CN101831458A - 强耐盐抗旱植物的培育方法及其双价表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和生物技术领域，提供了一种强耐盐抗旱植物品种的培育方法：通过构建双基因植物表达载体实现中亚荒漠特有种属--多浆强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的液泡膜氢焦磷酸酶(H⁺-PPase)基因ZxVP1-1和液泡膜钠氢逆向转运蛋白(Na⁺/H⁺ antiporter)基因ZxNHX聚合，然后经过一次转化即可实现耐盐抗旱功能协同的两个基因在转化植物品种(系)中连锁超表达，从而培育出强耐盐抗旱植物品种。其优点是：①转双基因植物的耐盐抗旱性强于转单基因的植物；②大大加速了培育强耐盐抗旱植物的育种进程；③植物后代的耐盐抗旱性状稳定。本发明主要用于农作物和优良牧草的遗传改良，可以提高其耐盐、抗旱、抗寒和产量等性状，具有重要的社会、经济和生态效益。

Description

强耐盐抗旱植物的培育方法及其双价表达载体

技术领域：

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及培育强耐盐抗旱植物的方法及其转基因载体。

背景技术：

干旱和土壤盐渍化是制约全球农牧业生产的两个最主要不利因素。目前，世界上干旱区总面积约为61亿公顷，约占全球陆地面积的40％(《环球时报》2009)。而且，由于温室气体排放，气温升高，水分蒸发加剧，致使某些半湿润地区也变成了干旱地区。此外，由于干旱和半干旱地区的强烈蒸发，使这些地区的土壤中富集了大量盐分而使土壤盐渍化、荒漠化。据统计，全球有各种盐渍土地约9.5亿公顷(Kovda&Szabolcs，Modelling of SoilSalinization and Alkalization.1979)；而且，由于耕地的次生盐渍化，盐渍土地面积还在不断增加。随着社会不断进步，人口急速膨胀，世界粮食出现严重危机；因此，在耕地资源愈趋匮乏和全球生态日益恶化的形势下，对大面积存在的干旱盐渍土地资源进行开发利用变得愈加迫切。

然而，令人遗憾的是，全球植物物种的99％，尤其是农作物对干旱和盐渍环境的耐受性都不强(Flowers T J and Colmer T D.2008.New Phytol.179(4)：945-63；Xiong L M and Zhu J K.Salt Tolerance.The ArabidopsisBook.2002)；因此，提高农作物以及其它植物的耐盐抗旱性是开发利用大面积存在的干旱盐渍土地资源的重要途径之一，也是解决粮食危机和应对全球气候变暖的重要手段。然而目前作物性状的改良主要依赖于传统育种。由于遗传物质的杂合性和优良品种数量以及其有限的抗逆性的限制，传统育种不但费时长而且成功几率小。庆幸的是：一方面，植物基因工程可以克服传统育种的缺陷，突破物种间优良抗逆基因资源转移的障碍，培育出传统育种方法所不能培育的新品种(系)；另一方面，干旱盐渍环境中的植物在漫长的生命史中演化出适应不良环境的独特机制，进化出大量对干旱盐渍环境具有强抗性的独特抗逆基因资源，为农作物抗旱耐盐性的遗传改良奠定了物质基础。

为了在干旱盐渍环境中生存，植物细胞必须维持很低的渗透势以保证在干旱条件下根系能从土壤中吸收水分以及减少叶片细胞的水分散失。尽管植物可以合成大量“兼性”有机溶质，如糖类(蔗糖)、糖醇类(山梨醇)、氨基酸类(脯氨酸)、甲基化脯氨酸类化合物(甲基脯氨酸)、甜菜碱类(甘氨酸甜菜碱)和甲基磺酸化合物(β-二甲基巯基丙酸盐，DMSP)(Hasegawa PM，Bressan R A，Zhu J K，Bohnert H J.2000.Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology.51：463-499；Rhodes D，HansonA D.1993.Annual Review of Plant Physiology and Plant MolecularBiology 44：357-384)等进行渗透调节；但其不仅消耗了大量的C源和N源，而且在合成过程中还需要耗费相当的能量。因此，合成有机渗透调节物质并不是一种理想的渗透调节方式。然而，已有的研究多集中于“兼性”有机溶质合成基因的遗传转化。因此，本发明的动因之一是规避采用合成有机渗透调节物质以提高作物耐盐抗旱性的不足之处，通过增强无机离子的吸收与积累以有效提高植物的渗透调节能力。

