CN105008386A

CN105008386A - 一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白nhx2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105008386A
Application number: CN201380074516.4A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 梁远金; 田大翠; 刘捷
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-04-22
Also published as: WO2014172825A1; CN105008386B

Abstract

一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因，以及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

Description

一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX2及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

背景技术盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷，占灌溉农田的 1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展（Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 201 1. Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ) 。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。

发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白（本文命名为 NHX2)的编码基因，并测定了其 DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株后，可明显改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白 NHX2 的编码基因 (本文命名为 7¾NH 2) ，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是

PCAMBIA2300; 并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-ThNHX2-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。附图说明

图 1是 NHX2基因的植物表达载体（35S-ThNHX2-2300) 构建流程（图 la-lb) 。图 2是 NHX2基因的植物表达载体（35S-ThNHX2-2300) 的质粒图。图 3是培养的供试植物拟南芥。图 4是 ThNHX2转基因拟南芥的 T1代植株的耐盐实验结果， Tlc4表现出明显的耐盐性， Tlcl7、 Tlcl9的结果与其类似，在此未示出。

图 5为利用反转录 PCR对 1\代转基因烟草植株和非转基因对照植株中 ThNHX2基因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-4为不耐盐的对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThNHX2-2300质粒）， 5-12 为耐盐 T1代转基因拟南芥植株。

具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。实施例 1. 盐胁迫下小盐芥 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（差减文库）。在实验过程中以生长过程中盐处理的小盐芥组织中提取的 mRNA作为样本（Tester) ，以未处理的小盐芥组织中提取的 mRNA作为对照（Driver) 。具体步骤如下：

( 1 ) 供试材料：

小盐芥（ TheUungieUa halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色植物园盐生植物繁育中心）播种到灭菌的蛭石上，在 22°C、光周期 12 小时光照 /12 小时黑暗（光强 3000— 4000 Lx) 条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（含有 9.39 mM KN0₃ , 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM NH4NO3 , 0.75 mM MgS0₄， 1.5 mM CaCl₂， 50 μ M KI, 100 μ M H3BO3 , 100 μ M MnS0₄, 30 μ M ZnS0₄， 1 μ M Na₂Mo0₄， 0.1 μ M CoCl₂, 100 μ M Na₂EDTA, 100 μ M FeS0₄)—次。当植株长到直径达为 5-6 cm 时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试植株分为 2组，每组 4盆，每盆 3株。第一组为对照组，正常地用 1/2MS 浇灌；第二组为盐处理组，浇灌 300 mM NaCl溶液，将两组植物在 22°C、光周期 12 小时光照 /12小时黑暗（光强 3000— 4000 Lx) 条件下培养处理 10天，然后及时收集两组植株（用蒸熘水洗净根部），用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。 ( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的小盐芥 3.0 g，用植物 RNA 提取试剂盒（购自 invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆。/OD₂₈。比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。

( 4) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段（PCR进行前，第二次正向差减杂交产物进行末端补平）。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书，将所述第二次正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在 200 l PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接酶 1 μ 1，于 4°C连接过夜。然后取 10 μ ΐ连接反应产物，加入到 100 μ ΐ感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中，冰浴 30分钟、热休克 60秒、冰浴 2分钟，另加 250 液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5%酵母提取物（Yeast Extract, 购自 OXOID) 禾 P 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C摇床中，以 225 rpm振荡培养 30分钟，然后从中取 200 μ ΐ菌液接种于含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB (同上) /X-gal ( 5-溴-4氯-3-吲哚^ -0-半乳糖苷） /IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）（X-gal/IPTG购自 TAKARA) LB固体培养板上， 37°C培育 18小时。计数培养板中直径 > 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落，随机挑取 450 个白色菌落（编号： Th-S001至 Th-S450) 。将所挑取白色菌落克隆接种于 96孔细胞培养板（CORNING) 中的含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB (同上）液体培养基， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比），然后于 - 80°C保存备用。对所培养的菌落克隆以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒）进行菌液 PCR扩增验证，得到 342个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到 301个有效表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST) ( Unigene ) 。

