WO2015042736A1 - 一种木榄叶泡焦磷酸酶vp1及其编码基因与应用 - Google Patents

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WO2015042736A1
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王建胜
梁远金
王君丹
陈淼
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创世纪转基因技术有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the present invention relates to plant proteins and their coding genes and applications, and more particularly to a leaf vesicular pyrophosphatase VP1 derived from the genus Prunus chinensis and its coding gene, and its use in the cultivation of transgenic plants having improved salt tolerance.
  • Salt stress is one of the most important abiotic stress hazards in agricultural production in the world. Salted soil is usually dominated by sodium salt, calcium salt or magnesium salt, and is a major factor affecting plant growth and causing food and economic crop yield reduction. The world's saline-alkali soil covers an area of about 400 million hectares, accounting for one-third of the irrigated farmland.
  • Saline-alkali land is widely distributed in China, and the existing saline-alkali land area is about 0.4 million hectares. With the increase of population in China and the reduction of cultivated land, the development and utilization of saline-alkali resources has extremely important practical significance.
  • the improvement of plant resistance to salt and alkali and the selection of plant species or strains suitable for growth on saline-alkali land with high economic and ecological value are economical and effective measures to utilize saline-alkali land.
  • most plants are poorly tolerant to saline and can only grow on soils with a sodium chloride content of less than 0.3%. Excess Na + in the soil will normalize the growth and metabolism of plants. Produces a toxic effect. Therefore, how to increase crop yield in a salted environment has become a very important issue in agricultural production worldwide.
  • the salt tolerance of plants is a very complex quantitative trait, and its salt tolerance mechanism involves various levels from plants to organs, tissues, physiology and biochemistry to molecules.
  • scientists from various countries have also done a lot of work for this purpose, and have made a lot of new progress, especially in the use of the model plant Arabidopsis to study the salt-tolerant molecular mechanism of plants, which has made a breakthrough in the research in this field ( Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 201 1.
  • the first aspect of the present invention provides a gene encoding the Phyllostachys pubescens VP1 (designated herein as BgVP1) having the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a second aspect of the present invention provides a recombinant expression vector comprising the gene of the first aspect of the present invention, which is obtained by inserting the gene into an expression vector, and the nucleotide sequence of the gene
  • the expression control sequence of the recombinant expression vector is operably linked; preferably, the expression vector is pCAMBIA2300 ; preferably, the recombinant expression vector is the 35 S-Bg VPJ-2W0 vector shown in FIG.
  • a third aspect of the invention provides a recombinant cell comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention; preferably, the recombinant cell is a recombinant Agrobacterium cell.
  • a fourth aspect of the invention provides a method for improving salt tolerance of a plant, comprising: introducing the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention into a plant or plant tissue and expressing the gene
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a fifth aspect of the invention provides a method for producing a transgenic plant, comprising: cultivating a plant or plant tissue comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention under conditions effective to produce a plant
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a sixth aspect of the present invention provides the gene according to the first aspect of the present invention, the recombinant expression vector of the second aspect of the present invention or the recombinant cell of the third aspect of the present invention for improving salt tolerance of a plant and for use in plant breeding Use;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a seventh aspect of the invention provides the protein encoded by the gene of the first aspect of the invention, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • Figure l is a plasmid map of the plant expression vector (35S-BgVPl-2300) of the Sg P gene.
  • Fig. 3 shows the results of salt tolerance test of T1 Arabidopsis thaliana plants transgenic with BgVPJ gene, Tlo5 showed significant salt tolerance, and the results of Tlo9 and Tlol l were similar thereto, and are not shown here.
  • Figure 4 shows the results of molecular level detection of the transcription level of the BgVPJ gene in T1 transgenic Arabidopsis plants and non-transgenic control plants by reverse transcription PCR.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000)
  • 1-7 is salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plants (three strains belonging to Tlo5, Tlo9, and Tlol, respectively)
  • 8-11 are non-transgenic control Arabidopsis plants.
  • Mulan was collected from Futian National Nature Reserve, Shenzhen, Guangdong province ( ⁇ 22° 53 ', E114° 01 ').
  • the P. guiem gymnoirhi hypocotyls with no pests, well-developed and mature levels were collected, and hypocotyls of similar size, length and weight were selected for the experiment.
  • plastic buckets (bottle diameter 18 cm, height 15 cm)
  • the bottom of each bucket is padded with plastic trays
  • the fine sand is river sand
  • the average particle size is about 1 mm
  • tap water is washed
  • each small barrel is planted with hypocotyls. 4.
  • Invitrogen extracts total RNA.
  • the absorbance of total RNA at 260 nm and 280 nm was measured by HITACHI's UV spectrophotometer U-2001.
  • the OD 260 / OD 280 ratio was 1.8-2.0, indicating that the total RNA purity was higher; 1.0% agarose was used to coagulate.
  • Gel electrophoresis detected the integrity of total RNA.
  • the 28S band was approximately twice as bright as the 18S band, indicating good RNA integrity.
  • mRNA was isolated using Qiagen's Oligotex mRNA Purification Kit (purified polyA+ RNA from total RNA).
  • Two tester cDNAs with different adaptors were mixed with excess Driver cDNA for the first forward subtractive hybridization.
  • the products of the two first forward subtractive hybridizations were mixed, and a second forward subtractive hybridization was performed with the newly denatured Driver cDNA, and the differentially expressed genes were amplified by two inhibitory PCR amplifications (PCR). Before, the second forward subtractive hybridization product is end-filled).
  • the second inhibitory PCR amplification product of the second forward subtractive hybridization cDNA fragment (purified using QIAquick PCR Purification Kit, purchased from Qiagen) according to the instructions of the pGEM-T Easy kit (purchased from Promega)
  • the specific steps are linked to the pGEM-T Easy vector as follows: The following components are sequentially added to the 200 l PCR tube: Purified combined positive subtractive hybridization cDNA fragment second inhibitory PCR product 3 ⁇ 1 , 2 X T4 DNA ligase buffer 5 ⁇ l, pGEM-T Easy vector 1 ⁇ l, ⁇ 4 DNA ligase 1 ⁇ l, ligated overnight at 4 °C.