研究表明，干旱盐渍环境中的植物可利用大量无机离子如Na⁺、K⁺等进行渗透调节。由于Na⁺会危害细胞质内各种代谢酶的活性(Blumwald E.2000.Curr Opin Cell Biol.12(4)：431-4)，因此，植物细胞需要将进入细胞质的Na⁺进行区隔以维持正常的生长代谢活动(Frommer W B and Rentsch D.1999.Science.285：1222-1223)。由于液泡占成熟细胞体积的80-90％(Schmidt UG，Endler A，Schelbert S，et al.2007.Plant Physiology.145：216-229)，因此液泡是大量有害物质如Na⁺等的理想区隔场所。离子区域化的实现主要依赖各种离子的膜转运蛋白和为膜离子转运蛋白提供转运动力的质子泵。因此，提高膜转运蛋白和膜质子泵的活性或增加其表达量均可使离子转运效率提高。液泡膜钠氢逆向转运蛋白(vacuolar Na⁺/H⁺antiporter，NHX)是位于液泡膜上的一种钠泵，它利用液泡膜H⁺-ATPase和液泡膜H⁺-PPase建立的跨液泡膜质子梯度将细胞质中过多的Na⁺区域化到液泡，一方面避免过多Na⁺对细胞质内各种代谢酶的毒害，另一方面又可将Na⁺作为一种有益的渗透调节剂来降低细胞的渗透势，从而使植物能更好地适应盐渍和干旱环境(Blumwald E.1987.Physiologia Plantarum，1987，69：731-734)。

霸王作为一种典型的荒漠多浆旱生植物，可从含盐量极低的生境中吸收并积累大量的Na⁺以降低细胞渗透势来适应极端的干旱环境(Wang S M，WangY R，Chen H，et al.2004.J.Arid Environ.56：525539)。广泛分布于我国西北荒漠的--霸王(赵一之，朱宗元.2003.云南植物研究.25(2)：113 121)，在其漫长的生命进化史中孕育出大量而独特的抗逆基因资源，对极端环境如强光照、极度干旱、强烈温差和贫瘠的荒漠土壤等具有很强的适应性(周向睿，周志宇，吴彩霞.2006.草业科学，23(6)：38-41)。因此，本发明从对干旱和盐渍环境具有特殊适应机制的荒漠植物霸王中挖掘其特异的抗逆基因--液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因和液泡膜H⁺-PPase基因，用于对农作物和优良牧草进行抗逆性遗传改良，使其更有效地利用土壤中的Na⁺进行渗透调节，从而增强其适应干旱盐渍等不良生境的能力。

大量研究表明，超表达拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺ antiporter基因和H⁺-PPase基因都可以显著增强转基因植物的耐盐性。1999年，Apse等(Apse M P，Aharon G S，Snedden W A，et al.1999.Science.285：1256-1258)在拟南芥中鉴定了第一个高等植物的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因AtNHX1，并将其在拟南芥中超表达，与野生型相比，转基因植株幼苗在200mMNaCl处理中仍能正常生长发育，而野生植株型则出现黄化枯萎，叶面积变小，生长受抑；进一步分析发现，转基因植株叶片Na⁺含量比野生型植株的高。Zhang等(Zhang H X，Hodson J N，Williams J P，et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98：12832-12836)将AtNHX1转入油菜，发现超表达该蛋白的转基因油菜在200mM NaCl的环境中能够正常生长、开花和结实，但野生型生长严重受阻；分析结果表明，在高盐条件下，转基因油菜产量和油的品质不受影响。Gaxiola等(Gaxiola R A，Li J，Undurraga S，et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98：11444 11449)首次将带有35S启动子的AVP1基因转入拟南芥中，与野生型相比，发现AVP1蛋白含量显著增加的转基因植株幼苗在250mM NaCl中处理10天仍能正常生长发育，而野生植株型则出现黄化枯萎。Bao等(Bao A K，Wang S M，Wu G Q，et al.2009.PlantScience.176：232240)将拟南芥AVP1转入紫花苜蓿，与野生型相比，发现转基因紫花苜蓿的叶和根中积累了更多的Na⁺、K⁺和Ca²⁺，叶片具有更低的渗透势，其耐盐性和抗旱性也显著增强。这些研究结果表明：超表达液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因或液泡膜H⁺-PPase基因，的确可以促进转基因植株吸收大量的无机离子，尤其是把在细胞质中具有毒害效应的Na⁺区域化到液泡中作为有益的渗透调节剂，进而降低了细胞水势，促进了细胞的水分吸收，增加了组织保水性，从而使植物在水分亏缺或盐分胁迫下，表现出更强的抗旱性和耐盐性。