实施例 2小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白基因 ThNHX2的克隆

将所述鉴定的小盐芥 SSH文库中来自菌落 Th-S312的克隆子去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列编码的蛋白属于液泡膜钠氢反向转运蛋白。本文将 SEQ ID No: 3序列对应的全长编码基因命名为 7¾Μ¾Γ2，其对应的蛋白命名为 ΝΗΧ2。

SEQ ID No: 3：

ACAAACTTCC ATTCGTTGAG TGTCTCATGT TTGGCTCTCT TATCTCAGCC ACTGATCCTG

1 TCACTGTCTT GTCCATATTT CAGGAACTTG GCTCCGATGT GAATTTGTAT GCCCTGGTGT2 1 TTGGAGAATC AGTTTTGAAT GATGCTATGG CCATATCTCT CTACAGGACA ATGTCCTTGG81 TGAGAAGTCA CTCATCTGGA CAGAATATCT TTATGGTGGT AGTCAGGTTT CTCGAAACCT4 1 TTATCGGTTC AATGTCTGCA GGGGTTGGAG TTGGATTTAC ATCTGCTCTC CTCTTCAAGT01 ATGCAGGGCT GGATGTTGAT AATTTGCAGA ACTTGGAGTG CTGCCTCTTT GTGCTTTTCC61 CATATTTCTC ATACATGCTT GCTGAGGGTC TCAGTCTATC TGGCATTGTA TCGATTCTAT2 1 TTACTGGGAT TGTCATGAAG CATTATACCT ACTCAAACTT GTCTGTAAAT TCTCAGCGAT81 TTGTGTCTGC ATTCTTTCAT CTGATATCTT CGCTGGCAGA GACATTTGTG TTCATCTACA4 1 TGGGTTTTGA TATTGCCATG GAAAAGCATA GTTGGTCACA CTTGGGATTC ATCTTTTTTT01 CTATTCTGTT TATCGTTATT GCGAGGGCAG CTAATGTGTT TGGTTGTGGA TATTTGGTCA61 ACCTGGCACG ACCTGCTCAT AGGAAAATAC CAATGACGCA TCAAAAAGCA CTTTGGT

ThNHX2全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计如下两条特异性引物，作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。

ThNHX2 GSP 1： SEQ ID No： 4：

GCGAGGGCAG CTAATGTGTT TG

ThNHX2 GSP2: SEQ ID No: 5：

ACCTGCTCAT AGGAAAATAC CA

实验步骤按试剂盒说明书操作（ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带），以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1 双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72 °C延伸 10分钟。回收第二次 PCR产物中片段约为 900 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行菌液 PCR扩增，得 4个阳性克隆，将 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的 7¾NHJ 基因片段，设计如下三条特异性引物，作为 5 ' RACE 的 3 ' 端特异性引物。

ThNHX2 GSP3 : SEQ ID No: 6： CCTGCATACT TGAAGAGGAG AGC

ThNHX2 GSP4: SEQ ID No: 7：

CCAACTCCAA CCCCTGCAGA CA

ThNHX2 GSP5 : SEQ ID No: 8：

TCTGTCCAGA TGAGTGACTT CT

实验步骤按试剂盒说明书操作（ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA

Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带），以盐处理组小盐芥提取的 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6 ) 为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ ΐ以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 55 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72 °C延伸 10分钟。回收第二次 PCR产物中片段约为 700 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自 OMEGA) ，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 μ_§/ηΛ氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 6个阳性克隆，选取其中 4个克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。所得的 5'RACE产物克隆测序后，将其与 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3序列进行拼接。获得 7¾ £Ώ全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9：

1 CAACTACCAT TGATATAAAC CCTAGAATTT TATTTCTGCA AGGCGTAATG TCGGAGCTGC

61 AGATTTCGCC GGCGATTCAC GATCCGCAAG GCCAAGAGAA GCAGCAGCAG GCCGCCGGAG

121 TTGGGATTTT GCTTCAGATC ATGATGCTTG TCCTCTCTTT TGTACTCGGT CATGTCCTTC 181 GCCGTCATAA GTTCTATTAT CTACCCGAAG CTAGTGCTTC GCTTCTCATC GGGTTGATCG