  • E. coli JM109 competent cells purchased from TAKARA
  • ice bath for 30 minutes heat shock for 60 seconds
  • ice bath for 2 minutes heat shock for 60 seconds
  • 250 l LB liquid medium was added.
  • tryptone purchased from OXOID
  • yeast extract purchased from OXOID
  • NaCl 1% NaCl
  • the nested PCR primers Primer 1 and Primer 2R (PCR-select TM cDNA Subtraction Kit from Clontech) were used to perform PCR amplification verification on the cultured cells, and 215 positive clones were obtained, and then all positive clones were sent.
  • Yingjie Jieji (Shanghai) Trading Co., Ltd. was sequenced.
  • sequence was SEQ ID No: 3.
  • Sequence analysis indicated that the protein encoded by the sequence belonged to leaf follicle phosphatase.
  • Sg P the full-length coding gene corresponding to the sequence of SEQ ID No: 3
  • VP1 the corresponding protein
  • BgVPl GSP 1 SEQ ID No: 4:
  • BgVPl GSP2 SEQ ID No: 5:
  • the AGGAAATTGA ACCAGCATTG AAG procedure was performed according to the kit instructions (3 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit purchased from Invitrogen).
  • the first round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 4 and the universal primer AUAP (provided with the kit), and the cDNA obtained by reverse transcription of the mRNA extracted by the salt treatment group was used as a template. Specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 4 and AUAP each 2.0 ⁇ ⁇ and 35 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes), 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water, and 2.0 ⁇ L was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out by using SEQ ID NO: 5 and the universal primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 lO X Ex Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 5 and P AUAP Each of 2.0 ⁇ 1 and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • BgVPl GSP3 SEQ ID No: 6:
  • BgVPl GSP5 SEQ ID No: 8:
  • the experimental procedure was performed according to the kit instructions (5 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit purchased from Invitrogen).
  • the cDNA obtained by reverse transcription of the mRNA extracted from the salt-treated group (reverse transcription primer SEQ ID NO: 6, dCTP plus tail) was used as a template.
  • the first round of PCR amplification the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 7 and P AAP each with 2.0 ⁇ l and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was diluted 50 times with double distilled water, and 2.0 ⁇ ⁇ was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 8 and the primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 lO X Ex Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 8 and P AUAP Each of 2.0 ⁇ 1 and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • a strip of about 800 bp fragment (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered from the second round of PCR product, and ligated into pGEM-T Easy vector, and then transformed into E. coli JM109 competent cells (the method is the same as above)
  • the transformed bacterial solution was applied to LB solid medium containing 50 ⁇ l of ampicillin and 40 ⁇ g of mL X-gaK 24 g/mL IPTG for screening. 10 white colonies were randomly picked and inoculated into LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C, glycerol was added to a final concentration of glycerol of 20% (volume ratio), and stored at -80 ° C. .
  • the Sg P full-length coding gene was cloned by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • the PCR reaction was carried out using TAKARA's PrimeSTAR HS DNA polymerase and the reverse-transcribed cDNA extracted from the roots of the salt-treated group.
  • 50 ⁇ 1 PCR reaction system 10 ⁇ 1 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR HS DNA polymerase, 10 ⁇ M primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 each of 2.0 ⁇ 1 and 30 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions Pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • PCR amplification product plus A tail 2.5 times the volume of absolute ethanol was added to the PCR product, placed at -20 ° C for 10 minutes, centrifuged, the supernatant was removed, air-dried, and then the resulting precipitate was dissolved in 21 ⁇ M of double distilled water. Then, 2.5 ⁇ l lO X Ex Buffer 0.5 ⁇ l 5 mM dATP, 1.0 l Ex Taq was added thereto. Reaction conditions: The reaction was carried out at 70 ° C for 30 minutes. The obtained 2300 bp DNA fragment was recovered (Omega recovery kit), and ligated into pGEM T-easy vector to obtain BgVP1-pGEM plasmid, and then the ligated product was transformed into E.
  • coli JM109 competent cells (method same as above) The transformed bacterial solution was applied to LB solid medium containing 50 g/mL ampicillin, 40 g/mL X-gal, 24 g/mL IPTG for screening. Ten white colonies were randomly picked and inoculated in LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin. After incubation at 37 °C overnight, glycerol was added to the final concentration of glycerol. 20% (by volume), -80 °C for storage.
  • SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 for bacterial liquid PCR amplification verification (reaction system and reaction conditions are the same as above), 9 positive clones were obtained, and 3 positive clones were selected and sent to Yingjiejie (Shanghai) Trade. Sequencing, the resulting sequence is SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the encoded protein is SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence of VP1 protein SEQ ID NO: 1
  • the plant binary expression vector pCAMBIA2300 (purchased from Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.) was selected as a plant expression vector, and the 35S promoter containing the double enhancer of the ⁇ gene was replaced with the Pnos promoter to reduce the expression of prion protein in plants. .
  • the 35S promoter and the Tnos terminator were selected as promoters and terminators of the BgVPI gene, respectively.
  • the construction flow chart is shown in Figure 1.
  • Pnos was amplified using the plant expression vector pBI121 plasmid (purchased from Beijing Huaxia Ocean Technology Co., Ltd.) using TAKARA's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • 50 l PCR reaction system 10 l 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 ⁇ 121 plasmid, 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR HS DNA polymerase, 10 ⁇ M primers SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO : 13 each of 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was digested with EcoRI, Bglll, and ligated into pCAMBIA2300 according to the kit instructions (Promega, T4 ligase kit) to obtain pCAMBIA2300-1.
  • Tnos was amplified using the primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 with the pBI121 plasmid as a template, using TAKARA's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was ligated by Kpnl, EcoRI digestion (Promega T4 ligase kit) to pCAMBIA2300-1 to obtain pCAMBIA2300-2.
  • TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA The 35S promoter was amplified using the primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 using the pCAMBIA2300 plasmid as a template.
  • TAKARA's PrimeSTAR HS DNA polymerase was used. 50 yl PCR reaction system: 10 ⁇ 1 5 X PS Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ l pCAMBIA2300 plasmid, 1.0 ⁇ l PrimeSTAR HS DNA polymerase, 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 16 and P SEQ ID NO: 17 each of 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds), 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was ligated by HindIII and Sail (connection method as above) to pCAMBIA2300-2 to obtain pCAMBIA2300-3.
  • TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGACT The full-length sequence of the Sg P-encoding gene was amplified with primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 (template was the positive BgVP1-pGEM plasmid obtained in Example 2), using TAKARA's PrimeSTAR HS DNA polymerase. 50 ⁇ ⁇ PCR reaction system: 10 l 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 BgVP1-pGEM plasmid, 1.0 ⁇ l PrimeSTAR HS DNA polymerase, 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 each of 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was ligated by Sall and Kpnl (connection method as above) to pCAMBIA2300-3, and the plant expression vector 35S-BgVPl-2300 was obtained after verification (Fig. 2).
  • Agrobacterium GV3101 (purchased from Shanghai Maiqi Biotechnology Co., Ltd.) Preparation of Competent Cells: Agrobacterium GV3101 was drawn on LB solid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 rifampicin and 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 gentamicin Single spot inoculation, culture at 28 °C for 1 to 2 days. Pick a single colony and inoculate 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 rifampicin and 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 gentamicin, and incubate overnight (about 12-16 hours) to OD 6 at 28 °C. . . A value of 0.4 forms a seed broth.
  • Transformation of Agrobacterium The GV3101 competent cells were thawed on ice, and 1 ⁇ M of the plasmid 35S-BgVPl-2300 obtained in Example 3 was added to 40 ⁇ M of the competent cells, and the mixture was mixed and ice-cooled for about 10 minutes. Transfer the mixture of competent cells after ice bath and 35S-BgVPl-2300 plasmid to a ice-cold 0.1 cm size electric shock cup (purchased from Bio-Rad) with a micropipette, tapping to bring the suspension to electric shock The bottom of the cup (be careful not to have bubbles). Place the electric shock cup on the slide of the electric shock chamber, and push the slide to place the electric shock cup to the base electrode of the electric shock chamber.
  • a ice-cold 0.1 cm size electric shock cup purchased from Bio-Rad
  • Example 5 Receptor Material Arabidopsis Culture Select the vermiculite with good water absorption and soft soil to match the nutrient soil (1:1) as the soil for Arabidopsis planting. Using a 9 cm diameter pot, seeded 20-30 Arabidopsis seeds per pot (Columbia type, from the Arabidopsis Bioresources Center, Ohio State University). After sowing, the film is covered with a film to provide a moist environment for plant growth. The temperature was 22 V, the light intensity was 3500-4000 lx, the photoperiod was 12 hours dark/12 hours light culture, and 1/2 MS liquid medium was watered every 7 days.
  • the GV3 101 Agrobacterium liquid of the transformed 35 S-BgVP l -2300 expression vector obtained in Example 4 was inoculated to contain rifampicin containing 50 g/ml, 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 gentamicin, 50 g/ml.
  • Kanamycin was cultured overnight in LB liquid medium, and inoculated 1:50 in the morning to 50 g/ml rifampicin, 50 g/ml gentamicin, 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 kanamycin In the new LB medium (1L), the culture is carried out for about 8 hours, and the Agrobacterium liquid OD 6QQ is between 1.0 and 1.2.
  • Seed disinfection Soak for 10 minutes with 70% ethanol, and occasionally suspend the seeds; then wash with sterile water four times, and occasionally suspend the seeds. Then, the treated seeds were uniformly coated on the surface of 1/2MS solid screening medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 kanamycin (a maximum of 1500 seeds were seeded in a 150 mm diameter plate), and vernalized at 4 °C. After 2 days, it was cultured for 7-10 days at a constant temperature of 22 ° C, an illumination intensity of 3500-4000 k, and a photoperiod of 12 hours of darkness/12 hours of light. After germination of the transgenic seeds on the screening medium for 2 weeks, the plants capable of germination and normal growth were transferred to soil for further cultivation.
  • the transgenic Arabidopsis thaliana and the control Arabidopsis thaliana each of the plants in Example 8 were left untreated, and 1/2 MS liquid medium was normally poured, and one pot of each plant was irrigated with 1/2 MS liquid medium containing 150 mM NaCl.
  • the temperature was 22 ° C
  • the light intensity was 3500-4000 k
  • the 12-hour light culture/12-hour dark culture cycle and the experimental results were observed after 14 days.
  • the salt tolerance of T1 transgenic plants (plants grown from seeds of T0 transgenic plants) showed that the T1 transgenic plants Tlo5, Tlo9, Tlol l showed significant salt tolerance (see Figure 3, The results of Tlo5, Tlo9, Tlol l are similar, not shown here).
  • Example 10 Validation of Sg P gene expression at the transcriptional level
  • Example 9 Seven of the T1 transgenic plants with good salt tolerance in Example 9 were randomly selected (one of the three salt-tolerant strains of Tlo5, Tlo9, and Tlol, respectively), and the control plants in Example 9 were randomly selected from 4 plants. Total leaves of 0.05 g were treated with salt (150 mM NaCl) for 14 days, and total RNA was extracted using a plant RNA extraction kit (Invitrogen). The absorbance values of total RNA obtained at 260 nm and 280 nm were determined by ultraviolet spectrophotometry, and the respective RNA concentrations were calculated.
  • Reverse transcription was carried out according to the method shown by Invitrogen reverse transcription assay [J box Superscript III Reverse Transcriptase, and 1 total RNA was used as a template for reverse transcription.
  • primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 20: GACCTAAATG CAGTGATAAA AGO amplification ⁇ Sg P fragment, detection Its transcription.
  • Amplification of the AtACT2 fragment using the primers SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO: 21: 5-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3) and SEQ ID NO: 22 (SEQ ID NO: 22: TTCTCGATGGAAGAGCTGGT) ( Arabidopsis housekeeping gene: http: ⁇ www.ncbi.nlm.
  • PCR reaction was carried out using the Ex DNA polymerase of TAKARA and using the cDNA obtained by the above reverse transcription as a template.
  • 50 ⁇ l ⁇ Reaction system 5 ⁇ ⁇ Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ cDNA, 0.3 ⁇ Ex DNA polymerase, 10 ⁇ primer SEQ ID NO: 10 and P SEQ ID NO: 20 each 2.0 ⁇ l, and 35.7 ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 30 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the electrophoresis results of the PCR products are shown in Figure 4: 1-7 is a salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plant (three strains belonging to Tlo5, Tlo9, and Tlol1, respectively). 8-11 is a non-transgenic control Arabidopsis plant.
