CN101402962A - 紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及紫花苜蓿解旋酶基因的克隆、重组及耐逆功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。从紫花苜蓿中提取总RNA，然后将1微克总RNA反转录成cDNA。根据已公布的EST序列设计一对特异引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pGEM－T Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α，进行序列测定。然后构建表达载体pBI221和PBI121分别转化洋葱表皮和模式植物拟南芥。洋葱表皮亚细胞定位表明该基因所编码的蛋白质定位在细胞核内。表达MH1基因的转基因拟南芥植株具有较高的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力。因此，该基因转化苜蓿等双子叶作物，将会改善其耐逆能力，提高其产量和品质，从而可以在淡水资源严重匮乏的西部地区以及盐碱地较多的滨海地区大面积推广种植，具有巨大的经济效益和社会效益。

Description

紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆与应用

(一)技术领域

本发明涉及紫花苜蓿中解旋酶基因MH1的克隆、重组及耐逆功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

干旱、盐碱等不良环境条件在世界范围内严重影响作物的生长和产量。因此，提高作物的耐逆能力愈来愈受到人们的重视。解旋酶在植物耐逆过程中的作用是近几年才被发现的，是一种新的植物耐逆途径。研究表明过量表达某些解旋酶基因可以提高转基因植物的耐盐和耐低温能力。与传统耐逆途径的区别在于，它有可能直接作用于胁迫敏感的遗传信息转录翻译过程。这大大促进了耐逆基因工程方面的研究工作，并取得突破性进展。2005年N.Sanan-Mishra等利用基因工程手段在烟草中过量表达豌豆来源的基因PDH45(Pea DNAhelicase 45)，在不影响转基因植株产量的同时极大的提高了其耐盐能力，转基因植株可以在含300mM NaCl的培养基上正常生长(N.Sanan-Mishra，X.H.Pham，S.K.Sopory and N.Tuteja，Pea DNA helicase 45 overexpression intobacco confers high salinity tolerance without affecting yield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)，pp.509514.)。

由于解旋酶基因在植物耐逆过程中所起的作用，本发明人利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，从常用豆科牧草紫花苜蓿中分离编码解旋酶的基因MH1，利用半定量RT-PCR的方法分析了不同逆境胁迫条件下该基因的表达情况。构建正义表达载体，利用花序浸染法转化模式植物拟南芥，发现转基因植株的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力得到了显著提高。该基因可用于双子叶植物的遗传转化，提高其耐旱、耐盐能力。

(三)发明内容：

本发明首次从紫花苜蓿中分离出解旋酶基因MH1的全长cDNA，半定量RT-PCR分析表明该基因的表达受不同逆境胁迫的诱导。将其连接到表达载体pBI121上，转化拟南芥，转基因植株在种子萌发、幼苗生长和以后的生长发育过程中耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力都得到了提高。

该基因的全长cDNA为1609bp，其中开放阅读框部分为1221bp，由此推得含有406个氨基酸的一段序列，用DNAMan软件将MDH基因编码的氨基酸序列与GenBank中登记的序列进行比较发现，该序列与豌豆、烟草、拟南芥解旋酶序列有较高的同源性。MDH具有DEAD-box家族的所共有的九个基序Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V和VI，属于DEAD-box解旋酶家族。(见附图1)。表明经过上述克隆步骤得到了紫花苜蓿中编码DEAD-box解旋酶的基因。该基因的序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征

