WO2014172825A1 - 一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白nhx2及其编码基因与应用 - Google Patents

一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白nhx2及其编码基因与应用 Download PDF

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WO2014172825A1
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expression vector
recombinant
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崔洪志
梁远金
田大翠
刘捷
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创世纪转基因技术有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the present invention relates to plant proteins and their coding genes and applications, and more particularly to a tonoplast sodium hydrogen back transporter NHX2 derived from small salt mustard and a gene encoding the same, and in the cultivation of transgenic plants having improved salt tolerance Applications.
  • Salt stress is one of the most important abiotic stress hazards in agricultural production in the world.
  • Salted soil is usually dominated by sodium salt, calcium salt or magnesium salt, and is a major factor affecting plant growth and causing food and economic crop yield reduction.
  • the world's saline-alkali soil covers an area of about 400 million hectares, accounting for one-third of the irrigated farmland.
  • Saline-alkali land is widely distributed in China, and the existing saline-alkali land area is about 0.4 million hectares. With the increase of population in China and the reduction of cultivated land, the development and utilization of saline-alkali resources has extremely important practical significance.
  • the salt tolerance of plants is a very complex quantitative trait, and its salt tolerance mechanism involves various levels from plants to organs, tissues, physiology and biochemistry to molecules.
  • scientists from various countries have also done a lot of work for this purpose, and have made a lot of new progress, especially in the use of the higher model plant Arabidopsis to study the salt-tolerant molecular mechanism of plants, making breakthroughs in research in this field ( Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 201 1.
  • Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing Through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ).
  • Higher plant cells can have multiple ways to sense changes in the physical and chemical parameters in the external environment, thereby transforming extracellular signals into intracellular signals, and finally transmitting stress signals to the nucleus through a series of signal transductions, activating transcription factors, and activating transcription.
  • the factor acts on the functional gene and initiates the expression of the stress response gene to increase the tolerance of the plant.
  • researchers have conducted a large number of studies from different sides, due to the complexity of the mechanism, many important issues in plant salt resistance remain to be explored. For example, the key factor in plant salt resistance is still not Found; the molecular mechanism of plant salt tolerance is not very clear.
  • NHX2 tonoplast sodium hydrogen anti-transporter
  • SSH suppression subtractive hybridization
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • the first aspect of the present invention provides a gene encoding a tonoplast sodium hydrogen anti-transporter NHX2 of a small salt mustard (herein named 73 ⁇ 4NH 2 ) having the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a second aspect of the present invention provides a recombinant expression vector comprising the gene of the first aspect of the present invention, which is obtained by inserting the gene into an expression vector, preferably, the expression vector is
  • the nucleotide sequence of the gene is operably linked to the expression control sequence of the recombinant expression vector; preferably, the recombinant expression vector is the 35S-ThNHX2-2300 vector shown in Figure 2.
  • a third aspect of the invention provides a recombinant cell comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention; preferably, the recombinant cell is a recombinant Agrobacterium cell.
  • a fourth aspect of the invention provides a method for improving salt tolerance of a plant, comprising: introducing the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention into a plant or plant tissue and expressing the gene
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a fifth aspect of the invention provides a method for producing a transgenic plant, comprising: cultivating a plant or plant tissue comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention under conditions effective to produce a plant
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a sixth aspect of the present invention provides the gene according to the first aspect of the present invention, the recombinant expression vector of the second aspect of the present invention or the recombinant cell of the third aspect of the present invention for improving salt tolerance of a plant and for use in plant breeding Use;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the seventh aspect of the invention provides the protein encoded by the gene of the first aspect of the invention, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 is the construction flow of the plant expression vector (35S-ThNHX2-2300) of the NHX2 gene (Fig. la-lb).
  • Figure 2 is a plasmid map of the plant expression vector (35S-ThNHX2-2300) of the NHX2 gene.
  • Figure 3 is a cultured test plant Arabidopsis thaliana.
  • Figure 4 shows the salt tolerance test results of T1 plants of ThNHX2 transgenic Arabidopsis thaliana. Tlc4 showed significant salt tolerance, and the results of Tlcl7 and Tlcl9 were similar thereto, and are not shown here.
  • Figure 5 shows the results of molecular level detection of the transcription level of ThNHX2 gene in 1 ⁇ generation transgenic tobacco plants and non-transgenic control plants by reverse transcription PCR.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000)
  • 1-4 is a salt-tolerant control Arabidopsis plant
  • 13 is a plasmid PCR positive control (35S-ThNHX2-2300 plasmid)
  • 5-12 is a salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis thaliana Plant.
  • Small salt mustard (TheUungieUa halophila, purchased from the Yanlan Plant Breeding Center of Ulan Buh and Desert Green Botanical Garden, Bayannao, Inner Mongolia, China) Seeded onto sterilized vermiculite, at 22 ° C, photoperiod 12 hours light / 12 hours dark (Light intensity 3000-4000 Lx) culture, 1/2MS medium per week (containing 9.39 mM KN0 3 , 0.625 mM KH 2 P0 4 , 10.3 mM NH4NO3 , 0.75 mM MgS0 4 , 1.5 mM CaCl 2 , 50 ⁇ M KI, 100 ⁇ M H3BO3 , 100 ⁇ M MnS0 4 , 30 ⁇ M ZnS0 4 , 1 ⁇ M Na 2 Mo0 4 , 0.1 ⁇ M CoCl 2 , 100 ⁇ M Na 2 EDTA, 100 ⁇ M FeS0 4 ). The experiment was performed when the plants were grown to a diameter of 5-6 cm.
  • the test plants were divided into 2 groups, 4 pots per group and 3 plants per pot.
  • the first group was the control group, which was normally watered with 1/2MS;
  • the second group was the salt treatment group, which was watered with 300 mM NaCl solution, and the two groups of plants were at 22 ° C, photoperiod 12 hours light / 12 hours dark (light intensity)
  • the culture was carried out for 10 days under conditions of 3000-4000 Lx), and then the two groups of plants were washed in time (the roots were washed with steamed water), rapidly frozen with liquid nitrogen, and stored in a refrigerator at -70 °C.
  • the absorbance of total RNA at 260 nm and 280 nm, OD 26 was determined using a HITACHI UV spectrophotometer U-2001. /OD 28 .