  • the results showed that BgVPJ was significantly transcribed in salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plants, and BgVP1 was not transcribed in non-transgenic control Arabidopsis plants.

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Abstract

提供了一种来源于木榄的叶泡焦磷酸酶VP1，其编码基因，以及该基因在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

Description

一种木榄叶泡焦磷酸酶 VP1及其编码基因与应用
技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一种来源于木榄的叶泡焦 磷酸酶 VP1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。 背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、 钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重 要的现实意义。而植物抗盐碱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生 态价值的植物种或品系的选育， 则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大多数农作 物来说，大多数植物对盐碱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0.3%以下的土壤上， 土壤中过量的 Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。 因此如何在盐渍环境 下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。 各国的科学家也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展， 特别在利用模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面， 使该领域的研 究有了突破性的进展 ( Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 201 1. Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ) 。 高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化， 从而将胞外的信号传递到胞内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞 核内激活转录因子。 激活转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表达， 从 而提高植物的耐逆性。 尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究， 但由于其机制十分 复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清楚。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆了一种木榄叶泡焦磷酸酶（本文命名为 VP1 )的编码基因， 并测定了其 DNA 序列。 并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后， 可显著改善转基因植 株的耐盐性， 而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供一种木榄叶泡焦磷酸酶 VP1 的编码基因 （本文命名为 BgVPl ) ， 其序列为 SEQ ID NO : 2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的， 并且所述基因的核苷酸序列与 所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述表达载体是 pCAMBIA2300 ; 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35 S-BgVPJ-2W0载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将本发明第一方面所 述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条 件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的 植物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组 表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育 种的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO : 1所示。
附图说明 图 l ^Sg P 基因的植物表达载体 （35 S-BgVP l -2300 ) 构建流程 （图 la-lb ) 。 图 2¾Sg P 基因的植物表达载体 （35S-BgVPl-2300 ) 的质粒图。
图 3是转 BgVPJ基因的 T1代拟南芥植株的耐盐实验结果， Tlo5表现出显著的耐 盐性， Tlo9、 Tlol l的结果与其类似， 在此未示出。
图 4为利用反转录 PCR对 T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中 BgVPJ基 因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-7为 耐盐 T1代转基因拟南芥植株 （分别属于 Tlo5、 Tlo9、 Tlol l三个株系）， 8-11为非 转基因对照拟南芥植株。 具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出 于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。
以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 在本发明中， 如果没有注明并且在上下文中没有歧义， 比例和百分比是基于重量计 算的。 实施例 1. 盐胁迫下木榄 SSH文库构建：
具体方法为：
按照 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法 通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（抑制差减文库） 。 在实验过程中以盐处理的木 榄根中提取的 mRNA作为样本（Tester) ， 以未处理的木榄根中提取的 mRNA作为对 照 （Driver) 。 具体步骤如下：
( 1 ) 供试材料：
木榄采自广东省深圳市福田国家级自然保护区 （Ν22° 53 ' ， E114° 01 ' )。 采集无 虫害、 发育良好、成熟程度接近的木榄 B guiem gymnoirhi 胚轴， 选取大小、 长度、 重量接近的胚轴用于实验。 在塑料桶 （盆口径 18 cm, 高 15 cm) 中沙培， 每个桶底部垫 塑料托盘， 细沙为河沙， 平均粒径约为 l mm， 自来水洗净， 每个小桶种植胚轴 4个。 在 28°C， 自然光照 12小时每天的条件下萌发生长苗木培养期间， 每天浇适量的自来水补充 水分，并且每一周浇一次 Hoagland营养液 (D.R. Hoagland and D.I. Arnon. The water-culture method of growing plants without soil. Calif. Agr. Expt. Sta. Circ. 347. 1950)。
( 2 ) 材料处理： 选择生长发育外观一致 （幼苗高度一致、 每株幼苗长至 6片叶子） 的木榄幼苗， 分成两组， 一组浇 2L 500 mM NaCl， 一组浇 2L蒸熘水， 处理时间为 6小时。 收集处 理组和对照组的根。 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。
( 3 ) 总 RNA提取：
分别取对照组和盐处理组的木榄根各 3.0 g， 用植物 RNA 提取试剂盒 （购自
Invitrogen)提取总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较高; 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2 倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。
( 4 ) 抑制差减杂交：
按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进 行抑制差减杂交。 先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录（反转录引物为试剂 盒所提供引物） ， 得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA禾 P 2 μ g Driver cDNA作 为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5 小时， 然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA 不连接头。 两种连有不同接头的 Tester cDNA 分别与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将两种第一次正向差减杂交的产物混合， 再 与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交， 通过两次抑制性 PCR扩增富集 差异表达基因的片段 （PCR进行前， 将第二次正向差减杂交产物进行末端补平） 。
( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定
依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书， 将所述第二次正向差减杂 交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯 化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 在 200 l PCR管中 依次加入下列成分： 纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接 酶 1 μ 1， 于 4°C连接过夜。 然后取 10 μ ΐ连接反应产物， 加入到 100 μ ΐ大肠杆菌 JM109感受态细胞（购自 TAKARA)中， 冰浴 30分钟、 热休克 60秒、 冰浴 2分钟， 然后加入 250 l LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5% 酵母提取物 （Yeast Extract, 购自 OXOID ) 和 1% NaCl (购自国药）） 后置于 37°C摇 床中， 以 225 rpm振荡培养 30分钟， 然后从中取 200 μ 1菌液接种于含 50 μ g/ml氨 苄青霉素、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷） 的 LB (同上） 固体 （1.5%琼脂， 下同） 培养板上 （X-gal 和 IPTG均购自 TAKARA) ， 37°C培育 18小时。 计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白 色及蓝色菌落， 随机挑取 300个白色菌落 （编号： Bg-SR-001至 Bg-SR-300) 。 将所 挑取白色菌落分别接种于 96孔细胞培养板 （CORNING) 中的含 50 μ g/ml氨苄青霉 素的 LB液体培养基 （同上） 中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积 比）， 然后于 - 80°C保存备用。 使用巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech 公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒） 对所培养的菌液分别进行 PCR扩 增验证， 得到 215个阳性克隆， 然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海） 贸易有限公 司测序。
( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：
将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 198个有效 表达序列标签 （Expressed Sequence Tag, EST) (Unigene) 。 实施例 2 木榄叶泡焦磷酸酶编码基因 BgVPI的克隆
将所述鉴定的木榄 SSH文库中编号为 Bg-SR-091的克隆子去掉冗余 DNA后， 序列 为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白属于叶泡焦磷酸酶。 本文将 SEQ ID No: 3序列对应的全长编码基因命名为 Sg P , 其对应的蛋白命名为 VP1。
SEQ ID No: 3：
1 ACTATAAGTC TGACTGGGAG GGCCTATTTG AGTCAATTAC TGGTTATGGT CTTGGAGGGT
61 CATCCATGGC TCTCITTGGA AGGGTTGGTG GTGGCATTTA TACCAAAGCT GCTGATGTTG 121 GTGCTGATCT TGTTGGAAAG GTTGAAAGAA ACATCCCAGA AGATGACCCT AGAAACCCAG 181 CTGTCATTGC CGACAATG T GGTGATAATG TTGGTGATAT TGCAGGCATG GGGTCTGATC 241 T TTCGGCTC ATATGCTGAA TCATCATGTG CTGCCCTTGT TGTCGCCTCT ATCTCCTCTT 301 TTGGAGTCAA CCATCAATTC ACTCCCATGC TATATCCTCT TCTCATTAGT TCTGTGGGTA 361 TCCTTGTTTG TTTGATTACA ACCCTCTTTG CAACCGAC T CTTTGAAATC AAGGCCGTAA 421 AGGAAATTGA ACCAGCATTG AAGAAGCAGC TTATCATCTC CACTATTCTA ATGACTGTGG 481 GAATTGCTAT TGTAACTTGG ATAAGTGTGC CATCTTCCTT TACCATCTAT AATTTTGGT
BgVPI全长编码基因的克隆
根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计如下两条特异性引物， 作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。
BgVPl GSP 1： SEQ ID No： 4：
TTGGAGTCAA CCATCAATTC ACTC
BgVPl GSP2: SEQ ID No: 5：
AGGAAATTGA ACCAGCATTG AAG 实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下：
50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4禾口 AUAP各 2.0 μ ΐ以及 35 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变 性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5 与通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1600 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自
OMEGA)， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细 胞中 （具体方法同上）， 并将转化后的菌液涂布于含 50 ^lmL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行 菌液 PCR扩增验证， 得 9个阳性克隆， 将 3个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易 有限公司测序， 获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。
根据已经获得的3^^ 基因片段， 设计如下三条特异性引物， 作为 5 ' RACE的 3 ' 端特异性引物。 BgVPl GSP3 : SEQ ID No: 6：
GAGTGAATTG ATGGTTGACT CCAA
BgVPl GSP4: SEQ ID No: 7：
CAACCTTTCC AACAAGATCA GCAC
BgVPl GSP5 : SEQ ID No: 8：
CCTTCCAAAG AGAGCCATGG ATG
实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以盐处理组木榄提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6， dCTP加尾） 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7禾 P AAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C 变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8 与引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
回收第二轮 PCR 产物中片段约为 800 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细 胞中 （具体方法同上）， 并将转化后的菌液涂布于含 50 ^lmL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增验证（反应体系及反应条件同上）， 得到 8个阳性克隆， 选取其中 3个克隆 送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。 所得的 5'RACE产物克隆测序后， 将其与上述 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3序列进 行拼接， 获得 BgVPl全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9。 SEQ ID No: 9：
GCGTAGAGTT CTTTGTTAGT T TCCGGCGT ACGGACGCAC CGGAGAGGAG GAGAATGGGA
61 ACGTCGGCGC TGCTGCCTGA AATAGCCACG GAGATAATTG TGCCGGTGTG CGCGGTGGTA
121 GGCATAGCCT TCTCGCTGGT TCAGTGGCTC C TGTCTCGC GCGTGAAACT CACGGCGGAC
181 CGCCGGTCTC CGCCGAACTC TGGTAACAAG AACGG TACA ACGA TAC T GATTGAAGAA
241 GAGGAAGGTC TCAATGATAA CAGCGTCGTC GCTAAGTGCG CTGATATTCA GACCGCCATC
301 TCCGAAGGTG CCACATCATT TCl'l'l'l'CACT GAATATAAGT ATGTTGGGAT CTTCATGATT
361 GCCTTTGCAA TTCTTATATT CCTCTTTCTG GGCTCTGTTG AGAGCTTTAG CACCAAGAGC
421 CAGCCTTGCA CCTATGATAA AGAGAAGATG TGCAAGCCAG CACTTGCCAC TGCAATCTTC