*长度：1609碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：紫花苜蓿

(f)序列描述：

ctcgtctctc aaccaaacct tcttcctttt catctcggcg gcgatggcga cagcttctgt  60

ggttccggcg aatcgccgac gaacggttac ggccaacgag gacatggatt ttgaaacaac  120

cgaaggcgtg aaagcaatcg gaagcttcga agagatgggg ataaaagacg atttgcttcg  180

tggaatctac aattacggat ttgagaaacc gtctgcgatt caacagcgtg cggttgcgcc  240

gattattcag ggaagagatg ttattgctca ggcgcaatct ggtactggaa agacttcgat  300

gattgctttg acggtttgtc aggttgttga tacatccgtc agagaggtgc aagctttaat  360

tgtgtctccg acaagagaac tggcctcaca gactgagaaa gttatattgg caattgggga  420

ttatatcaat atacaagccc atgcttgcat tggagggaaa agtgtgggag aagacattag  480

aaaacttgag catggagttc atgtcgtgtc tggaactcct ggccgagtct gtgacatgat  540

aaagaggaga acattgcgca ccagggccat caagttacta gttctggatg aatctgatga  600

aatgttgagc agagggttta aagatcagat ttatgatgtg tacagatatc tcccaccgga  660

tcttcaggtt tgcctgattt ctgctacgct acctcatgaa attctggaga tgacaaacaa  720

gtttatgaca gatccagtga ggatccttgt aaagcgtgat gaattgacat tggagggcat  780

caagcaattt tttgttgcgg ttgaaaggga ggaatggaag tttgatactc tgtgtgatct  840

atatgatact ctcaccatta ctcaagctgt tatattctgt aacaccaagc ggaaggtgga  900

ctggttaact gaaaaaatgc gtaacaataa tttcactgtt tcatccatgc acggtgacat  960

gcctcaaaga gaaagagatg ccattatgag tgaattccgc gttggaacaa cccgagtatt  1020

gataacaacc gatgtttggg ctcgtggcct tgatgtacaa caggtttctc tagttatcaa  1080

ttatgacctt ccaaataatc gagagctcta cattcatcgg attggtcgtt ctggacgttt  1140

tggacgaaag ggtgttgcaa taaattttgt taaaagcgat gatatcaaga ttttgagaga  1200

tattgagcaa tattacagta cccagattga tgagatgcca atgaatgttg ctgatcttat  1260

ataaaaggac aaggcagtat gctgagtgga gtgcgtttgt caaatttgtg gtaggaatta  1320

gtgtttgatt gtggtttctt tttgatactc tgcgatgttc ttctgaaact tttgacattt  1380

ggtgtattag atttttagtg tgctcgactg taccgcagag ataacgtgtt tttctttgct  1440

gaaatggttg agacttgaga tcaatttgta aattgagttg gaatgatttg tccattgctt  1500

actttcgatg tgaatatcta attttgtgat tcaagtgata tgtgatgttt tgacgaggtt  1560

taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa              1609

(2)SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特

*长度：406氨基酸征

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述

001 MATASVVPAN RRRTVTANED MDFETTEGVK AIGSFEEMGIK DDLLRGIYN YGFEKPSAIQ 60

061 QRAVAPIIQG RDVIAQAQSG TGKTSMIALT VCQVVDTSVR EVQALIVSPT RELASQTEKV 120

121 ILAIGDYINI QAHACIGGKS VGEDIRKLEH GVHVVSGTPG RVCDMIKRRT LRTRAIKLLV 180

181 LDESDEMLSR GFKDQIYDVY RYLPPDLQVC LISATLPHEI LEMTNKFMTD PVRILVKRDE 240

241 LTLEGIKQFF VAVEREEWKF DTLCDLYDTL TITQAVIFCN TKRKVDWLTE KMRNNNFTVS 300

301 SMHGDMPQRE RDAIMSEFRV GTTRVLITTD VWARGLDVQQ VSLVINYDLP NNRELYIHRI 360

361 GRSGRFGRKG VAINFVKSDD IKILRDIEQY YSTQIDEMPM NVADLI                406

构建融合蛋白表达载体35S::MH1-GFP，在洋葱表皮细胞内瞬时表达，发现MH1蛋白定位于细胞核中(见附图2)。

利用200mM甘露醇，200mM NaCl，10μm H₂O₂，15μM ABA和500μM水杨酸处理水培的紫花苜蓿幼苗并提取总RNA做半定量RT-PCR，结果表明该基因的表达受各种逆境胁迫诱导(见附图3)。

利用过量表达策略，构建植物表达载PBI121，转化模式植物拟南芥，选取不同的纯合转基因株系进行耐逆性分析，同时以表达PBI 121::GUS空载体的转基因拟南芥植株做为对照。

正常情况下转基因植株和对照植株的萌发和生长情况没有明显差异(见附图4-h)。将GM培养基上正常生长14天的幼苗在光照培养箱中干燥6小时，幼苗复水48小时以后发现对照植株的幼苗全部漂白死亡，而转基因株系的幼苗仍然能保持部分绿色(见附图4-a)。在含有400mM甘露醇的GM培养基上对照植株种子的萌发率仅为15％左右，而转基因种子均能够正常萌发(见附图4-b)。