  • the ratio of 1.8-2.0 indicates that the total RNA purity is high.
  • the integrity of total RNA is detected by 1.0% agarose gel electrophoresis.
  • the brightness of the 28S band is about twice that of the 18S band, indicating that the RNA integrity is good.
  • the method according to Clontech's PCR-select TM cDNA Subtraction Kit kit instructions will be shown suppression subtractive hybridization.
  • Driver mRNA and Tester mRNA were reverse transcribed, respectively, to obtain double-stranded cDNA, and 2 ⁇ g of Tester cDNA and 2 ⁇ g of Driver cDNA were used as starting materials for subtractive hybridization.
  • the Tester cDNA and Driver cDNA were digested with Rsa I for 1.5 hours in a 37 ° C water bath, and then the digested Tester cDNA was divided into two equal portions, and the different linkers were ligated, and the Driver cDNA was not ligated.
  • Two tester cDNAs with different adaptors were mixed with excess Driver cDNA for the first forward subtractive hybridization.
  • the products of the two first forward subtractive hybridizations were mixed, and a second forward subtractive hybridization was performed with the newly denatured Driver cDNA, and the differentially expressed genes were amplified by two inhibitory PCR amplifications (PCR). Before, the second forward subtraction hybridization product was end-filled).
  • the second inhibitory PCR amplification product of the second forward subtractive hybridization cDNA fragment (purified using QIAquick PCR Purification Kit, purchased from Qiagen) according to the instructions of the pGEM-T Easy kit (purchased from Promega)
  • the specific steps are linked to the pGEM-T Easy vector as follows: The following components are sequentially added to the 200 l PCR tube: Purified combined positive subtractive hybridization cDNA fragment second inhibitory PCR product 3 ⁇ 1 , 2 X T4 DNA ligase buffer 5 ⁇ l, pGEM-T Easy vector 1 ⁇ l, ⁇ 4 DNA ligase 1 ⁇ l, ligated overnight at 4 °C.
  • the picked white colony clones were inoculated into 96-well cell culture plates (CORNING)
  • the LB (same as above) liquid medium containing 50 g/ml ampicillin was cultured overnight at 37 ° C, and then glycerin was added to a final concentration of glycerol of 20% by volume, and then stored at -80 ° C until use.
  • the cultured colonies were cloned with nested PCR primers Primer 1 and Primer 2R (PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit from Clontech) to verify 342 positive clones, and then all positive clones were obtained.
  • the sequence is SEQ ID No: 3, and the sequence analysis indicated that the protein encoded by the sequence belongs to the vacuolar membrane sodium hydrogen anti-transporter.
  • the full-length coding gene corresponding to the sequence of SEQ ID No: 3 is named 73 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 2, and the corresponding protein is named ⁇ 2.
  • ThNHX2 GSP 1 SEQ ID No: 4:
  • ThNHX2 GSP2 SEQ ID No: 5:
  • the first round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 4 and the universal primer AUAP (provided with the kit), and the mRNA reverse-transcribed cDNA extracted from the salt-treated group was used as a template. Specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 4 and AUAP each with 2.0 ⁇ 1 and 35 ⁇ 1 double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water, and 2.0 ⁇ M was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 5 and the universal primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 lO X Ex Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 5 and P AUAP Each of 2.0 ⁇ 1 and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • a fragment of about 900 bp in the second PCR product (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered and ligated into pGEM-T Easy vector, and then transformed into E. coli JM109 competent cells (specific method is the same as above) And screened on LB solid medium containing 50 g/mL ampicillin. Ten white colonies were randomly picked and inoculated in LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C, and then glycerin was added to a final concentration of glycerol of 20% by volume, and stored at -80 ° C until use.
  • ThNHX2 GSP3 SEQ ID No: 6: CCTGCATACT TGAAGAGGAG AGC
  • ThNHX2 GSP4 SEQ ID No: 7:
  • ThNHX2 GSP5 SEQ ID No: 8:
  • the Ends kit was purchased from Invitrogen).
  • the first round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 7 and the universal primer AAP (provided with the kit), and the reverse-transcribed cDNA (reverse transcription primer SEQ ID NO: 6) extracted from the salt-treated group of small salt mustard was used as a template. increase, Specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 7 and AAP each with 2.0 ⁇ ⁇ and 35 ⁇ ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was diluted 50 times with double distilled water, and 2.0 ⁇ M was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 8 and primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction system 5 ⁇ 1 lO X Ex Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ l diluted first round PCR product, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 8 and P AUAP Each of 2.0 ⁇ 1 and 35 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 1 minute), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • a strip of about 700 bp in the second PCR product (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered and ligated into pGEM-T Easy vector, and then transformed into E. coli JM109 competent cells (specific method as above)
  • the transformed bacterial solution was applied to LB solid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ ampicillin for screening.
  • Ten white colonies were randomly picked and inoculated into LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin, and cultured at 37 ° C overnight, and then glycerin was added to a final concentration of glycerol of 20% by volume, and stored at -80 ° C until use.
  • a pair of primers were designed according to the sequence of SEQ ID NO: 9 as follows:
  • ThNHX2 full-length coding gene was cloned by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • PCR reaction was carried out using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase using the cDNA of the small salt mustard as a template.
  • 50 l PCR reaction system 10 ⁇ ⁇ 5 X PS Buffer 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR 10 ⁇ M primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 each 2.0 ⁇ 1 And 30 ⁇ l of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • PCR amplification product plus A tail 2.5 times the volume of absolute ethanol was added to the PCR product, placed at -20 ° C for 10 minutes, centrifuged, the supernatant was removed, air-dried, and then dissolved in 21 ⁇ ⁇ double distilled water. Then add 2.5 ⁇ ⁇ to it ⁇ ⁇ ⁇ Buffer 0.5 ⁇ 1 5 mM dATP, 1.0 ⁇ 1 Ex Taq. Reaction conditions: The reaction was carried out at 70 ° C for 30 minutes. The obtained 1600 bp DNA fragment was recovered (Omega recovery kit) and ligated into the pGEM T-easy vector (to obtain the ThNHX2-pGEM plasmid), and then transformed into E.
  • Amino acid sequence of NHX2 protein SEQ ID NO: 1
  • the plant binary expression vector pCAMBIA2300 (purchased from Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.) was selected as a plant expression vector, and the 35S promoter containing the double enhancer of the ⁇ gene was replaced with the Pnos promoter to reduce the expression of prion protein in plants. .