481 AGCACTGTTT CCTTCTTGCT TGGTGCTGTC ACCTCACTCC TCTCGGGT T TTTGGGGATG
541 AAAATTGCTA CTTATGCCAA TGCCAGAACA ACCTTGGAAG CAAGAAAGGG TGTTGGCAAG
601 GCTITTATCA CTGCATTTAG GTCTGGAGCT GTAATGGGCT TTCTCCTTGC CGCAAATGGT
661 TTGTTGGTAC TTTACATTGC CATCAATCTC TTTAAGCTGT ACTATAAGTC TGACTGGGAG
721 GGCCTATTTG AGTCAATTAC TGGTTATGGT CTTGGAGGGT CATCCATGGC TCTCTTTGGA
781 AGGGTTGGTG GTGGCATTTA TACCAAAGCT GCTGATGTTG GTGCTGATCT TGTTGGAAAG
841 GTTGAAAGAA ACATCCCAGA AGATGACCCT AGAAACCCAG CTGTCATTGC CGACAATG T
901 GGTGATAATG TTGGTGATAT TGCAGGCATG GGGTCTGATC 'rrrrCGGCTC ATATGCTGAA
961 TCATCATGTG CTGCCCTTGT TGTCGCCTCT ATCTCCTCTT TTGGAGTCAA CCATCAATTC
1021 ACTCCCATGC TATATCCTCT TCTCATTAGT TCTGTGGGTA TCCTTGTTTG TTTGATTACA
1081 ACCCTCITTG CAACCGAC T CTTTGAAATC AAGGCCGTAA AGGAAATTGA ACCAGCATTG
1141 AAGAAGCAGC TTATCATCTC CACTATTCTA ATGACTGTGG GAATTGCTAT TGTAACTTGG
1201 ATAAGTGTGC CATCTTCCTT TACCATCTAT AATITIGGTA CTCAGAAGGT TGTAAAGAAC
1261 TGGCAGATGT TCTTGTGTGT GGCTGTTGGT C TTGGGCTG GACTTATTAT TGGATTTGTT
1321 ACTGAGTATT ATACCAGCAA TGCCTACAGC CCTGTGCAAG ATGTTGCTGA CTCCTGCAGG
1381 ACTGGAGCTG CTACTAATGT TATCTTTGGC CTTGCCTTGG GATACAAATC TGTCATCATT
1441 CCAA'l'l'l'l'lG CTATCGCAGT TAGCATCTTT GTTAGTTTTA GCITTGCAGC TATGTATGGC
1501 ATTGCTGTGG CTGCCCTGGG AATGCTAAGT ACAATTGCTA CTGGATTGGC TATTGATGCT
1561 TATGGTCCCA TCAGTGACAA TGCTGGCGGC ATTGCTGAGA TGGCTGGCAT GAGTCACCGC
1621 ATCCGTGAGC GAACCGATGC CCTTGATGCA GCAGGCAACA CTACTGCTGC GATTGGAAAG
1681 GGGTTTGCCA TTGGATCTGC TGCGCTAGTA TCTTTGGCTC TATTTGGTGC ATTTGTTAGT
1741 CGAGCAAACA TTACTACAGT GGATGTCCTA ACCCCAAAGG TCTTCATTGG TCTGATTGTG
1801 GGTGCCATGC TTCCTTACTG GTTCTCTGCC ATGACTATGA AGAGTGTTGG AAGTGCAGCC
1861 TTGAAGATGG TAGAGGAAGT TCGGAGGCAG TTCAATACCA TTGCTGGTCT CATGGAGGGT
1921 CATACCAAGC CTGATTATGC TAACTGTGTC AAGATCTCCA CTGATGCATC TATCAAGGAG
1981 ATGATTCCTC CAGGTGCTCT TGTCATGCTC ACGCCCA TA TTGTTGGGAC A TCTTTGGT
2041 GTTGAGACTC TTTCTGGTGT TCTGGCTGGT TCTCTTGTTT CTGGTGTTCA GATAGCAATT
2101 TCTGCTTCAA ACACTGGTGG AGCATGGGAC AATGCCAAGA AGTACATTGA GGCTGGTGCC 2161 TCGGAGCATG CAAGGTCCCT TGGCCCAAAG GGTTCTGATC CACACAAGGC AGCTGTGATT
2221 GGTGATACCA TCGGTGACCC GCTTAAGGAT ACCTCAGGCC CATCTCTTAA CATCCTCATT
2281 AAGCTCATGG CAGTGGAATC ACTTGTCTrT GCACCCTITT TTGCTACCCA CGGTGGT TG
2341 CTCTTCAAGA TATTCTGAAA GATGGGGAGC ATGAGATAGG GCACAAGGAA GGAGGGCCAT
2401 TGTGCAACCT TGCTTTCTCT TGCTAAGTAC CTCTTCCTCT TGTCCTTACA ITTGGGTTT
2461 TCAAGCTAGT TCATATCG T CAGTCGCATA ΟΤΑΊΊΊΊΊΊΆ AGATGTCCTG ATGGTGATGA
2521 CAATCAAAGA TGGTTAGGAT GGTGGCCAGA CATGGTCACT CACATGAAGC AGAGTCTAGG
2581 TTGTGTCATT TTTACCCTGT AGCACTGGAA CCGCTTGAGT GTACAATTTT GTGCATTAAG
2641 CTAGGACCGC TATTTTGGAC TCGCTGAT G TAGTAAATTT ACCCTTTGGC TGTAAAATCC
2701 '丄'丄'丄'丄 GAGATG CAACTAAACA T GTGACCGT CATTCATAAT AAGATTCTGT TATCCTITTG
2761 TGCATTAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΆ AAA 根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下：
SEQ ID No: 10：
ATGGGAACGT CGGCGCTGCT GCC
SEQ ID No: 11：
TCAGAATATC TTGAAGAGCA AAC
通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 Sg P 全长编码基因。
采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以盐处理组木榄根提取的 mRNA 反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的 引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2 分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟， 离心， 去上清， 晾干， 然后用 21 μ ΐ双蒸水溶解所得沉淀。 然后向其中加入 2.5 μ 1 lO X Ex Buffer 0.5 μ 1 5 mM的 dATP、 1.0 l Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分 钟。 将得到的约 2300 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体上得到 BgVPl-pGEM质粒， 然后将连接产物转化到大肠杆菌 JM109感受态 细胞中（方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 g/mL X-gal、 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增验证（反应体系及反应条件同上） ， 得到 9个阳性克隆， 选取其中 3个阳性克隆 送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 所得序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋 白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
VP1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1
1 MGTSALLPEI ATEI IVPVCA
21 WGIAFSLVQ WLLVSRVKLT
41 ADRRSPPNSG NKNGYNDYLI
61 EEEEGLNDNS WAKCADIQT
81 AISEGATSFL FTEYKYVGI F
101 MIAFAILI FL FLGSVESFST
121 KSQPCTYDKE K CKPALATA
141 I FSTVSFLLG AVTSLLSGFL
161 GMKIATYANA RTTLEARKGV
181 GKAFITAFRS GAVMGFLLAA
201 NGLLVLYIAI NLFKLYYKSD
221 WEGLFES ITG YGLGGSSMAL
241 FGRVGGGIYT KAADVGADLV
261 GKVERNI PED DPRNPAVIAD
281 NVGDNVGDIA GMGSDLFGSY
301 AESSCAALW AS ISSFGVNH
321 QFTPMLYPLL ISSVGILVCL
341 ITTLFATDFF EIKAVKEIEP
361 ALKKQLI IST ILMTVGIAIV
381 TWISVPSSFT IYNFGTQKW
401 KNWQMFLCVA VGLWAGLI IG
421 FVTEYYTSNA YSPVQDVADS
441 CRTGAATNVI FGLALGYKSV
461 I I PI FAIAVS I FVSFSFAAM
481 YGIAVAALGM LSTIATGLAI
501 DAYGPISDNA GGIAEMAGMS
521 HRIRERTDAL DAAGNTTAAI
541 GKGFAIGSAA LVSLALFGAF
561 VSRA ITTVD VLTPKVFIGL
