基因拟南芥；

3）结果表明：MpZFP基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性。

本发明克隆了一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP，构建MpZFP重组植物表达载体，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpZFP基因拟南芥，结果表明MpZFP基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性。证明MpZFP基因具有提高植物耐逆性的作用。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析MpZFP基因在盐胁迫处理下的表达特征图；

图2MpZFP重组植物表达载体PBI121-MpZFP构建流程图；

图3为MpZFP基因在转MpZFP基因拟南芥植株中的表达量RT-PCR检测图；

图4为野生型植株和转MpZFP基因植株在盐胁迫下的相对根长测定及表型观察图，注：（a）纵坐标相对根长用小数表示作图，两个星号表示P<0.01；

图5为野生型植株和转MpZFP基因植株在盐胁迫下的生长比较图，注：（a）转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复10天和30天表型观察；（b）转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复10天的存活率统计；（c）转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复30天的干重统计；（d）转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复30天统计主茎高；一个星号表示P<0.05，两个星号表示P<0.01。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

实施例1水黄皮耐逆性相关蛋白MpZFP编码基因的筛选及其全长cDNA克隆

用海水（相当于30‰NaCl）和淡水处理水黄皮一月龄植株，然后选取处理2、4和8小时的根和叶样品分别进行RNA提取，再将三个时间点的RNA等量混合，构建得到四个文库（即根淡水处理、根海水处理、叶淡水处理和叶海水处理）后进行Illumina测序。最后，将测序结果进行组装和拼接，得到十万多条unigene序列。根据以下三个原则选择基因：首先，该基因在盐胁迫后表达显著上调表达；其次，该基因同源性最高的序列来自于豆科物种；再次，与该基因相似性最大的几个基因在植物耐盐和干旱机制方面的还未见研究报道。根据以上三原则得到一个水黄皮基因，其表达受盐胁迫诱导。

提取水黄皮幼苗总RNA，通过RACE技术获取全长cDNA。将水黄皮总RNA分别经5’和3’RACE所用化学试剂处理，然后进行巢式PCR，将得到的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将该回收片段与PMD18-T载体连接，把连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态，通过PMD18-T载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的M13-47和RV-M序列引物进行测序。将测序结果用GeneTool软件进行拼接并分析，又将拼接后序列与转录组测序获得的序列进行比对，并且将拼接后序列与NCBI数据库比对。比对结果表明，RACE所获得的序列在5’端具有帽子结构，在3’端具有poly（A）结构，说明这就是全长cDNA序列，进一步分析获得了开发阅读框（ORF）。结果表明MpZFP基因由543个脱氧核糖核苷酸组成，具体序列如SEQ IDNO：1所示；其编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

RACE巢式所用引物如下：

实施例2盐胁迫处理下水黄皮MpZFP基因的表达特征

将20株生长一致的水黄皮一月龄幼苗平均分为5组（每组4株），向这五组幼苗分别浇30‰NaCl溶液0、2、4、8、12小时。快速取每组植株的顶端嫩叶和根于液氮速冻后-80℃保存备用，其中根和叶分别秤相同重量。用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA。进行实时荧光定量PCR，以分析MpZFP基因在盐胁迫下的表达情况，所用引物如下：

结果如图1所示，MpZFP基因的表达明显受NaCl胁迫的诱导。盐胁迫后，MpZFP基因表达量在根中变化大于叶中变化，并且在根中2小时内变化都不太大，而在2-4小时期间猛然上升，4小时达到最大表达量，而后表达量下降。

实施例3MpZFP重组植物表达载体PBI121-MpZFP构建

MpZFP重组植物表达载体PBI121-MpZFP构建过程参见图2。

以水黄皮总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和SacI接头序列的特异引物PCR扩增MpZFP（序列表中的SEQ ID NO：1）；然后BamHI和SacI双酶切PCR产物和质粒pBI121，回收，用T4DNAligase连接,将MpZFP正向插入植物表达载体PBI121的CaMV35S启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得到重组植物表达载体PBI121-MpZFP。

含有BamHI和SacI接头序列的特异引物如下：

5’-CCGGGATCCATGAAGAGAGAAAGGGAAGGT-3’

5’-CACGAGCTCTCAATTGAAACAATGAACCAAAG-3’。

实施例4MpZFP重组植物表达载体PBI121-MpZFP农杆菌介导转化拟南芥

将PBI121-MpZFP导入根癌农杆菌LBA4404，PCR鉴定后，通过花浸泡的方法（Clough-SJ,Bent-AF.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743）利用根癌农杆菌LBA4404转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0），具体为：浸泡时间为50秒，农杆菌浓度为OD600=0.8。