  • the 35S promoter and the Tnos terminator were selected as promoters and terminators of the ThNHX2 gene, respectively.
  • the construction flow chart is shown in Figure 1. Using the primers SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, Pnos was amplified using the plant expression vector pBI121 (purchased from Beijing Huaxia Ocean Technology Co., Ltd.) as a template, and PrimeSTAR HS DNA polymerase of TaKaRa was used.
  • PCR reaction system 10 l 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 ⁇ 121, 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 12 and P SEQ ID NO: 13 each 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was digested with EcoRI, Bglll, and ligated into pCAMBIA2300 according to the kit instructions (Promega, T4 ligase kit) to obtain pCAMBIA2300-1.
  • Primers SEQ ID NO: 14 and P SEQ ID NO: 15 were used to amplify Tnos using pBI121 as a template, using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • 50 l PCR reaction system 10 ⁇ 1 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 pBI121 1.0 ⁇ 1 Prime STAR, 10 ⁇ ⁇ primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 each 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was ligated by Kpnl and EcoRI (Promega T4 ligase kit) to pCAMBIA2300-1 to obtain pCAMBIA2300-2.
  • the 35S promoter was amplified using primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 with pCAMBIA2300 as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase using TaKaRa 50 ⁇ 1 PCR reaction system: 10 ⁇ 1 5 X PS Buffer 3 l 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 pCAMBIA2300 1.0 ⁇ 1 Prime STAR, 10 ⁇ M primer SEQ ID NO: 16 and P SEQ ID NO: 17 each 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was ligated by HindIII, Sail digestion (ligation method as above) to pCAMBIA2300-2 to obtain pCAMBIA2300-3.
  • the full length sequence of the 73 ⁇ 4NHX2 encoding gene was amplified using primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 (the template was the positive ThNHX2-pGEM plasmid obtained in Example 2), using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • 50 l PCR reaction system 10 l 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ 1 ThNHX2-pGEM 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR, 10 ⁇ ⁇ primer SEQ ID NO: 18 and P SEQ ID NO: 19 2.0 ⁇ ⁇ and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes), extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was ligated by Sall and Kpnl (connection method as above) to pCAMBIA2300-3 to obtain a plant expression vector 35S-ThNHX2-2300 (Fig. 2).
  • Agrobacterium LBA4404 Preparation of competent cells of Agrobacterium LBA4404 (purchased from Biovector Science Lab, Inc): Agrobacterium LBA4404 in LB solid medium containing 50 ⁇ g/ml rifampicin and 50 ⁇ g/ml streptomycin 1-2 days in advance Single spotted inoculation, cultured at 28 °C for 1 to 2 days. Single colonies were picked and inoculated into 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g/ml rifampicin and 50 ⁇ g/ml streptomycin, and cultured overnight (about 12-16 hours) to OD 6QQ at 28 °C. At 0.4, a seed bacterial liquid was formed.
  • Transformation of Agrobacterium Melting the LBA4404 competent cells on ice to 40 ⁇ l of the competent state 1 ⁇ l of the plasmid 35S-ThNHX2-2300 obtained in Example 3 was added to the cells, and the mixture was mixed and ice-cooled for about 10 minutes. Transfer the mixture of competent cells after ice bath and 35S-ThNHX2-2300 plasmid to a ice-cold electric shock cup (purchased from Bio-Rad) with a pipette, tap to bring the suspension to the bottom of the electric shock cup, be careful not to There are bubbles. Place the electric shock cup on the slide of the electric shock chamber, and push the slide to place the electric shock cup to the base electrode of the electric shock chamber.
  • a ice-cold electric shock cup purchased from Bio-Rad
  • the program of the MicroPulser (purchased from Bio-Rad) is set to "Agr" and the electric shock is applied once. Immediately remove the electric shock cup and add 200 ⁇ ⁇ ⁇ medium pre-warmed at 28 °C. Quickly and gently mix the competent cells with a pipette. The suspension was transferred to a 1.5 ml centrifuge tube and incubated at 28 ° C for 1 hour at 225 rpm. Apply 100-200 ⁇ M of bacterial solution to the corresponding resistant screening medium plate (LB solid medium, including
  • the Agrobacterium liquid of the transformed expression vector obtained in Example 4 was inoculated to an LB medium containing 10-50 ⁇ g/ml kanamycin (kan) and cultured overnight at 1:50 in the morning.
  • a new LB medium containing antibiotics (1 L) culture for about 8 hours, Agrobacterium liquid 0D 6 . . It should be between 1.0 and 1.2. After centrifugation at 5000 rpm for 5 minutes at room temperature, the supernatant was discarded, and the Agrobacterium pellet was suspended in an osmotic medium (1/2 MS; 5% sucrose; adjusted to pH 5.7 with K0H; 0. 02% Si lwet L-77). 0D 6 . . Around 0.8.
  • Example 7 Screening of Arabidopsis Positive Transformants:
  • Seed disinfection first soak for 10 minutes with 70% ethanol, and suspend the seeds from time to time during the above treatment; then wash with sterile water four times, and it is best to suspend the seeds from time to time.
  • the treated seeds were uniformly coated on the surface of 1/2MS solid screening medium containing 50 g/ml kan for 2 days (up to 1500 plants per 150 mm diameter plate), constant temperature 22 ° C, light intensity 3500- 4000 k, light cycle is 12 hours dark, 12 hours light culture, culture 7-10 days. Whether it is a transgenic seed is judged according to the growth condition. Seeds successfully transferred to the recombinant plasmid were able to grow normally more than 4 true leaves on the resistant medium.
  • Non-transgenic seeds can not grow normally, only two cotyledons can grow, and the growth of the roots is also severely inhibited. It usually dies 10 days later.
  • the positive plants were transferred to the soil for further cultivation, and the transgenic Arabidopsis was subjected to PCR detection with SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 to remove the negative plants and collect the positive plant seeds.
  • Label T0cl-T0c22.