581 IVGAMLPYWF SAMTMKSVGS
601 AALK VEEVR RQFNTIAGLM iL DDD DDi DV DWDD D¾DD¾DDi¾D U DDDi^DD D¾¾DDD¾DiD DDi¾DDDD¾D T9ST iD¾Di¾DDDi DDDi¾D¾D DiL DDDDDD DDiWD Di D¾Di¾DDDiD DiVUDDi^D TOST iLV DDDiLV DD V DDiL WDViDW DiWDDD D DD DDDiD DiL DDDiVi T ς£
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SST100/C10ZN3/X3d Ϊ0Ζ OAV 1621 GGAAAGGGGT TTGCCATTGG ATCTGCTGCG CTAGTATCTT TGGCTCTATT TGGTGCATTT
1681 G TAGTCGAG CAAACATTAC TACAGTGGAT GTCCTAACCC CAAAGGTCTT CATTGGTCTG
1741 ATTGTGGGTG CCATGCTTCC TTACTGGTTC TCTGCCATGA CTATGAAGAG TGTTGGAAGT
1801 GCAGCCTTGA AGATGGTAGA GGAAG TCGG AGGCAGTTCA ATACCATTGC TGGTCTCATG
1861 GAGGGTCATA CCAAGCCTGA TTATGCTAAC TGTGTCAAGA TCTCCACTGA TGCATCTATC
1921 AAGGAGATGA TTCCTCCAGG TGCTCTTGTC ATGCTCACGC CCATTATTGT TGGGACATTC
1981 TTTGGTGTTG AGACTCTTTC TGGTGTTCTG GCTGGTTCTC TGTTTCTGG TGTTCAGATA
2041 GCAATTTCTG CTTCAAACAC TGGTGGAGCA TGGGACAATG CCAAGAAGTA CATTGAGGCT
2101 GGTGCCTCGG AGCATGCAAG GTCCCTTGGC CCAAAGGGTT CTGATCCACA CAAGGCAGCT
2161 GTGATTGGTG ATACCATCGG TGACCCGCTT AAGGATACCT CAGGCCCATC TCTTAACATC
2221 CTCATTAAGC TCATGGCAGT GGAATCACTT GTCTTTGCAC CCTITITTGC TACCCACGGT
2281 GGTTTGCTCT TCAAGATATT CTGA 实施例 3 BgVPl基因植物表达载体构建
选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 BgVPI 基因的启动子和终止子， 构建流程图如图 1所示。
使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13， 以植物表达载体 pBI121质粒（购 自北京华夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72 °C延伸 10 分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明 （Promega, T4 连接 酶试剂盒） 连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。
SEQ ID NO: 12
GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga
SEQ ID NO: 13
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以 pBI121质粒为模板扩增 Tnos, 采 用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合 酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15各 2.0 μ 1以及 31 μ 1的双蒸 水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30 秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产 物连接 （Promega T4 连接酶试剂盒） 到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO: 14：
AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：
TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA 用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。 采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 y l PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变 性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Sail 酶切将所得的 PCR 产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2 获得 pCAMBIA2300-3。
SEQ ID NO: 16：
ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：
TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 Sg P 编码基因的全长序列（模 板是实施例 2所获得阳性 BgVPl-pGEM质粒）， 采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 BgVPl-pGEM质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变 性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延 伸 10 分钟。 通过 Sall、 Kpnl 酶切将所得的 PCR 产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-3 , 经验证后获得植物表达载体 35S-BgVPl-2300 (图 2 ) 。 SEQ ID NO: 18
ACTGTCGAC ATGGGAACGT CGGCGCTGCT GCC SEQ ID NO: 19
ACTGGTACC TCAGAATATC TTGAAGAGCA AAC 实施例 4 35S-BgVP7-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌 GV3101 (购自上海迈其生物科技有限公司） 感受态细胞的制备： 将农杆 菌 GV3101在含 50 μ§/ιη1利福平和 50 μ§/ιη1庆大霉素的 LB固体培养基上划单斑接 种， 28 °C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ§/ιη1利福平和 50 μ§/ιη1庆大 霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜 （约 12-16小时） 至 OD6。。值为 0.4， 形成种子菌液。 取 5 ml培养活化后的菌液 （1 :20的比例） 接种于 100 ml含 50 μ§/ιη1 利福平和 50 μ§/ιη1 庆大霉素的 LB 液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 小时至 OD6QQ=0.8。 冰浴菌液 10 分钟， 每隔 3 分钟摇匀一次， 使所述细菌均匀进入休眠状 态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 l ml冰预冷的 10% (体积比） 甘 油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (体积比） 甘油重复洗 3-4次； 然后加入适量冰预冷的 10% (体积比） 甘油重新悬浮细菌沉淀， 即制得 GV3101感受态细胞， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。
转化农杆菌： 在冰上融化所述的 GV3101感受态细胞， 向 40 μΐ的所述感受态细 胞中加入 1 μΐ实施例 3获得的质粒 35S-BgVPl-2300， 混匀后冰浴约 10分钟。 将冰浴 后的感受态细胞和 35S-BgVPl-2300 质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的 0.1 cm规格的电击杯 （购自 Bio-Rad) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部 （注意不要有气 泡） 。 将所述电击杯放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极 处。 将 MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 "Agr"， 电击一次。 立即取出电击 杯， 加入 28 °C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。 快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打 匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 在 28 °C下 225 rpm摇动培养 1小时。 取 100-200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基， 含 50 g/ml利福平、 50 μ§/ιη1庆大霉素、 50 μ§/ιη1卡那霉素） ， 28 °C培养。 筛选阳性转化克隆， 并将其菌 液于 -70°C保存备用。 实施例 5 受体材料拟南芥培养 选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 使用 直径 9 cm的花盆， 每盆播种 20-30颗拟南芥种子（哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立 大学的拟南芥生物资源中心） 。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一个 湿润的环境。 恒温 22 V , 光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗 /12小时光 照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS液体培养基。 培养 30天后， 每盆保留 4-5棵植株， 光照周期调整为 8小时黑暗 /16小时光照培养， 待大部分植株都抽苔之后， 在花序基 部剪掉整个主苔， 去其顶端优势， 约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔， 待侧苔 花序形成花蕾并部分开花或形成 1 -2个角果时， 便可用于转化。 实施例 6 拟南芥花浸转化