此外，超表达拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因和H⁺-PPase基因还可以增加转基因植物的生物量。He等(He C X，Yan J Q，Shen G X，et al.2005.Plant Cell Physiol.46：1848-1854)在棉花中超表达AtNHX1，发现转基因植株在200mM NaCl处理下，不但生物量增加，棉纤维更多；而且转基因棉花的光合速率和氮同化速率也比非转基因植株强。此外，在大田实验中，转基因棉花同样能够生产更多、质量更好的棉纤维。过量表达AtNHX1的转基因小麦也具有更高的产量。Li等(Li J，Yang H，Peer W A，et al.2005.Science.310：121125)发现，液泡膜H⁺-PPase还可控制生长素的运输、进而影响植物的生长发育，如超表达AVP1可提高生长素的运输效率，加快细胞的分裂和植物器官的形成及增生，和野生型相比，H⁺-PPase转基因植物具有更多的叶片和更发达的根系，生物量提高60％；相反，avp1-1缺失突变体由于生长素运输效率的降低，导致根和地上部发育受到严重抑制，其生物量大大减少。值得一提的是，植物根系发达意味着可从更多的土体中吸收矿质营养和水分，因此可增加其耐贫瘠性和抗旱性。

长期以来培育高产、抗逆境等优良性状兼具的植物品种是每一个从事植物遗传改良科学家的共同愿望。然而，目前的植物基因工程多是通过转化单个外源基因来改良植物单一性状。虽然，理论上可以通过反复多次将多个基因导入同一生物体中或先将不同基因转化两亲本，再把获得的转基因纯系杂交获得聚合多个目标基因的转基因植物；但是，考虑到转基因的位置效应和基因表达的稳定性，不同基因间易发生分离或诱发沉默，因而其在实践中耗时长，筛选困难，难度较大。因此，本发明的目的是：实现通过一次转化即可获得双价基因的转化植物，从而大大加速作物遗传改良育种的进程。本发明提供的转基因载体在获得抗旱耐盐增产转基因植物方面的应用，其为本发明的优选应用。

发明内容：

本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种强耐盐抗旱植物的培育方法，实现强旱生荒漠植物霸王的两个具有协同耐盐抗旱功能的基因--液泡膜H⁺-PPase基因ZxVP1-1和Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX--聚合，通过一次转化即可使它们在转化植物品种(系)中连锁超表达，从而获得比转单一基因更强的强耐盐抗旱植物新品种(系)。

本发明采取的技术方案为：一种强耐盐抗旱植物的培育方法，其主要特点在于，包括以下步骤：

(a)将能把Na⁺从细胞质中区域化到液泡中的液泡膜钠氢逆向转运蛋白Na⁺/H⁺antiporter基因，以及能为液泡膜钠氢逆向转运蛋白提供质子驱动力并提高生长素运输效率的液泡膜氢焦磷酸酶H⁺-PPase基因转化到目标植物的细胞中，并使所述基因在植物细胞中超表达；

(b)从步骤(a)获得的所述植物细胞再生出植物，并选育出耐盐抗旱性较野生型强的株系以培育新品种/系。

所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，步骤(a)所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因均来自对荒漠极端环境具有很强适应性的中国特有种属植物霸王。

所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，步骤(a)所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因籍由同一表达载体导入目标植物细胞。

所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，获得的耐盐抗旱性较强的转基因细胞系或转基因植物及其后代和种子。