  • Transgenic Arabidopsis thaliana and control Arabidopsis thaliana were treated without treatment. Normally watered 1/2MS, transgenic Arabidopsis thaliana and control Arabidopsis thaliana each potted with 1/2MS containing 150 mM NaCl, constant temperature 22V, light intensity 3500- 4000 lx, 12 hour light culture / 12 hour dark culture cycle. Observation results after 10 days: Identification of salt tolerance of T1 transgenic plants (plants grown from seeds of TO transgenic plants) showed that T1 transgenic plants Tlc4,
  • Example 9 Among the T1 transgenic plants with good salt tolerance in Example 9, 8 were randomly selected (respectively belong to the above three salt-tolerant strains), and the control plants in Example 9 were randomly selected from 4 plants, and the leaves were treated with salt for 14 days. g, planting Total RNA was extracted from the RNA extraction kit (Invitrogen). The absorbance values of total RNA obtained at 260 nm and 280 nm were determined by ultraviolet spectrophotometry, and the respective RNA concentrations were calculated. Reverse transcription was carried out according to the method shown by Invitrogen Reverse Transcription Kit Superscript III Reverse Transcriptase (1 ⁇ g total RNA as a template, reverse transcription primer SEQ ID NO: 11).
  • ThNH ⁇ 2 was amplified by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20: CCTGCAGACA TTGAACCGAT AA), and its transcription was examined.
  • the PCR reaction was carried out using the reverse-transcribed cDNA of TaKaRa as a template using PrimeSTAR HS DNA polymerase of TaKaRa.
  • 50 ⁇ ⁇ PCR reaction system 10 ⁇ ⁇ 5 X PS Buffer, 3 ⁇ 1 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ 1 cDNA, 1.0 ⁇ 1 PrimeSTAR 10 ⁇ M primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 20 each 2.0 1, 1, and 30 ⁇ ⁇ of double distilled water.
  • M is the DNA Ladder Marker (DL2000, purchased from Shenzhen Ruizhen Biotechnology Co., Ltd.)
  • 1-4 is the salt-tolerant control Arabidopsis plant
  • 13 is the plasmid PCR positive control (35S- ThNHX2-2300 plasmid)
  • 5-12 is a salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plant.
  • the size of the band shown is the same as the size of the positive control (approximately 700 bp).
  • the results showed that the transcription of 73 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 2 in the salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plants was stronger, and there was no transcription of ThNHX2 in the salt-tolerant control Arabidopsis plants.

Abstract

一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因，以及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

Description

一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX2及其编码基因与应用
技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于小盐芥的液泡 膜钠氢反向转运蛋白 NHX2及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的 应用。
背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、 钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重 要的现实意义。 而植物抗盐碱、 耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高 经济和生态价值的植物种或品系的选育， 则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大 多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上，土壤中过量的 Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如 何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。 各国的科学家也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展， 特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面， 使该领域 的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 201 1. Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ) 。 高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变 化， 从而将胞外的信号变为胞内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细 胞核内， 激活转录因子， 而激活转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表 达从而提高植物的耐逆性。 尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究， 但由于其机制 十分复杂， 植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。 例如， 植物抗盐的关键因子仍未 找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆了小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白（本文命名为 NHX2)的编码基因， 并测定了其 DNA序列。 并且发现通过转基因技术将其导入植株后， 可明显改善转基 因植株的耐盐性， 而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX2 的编码基因 (本文命名为 7¾NH 2) ， 其序列为 SEQ ID NO: 2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的， 优选地， 所述表达载体是
PCAMBIA2300; 并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可 操作地连接； 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-ThNHX2-2300载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将本发明第一方面所 述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条 件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的 植物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组 表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育 种的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明
图 1是 NHX2基因的植物表达载体 （35S-ThNHX2-2300) 构建流程 （图 la-lb) 。 图 2是 NHX2基因的植物表达载体 （35S-ThNHX2-2300) 的质粒图。 图 3是培养的供试植物拟南芥。 图 4是 ThNHX2转基因拟南芥的 T1代植株的耐盐实验结果， Tlc4表现出明显的 耐盐性， Tlcl7、 Tlcl9的结果与其类似， 在此未示出。
图 5为利用反转录 PCR对 1\代转基因烟草植株和非转基因对照植株中 ThNHX2基 因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-4为 不耐盐的对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThNHX2-2300质粒）， 5-12 为耐盐 T1代转基因拟南芥植株。
