CN104975040A

CN104975040A - 一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法

Info

Publication number: CN104975040A
Application number: CN201510412350.3A
Authority: CN
Inventors: 包爱科; 王锁民; 杜宝强; 席杰军; 马清; 未丽; 张金林
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明涉及一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，是将ZxNHX基因和ZxVP1-1基因导入目的植物中，得到抗逆性提高的转基因植物；所述抗逆性为抗旱性和耐盐性；所述目的植物为紫花苜蓿。通过对转基因植物和目的植物的性能进行实验，结果表明向紫花苜蓿中导入ZxNHX基因和ZxVP1-1基因后，紫花苜蓿的耐盐性和抗旱性得到显著提升，并且还可以显著提升紫花苜蓿的生长速度，获得更高的生物量。

Description

一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法

技术领域

本发明涉及一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法。

背景技术

紫花苜蓿，是一种多年生草本，其根粗壮，根颈发达，是优良的豆科牧草，冠有“牧草之王”之美称。随着我国草地农业的迅速发展，近年来，紫花苜蓿作为主要牧草被大面积发展种植，使得紫花苜蓿的产量日渐提升。但是现有紫花苜蓿品种的抗旱和耐盐性较差，在有些地区无法种植，因此有必要提供一种紫花苜蓿的培育方法，改善紫花苜蓿的抗旱和耐盐性。

发明内容

本发明的目的就是提供一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，其可有效实现上目的，提高紫花苜蓿的抗旱和耐盐性。

一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，是将ZxNHX基因和ZxVP1-1基因导入目的植物中，得到抗逆性提高的转基因植物；

所述抗逆性为抗旱性和耐盐性；

所述目的植物为紫花苜蓿。

具体的操作为：所述ZxNHX基因和ZxVP1-1基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为pCAMBIA1301-ZxVP1-1-ZxNHX。更为详细的为：ZxNHX基因和ZxVP1-1基因通过根癌工程农杆菌GV3101导入目的植物的增殖细胞中，由增殖细胞重新萌发的顶芽培养得到转基因植物。

上述的方法在培育植物新品种中的应用也属于本发明的保护范围之内。

通过对转基因植物和目的植物的性能进行实验，结果表明向紫花苜蓿中导入ZxNHX基因和ZxVP1-1基因后，紫花苜蓿的耐盐性和抗旱性得到显著提升，并且还可以显著提升紫花苜蓿的生长速度，获得更高的生物量。

附图说明

图1为转基因紫花苜蓿中ZxNHX和ZxVP1-1整合基因组的PCR检测图；

图2为ZxNHX和ZxVP1-1基因在转基因紫花苜蓿株系中的表达图谱；

图3为盐胁迫30d后紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因紫花苜蓿株系(L9)的生长状况示意图；

图4为干旱胁迫5d(a)、7d(b)以及复水2d(c)和7d(d)后紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因株系(L9)的生长状况示意图；

图5为盐处理(a)和干旱胁迫(b)下紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因株系(L9)的净光合速率(Pn)的对照图；

图6为野外大田试验条件下移栽50d(a)和100d(b)后紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因株系(L9)的生长状况示意图；

图7为野外大田试验条件下移栽30d、60d和90d后紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因株系(L9)的气孔导度(a)、净光合速率(b)和水分利用效率(c)的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

一、抗性紫花苜蓿的获得

1、ZxNHX基因和ZxVP1-1基因的克隆

ZxNHX基因为已知的霸王液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX(GeneBank:EU103624)；ZxVP1-1基因为已知的霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1(GeneBank:EU103625)。

2、重组表达载体的构建

重组表达载体的构建可采用中国专利“强耐盐抗旱植物的培育方法及其双价表达载体”(公开号：CN101831458A；下称参考文献1)中公开的方法进行操作获取，所得重组表达载体即为：pCAMBIA1301-ZxVP1-1-ZxNHX(公众可从兰州大学获得ZxNHX基因、ZxVP1-1基因以及重组表达载体pCAM BIA1301-ZxVP1-1-ZxNHX等生物材料)。