241 TTGGTGGTTT GGCGAACATC TCGAACACGG AGACTAGCAT AAGGACATGG TTCAATTTCC

301 ACGACGAGTT CTTCTTTCTG TTTCTGCTGC CACCCATTAT ATTCCAGTCA GGATTCAGTC

361 TACAACCCAA ACCATTCTTT TCAAACTTTG GAGCCATTGT CACTTTCTCC GTACTTGGAA

421 CTTTCGTAGC TTCCATGGTC ACAGGCGTGC TAGTGTACCT TGGCGGTGTG ATGTTTCTCA 481 TGTACAAACT TCCATTCGTT GAGTGTCTCA TGTTTGGCTC TCTTATCTCA GCCACTGATC

541 CTGTCACTGT CTTGTCCATA TTTCAGGAAC TTGGCTCCGA TGTGAATTTG TATGCCCTGG

601 TGTTTGGAGA ATCAGTTTTG AATGATGCTA TGGCCATATC TCTCTACAGG ACAATGTCCT

661 TGGTGAGAAG TCACTCATCT GGACAGAATA TCTTTATGGT GGTAGTCAGG TTTCTCGAAA 72 1 CCTTTATCGG TTCAATGTCT GCAGGGGTTG GAGTTGGATT TACATCTGCT CTCCTCTTCA

781 AGTATGCAGG GCTGGATGTT GATAATTTGC AGAACTTGGA GTGCTGCCTC TTTGTGCTTT

84 1 TCCCATATTT CTCATACATG CTTGCTGAGG GTCTCAGTCT ATCTGGCATT GTATCGATTC

901 TATTTACTGG GATTGTCATG AAGCATTATA CCTACTCAAA CTTGTCTGTA AATTCTCAGC

961 GATTTGTGTC TGCATTCTTT CATCTGATAT CTTCGCTGGC AGAGACATTT GTGTTCATCT

102 1 ACATGGGTTT TGATATTGCC ATGGAAAAGC ATAGTTGGTC ACACTTGGGA TTCATCTTTT

1081 TTTCTATTCT GTTTATCGTT ATTGCGAGGG CAGCTAATGT GTTTGGTTGT GGATATTTGG

114 1 TCAACCTGGC ACGACCTGCT CATAGGAAAA TACCAATGAC GCATCAAAAA GCACTTTGGT

12 01 ACAGTGGACT TCGAGGCGCT ATGGCTTTTG CTCTTGCTCT ACAATCTGTT CATGATCTTC

1261 CAGAAGGACA TGGTCAAACC ATCTTCACAG CAACGACAGC CATTGTTGTT CTGACGGTGT

132 1 TGCTAATTGG AGGATCCACT GGTACAATGC TTGAAGCCCT AGAGGTTGTA GGCGATAGCC

13 81 ATGATACATC CCTTGGTGAT GGCTTTGAGG TGGTGAACAA TCGTTTCATG ACAAGTTATG

144 1 ATGATGAAGA TTCACCATCA GGGAGTGGAT TCAGGACAAA ACTAAGAGAG TTCCATAAGA

1501 GCGCCGCGTC ATTTACAGAA CTAGACAGAA ACTACCTAAC ACCGTTCTTC ACAAGTAACA

1561 ACGGAGATTA TGATGATGAG GATAACACTG AGCAAGACCA TGAAGAACGA ATGCCTTTCA

162 1 CTAGAAGAGG GAATTTTAAT AACCGCGGCT AATTACCTGA GACGAGAAAC CTAGTTGTTA

1681 TCAGTTATCA CACTCACAGG CAT AT CAT AT ATTAGTGAAG CAGCCGTTGG TGTACATATA

174 1 GAAAACATAC TGGATCGTTC CGAAGAACTA TGTTGAGTAG TAGTAGTAGT CGTCAGATTA

1801 CTGGACTGTG TTGTGTTGTT ACTCTGAACC TTGGTGGGGA TATTGTTTGG CTAATTACAT

1861 CCACACAAGC TTAAGAAAAA AAAGAGGAAA AACAAAACTT TGATGCCATG GCTGGCTCAA

192 1 TCCCACGAAT CTCGTTCTGT AGGTTTCGTA TTAAATTCTG TCTCTGTCTC AATTAACTAA

1981 ATTTCCTTCT TTTTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA

根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下：

SEQ ID No: 10：

ATGTCGGAGC TGCAGATTTC GC

SEQ ID No: 11：

TTAGCCGCGG TTATTAAAAT TCCC 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 ThNHX2全长编码基因。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以小盐芥的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 l PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，然后用 21 μ ΐ 双蒸水溶解。然后向其中加入 2.5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer 0.5 μ 1 5 mM的 dATP、 1.0 μ 1 Ex Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到的约 1600 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），并将其连接至 pGEM T-easy载体上（得到 ThNHX2-pGEM质粒），然后转化大肠杆菌 JM109感受态细胞中 (方法同上），并在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10 个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增（反应体系及反应条件同上），得到 7个阳性克隆，选取其中 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