具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出 于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。
下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1. 盐胁迫下小盐芥 SSH文库构建：
具体方法为：
按照 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法 通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（差减文库）。 在实验过程中以生长过程中盐处 理的小盐芥组织中提取的 mRNA作为样本 （Tester) ， 以未处理的小盐芥组织中提取 的 mRNA作为对照 （Driver) 。 具体步骤如下：
( 1 ) 供试材料：
小盐芥 （ TheUungieUa halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色 植物园盐生植物繁育中心） 播种到灭菌的蛭石上， 在 22°C、 光周期 12 小时光照 /12 小时黑暗 （光强 3000— 4000 Lx) 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 （含有 9.39 mM KN03 , 0.625 mM KH2P04， 10.3 mM NH4NO3 , 0.75 mM MgS04， 1.5 mM CaCl2， 50 μ M KI, 100 μ M H3BO3 , 100 μ M MnS04, 30 μ M ZnS04， 1 μ M Na2Mo04， 0.1 μ M CoCl2, 100 μ M Na2EDTA, 100 μ M FeS04)—次。 当植株长到直径达为 5-6 cm 时用于实验。
( 2 ) 材料处理：
将供试植株分为 2组， 每组 4盆， 每盆 3株。 第一组为对照组， 正常地用 1/2MS 浇灌； 第二组为盐处理组， 浇灌 300 mM NaCl溶液， 将两组植物在 22°C、 光周期 12 小时光照 /12小时黑暗 （光强 3000— 4000 Lx) 条件下培养处理 10天， 然后及时收集 两组植株 （用蒸熘水洗净根部） ， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。 ( 3 ) 总 RNA提取：
分别取对照组和盐处理组的小盐芥 3.0 g， 用植物 RNA 提取试剂盒 （购自 invitrogen)提取总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD26。/OD28。比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较 高， 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带 的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从 总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。
( 4) 抑制差减杂交：
按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进 行抑制差减杂交。 先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水 浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5小时， 然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同 接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将 两种第一次正向差减杂交的产物混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向 差减杂交， 通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段 （PCR进行前， 第二 次正向差减杂交产物进行末端补平） 。
( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定
依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书， 将所述第二次正向差减杂 交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯 化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 在 200 l PCR管中 依次加入下列成分： 纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接 酶 1 μ 1， 于 4°C连接过夜。 然后取 10 μ ΐ连接反应产物， 加入到 100 μ ΐ感受态大肠 杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中， 冰浴 30分钟、 热休克 60秒、 冰浴 2分钟， 另加 250 液体培养基 （含有 1%胰蛋白胨 （Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5%酵母提取 物 （Yeast Extract, 购自 OXOID) 禾 P 1% NaCl (购自国药）） 后置于 37°C摇床中， 以 225 rpm振荡培养 30分钟， 然后从中取 200 μ ΐ菌液接种于含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB (同上) /X-gal ( 5-溴-4氯-3-吲哚^ -0-半乳糖苷） /IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半 乳糖苷） （X-gal/IPTG购自 TAKARA) LB固体培养板上， 37°C培育 18小时。 计数培 养板中直径 > 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落， 随机挑取 450 个白色菌落 （编号： Th-S001至 Th-S450) 。 将所挑取白色菌落克隆接种于 96孔细胞培养板（CORNING) 中的含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB (同上） 液体培养基， 37°C培养过夜后加甘油至甘 油终浓度为 20% (体积比） ， 然后于 - 80°C保存备用。 对所培养的菌落克隆以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒） 进行菌液 PCR扩增验证， 得到 342个阳性克隆， 然后将所有阳性克隆送 英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。
( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：
将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 301个有效 表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST) ( Unigene ) 。
实施例 2小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白基因 ThNHX2的克隆
将所述鉴定的小盐芥 SSH文库中来自菌落 Th-S312的克隆子去掉冗余 DNA后， 序 列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白属于液泡膜钠氢反向转运蛋 白。 本文将 SEQ ID No: 3序列对应的全长编码基因命名为 7¾Μ¾Γ2， 其对应的蛋白 命名为 ΝΗΧ2。
SEQ ID No: 3：
ACAAACTTCC ATTCGTTGAG TGTCTCATGT TTGGCTCTCT TATCTCAGCC ACTGATCCTG
1 TCACTGTCTT GTCCATATTT CAGGAACTTG GCTCCGATGT GAATTTGTAT GCCCTGGTGT2 1 TTGGAGAATC AGTTTTGAAT GATGCTATGG CCATATCTCT CTACAGGACA ATGTCCTTGG81 TGAGAAGTCA CTCATCTGGA CAGAATATCT TTATGGTGGT AGTCAGGTTT CTCGAAACCT4 1 TTATCGGTTC AATGTCTGCA GGGGTTGGAG TTGGATTTAC ATCTGCTCTC CTCTTCAAGT01 ATGCAGGGCT GGATGTTGAT AATTTGCAGA ACTTGGAGTG CTGCCTCTTT GTGCTTTTCC61 CATATTTCTC ATACATGCTT GCTGAGGGTC TCAGTCTATC TGGCATTGTA TCGATTCTAT2 1 TTACTGGGAT TGTCATGAAG CATTATACCT ACTCAAACTT GTCTGTAAAT TCTCAGCGAT81 TTGTGTCTGC ATTCTTTCAT CTGATATCTT CGCTGGCAGA GACATTTGTG TTCATCTACA4 1 TGGGTTTTGA TATTGCCATG GAAAAGCATA GTTGGTCACA CTTGGGATTC ATCTTTTTTT01 CTATTCTGTT TATCGTTATT GCGAGGGCAG CTAATGTGTT TGGTTGTGGA TATTTGGTCA61 ACCTGGCACG ACCTGCTCAT AGGAAAATAC CAATGACGCA TCAAAAAGCA CTTTGGT
ThNHX2全长编码基因的克隆
根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计如下两条特异性引物， 作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。
ThNHX2 GSP 1： SEQ ID No： 4：
GCGAGGGCAG CTAATGTGTT TG
ThNHX2 GSP2: SEQ ID No: 5：
ACCTGCTCAT AGGAAAATAC CA
实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下：
50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1 双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72 °C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产 物中片段约为 900 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中 （具体方法同上）， 并 在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行 菌液 PCR扩增， 得 4个阳性克隆， 将 4个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易有限 公司测序测序， 获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。