3、转基因紫花苜蓿的获得

a)：挑选籽粒饱满、均匀一致的紫花苜蓿用70％酒精浸泡5分钟，然后用10％Bleach浸泡15分钟后用无菌水冲洗5次，接种于1/2MS培养基上培养进行萌发，获得无菌实生苗。

b)：将重组表达载体pCAMBIA1301-ZxVP1-1-ZxNHX电转化至根癌农杆菌中获得根癌工程农杆菌GV3101(参考文献1、公众可从兰州大学获取)，以紫花苜蓿无菌苗丛生芽为受体，将根癌工程农杆菌GV3101导入到增殖细胞中，增殖细胞重新萌发的顶芽培养成植株，经分子检测获得ZxNHX和ZxVP1-1基因共表达的转基因株系。

步骤b)具体的操作为：

在无菌环境中，切去新疆大叶苜蓿4d无菌苗的子叶和顶端分生组织，将幼苗放入装有15ml根癌工程农杆菌GV3101悬浮液的50ml离心管中，并加入2.4g无菌石英砂，在室温下3200rpm涡旋20min，将涡旋感染后的幼苗垂直移栽于共培养基中(1/2MS+5％蔗糖+5.0g·L^-1琼脂，pH＝5.8)共培养36h；然后将幼苗移入脱菌培养基(1/2MS+10％蔗糖+300mg/L羧苄青霉素)中培养21d，期间在相同的新鲜脱菌培养基上继代1次。待转化稳定并长出新芽(幼苗约3-4cm)，将幼苗移入选择培养基(1/2MS+10％蔗糖+300mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素)中选择培养30d，期间每隔10d在相同的新鲜选择培养基上继代1次，最终获得30株抗潮霉素的阳性植株。将这些阳性苗经过7d左右的炼苗后移入含珍珠岩、蛭石和草炭土的混合基质中(体积比为1:1:1)培养，在温室内生长旺盛，生根良好。

提取全部30株抗性植株和未转化对照植株的叶DNA作为模板，分别用ZxNHX和ZxVP1-1基因的特异性引物进行扩增，发现27株阳性植株中全部含有ZxNHX和ZxVP1-1基因，结果如图1所示。随后，进一步对27个转基因系列进行RT-PCR分析，发现ZxNHX和ZxVP1-1基因在其中25个PCR阳性株系中稳定表达，结果如图2所示。

图1为转基因紫花苜蓿中ZxNHX和ZxVP1-1整合基因组的PCR检测；其中：“M”代表DNA marker，“P”代表阳性对照(携带目标基因的根癌农杆菌GV3101菌株)，“WT”代表阴性对照(未转化植株)；1-27泳道均为ZxNHX-ZxVP1-1共转化株系。

图2为ZxNHX和ZxVP1-1基因在转基因紫花苜蓿株系中的表达图谱；其中“WT”代表对照(未转化植株)；1-25泳道均为ZxNHX-ZxVP1-1共转化株系，ACTIN作为内参基因。

该转化流程耗时不超过5个月，大大缩短了紫花苜蓿的转化周期，且转化率较高，达到15％以上。

二、抗性紫花苜蓿的检测

1、温室内评价紫花苜蓿转基因株系的耐盐性和抗旱性

挑选苗高、长势及根长基本一致的转基因株系和野生对照植株扦插苗作为实验材料，在正常条件下培养4周，然后进行50、100、150和200mmol/L的NaCl处理30d的盐胁迫实验或停止浇水8d的干旱胁迫实验。

在正常条件下，野生型和转基因植株均生长良好，但转基因植株比野生型生长更快，经过近60d的生长后，转基因植株的株高、地上部干重和根干重分别达到野生型植株的1.6、1.7和1.6倍，具体结果如图3中(a)；200mmol/L的NaCl处理30d后，转基因植株的生长虽然受到抑制，但受抑程度要远轻于野生型植株，结果如图3中(b)所示。随着外界盐浓度的递增，转基因植株和野生型的株高、根和地上部干重等参数均呈逐渐下降的趋势，但前者的下降幅度比后者的小；在各浓度NaCl处理下，转基因植株的上述各项形态指标均显著高于野生型植株，具体如表1所示。

表1 为盐胁迫下30d后紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因紫花苜蓿株系(L9)的形态指标

