CN109354609A - 一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因，将该紫花苜蓿耐盐耐旱基因转入烟草中，能够提高烟草的耐盐耐旱能力，用于培育抗逆能力强的烟草品种。

Description

一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因及其应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界分布最广泛的多年生豆科牧草。素有“牧草之王”的美称。大面积种植紫花苜蓿有利于改善农业生产环境和生态环境。当今农业，饲草产量降低、品质下降，草畜失衡的矛盾日益加剧，制约畜牧业的可持续发展。近年来，越来越多的抗逆相关基因从植物中克隆并通过转基因手段培育了一大批新品种。这种新的技术手段，为改善作物品质、提高植物抗逆性对中国畜牧业发展和生态环境的改善具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因，并验证其功能。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因，其特征在于，该紫花苜蓿耐盐耐旱基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列如下：

与现有技术相比，本发明的紫花苜蓿耐盐耐旱基因，带来的有益技术效果在于：

1、通过RACE技术，得到了紫花苜蓿耐盐耐旱基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列。

2、根据申请人的实验证明，将该紫花苜蓿耐盐耐旱基因转入烟草中，能够提高烟草的耐盐耐旱能力，用于培育抗逆能力强的烟草品种的应用。

培育得到抗逆能力强的烟草品种，通过以下步骤得以实现：

1)将紫花苜蓿耐盐耐旱基因和植物双元表达载体pCAMBIA1302用T4连接酶连接，构建烟草过表达载体；

2)将烟草过表达载体质粒导入农杆菌GV3101中，使用烟草叶盘法侵染植物叶片，利用潮霉素筛选抗性植株；

3)将所筛选得到的植株通过炼苗，移栽入土中，观察植物生长状态。

附图说明

图1为紫花苜蓿耐盐耐旱基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列和对应氨基酸序列；

图2为紫花苜蓿耐盐耐旱基因获取方法及转基因植株获得方法技术路线图；

图3为紫花苜蓿耐盐耐旱基因在紫花苜蓿各组织相对表达情况；

图4为5’RACE扩增图；

图5为3’RACE扩增图；

图6为紫花苜蓿耐盐耐旱基因扩增图；

图7为转基因烟草植株鉴定结果；

图8-9为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果；其中，图8为盐胁迫后丙二醛检测结果，图9为盐胁迫后脯氨酸检测结果；

图10-11为转基因烟草在干旱胁迫处理后生理指标检测结果；其中图10为干旱胁迫后丙二醛检测结果，图11为干旱胁迫后脯氨酸检测结果。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

一、紫花苜蓿耐盐耐旱基因获取及转基因植株获得

通过RACE技术得到的紫花苜蓿耐盐耐旱基因及转基因植株获得方法技术路线如图2所示，其中包括：

1)5’RACE扩增操作：5’RACE反转录；cDNA的S.N.A.P柱子纯化；TdT加尾；5’RACE扩增；5’RACE目的片段与T载体连接：将回收的5’RACE片段连接到pMD18-T载体；大肠杆菌DH5α转化，挑菌测序。

2)3’RACE扩增操作：3’RACE反转录；3’RACE PCR扩增：以3’RACE反转录cDNA为模板，3’GSP和AUAP为引物进行PCR扩增；3’RACE PCR产物的纯化回收：使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒中的操作手册回收目的基因片段；3’RACE目的片段与T载体连接：将回收的3’RACE片段连接到pMD18-T载体，大肠杆菌DH5α转化，挑菌测序。

3)使用Trizol(Invitrogen)提取紫花苜蓿叶片RNA，并依cDNASynthesis Kit(TaKaRa)反转成cDNA。PCR获得目的片段后，连接T载体。T载体测序后，使用DNAman软件，将其与5’RACE和3’RACE结果拼接，得到紫花苜蓿耐盐耐旱基因序列。

4)在基因序列开放阅读框(ORF)两端设计全长引物，利用高保真酶(TaKaRa)扩增该基因。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收基因片段，连接pMD18-T转化大肠杆菌DH5α，挑菌测序，最终得到紫花苜蓿耐盐耐旱基因序列，该紫花苜蓿耐盐耐旱基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列如下：

紫花苜蓿耐盐耐旱基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列和对应氨基酸序列如图1所示。

紫花苜蓿耐盐耐旱基因在紫花苜蓿各组织相对表达情况如图3所示，其中，紫花苜蓿耐盐耐旱基因在紫花苜蓿茎中表达量最高，其次是叶。

5’RACE扩增图如图4所示，目的条带长461bp。

3’RACE扩增图如图5所示，目的条带长512bp。

紫花苜蓿耐盐耐旱基因扩增图如图6所示，目的条带长1134bp。

二、转基因植株获得

请继续参见图2，转基因植株获得按以下方式进行：

1)将紫花苜蓿耐盐耐旱基因和植物双元表达载体pCAMBIA1302用T4连接酶连接，构建烟草过表达载体；

2)将烟草过表达载体质粒导入农杆菌GV3101中，使用烟草叶盘法侵染植物叶片，利用潮霉素筛选转基因烟草抗性植株；

3)将所筛选得到的转基因烟草抗性植株通过炼苗，移栽入土中，观察植物生长状态。

转基因烟草抗性植株鉴定结果如图7所示，使用潮霉素通用引物进行鉴定：目的条带长521bp。

盐胁迫处理：使用200mM的NaCl对转基因烟草抗性植株进行盐胁迫处理，在0，7，14d取样，对生理指标丙二醛和脯氨酸含量进行检测。

盐胁迫后丙二醛检测结果如图8所示，脯氨酸检测结果如图9所示。

干旱胁迫处理：使用自然干旱法对转基因烟草抗性植株进行干旱胁迫处理。在0，14d取样，对生理指标丙二醛和脯氨酸含量进行检测。

干旱胁迫后丙二醛检测结果如图10所示，脯氨酸检测结果如图11所示。

结果表明，转基因烟草抗性植株具有较强的耐盐耐旱的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术方案所作的任何修改、等同替换、改进等，均应视为本发明的保护范围。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因及其应用

<160>

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213>核苷酸序列

<220>

<400>

aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg gacagatagc aacagctaaa aaataataaaagtactctta attgacatgg ctgtcatggt

tacattcttg aatttgatta tcattttttc agtggtttct acaggaaaat cactcagcttaaactactat gataaatcat gccatgatct

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Claims (3)

1.一种紫花苜蓿耐盐耐旱基因，其特征在于，该紫花苜蓿耐盐耐旱基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列如下：

2.权利要求1所述的紫花苜蓿耐盐耐旱基因用于培育抗逆能力强的烟草品种的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，按以下步骤进行：

1)将紫花苜蓿耐盐耐旱基因和植物双元表达载体pCAMBIA1302用双酶切后再用T4连接酶连接，构建烟草过表达载体；

2)将烟草过表达载体质粒用电转化法导入农杆菌GV3101中，使用烟草叶盘法侵染植物叶片，利用潮霉素筛选抗性植株；

3)将所筛选得到的植株通过炼苗，移栽入土中，观察植物生长状态。