根据已经获得的 7¾NHJ 基因片段， 设计如下三条特异性引物， 作为 5 ' RACE 的 3 ' 端特异性引物。
ThNHX2 GSP3 : SEQ ID No: 6： CCTGCATACT TGAAGAGGAG AGC
ThNHX2 GSP4: SEQ ID No: 7：
CCAACTCCAA CCCCTGCAGA CA
ThNHX2 GSP5 : SEQ ID No: 8：
TCTGTCCAGA TGAGTGACTT CT
实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6 ) 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ ΐ以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 55 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8与 引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72 °C延伸 10分钟。 回收第二次 PCR产 物中片段约为 700 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中 （具体方法同上）， 并 将转化后的菌液涂布于含 50 μ§/ηΛ氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜 后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 8与引 物 AUAP进行菌液 PCR扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 6个阳性克隆， 选 取其中 4个克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序测序， 获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。 所得的 5'RACE产物克隆测序后， 将其与 3'RACE产物测序结果以 及 SEQ ID No: 3序列进行拼接。 获得 7¾ £Ώ全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9：
1 CAACTACCAT TGATATAAAC CCTAGAATTT TATTTCTGCA AGGCGTAATG TCGGAGCTGC
61 AGATTTCGCC GGCGATTCAC GATCCGCAAG GCCAAGAGAA GCAGCAGCAG GCCGCCGGAG
121 TTGGGATTTT GCTTCAGATC ATGATGCTTG TCCTCTCTTT TGTACTCGGT CATGTCCTTC 181 GCCGTCATAA GTTCTATTAT CTACCCGAAG CTAGTGCTTC GCTTCTCATC GGGTTGATCG
241 TTGGTGGTTT GGCGAACATC TCGAACACGG AGACTAGCAT AAGGACATGG TTCAATTTCC
301 ACGACGAGTT CTTCTTTCTG TTTCTGCTGC CACCCATTAT ATTCCAGTCA GGATTCAGTC
361 TACAACCCAA ACCATTCTTT TCAAACTTTG GAGCCATTGT CACTTTCTCC GTACTTGGAA
421 CTTTCGTAGC TTCCATGGTC ACAGGCGTGC TAGTGTACCT TGGCGGTGTG ATGTTTCTCA 481 TGTACAAACT TCCATTCGTT GAGTGTCTCA TGTTTGGCTC TCTTATCTCA GCCACTGATC
541 CTGTCACTGT CTTGTCCATA TTTCAGGAAC TTGGCTCCGA TGTGAATTTG TATGCCCTGG
601 TGTTTGGAGA ATCAGTTTTG AATGATGCTA TGGCCATATC TCTCTACAGG ACAATGTCCT
661 TGGTGAGAAG TCACTCATCT GGACAGAATA TCTTTATGGT GGTAGTCAGG TTTCTCGAAA 72 1 CCTTTATCGG TTCAATGTCT GCAGGGGTTG GAGTTGGATT TACATCTGCT CTCCTCTTCA
781 AGTATGCAGG GCTGGATGTT GATAATTTGC AGAACTTGGA GTGCTGCCTC TTTGTGCTTT
84 1 TCCCATATTT CTCATACATG CTTGCTGAGG GTCTCAGTCT ATCTGGCATT GTATCGATTC
901 TATTTACTGG GATTGTCATG AAGCATTATA CCTACTCAAA CTTGTCTGTA AATTCTCAGC
961 GATTTGTGTC TGCATTCTTT CATCTGATAT CTTCGCTGGC AGAGACATTT GTGTTCATCT
102 1 ACATGGGTTT TGATATTGCC ATGGAAAAGC ATAGTTGGTC ACACTTGGGA TTCATCTTTT
1081 TTTCTATTCT GTTTATCGTT ATTGCGAGGG CAGCTAATGT GTTTGGTTGT GGATATTTGG
114 1 TCAACCTGGC ACGACCTGCT CATAGGAAAA TACCAATGAC GCATCAAAAA GCACTTTGGT
12 01 ACAGTGGACT TCGAGGCGCT ATGGCTTTTG CTCTTGCTCT ACAATCTGTT CATGATCTTC
1261 CAGAAGGACA TGGTCAAACC ATCTTCACAG CAACGACAGC CATTGTTGTT CTGACGGTGT
132 1 TGCTAATTGG AGGATCCACT GGTACAATGC TTGAAGCCCT AGAGGTTGTA GGCGATAGCC
13 81 ATGATACATC CCTTGGTGAT GGCTTTGAGG TGGTGAACAA TCGTTTCATG ACAAGTTATG
144 1 ATGATGAAGA TTCACCATCA GGGAGTGGAT TCAGGACAAA ACTAAGAGAG TTCCATAAGA
1501 GCGCCGCGTC ATTTACAGAA CTAGACAGAA ACTACCTAAC ACCGTTCTTC ACAAGTAACA
1561 ACGGAGATTA TGATGATGAG GATAACACTG AGCAAGACCA TGAAGAACGA ATGCCTTTCA
162 1 CTAGAAGAGG GAATTTTAAT AACCGCGGCT AATTACCTGA GACGAGAAAC CTAGTTGTTA
1681 TCAGTTATCA CACTCACAGG CAT AT CAT AT ATTAGTGAAG CAGCCGTTGG TGTACATATA
174 1 GAAAACATAC TGGATCGTTC CGAAGAACTA TGTTGAGTAG TAGTAGTAGT CGTCAGATTA
1801 CTGGACTGTG TTGTGTTGTT ACTCTGAACC TTGGTGGGGA TATTGTTTGG CTAATTACAT
1861 CCACACAAGC TTAAGAAAAA AAAGAGGAAA AACAAAACTT TGATGCCATG GCTGGCTCAA
192 1 TCCCACGAAT CTCGTTCTGT AGGTTTCGTA TTAAATTCTG TCTCTGTCTC AATTAACTAA
1981 ATTTCCTTCT TTTTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA
根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下：
SEQ ID No: 10：
ATGTCGGAGC TGCAGATTTC GC
SEQ ID No: 11：
TTAGCCGCGG TTATTAAAAT TCCC 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 ThNHX2全长编码基因。
采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以小盐芥的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 l PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。
PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟， 离心， 去上清， 晾干， 然后用 21 μ ΐ 双蒸水溶解。 然后向其中加入 2.5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer 0.5 μ 1 5 mM的 dATP、 1.0 μ 1 Ex Taq。 反应条件： 70°C反应 30分 钟。 将得到的约 1600 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体上 （得到 ThNHX2-pGEM质粒） ， 然后转化大肠杆菌 JM109感受态细胞中 (方法同上）， 并在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10 个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后 加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 7个阳性克隆， 选取其中 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序， 所得序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
NHX2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1
1 MSELQISPAI HDPQGQEKQQ
21 QAAGVGILLQ IMMLVLSFVL
41 GHVLRRHKFY YLPEASASLL
61 IGLIVGGLAN ISNTETS IRT
81 WFNFHDEFFF LFLLPPI I FQ
101 SGFSLQPKPF FSNFGAIVTF
121 SVLGTFVASM VTGVLVYLGG
141 VMFLMYKLPF VECLMFGSLI
161 SATDPVTVLS I FQELGSDVN
181 LYALVFGESV LNDAMAISLY
201 RTMSLVRSHS SGQNI FMVW
221 RFLETFIGSM SAGVGVGFTS
241 ALLFKYAGLD VDNLQNLECC
261 LFVLFPYFSY MLAEGLSLSG
281 IVS ILFTGIV MKHYTYSNLS