将萌发后5天的TL34株系和对照幼苗移栽至盛满基质的同一个花盆中，不浇水完全干旱处理14天，待幼苗均发生严重枯萎后恢复浇水5天，发现转基因幼苗能够返青并继续生长而对照植株却严重失绿最终死亡(见附图4-c)。由于不同苗期，植物对干旱的抵抗能力存在很大差异，所以又选择在短日照条件下正常生长一个月后的TL34株系和对照植株进行干旱处理。完全干旱4周后，对照植株生长非常缓慢，相同叶位叶片的面积仅为转基因植株的1/2(见附图4-d)，叶片枯萎现象严重，整株叶片呈现墨绿色。而转基因植株的生长虽然受到一定程度的抑制但是生长状况远远好于对照植株。

在含有200mM NaCl的GM培养基上转基因种子的萌发率为100％，而对照种子的萌发率仅为46％左右(见附图4-e)。对短日照条件下生长25天的幼苗浇灌200mM NaCl，连续浇灌15天后，可以明显的观察到对照植株叶片变紫开始枯萎并最终死亡，而转基因植株虽然生长比较弱但仍能继续生长(见附图4-f)。

在含有5μM甲基紫精的GM平板上检测不同转基因株系(TL12和TL34)种子的萌发与幼苗的生长情况。结果显示95％以上的转基因种子均能够正常萌发而对照种子萌发率低于7％(见附图4-g)。对照幼苗在含有甲基紫精的培养基上竖直培养5天后全部漂白死亡，而转基因植株虽然生长较弱，但是仍然可以继续生长(见附图4-i)。

根据上述技术，从紫花苜蓿中分离出编码DEAD-box解旋酶的基因MH1，该基因的表达受不同胁迫处理的诱导。在拟南芥中表达MH1基因能够提高转基因植株的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力。该研究为利用基因工程技术进行紫花苜蓿耐逆新品种的培育提供了新的理论资料和基因资源。具有非常重要的经济效益和理论价值。

(四)附图说明：

图1推测的MH1蛋白序列与不同物种来源的DEAD-box解旋酶序列比较分析。序列比较图用DNAMAN分析软件完成。灰底和浅灰底分别代表100％和75％的同源性。序列中的原点代表缺少的氨基酸。假定的保守结构域用罗马字表示。解旋酶序列的来源分别为PDH45：豌豆(CAA76677)，NeIF4A3：烟草(CAA43514)，和eIF4A1：拟南芥(NP_566469)。同源比较图用DNAMAN分析软件完成。

图2洋葱表皮瞬时表达分析表明MH1-GFP融合蛋白定位在细胞核中。下图为表达35S::GFP的洋葱表皮细胞对照。

图3利用200mM甘露醇，200mM NaCl，10μM H₂O₂，15μM ABA和500μM水杨酸处理水培三周的紫花苜蓿幼苗，处理不同时间后MH1基因的表达分析。

图4转基因拟南芥的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力分析。a：幼苗离体条件下失水和复水情况。b；转基因和对照种子在含有400mM甘露醇的GM培养基上萌发10天。c：幼苗干旱处14天后，恢复浇水5天。d：正常生长一个月的转基因和对照植株干旱处理4周。e：转基因和对照种子在含200mM NaCl的GM培养基上萌发10天。f：移植在同一个花盆中的转基因和对照幼苗用200mMNaCl连续处理15天。g：在含有5μm甲基紫精的GM培养基上种子萌发10天。h：在GM培养基上转基因和对照种子的萌发10天。i：正常萌发10天的幼苗在含有5μm甲基紫精的GM培养上竖直生长5天。

Control：对照植株。TL：表示不同的转基因株系。

(五)具体发明实施方式：

实施方式1：紫花苜蓿解旋酶基因的克隆方法

(1)RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取RNA。

(2)DNA第一条链的合成：取1μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃条件下反应60分钟，然后在85℃条件下，放置10分钟，终止反应。