一种培育强耐盐抗旱植物的双价表达载体，其主要特点在于包括：

(a).含有强旱生植物霸王液泡膜钠氢逆向转运蛋白Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX；

(b).含有强旱生植物霸王液泡膜氢焦磷酸酶H⁺-PPase基因ZxVP1-1；

(a)和(b)所述基因均可独立在植物细胞中超表达。

所述的培育强耐盐抗旱植物的双价表达载体，含有所述所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因双价表达载体的宿主菌。

本发明的有益效果：①转双基因植物的耐盐抗旱性强于转单基因的植物；②大大加速了培育强耐盐抗旱植物的育种进程；③植物后代的耐盐抗旱性状稳定。本发明主要用于农作物和优良牧草的遗传改良，可以提高其耐盐、抗旱、抗寒和产量等性状，具有重要的社会、经济和生态效益。

虽然通过两个基因载体二次转化或共转化也能获得本发明所述的两个具有协同耐盐抗旱功能基因的的强耐盐抗旱植物新品种(系)，但此种获得强耐盐抗旱植物新品种(系)方式不但耗时耗力，而且因两个基因独立插入植物不同染色体或同一染色体不同位置而不能连锁，因此所获得强耐盐抗旱植物新品种(系)后代的性状易于分离和流失。本发明加快了育种进程，防止了上述现象的发生。

通过本发明所述的表达载体可一次转化即获得转双基因的植物，且所述两个功能相关基因将会在转基因植物中连锁并协同表达：其一，转双基因植物的耐盐抗旱性强于转单基因的植物；其二；大大加速了培育强耐盐抗旱植物的育种进程；其三，植物后代的耐盐抗旱性状稳定。

附图说明：

图1：霸王液泡膜H⁺-PPase基因ZxVP1-1一价表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1的构建流程。

图2：表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1构建过程的电泳检测；其中：M：DNA Marker III；1：以霸王cDNA为模板的PCR扩增ZxVP1-1基因ORF框；2：PCR检测pMD 19-T-ZxVP1-1载体；3：PCR检测pCAMBIA1302-ZxVP1-1。

图3：植物表达载体pCAMBI A1300RBS的改造由来：由植物表达载体pCAMBIA1300和克隆载体pUC19-35S-FLAG-RBS构建中间载体pCAMBIA1300MV的流程；

图4：由中间载体pCAMBIA1300MV和克隆载体pUC19-35S-FLAG-RBS构建植物表达载体pCAMBIA1300RBS的流程。

图5：霸王液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX一价表达载体pCAMBIA1300RBS-ZxNHX的构建流程。

图6：表达载体pCAMBIA1300RBS-ZxNHX构建过程的电泳检测；其中：M：DNA Marker 200Ladder；1：以霸王cDNA为模板的PCR扩增ZxNHX基因ORF框；2：PCR检测pMD19-T-ZxNHX载体；3：PCR检测pCAMBIA1300RBS-ZxNHX。

图7：霸王液泡膜H⁺-PPase基因ZxVP1-1和液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX的双价植物表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX的构建流程。

图8：表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX的构建PCR检测；其中：M：DNA Marker III；1：以含有pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX载体的大肠杆菌DH5a扩增ZxVP1-1的菌体PCR；2：以含有pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX载体的大肠杆菌DH5a扩增ZxNHX的菌体PCR。

具体实施方式：

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：霸王H⁺-PPase基因一价表达载体的构建，见图1、图2。

液泡膜H⁺-PPase在植物细胞代谢中具有重要的功能，如调节胞质和液泡的pH、清除各种代谢途径的副产物PPi、参与Na⁺、K⁺等溶质向液泡内运输，降低细胞的渗透势，进而提高细胞的耐盐抗旱性；此外，植物细胞中超表达该核酸分子还可促进生长素的运输效率，导致细胞加快分裂和增生，使植物根系更加茁壮和叶片更加繁茂，因而使植株可以耐贫瘠的土壤和增加生物量。本发明人根据已知的霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1(GeneBank：EU103625)的序列设计酶切位点引物，以霸王叶总RNA为模板，采用RT-PCR方法，扩增出ZxVP1-1基因ORF框，胶回收后连接到pMD19-TSimple Vector载体。测序确认正确后，将含有ZxVP1-1基因ORF框的pMD19-T-ZxVP1-1载体酶切回收，并将回收到的产物正确无误地插入二元载体pCAMBIA1302以获得一价表达载体，并将其命名为pCAMBIA1302-ZxVP1-1。