301 VNSQRFVSAF FHLISSLAET
321 FVFIYMGFDI AMEKHSWSHL
341 GFI FFS ILFI VIARAANVFG
361 CGYLVNLARP AHRKI PMTHQ
381 KALWYSGLRG AMAFALALQS
401 VHDLPEGHGQ TI FTATTAIV
421 VLTVLLIGGS TGTMLEALEV
441 VGDSHDTSLG DGFEWNNRF
461 MTSYDDEDSP SGSGFRTKLR
481 EFHKSAASFT ELDRNYLTPF
501 FTSNNGDYDD EDNTEQDHEE 52 1 RMPFTRRGNF NNRG*
ThNHX2基因的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2
1 ATGTCGGAGC TGCAGATTTC GCCGGCGATT CACGATCCGC AAGGCCAAGA GAAGCAGCAG
61 CAGGCCGCCG GAGTTGGGAT TTTGCTTCAG ATCATGATGC TTGTCCTCTC TTTTGTACTC
12 1 GGTCATGTCC TTCGCCGTCA TAAGTTCTAT TATCTACCCG AAGCTAGTGC TTCGCTTCTC
181 ATCGGGTTGA TCGTTGGTGG TTTGGCGAAC ATCTCGAACA CGGAGACTAG CATAAGGACA
24 1 TGGTTCAATT TCCACGACGA GTTCTTCTTT CTGTTTCTGC TGCCACCCAT TATATTCCAG
3 01 TCAGGATTCA GTCTACAACC CAAACCATTC TTTTCAAACT TTGGAGCCAT TGTCACTTTC
361 TCCGTACTTG GAACTTTCGT AGCTTCCATG GTCACAGGCG TGCTAGTGTA CCTTGGCGGT
42 1 GTGATGTTTC TCATGTACAA ACTTCCATTC GTTGAGTGTC TCATGTTTGG CTCTCTTATC
4 81 TCAGCCACTG ATCCTGTCAC TGTCTTGTCC ATATTTCAGG AACTTGGCTC CGATGTGAAT
54 1 TTGTATGCCC TGGTGTTTGG AGAATCAGTT TTGAATGATG CTATGGCCAT ATCTCTCTAC
601 AGGACAATGT CCTTGGTGAG AAGTCACTCA TCTGGACAGA ATATCTTTAT GGTGGTAGTC
661 AGGTTTCTCG AAACCTTTAT CGGTTCAATG TCTGCAGGGG TTGGAGTTGG ATTTACATCT
72 1 GCTCTCCTCT TCAAGTATGC AGGGCTGGAT GTTGATAATT TGCAGAACTT GGAGTGCTGC
781 CTCTTTGTGC TTTTCCCATA TTTCTCATAC ATGCTTGCTG AGGGTCTCAG TCTATCTGGC
84 1 ATTGTATCGA TTCTATTTAC TGGGATTGTC ATGAAGCATT ATACCTACTC AAACTTGTCT
901 GTAAATTCTC AGCGATTTGT GTCTGCATTC TTTCATCTGA TATCTTCGCT GGCAGAGACA
961 TTTGTGTTCA TCTACATGGG TTTTGATATT GCCATGGAAA AGCATAGTTG GTCACACTTG
102 1 GGATTCATCT TTTTTTCTAT TCTGTTTATC GTTATTGCGA GGGCAGCTAA TGTGTTTGGT
1081 TGTGGATATT TGGTCAACCT GGCACGACCT GCTCATAGGA AAATACCAAT GACGCATCAA
114 1 AAAGCACTTT GGTACAGTGG ACTTCGAGGC GCTATGGCTT TTGCTCTTGC TCTACAATCT
12 01 GTTCATGATC TTCCAGAAGG ACATGGTCAA ACCATCTTCA CAGCAACGAC AGCCATTGTT
1261 GTTCTGACGG TGTTGCTAAT TGGAGGATCC ACTGGTACAA TGCTTGAAGC CCTAGAGGTT
132 1 GTAGGCGATA GCCATGATAC ATCCCTTGGT GATGGCTTTG AGGTGGTGAA CAATCGTTTC
13 81 ATGACAAGTT ATGATGATGA AGATTCACCA TCAGGGAGTG GATTCAGGAC AAAACTAAGA
144 1 GAGTTCCATA AGAGCGCCGC GTCATTTACA GAACTAGACA GAAACTACCT AACACCGTTC
1501 TTCACAAGTA ACAACGGAGA TTATGATGAT GAGGATAACA CTGAGCAAGA CCATGAAGAA
1561 CGAATGCCTT TCACTAGAAG AGGGAATTTT AATAACCGCG GCTAA
实施例 3 ThNHX2基因的植物表达载体构建
选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 ThNHX2 基因的启动子和终止子， 构建流程图如图 1所示。 使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13， 以植物表达载体 pBI121 (购自北 京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚 合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121、 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C 变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 EcoRI、 Bglll 酶切将所得的 PCR 产物按试剂盒说明 （Promega , T4 连接酶试剂盒） 连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。
SEQ ID NO: 12
GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga
SEQ ID NO: 13
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
用引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15 以 pBI121为模板扩增 Tnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 pBI121 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预 变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C 延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接 （Promega T4 连接酶 试剂盒） 到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO: 14：
AAGGGTAACGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
SEQ ID NO: 15：
TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA
用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300为模板扩增 35S启 动子。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 l 2.5 mM dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C 延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Sail酶切将所得的 PCR产物连接（连 接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。 SEQ ID NO: 16：
ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：
TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT
用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 7¾NHX2编码基因的全长序列（模 板是实施例 2所获得阳性 ThNHX2-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ThNHX2-pGEM 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 18禾 P SEQ ID NO: 19各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循 环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 Sall、 Kpnl酶切将所得的 PCR产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-3， 获得 植物表达载体 35S-ThNHX2-2300 (图 2 ) 。
SEQ ID NO: 18
ACTGTCGACATGTCGGAGC TGCAGATTTC GC
SEQ ID NO: 19
ACTGGTACCTTAGCCGCGG TTATTAAAAT TCCC 实施例 4 35S-ThNHX2-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc)感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 单斑接种， 28 °C培养 1 至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜 （约 12-16小时） 至 OD6QQ 值为 0.4， 形成种子菌液。 取 5 ml培养活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5小时至 OD6QQ=0.8。 冰浴菌液 10 分钟， 每隔 3 分钟摇匀一次， 使所述细菌均匀进入休眠状 态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 l ml冰预冷的 10% (体积比） 甘 油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (体积比） 甘油重复洗 3-4次； 然后加入适量冰预冷的 10% (体积比） 甘油重新悬浮细菌沉淀， 即制得 LBA4404感受态细胞， 以 40 μ 1/管将其分装， 于 -70°C保存备用。