表1中：数据为平均值±标准误(n＝15)，同一列中不同字母表示P<0.05水平上差异显著(Ducan检验)。

旱胁迫实验表明，停止浇水5d后，野生型植株生长已受到抑制，叶片发黄并开始出现萎蔫，而转基因株系仍然保持正常生长，如图4中(a)所示，直到干旱第7d，转基因植株才发生萎蔫，如图4中(b)所示；对所有植株恢复浇水2d后，转基因转植株解除萎蔫，但野生型植株则发生永久萎蔫，如图4中(c)所示；复水7d后，转基因植株完全恢复正常生长，而野生型植株已经枯死，如图4中(d)所示。在整个干旱处理期间，转基因植株的株高、地上部干重和根干重等各项形态指标均显著高于野生型对照，具体如表2所示。

表2 为干旱胁迫下紫花苜蓿野生型对照(WT)和转基因紫花苜蓿株系(L9)的形态指标

表2中：数据为平均值±标准误(n＝15)，同一列中不同字母表示P<0.05水平上差异显著(Ducan检验)。

紫花苜蓿转基因株系还表现出更强的光合能力，随着盐浓度的增加或干旱胁迫时间的延长，植株的净光合速率均呈下降的趋势，但在相同胁迫条件下，转基因植株的净光合速率显著高于野生型植株。例如，在200mmol/L的NaCl处理30d后，转基因植株的净光合速率较野生型对照高出37.6％，如图5中(a)所示；在水分胁迫的第7d，转基因植株的净光合速率也比野生型高64.3％，如图5中(b)所示。表明转基因植株在逆境条件下保持了较高的光合能力，这可能也是导致其生长更快的最直接原因。

综上所述，ZxNHX和ZxVP1-1基因在紫花苜蓿中的同时表达不仅显著促进了转基因植株的生长，而且大幅度提高了其耐盐性和抗旱性。

2、大田环境下评价紫花苜蓿转基因株系的生长特性

转基因紫花苜蓿的大田试验于2012年6月进行，试验地设在兰州大学榆中校区草地农业科技学院智能温室及兰州市榆中县兰州大学草地农业科技学院的试验田。当地为一山脚下平地，气候特点属于半干旱大陆性季风气候，温差大，降雨少，年平均气温6～9℃，年均降雨量327.7毫米，无霜期168天。≥10℃活动有效积温3300℃左右，年日照时数3200小时以上，光热资源丰富。试验地土壤类型为黄绵土，较贫瘠，其0～20cm土层Na、K、N和P的含量分别为0.13、0.19、0.62和1.33g/Kg。将温室条件下培养60d的盆栽苗留茬5cm刈割后移入大田，采用随机小区设计，小区面积4m×12m，转基因株系和野生对照各3个小区，株行距为0.8m×1m，移栽后浇透水，以后不再浇水，植物生长所需的水分都由自然降水提供。

在大田条件下，紫花苜蓿转基因株系的生长速度显著快于野生型对照，结果如图6所示。移栽90天后，紫花苜蓿转基因株系的株高、分枝数、主根长、地上部干重及根干重等指标均显著高于野生型对照，结果如表3所示。同时，转基因植株的气孔导度、净光合速率和水分利用效率均显著高于野生型，结果如图7所示。可见，在野外大田试验条件下，转基因紫花苜蓿维持了较高的光合能力，从而使其能够快速生长，获得更高的生物量。

表3 为野外大田试验条件下移栽90天后野生型和转基因紫花苜蓿的农艺性状

表3中：数据为平均值±标准误(n＝15)，同一列中不同字母表示P<0.05水平上差异显著(Ducan检验)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，是将ZxNHX基因和ZxVP1-1基因导入目的植物中，得到抗逆性提高的转基因植物；

所述抗逆性为抗旱性和耐盐性；

所述目的植物为紫花苜蓿。

2.根据权利要求1所述的培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，其特征在于：所述ZxNHX基因和ZxVP1-1基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为pCAMBIA1301-ZxVP1-1-ZxNHX。

3.根据权利要求2所述的培育抗逆转基因紫花苜蓿的方法，其特征在于：ZxNHX基因和ZxVP1-1基因通过根癌工程农杆菌GV3101导入目的植物的增殖细胞中，由增殖细胞重新萌发的顶芽培养得到转基因植物。