具体的构建方法如下：

(1)根据分离得到的霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1核苷酸序列设计引物：上游引物：

5’-CCATGGTTGTGAAGATGGGTCAGGTGAAAGATAGCC-3’

下游引物：

5’-TTACCGTGTATGTGTAGACTGTAGAGCAATGGC-3’。

以叶总RNA反转录成cDNA为模板，进行PCR反应，扩增该基因完整的开放阅读框(ORF)。

(2)取5μl PCR纯化产物与pMD19-T Simple Vector载体连接，操作步骤按大连宝生物公司“pMD19-T Simple Vector”说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5a，在表面涂有40μl X-gal(20mg/ml)、4μl IPTG(200mg/ml)的含有Amp(50μg/ml)的LB平板上37℃使之过夜培养。用牙签从转化平板上随机挑取白斑单菌落，在装有1ml LB+Amp(50μg/ml)的1.5ml离心管中37℃培养8-10小时。碱裂解法提取质粒DNA，进行序列测定。

(3)用限制性内切酶NcoI和PspEI将霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1 ORF框从pMD19-T-ZxVP1-1载体上切下，与相同酶切的pCAMBIA1302二元表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确。实施例2：植物表达载体pCAMBIA1300RBS的改造由来(图3、图4)

本发明需要对现有存在的载体进行改造，以便能够顺利实现本发明所述双价植物表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX的构建，其具体改造过程如下：

(1)将含有植物表达载体pCAMBIA1300和克隆载体pUC19-35S-FLAG-RBS的大肠杆菌DH5a分别接种到含有Kan(50μg/ml)和Amp(50μg/ml)的LB液体培养基的不同蜗牛瓶中37℃培养8-10小时。碱裂解法抽提质粒DNA。

(2)用限制性内切酶EcoRI和SacI将CaMV35S序列从克隆载体pUC19-35S-FLAG-RBS上切下并将其小片段回收，然后与相同酶切的pCAMBIA1300载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对阳性菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确并将得到的中间载体命名为pCAMBIA1300MV。

(3)用限制性内切酶PstI和HindIII将rbs-s-3’序列从克隆载体pUC19-35S-FLAG-RBS上切下并将其小片段回收，然后与相同酶切的pCAMBIA1300MV载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对阳性菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确并将得到的中间载体命名为pCAMBIA1300RBS。

实施例3：霸王Na⁺/H⁺antiporter基因一价表达载体的构建，见图5、图6。

液泡膜Na⁺/H⁺antiporter在植物细胞代谢中具有重要的功能，如调节胞质和液泡的pH、参与Na⁺向液泡内运输，降低细胞的渗透势，进而提高细胞的耐盐抗旱性；此外，植物细胞中超表达该核酸分子还可使作物增产。本发明人根据已知的霸王液泡膜Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX(GeneBank：EU103624)序列设计酶切位点引物，以霸王叶总RNA为模板，采用RT-PCR方法，扩增出ZxNHX基因ORF框，胶回收后连接到pMD19-T Simple Vector载体。测序确认正确后，将含有ZxNHX基因ORF框的pMD19T-ZxNHX载体酶切回收，并将回收到的产物正确无误地插入二元载体pCAMBIA1300RBS以获得一价表达载体，并将其命名为pCAMBIA1300RBS-ZxNHX。其具体的构建方法如下：

(1)根据分离得到的霸王Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因ZxNHX核苷酸序列设计引物：

上游引物：5’-GGATCCTGAGGATTGACTCGGAAAGG-3’；

下游引物：5’-CGATTGTCGACCAGGCACGAAGATCTG-3’；

以叶总RNA反转录成cDNA为模板，进行PCR反应，扩增该基因完整的开放阅读框(ORF)。

(2)取5μl PCR纯化产物与pMD19-T Simple Vector载体连接，操作步骤按大连宝生物公司“pMD19-T Simple Vector”说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5a，在表面涂有40μl X-gal(20mg/ml)、4μl IPTG(200mg/ml)的含有Amp(50μg/ml)的LB平板上37℃使之过夜培养。用牙签从转化平板上随机挑取白斑单菌落，在装有1ml LB+Amp(50μg/ml)的1.5ml离心管中37℃培养8-10小时。碱裂解法提取质粒DNA，进行序列测定。