NHX2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MSELQISPAI HDPQGQEKQQ

21 QAAGVGILLQ IMMLVLSFVL

41 GHVLRRHKFY YLPEASASLL

61 IGLIVGGLAN ISNTETS IRT

81 WFNFHDEFFF LFLLPPI I FQ

101 SGFSLQPKPF FSNFGAIVTF

121 SVLGTFVASM VTGVLVYLGG

141 VMFLMYKLPF VECLMFGSLI

161 SATDPVTVLS I FQELGSDVN

181 LYALVFGESV LNDAMAISLY

201 RTMSLVRSHS SGQNI FMVW

221 RFLETFIGSM SAGVGVGFTS

241 ALLFKYAGLD VDNLQNLECC

261 LFVLFPYFSY MLAEGLSLSG

281 IVS ILFTGIV MKHYTYSNLS

301 VNSQRFVSAF FHLISSLAET

321 FVFIYMGFDI AMEKHSWSHL

341 GFI FFS ILFI VIARAANVFG

361 CGYLVNLARP AHRKI PMTHQ

381 KALWYSGLRG AMAFALALQS

401 VHDLPEGHGQ TI FTATTAIV

421 VLTVLLIGGS TGTMLEALEV

441 VGDSHDTSLG DGFEWNNRF

461 MTSYDDEDSP SGSGFRTKLR

481 EFHKSAASFT ELDRNYLTPF

501 FTSNNGDYDD EDNTEQDHEE 52 1 RMPFTRRGNF NNRG*

ThNHX2基因的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2

1 ATGTCGGAGC TGCAGATTTC GCCGGCGATT CACGATCCGC AAGGCCAAGA GAAGCAGCAG

61 CAGGCCGCCG GAGTTGGGAT TTTGCTTCAG ATCATGATGC TTGTCCTCTC TTTTGTACTC

12 1 GGTCATGTCC TTCGCCGTCA TAAGTTCTAT TATCTACCCG AAGCTAGTGC TTCGCTTCTC

181 ATCGGGTTGA TCGTTGGTGG TTTGGCGAAC ATCTCGAACA CGGAGACTAG CATAAGGACA

24 1 TGGTTCAATT TCCACGACGA GTTCTTCTTT CTGTTTCTGC TGCCACCCAT TATATTCCAG

3 01 TCAGGATTCA GTCTACAACC CAAACCATTC TTTTCAAACT TTGGAGCCAT TGTCACTTTC

361 TCCGTACTTG GAACTTTCGT AGCTTCCATG GTCACAGGCG TGCTAGTGTA CCTTGGCGGT

42 1 GTGATGTTTC TCATGTACAA ACTTCCATTC GTTGAGTGTC TCATGTTTGG CTCTCTTATC

4 81 TCAGCCACTG ATCCTGTCAC TGTCTTGTCC ATATTTCAGG AACTTGGCTC CGATGTGAAT

54 1 TTGTATGCCC TGGTGTTTGG AGAATCAGTT TTGAATGATG CTATGGCCAT ATCTCTCTAC

601 AGGACAATGT CCTTGGTGAG AAGTCACTCA TCTGGACAGA ATATCTTTAT GGTGGTAGTC

661 AGGTTTCTCG AAACCTTTAT CGGTTCAATG TCTGCAGGGG TTGGAGTTGG ATTTACATCT

72 1 GCTCTCCTCT TCAAGTATGC AGGGCTGGAT GTTGATAATT TGCAGAACTT GGAGTGCTGC

781 CTCTTTGTGC TTTTCCCATA TTTCTCATAC ATGCTTGCTG AGGGTCTCAG TCTATCTGGC

84 1 ATTGTATCGA TTCTATTTAC TGGGATTGTC ATGAAGCATT ATACCTACTC AAACTTGTCT

901 GTAAATTCTC AGCGATTTGT GTCTGCATTC TTTCATCTGA TATCTTCGCT GGCAGAGACA

961 TTTGTGTTCA TCTACATGGG TTTTGATATT GCCATGGAAA AGCATAGTTG GTCACACTTG

102 1 GGATTCATCT TTTTTTCTAT TCTGTTTATC GTTATTGCGA GGGCAGCTAA TGTGTTTGGT

1081 TGTGGATATT TGGTCAACCT GGCACGACCT GCTCATAGGA AAATACCAAT GACGCATCAA

114 1 AAAGCACTTT GGTACAGTGG ACTTCGAGGC GCTATGGCTT TTGCTCTTGC TCTACAATCT

12 01 GTTCATGATC TTCCAGAAGG ACATGGTCAA ACCATCTTCA CAGCAACGAC AGCCATTGTT

1261 GTTCTGACGG TGTTGCTAAT TGGAGGATCC ACTGGTACAA TGCTTGAAGC CCTAGAGGTT

132 1 GTAGGCGATA GCCATGATAC ATCCCTTGGT GATGGCTTTG AGGTGGTGAA CAATCGTTTC

13 81 ATGACAAGTT ATGATGATGA AGATTCACCA TCAGGGAGTG GATTCAGGAC AAAACTAAGA

144 1 GAGTTCCATA AGAGCGCCGC GTCATTTACA GAACTAGACA GAAACTACCT AACACCGTTC

1501 TTCACAAGTA ACAACGGAGA TTATGATGAT GAGGATAACA CTGAGCAAGA CCATGAAGAA

1561 CGAATGCCTT TCACTAGAAG AGGGAATTTT AATAACCGCG GCTAA