收获种子后，播于含卡那霉素（30mg/L）的1/2MS筛选培养基上，获得T₀代植株。10天后，将T₀代植株移到花肥土上正常生长，并单株收种。各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。

T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。

提取野生型植株、转MpZFP基因T3代植株的总RNA进行RT-PCR鉴定分析。结果参见图3，表明，转MpZFP基因T3代植株（5-1-6-1，5-2-4-2和5-3-17-1）MpZFP基因表达，野生型对照植株（WT）无MpZFP基因表达。

RT-PCR所用引物如下：

实施例5转MpZFP基因植株耐盐胁迫试验

一、相对根长测定及表型观察：

将野生型和转基因拟南芥种子消毒后播种于正常1/2MS固体培养基中春化2天，正常培养5天后再转移至含有0、125mM NaCl的1/2MS固体培养基平板中培养60小时后测相对根长，培养132小时后做表型观察并且拍照。每个NaCl浓度，每个株系有10-12棵拟南芥幼苗，重复三次。

从图4（a）中可以看出，三个转基因株系（5-1-6-1，5-2-4-2和5-3-17-1相对根长明显长于野生型株系（WT相对根长用小数表示为0.194，即19.4%）。SPSS18.0分析其P<0.01，说明具有极显著差异。三个转基因株系中，第一个株系5-1-6-1在三个转基因株系中相对根长最短，为0.351即35.1%；第二个转基因株系5-2-4-2相对根长为0.418，即41.8%；第三个株系5-3-17-1最长，为0.515即51.5%。从图4（b）中可以看出，在无NaCl的1/2MS固体培养基平板中，野生型（WT）和三个转基因拟南芥株系长势都很好，但野生型根长略长于三个转基因株系。；在含有125mM NaCl的1/2MS固体培养基平板中，野生型拟南芥根长又短于三个转基因株系根长。结果表明，超表达MpZFP基因能够提高转基因拟南芥耐盐性。

二、转基因植株耐盐生理指标测定：

将3个转MpZFP基因株系的遗传稳定的T3代植株（5-1-6-1、5-2-4-2和5-3-17-1）和野生型植株的种子消毒后播种于正常的1/2MS固体培养基平板中，春化2天后正常培养5天，然后转移到含有150mM NaCl的1/2MS固体培养基平板中胁迫10天，然后全部种于培养土中恢复10天和30天，观察表型并拍照，统计存活率，干重和主茎高。实验共设三次重复，每次重复中，各株系分别用15株。

从图5（a）图中可以看出，在正常情况下野生型和转基因植株长势几乎无差别。野生型（WT）和转基因株系在150mM NaCl胁迫10天后恢复，每个花盆种都是种10株苗恢复。在恢复10天后很明显观察到野生型株系恢复的数量少，并且恢复后植株长势没有三个转基因株系好，表现为植株矮小、叶小。而三个转基因株系中5-2-4-2和5-3-17-1株系植株恢复情况相差无几，略好于5-1-6-1株系植株。在恢复30天后，三个转基因株系植株长势都明显优于野生型植株。（b）中三个转基因株系的存活率都明显高于野生型株系，SPSS分析P<0.01（其中WT的平均存活率为77.4%，5-1-6-1株系平均存活率为93.6%，5-2-4-2株系平均存活率为95.6%，5-3-17-1株系平均存活率为96.9%）。（c）称量了恢复30天后的干重。正常组中各株系间差别很小，SPSS都是大于0.05的；在胁迫后恢复组中，三个转基因株系的干重显著大于野生型株系干重，SPSS分析都是小于0.01；并且在三个转基因株系间，5-2-4-2和5-3-17-1株系干重差别很小，都大于5-1-6-1株系干重。（d）中统计了恢复30天后各株系植株主茎的高度。在正常组中各株系平均高度差别不大，在胁迫组中三个转基因株系都明显高于野生型株系。以上测定结果表明，超表达MpZFP基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性。

Claims (10)

1.一种水黄皮耐逆相关基因MpZFP，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的水黄皮耐逆相关基因MpZFP编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的重组载体。

4.权利要求3所述重组载体为重组植物表达载体。

5.含有权利要求3或4所述重组载体的重组细胞。

6.权利要求1所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP在提高植物耐逆性中的应用。

7.权利要求6所述植物为农作物。

8.一种提高植物耐逆性的方法，将水黄皮耐逆相关基因MpZFP导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP是下述核苷酸序列之一：

1）SEQ ID NO：1所示DNA序列；

2）编码SEQ ID NO：2所示氨基酸残基序列的DNA序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP通过含有所述水黄皮耐逆相关基因MpZFP的重组植物表达载体导入植物组织或细胞。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述重组植物表达载体为PBI121-MpZFP。

Images