转化农杆菌： 在冰上融化所述的 LBA4404感受态细胞， 向 40 μ 1的所述感受态 细胞中加入 1 μ 1实施例 3获得的质粒 35S-ThNHX2-2300， 混匀后冰浴约 10分钟。 将 冰浴后的感受态细胞和 35S-ThNHX2-2300 质粒的混合物用移液枪转移到冰预冷的电 击杯 （购自 Bio-Rad) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部， 注意不要有气泡。 将所述 电击杯放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0.1cm 规格的电击杯的时候， MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 "Agr" ， 电击一 次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。 快速而轻柔的用移液枪 将感受态细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 在 28°C下 225 rpm摇动培养 1小 时。 取 100-200 μ ΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含
50 y g/ml利福平、 50 y g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素） ， 28°C培养。 筛选阳性转 化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用。
实施例 5 受体材料拟南芥培养
选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 直 径 9 cm的花盆， 每盆播种 20-30颗。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提 供一个湿润的环境。 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000 lx， 光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 30天后， 保留 4_5棵植株， 光照周 期调整为 8小时黑暗、 16小时光照培养，待大部分植株都抽薹之后， 在花序基部剪掉 整个主苔， 去其顶端优势， 约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔， 待侧苔花序形 成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时， 便可用于转化 （图 3 ) 。 实施例 6 拟南芥花浸转化：
将实施例 4获得的已转化表达载体的农杆菌菌液接种至含有 10-50 μ g/ml卡那霉 素 （kan) 的 LB培养基中培养过夜， 第二天早上按 1： 50接种至含有抗生素的新的 LB 培养基中 （1L) ， 培养约 8个小时， 农杆菌液 0D6。。应当在 1. 0到 1. 2之间。 室温 5000 rpm离心 5分钟， 弃上清， 将农杆菌沉淀悬浮于渗透培养基里 （1/2MS; 5% 蔗糖； 用 K0H调至 pH5. 7; 0. 02% Si lwet L-77 ) ， 使 0D6。。在 0. 8左右。 将实施例 5制备的用于 转化的拟南芥的上部缓缓、 螺旋式浸入接种培养基内， 轻轻顺时针晃荡， 约 2分钟， 用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。 之后 2-3周， 保证植株水分充足。 当植株停止开花， 第一个果荚成熟变黄时， 用纸袋 套住， 当纸袋内的所有果荚变黄后， 停止浇水， 1-2周干燥后取回实验室， 进行转化 子选择， 同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。 实施例 7 拟南芥阳性转化子的筛选：
种子消毒： 先用 70%乙醇浸泡 10分钟， 在上述处理时要不时地使种子悬浮； 然 后用无菌水洗四次， 在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。 处理后的种子均匀涂布 在含 50 g/ml kan的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天 （一块 150 mm直径的平 皿最多播种 1500棵） ， 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000 k， 光照周期为 12小时黑暗 、 12小时光照培养， 培养 7-10天。 根据生长状况判断是否为转基因种子。 成功转入 重组质粒的种子能够在抗性培养基上正常生长出 4片以上真叶。非转基因种子不能正 常生长， 仅能长出 2片子叶， 根的生长也受到严重抑制， 一般萌发 10天以后死亡。 转基因种子在 MS+kan平板上萌发 2周以后， 将阳性植株转入土壤继续培养， 转基因 拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测， 去除阴性植株， 收集阳性 植株种子， 标号： T0cl-T0c22。 实施例 8 过表达 ThNHX2的转基因拟南芥 T1代植株的种植
选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 TOcl-TOC20每个转化子播种 2盆， 对照拟南芥播种 2盆， 每盆播种 20-30颗种子。 播种 以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一个湿润的环境。 恒温 22 °C， 光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS, 培 养 25天后， 转基因拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测， 去除阴 性植株， 保留 7-8 阳性棵苗， 继续培养 10天后， 选取大小一致的转基因拟南芥、 对 照拟南芥做耐盐实验， 每盆保留大小较一致的 4-5棵苗。 实施例 9 过表达 ThNHX2的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验
转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆不作处理， 正常浇灌 1/2MS, 转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2MS, 恒温 22V， 光照强度 3500-4000 lx, 12小时光培养 /12小时暗培养循环。 10天后观察实验结果： T1代转基因植株（TO 代转基因植株的种子长成的植株） 的耐盐性鉴定表明， T1 代转基因植株 Tlc4、
Tlc7、 Tlc9三个株系表现出明显的耐盐性（见图 4， 以 Tlc4例， Tlc7、 Tlc9的结果 与类似， 在此未示出） 。 实施例 10 在转录水平上验证 7¾Λ¾Χ2基因的表达
实施例 9中耐盐好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵 （分别属于上述三个耐盐 株系）， 实施例 9中对照植株随机选取 4棵， 各剪取盐处理 14天的叶片 0.05 g， 用植 物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。 紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm 和 280 nm 的吸光度值， 计算各个 RNA 浓度。 依照 Invitrogen 反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 （1 μ g总 RNA作为模板， 反转录引物 SEQ ID NO: 11 ) 。 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO : 20： CCTGCAGACA TTGAACCGAT AA) 扩增 ThNH∑2 , 检测其转录情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反 应。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20各 2.0 μ 1， 以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 32个循环 （94°C变 性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟） ， 72°C延伸 10分钟。 产物电泳结果如 图 5所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司） ， 1-4为不耐盐对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThNHX2-2300质粒）， 5-12为耐盐 T1代转基因拟南芥植株。 图中所示条带大小与阳性对照的大小一致 （约 为 700 bp ) 。 结果表明， 耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 7¾Λ¾Χ2的转录较强， 不耐 盐对照拟南芥植株中没有 ThNHX2的转录。

Claims

权 利 要 求 书
1. 小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所 示。
2. 编码权利要求 1 的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID
NO: 2所示。
3. 一种重组表达载体， 其是通过将权利要求 2 的基因插入到一种表达载体而获 得的， 并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接， 优 选地， 所述表达载体是 pC AMBI A2300。
4. 权利要求 3 所述的重组表达载体， 其为附图 2所示的 35S-ThNHX2-2300载 体。
5. 一种重组细胞， 其含有权利要求 2的基因或者权利要求 3或 4的重组表达载 体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐盐的方法， 包括： 将权利要求 2 的基因或者权利要求 3 或 4 的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物是拟南 芥。
7. 一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利 要求 2的基因或者权利要求 3或 4的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7的方法， 其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2的基因、 权利要求 3或 4的重组表达载体或者权利要求 5的重组细 胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9的用途， 其中所述植物是拟南芥。
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