实施例 3 ThNHX2基因的植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 ThNHX2 基因的启动子和终止子，构建流程图如图 1所示。使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13，以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121、 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 EcoRI、 Bglll 酶切将所得的 PCR 产物按试剂盒说明（Promega , T4 连接酶试剂盒）连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO: 13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15 以 pBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 pBI121 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C 延伸 10分钟。通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接（Promega T4 连接酶试剂盒）到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTAACGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300为模板扩增 35S启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 l 2.5 mM dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C 延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 HindIII、 Sail酶切将所得的 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。 SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT

用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 7¾NHX2编码基因的全长序列（模板是实施例 2所获得阳性 ThNHX2-pGEM质粒），采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ThNHX2-pGEM 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 18禾 P SEQ ID NO: 19各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。通过 Sall、 Kpnl酶切将所得的 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 35S-ThNHX2-2300 (图 2 ) 。

SEQ ID NO: 18

ACTGTCGACATGTCGGAGC TGCAGATTTC GC

SEQ ID NO: 19

ACTGGTACCTTAGCCGCGG TTATTAAAAT TCCC 实施例 4 35S-ThNHX2-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc)感受态细胞的制备：提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28 °C培养 1 至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD_6QQ 值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml培养活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5小时至 OD_6QQ=0.8。冰浴菌液 10 分钟，每隔 3 分钟摇匀一次，使所述细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10分钟，弃上清液；加入 l ml冰预冷的 10% (体积比）甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟，收集沉淀；用冰预冷的 10% (体积比）甘油重复洗 3-4次；然后加入适量冰预冷的 10% (体积比）甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞，以 40 μ 1/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化所述的 LBA4404感受态细胞，向 40 μ 1的所述感受态细胞中加入 1 μ 1实施例 3获得的质粒 35S-ThNHX2-2300，混匀后冰浴约 10分钟。将冰浴后的感受态细胞和 35S-ThNHX2-2300 质粒的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯（购自 Bio-Rad) 中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部，注意不要有气泡。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1cm 规格的电击杯的时候， MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。快速而轻柔的用移液枪将感受态细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下 225 rpm摇动培养 1小时。取 100-200 μ ΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含