将实施例 4获得的已转化 35 S-BgVP l -2300表达载体的 GV3 101农杆菌菌液接种至 含有含 50 g/ml利福平、 50 μ§/ιη1庆大霉素、 50 g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中 培养过夜，第二天早上按 1 : 50接种至含有 50 g/ml利福平、50 g/ml庆大霉素、 50 μ§/ιη1 卡那霉素的新 LB培养基 （1L ) 中， 培养约 8个小时， 至农杆菌液 OD6QQ在 1.0到 1.2 之间。 室温 5000 rpm离心 5分钟， 弃上清， 将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基 （ 1/2MS 液体培养基， 并含有 5% 蔗糖； 用 KOH调至 pH5.7 ; 0.02% Silwet L-77 )中， 使 OD6(K) 在 0.8左右。 将实施例 5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、 螺旋式浸入所述含农 杆菌的浸染培养基内， 轻轻顺时针晃动， 约 2分钟， 用透明塑料罩盖严以保持湿度， 放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩， 用水浇透。 之后 2-3周， 保证植株水分充 足。 当植株停止开花， 第一个果荚成熟变黄时， 用纸袋套住， 当纸袋内的所有果荚变 黄后， 停止浇水， 1 -2周干燥后收取种子， 进行转化子筛选， 同时取未经转化处理的 拟南芥果荚作为对照。 实施例 7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选
种子消毒： 先用 70%乙醇浸泡 10 分钟， 并不时地使种子悬浮； 然后用无菌水洗四 次， 并不时地使种子悬浮。 然后， 将处理后的种子均匀涂布在含 50 μ§/ιη1卡那霉素的 1/2MS固体筛选培养基表面上（一块 150 mm直径的平皿最多播种 1500粒种子）， 4°C春 化 2天， 然后在恒温 22°C、光照强度 3500-4000 k、光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照 条件下培养 7-10天。 转基因种子在所述筛选培养基上萌发 2周以后， 将能够萌发并正常 生长的植株转入土壤继续培养。剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株植物的 1-2 个叶片，提取其 DNA作为模板，用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引物进行 PCR 检测（反应体系及条件同上）， 去除 PCR阴性植株， 收集 PCR阳性植株的种子分别编号 ( T0ol-T0o22) 并保存。 实施例 8 过表达 BgVPJ的转基因拟南芥 T1代植株的种植
选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 将编号 T0ol-T0o22的每种转化子及非转基因对照拟南芥种子各播种 2盆 （每盆播种 20-30颗种 子） 。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一个湿润的环境。 恒温 22°C， 光 照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS 液体培养基。 培养 25天后， 每株剪取 1-2个叶片并提取其 DNA作为模板， 用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引物进行 PCR检测（反应体系及条件同上）。去除 PCR 阴性植株， 每盆保留 7-8棵 PCR阳性苗， 继续培养 10天后， 每盆保留大小较一致的 5-7棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。 实施例 9 过表达 BgVPJ的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验
将实施例 8 中转基因拟南芥、 对照拟南芥各保留一盆植株不作处理， 正常浇灌 1/2MS液体培养基， 同时各取一盆植株浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2MS液体培养基， 恒温 22°C、 光照强度 3500-4000 k、 12小时光培养 /12小时暗培养循环， 14天后观察 实验结果。 T1代转基因植株 （T0代转基因植株的种子长成的植株） 的耐盐性鉴定表 明， T1代转基因植株 Tlo5、 Tlo9、 Tlol l三个株系表现出显著的耐盐性 （见图 3， 以 Tlo5例， Tlo9、 Tlol l的结果与类似， 在此未示出） 。 实施例 10 在转录水平上验证 Sg P 基因的表达
将实施例 9中耐盐性好的 T1代转基因植株中随机选取 7棵（分别属于上述 Tlo5、 Tlo9、 Tlol l三个耐盐株系）， 实施例 9中对照植株随机选取 4棵， 各剪取盐（150 mM NaCl)处理 14天的叶片 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。 紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓 度。 依照 Invitrogen反转录试齐 [J盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反 转录， 取 1 总 RNA作为模板反转录。 使用引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO: 20： GACCTAAATG CAGTGATAAA AGO 扩增 ^Sg P 片段， 检测 其转 录情 况 。 使用 引 物 SEQ ID NO ： 21 ( SEQ ID NO ： 21 ： 5- GCCATCCAAGCTGTTCTCTC -3 ) 禾口 SEQ ID NO： 22 ( SEQ ID NO： 22： TTCTCGATGGAAGAGCTGGT ) 扩增 AtACT2 片段 （ 拟南芥看家基因 ： http：〃 www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/AK317453.1 ) ， 作为对 ,照。 采用 TAKARA的 Ex DNA聚合酶， 以上述反转录所得的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 0.3 μΐ Ex DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 20各 2.0 μ1， 以及 35.7 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 30个循环 （94°C变性 30 秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
PCR产物电泳结果如图 4所示： 1-7为耐盐 T1代转基因拟南芥植株 （分别属于 Tlo5、 Tlo9、 Tlol l三个株系） 8-11为非转基因的对照拟南芥植株。 结果表明， 耐盐 T1 代转基因拟南芥植株中 BgVPJ 均有显著转录， 非转基因对照拟南芥植株中没有 BgVPl的转录。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种编码木榄叶泡焦磷酸酶蛋白的基因编码的蛋白，其序列为 SEQ ID NO: 1。
2. 编码权利要求 1所述的蛋白的基因， 其序列为 SEQ ID NO: 2。
3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而 获得的， 并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接， 优选地， 所述表达载体是 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体， 其为图 2所示的 35S-BgVPl-2300载体。
5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组 表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3 或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物 是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法，包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利要 求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法， 其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5 所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途， 其中所述植物是拟南芥。
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