(3)PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：

首先将下列试剂混在一起：

10×反应缓冲液          2.5μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP)    2μl

正向引物(5μM)            2μl

反向引物(5μM)            2μl

模板cDNA                  2μl

Taq DNA聚合酶             0.25μl

总体积                    25μl

PCR反应条件为：94℃3分钟；然后进入下列循环：94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

(4)基因克隆：取3(1PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司pGEM-T Easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5(菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100(g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中过夜培养。

(5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

(6)序列测定：本工作在大连宝生物工程公司进行。

(7)3′和5′序列的分离：按Clontech公司的SMART RACE cDNA AmplificationKit说明书进行。

(8)同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。

实施方式2：紫花苜蓿解旋酶基因(MH1)的序列见“发明内容”部分。

实施方式3：表达载体的构建

(1)根据分离出的紫花苜蓿解旋酶基因核苷酸序列，设计引物：

正向引物：Ms-L：5’-ATCTAGACTCGTCTCTCAACCAAACCTTC-3’

反向引物：Ms-R：5’-AGTCGACCTCAGCATACTGCCTTGTCCTT-3’

以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

(2)取3μl PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T Easy Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。然后碱法提取质粒DNA，进行序列测定。

(3)用XbaI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T Easy载体上切下，与相同酶酶切的pBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌，所用菌株为GV3103。

实施方式4：转基因植物耐逆能力分析

(1)种植拟南芥。

(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28o℃振荡培养。

(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl₂，0.5％SilwetL-77)悬浮，菌液OD₆₀₀值在0.8左右。

(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。

(5)收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH 5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30μg/ml)上筛选，得到抗性植株。

(6)对T3代纯合的转基因株系进行耐旱、耐盐和抗氧化胁迫分析，观察种子萌发和幼苗的生长状况，分析结果见附图4。

序列表

<110>山东农业大学

<120>紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆与应用

<160>1

<170>patent in 3.1

<210>1

<211>1609

<212>DNA

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<221>1-1609

<400>1

ctcgtctctc aaccaaacct tcttcctttt catctcggcg gcgatggcga cagcttctgt 60

ggttccggcg aatcgccgac gaacggttac ggccaacgag gacatggatt ttgaaacaac 120

cgaaggcgtg aaagcaatcg gaagcttcga agagatgggg ataaaagacg atttgcttcg 180

tggaatctac aattacggat ttgagaaacc gtctgcgatt caacagcgtg cggttgcgcc 240

gattattcag ggaagagatg ttattgctca ggcgcaatct ggtactggaa agacttcgat 300

gattgctttg acggtttgtc aggttgttga tacatccgtc agagaggtgc aagctttaat 360

tgtgtctccg acaagagaac tggcctcaca gactgagaaa gttatattgg caattgggga 420

ttatatcaat atacaagccc atgcttgcat tggagggaaa agtgtgggag aagacattag 480

aaaacttgag catggagttc atgtcgtgtc tggaactcct ggccgagtct gtgacatgat 540

aaagaggaga acattgcgca ccagggccat caagttacta gttctggatg aatctgatga 600

aatgttgagc agagggttta aagatcagat ttatgatgtg tacagatatc tcccaccgga 660

tcttcaggtt tgcctgattt ctgctacgct acctcatgaa attctggaga tgacaaacaa 720

gtttatgaca gatccagtga ggatccttgt aaagcgtgat gaattgacat tggagggcat 780

caagcaattt tttgttgcgg ttgaaaggga ggaatggaag tttgatactc tgtgtgatct 840

atatgatact ctcaccatta ctcaagctgt tatattctgt aacaccaagc ggaaggtgga 900

ctggttaact gaaaaaatgc gtaacaataa tttcactgtt tcatccatgc acggtgacat 960

gcctcaaaga gaaagagatg ccattatgag tgaattccgc gttggaacaa cccgagtatt 1020

gataacaacc gatgtttggg ctcgtggcct tgatgtacaa caggtttctc tagttatcaa 1080

ttatgacctt ccaaataatc gagagctcta cattcatcgg attggtcgtt ctggacgttt 1140

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gtgtttgatt gtggtttctt tttgatactc tgcgatgttc ttctgaaact tttgacattt 1380