50 y g/ml利福平、 50 y g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。

实施例 5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。直径 9 cm的花盆，每盆播种 20-30颗。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22°C，光照强度 3500-4000 lx，光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 30天后，保留 4_5棵植株，光照周期调整为 8小时黑暗、 16小时光照培养，待大部分植株都抽薹之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时，便可用于转化（图 3 ) 。实施例 6 拟南芥花浸转化：

将实施例 4获得的已转化表达载体的农杆菌菌液接种至含有 10-50 μ g/ml卡那霉素（kan) 的 LB培养基中培养过夜，第二天早上按 1： 50接种至含有抗生素的新的 LB 培养基中（1L) ，培养约 8个小时，农杆菌液 0D₆。。应当在 1. 0到 1. 2之间。室温 5000 rpm离心 5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于渗透培养基里（1/2MS; 5% 蔗糖；用 K0H调至 pH5. 7; 0. 02% Si lwet L-77 ) ，使 0D₆。。在 0. 8左右。将实施例 5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入接种培养基内，轻轻顺时针晃荡，约 2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。之后 2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水， 1-2周干燥后取回实验室，进行转化子选择，同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。实施例 7 拟南芥阳性转化子的筛选：

种子消毒：先用 70%乙醇浸泡 10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。处理后的种子均匀涂布在含 50 g/ml kan的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天（一块 150 mm直径的平皿最多播种 1500棵），恒温 22°C，光照强度 3500-4000 k，光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养，培养 7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养基上正常生长出 4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出 2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发 10天以后死亡。转基因种子在 MS+kan平板上萌发 2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养，转基因拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测，去除阴性植株，收集阳性植株种子，标号： T0cl-T0c22。实施例 8 过表达 ThNHX2的转基因拟南芥 T1代植株的种植

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 TOcl-TO_C20每个转化子播种 2盆，对照拟南芥播种 2盆，每盆播种 20-30颗种子。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22 °C，光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 25天后，转基因拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测，去除阴性植株，保留 7-8 阳性棵苗，继续培养 10天后，选取大小一致的转基因拟南芥、对照拟南芥做耐盐实验，每盆保留大小较一致的 4-5棵苗。实施例 9 过表达 ThNHX2的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验

转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆不作处理，正常浇灌 1/2MS, 转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2MS, 恒温 22V，光照强度 3500-4000 lx, 12小时光培养 /12小时暗培养循环。 10天后观察实验结果： T1代转基因植株（TO 代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， T1 代转基因植株 Tlc4、

Tlc7、 Tlc9三个株系表现出明显的耐盐性（见图 4，以 Tlc4例， Tlc7、 Tlc9的结果与类似，在此未示出）。实施例 10 在转录水平上验证 7¾Λ¾Χ2基因的表达

实施例 9中耐盐好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵（分别属于上述三个耐盐株系），实施例 9中对照植株随机选取 4棵，各剪取盐处理 14天的叶片 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm 和 280 nm 的吸光度值，计算各个 RNA 浓度。依照 Invitrogen 反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（1 μ g总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 11 ) 。通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO : 20： CCTGCAGACA TTGAACCGAT AA) 扩增 ThNH∑2 , 检测其转录情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ ΐ PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20各 2.0 μ 1，以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 32个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-4为不耐盐对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThNHX2-2300质粒）， 5-12为耐盐 T1代转基因拟南芥植株。图中所示条带大小与阳性对照的大小一致（约为 700 bp ) 。结果表明，耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 7¾Λ¾Χ2的转录较强，不耐盐对照拟南芥植株中没有 ThNHX2的转录。

Claims

权利要求书

1. 小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。

2. 编码权利要求 1 的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因，其核苷酸序列如 SEQ ID

NO: 2所示。

3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2 的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，优选地，所述表达载体是 pC AMBI A2300。

4. 权利要求 3 所述的重组表达载体，其为附图 2所示的 35S-ThNHX2-2300载体。

5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2的基因或者权利要求 3或 4的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

6. 一种改善植物耐盐的方法，包括：将权利要求 2 的基因或者权利要求 3 或 4 的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2的基因或者权利要求 3或 4的重组表达载体的植物或植物组织。

8. 权利要求 7的方法，其中所述植物是拟南芥。

9. 权利要求 2的基因、权利要求 3或 4的重组表达载体或者权利要求 5的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。

10. 权利要求 9的用途，其中所述植物是拟南芥。