(3)用限制性内切酶BamHI和SalI将霸王Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因ZxNHXORF框从pMD19-T-ZxNHX载体上切下，与相同酶切的pCAMBIA1300RBS二元表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确。实施例4：霸王H⁺-PPase和Na⁺/H⁺antiporter基因双价表达载体的构建，见图7、图8。

其具体的构建方法如下：

(1)将含有pCAMBIA1302-ZxVP1-1和pCAMBIA1300RBS-ZxNHX载体的大肠杆菌DH5a分别接种到含有Kan(50μg/ml)LB液体培养基的不同蜗牛瓶中37℃培养8-10小时。碱裂解法抽提质粒DNA。

(2)用限制性内切酶EcoRI和HindIII将CaMV35S-ZxNHX-rbs-s-3’序列从一价表达载体pCAMBIA1300RBS-ZxNHX上切下并将其小片段回收，然后与相同酶切的pCAMBIA1302-ZxVP1-1表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确。

(3)将构建好的载体命名为pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX，电转化到根癌农杆菌GV3101。电转化条件为：C＝25μF；PC＝200ohm；V＝2.4kV

实施例5：一种培育强耐盐抗旱植物的方法，其特征包括如下步骤：

(1)构建霸王液泡膜H⁺-PPase和Na⁺/H⁺antiporter基因的双价表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX；

(2)将(1)步骤的双价表达载体转入根癌农杆菌，以获得转基因用工程农杆菌；

(3)通过(2)步骤的工程农杆菌将(1)步骤的双价表达载体中的所含基因转入植物细胞或组织或种子；

(4)将(3)步骤植物细胞或组织或者种子进行植株再生，其中转基因植株与野生型植株相比耐盐抗旱性提高或其它性状发生改良。

本发明所述植物表达载体载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1-ZxNHX的基因适合在所有植物细胞中表达。因此，本发明的载体并不限制植物的类型，它们可以是单子叶植物、双子叶植物；可以是种子植物、裸子植物；也可以是苔藓类、蕨类、藻类和高等植物；也可以是经济作物、粮食作物、牧草、花草树木等。本发明优选比较重要的植物有马铃薯、番茄、芸薹、棉花、向日葵、草莓、菠菜、莴苣、水稻、大豆、水稻、棉花、玉米、小麦、黑麦草、大麦、滨藜、碱篷、燕麦、大麦、啤酒花、甘蔗、苜蓿、百脉根、羊茅、高羊茅、早熟禾、三叶草、箭舌豌豆、向日葵、甜菜、胡椒、烟草、西瓜、西葫芦、豌豆、可可、大麻、咖啡、葡萄、漆树、桦树、松树、橡树、杨树、康乃馨、玫瑰、花生、油菜、甜菜、柳枝稷、木薯和藻类等。此外，可以根据不同的植物使用不同的转化方法，如农杆菌介导、基因枪、显微注射、电穿孔、聚乙二醇、磷酸钙共沉淀等方法获得本发明基因的转基因植株。

实施例6：耐盐抗旱增产转基因作物的获得的方法

以农杆菌介导的途径获得本发明的转基因百脉根：

(1)无菌苗的获得：将籽粒饱满的百脉根种子洗净后用70％乙醇振荡消毒3-5分钟，0.1％升汞振荡灭菌1-2min，无菌水冲洗3-5次；在含无菌水的三角瓶中24℃黑暗吸胀过夜，之后接种于铺有无菌滤纸的培养皿中24℃暗培养1天，然后再接种至MS培养基上培养5-7天(光周期为16时/天，光照强度为200μmol/m²·s，温度为24℃)，即可获得无菌苗。

(2)侵染菌液的制备：挑取鉴定好的根癌农杆菌GV3101加入含有50mg/LKan的YM液体培养基中，置28℃恒温摇床中，180rpm暗培养36小时至对数生长期(OD₆₀₀值为0.6-0.8)；4000rpm离心5分钟收集菌体，然后再加入适量的无菌B5液体培养基重悬浮工程菌，使达到最佳侵染浓度(OD₆₀₀＝0.5)。