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taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa             1609

Claims (2)

1.一种紫花苜蓿解旋酶基因MH1，其特征在于它具有下述所示的序列：

1    CTCGTCTCTC AACCAAACCT TCTTCCTTTT CATCTCGGCG GCGATGGCGA CAGCTTCTGT  60

61   GGTTCCGGCG AATCGCCGAC GAACGGTTAC GGCCAACGAG GACATGGATT TTGAAACAAC  120

121  CGAAGGCGTG AAAGCAATCG GAAGCTTCGA AGAGATGGGG ATAAAAGACG ATTTGCTTCG  180

181  TGGAATCTAC AATTACGGAT TTGAGAAACC GTCTGCGATT CAACAGCGTG CGGTTGCGCC  240

241  GATTATTCAG GGAAGAGATG TTATTGCTCA GGCGCAATCT GGTACTGGAA AGACTTCGAT  300

301  GATTGCTTTG ACGGTTTGTC AGGTTGTTGA TACATCCGTC AGAGAGGTGC AAGCTTTAAT  360

361  TGTGTCTCCG ACAAGAGAAC TGGCCTCACA GACTGAGAAA GTTATATTGG CAATTGGGGA  420

421  TTATATCAAT ATACAAGCCC ATGCTTGCAT TGGAGGGAAA AGTGTGGGAG AAGACATTAG  480

481  AAAACTTGAG CATGGAGTTC ATGTCGTGTC TGGAACTCCT GGCCGAGTCT GTGACATGAT  540

541  AAAGAGGAGA ACATTGCGCA CCAGGGCCAT CAAGTTACTA GTTCTGGATG AATCTGATGA  600

601  AATGTTGAGC AGAGGGTTTA AAGATCAGAT TTATGATGTG TACAGATATC TCCCACCGGA  660

661  TCTTCAGGTT TGCCTGATTT CTGCTACGCT ACCTCATGAA ATTCTGGAGA TGACAAACAA  720

721  GTTTATGACA GATCCAGTGA GGATCCTTGT AAAGCGTGAT GAATTGACAT TGGAGGGCAT  780

781  CAAGCAATTT TTTGTTGCGG TTGAAAGGGA GGAATGGAAG TTTGATACTC TGTGTGATCT  840

841  ATATGATACT CTCACCATTA CTCAAGCTGT TATATTCTGT AACACCAAGC GGAAGGTGGA  900

901  CTGGTTAACT GAAAAAATGC GTAACAATAA TTTCACTGTT TCATCCATGC ACGGTGACAT  960

961  GCCTCAAAGA GAAAGAGATG CCATTATGAG TGAATTCCGC GTTGGAACAA CCCGAGTATT  1020

1021 GATAACAACC GATGTTTGGG CTCGTGGCCT TGATGTACAA CAGGTTTCTC TAGTTATCAA  1080

1081 TTATGACCTT CCAAATAATC GAGAGCTCTA CATTCATCGG ATTGGTCGTT CTGGACGTTT  1140

1141 TGGACGAAAG GGTGTTGCAA TAAATTTTGT TAAAAGCGAT GATATCAAGA TTTTGAGAGA  1200

1201 TATTGAGCAA TATTACAGTA CCCAGATTGA TGAGATGCCA ATGAATGTTG CTGATCTTAT  1260

1261 ATAAAAGGAC AAGGCAGTAT GCTGAGTGGA GTGCGTTTGT CAAATTTGTG GTAGGAATTA  1320

1321 GTGTTTGATT GTGGTTTCTT TTTGATACTC TGCGATGTTC TTCTGAAACT TTTGACATTT  1380

1381 GGTGTATTAG ATTTTTAGTG TGCTCGACTG TACCGCAGAG ATAACGTGTT TTTCTTTGCT  1440

1441 GAAATGGTTG AGACTTGAGA TCAATTTGTA AATTGAGTTG GAATGATTTG TCCATTGCTT  1500

1501 ACTTTCGATG TGAATATCTA ATTTTGTGAT TCAAGTGATA TGTGATGTTT TGACGAGGTT  1560

1561 TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA。

2.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿解旋酶基因MH1的用途，其特征在于该基因在拟南芥中表达，显著提高其耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力。

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