(3)浸染外植体的获得：将萌发5-7天的百脉根无菌苗的子叶(带叶柄)切成小块并接到分化培养基上(B5+0.5mg/L 6-BA)，黑暗条件下预培养3-4天。

(4)侵染：将预培养的外植体放入制备好侵染菌液中，轻轻摇动，使外植体与农杆菌充分接触20分钟。

(5)共培养：将上述侵染过的外植体放在灭菌滤纸上吸干多余的菌液之后，接到分化培养基上(B5+0.5mg/L 6-BA)，在黑暗条件下共培养3天。

(6)脱菌：将共培养后的外植体转移至含300mg/L Carb的分化培养基(B5+0.5mg/L 6-BA)上，24℃光照培养20天，中间继代一次。

(7)抗性胚选择：将上述脱菌分化的外植体转移至含有10mg/L潮霉素(Hyp)的分化培养基中筛选2-3周，获得抗性芽点。

(8)将抗性芽点移至生根培养基中使其生根，获得抗性转化植株。

(9)对抗性植株进行RT-PCR检测，确保获得转基因苗。

(10)对转基因植株进行生理生化分析，确保优良性状后，进行大田试验和新品种培育。

目前已获得转基因抗性苗。与野生型植株比较，转基因百脉根植株具有根系发达、茎秆粗壮、分裂枝条多、叶面积较大，株形较高等形态上的优良性状。需要指出的是，本发明的载体并不限于对百脉根的遗传转化。

由于MS培养基、YM液体培养基、B5液体培养基和B5固体培养基的配方为本领域的技术人员所熟知，因此不再赘述。至于分化培养基和生根培养基，其分别是0.5mg/L 6-BA的B5固体培养基和0.05mg/L NAA的1/2MS固体培养基。

实施例7：生态恢复与环境保护

目前全球有大面积植物难以生长的盐渍化荒漠地区。这些地区生态环境恶劣，土壤贫瘠，气候干旱或伴有不同程度的干旱。基于此，可以将本发明的基因转化到适宜的地方植物中，然后将耐盐抗旱的转基因植物在这些地区种植，一方面可以在一定程度上恢复当地的植被盖度，防止荒漠化继续扩大；另一方面可以改良土壤，如增加土壤有机质，疏松土壤结构，增加土壤微生物活性和多样性等。

由于温室气体引起的全球气候变化给人类的发展带来了很多不确定的因素，如海平面的大幅上升，气候的变迁、极端气候的频发等，因此CO₂的减排问题成为各国政府、科学界和民众的关注焦点。在这一背景下，碳税产业也迅猛发展。因此，有些高排放量的企业可在干旱、盐渍、贫瘠的土地上大量种植具有本发明的耐受性的转基因植物，以固定空气中的CO₂，将在防止全球气候变暖方面具有积极重要的意义。

上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种强耐盐抗旱植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将能把Na⁺从细胞质中区域化到液泡中的液泡膜钠氢逆向转运蛋白Na⁺/H⁺antiporter基因，以及能为液泡膜钠氢逆向转运蛋白提供质子驱动力并提高生长素运输效率的液泡膜氢焦磷酸酶H⁺-PPase基因转化到目标植物的细胞中，并使所述基因在植物细胞中超表达；

(b)从步骤(a)获得的所述植物细胞再生出植物，并选育出耐盐抗旱性较野生型强的株系以培育新品种/系。

2.如权利要求1所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，其特征在于步骤(a)所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因均来自强旱生荒漠植物霸王。

3.如权利要求1所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，其特征在于步骤(a)所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因籍由同一表达载体导入目标植物细胞。

4.如权利要求1所述的强耐盐抗旱植物的培育方法，其特征在于获得的耐盐抗旱性较强的转基因细胞系或转基因植物及其后代和种子。

5.一种培育强耐盐抗旱植物的双价表达载体，其特征在于包括：

(a).含有强旱生植物霸王液泡膜钠氢逆向转运蛋白Na⁺/H⁺antiporter基因ZxNHX；

(b).含有强旱生植物霸王液泡膜氢焦磷酸酶H⁺-PPase基因ZxVP1-1；

(a)和(b)所述基因均可独立在植物细胞中超表达。

6.如权利要求5所述的培育强耐盐抗旱植物的双价表达载体，其特征在于含有所述所述的液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因和液泡膜氢焦磷酸酶基因双价表达载体的宿主菌。

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