CN105473719B - 一种棉花锌指蛋白zpt5-5及其编码基因与应用 - Google Patents

一种棉花锌指蛋白zpt5-5及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

一个来源自棉花的锌指蛋白ZPT5‑5及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花锌指蛋白ZPT5-5及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的锌指蛋白ZPT5-5及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
技术背景
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育,则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(Zhu JK.2002.Salt and drought stress singal transduction inplants.Annu.Rev.Plant Biol.53:1247-1273； Zhang ZL.2011.Arabidopsis FloralInitiator SKB1Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription andPre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3and Small NuclearRibonucleoprotein LSM4 Methylation.Plant Cell,23:396–411)。
高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
发明内容
本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了非洲棉(Gossypium herbaceum L.)的一个锌指蛋白(本文命名为 ZPT5-5)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现将其导入受体植株并使其表达后，可显著改善受体植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供棉花的一个锌指蛋白ZPT5-5的编码基因(本文命名为GhZPT5-5)，其序列为SEQ ID NO：2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为图2 所示的35S-GhZPT5-5-2300载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
附图说明
图1是GhZPT5-5基因的植物表达载体(35S-GhZPT5-5-2300)的构建流程(图 1a-1b)。
图2是GhZPT5-5基因的植物表达载体(35S-GhZPT5-5-2300)的质粒图。
图3是转GhZPT5-5基因的T1代转基因拟南芥植株(右图，T1F7-8)和作为对照的非转基因拟南芥植株(左图，CK)的耐盐模拟实验结果。
图4是利用反转录PCR对T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中 GhZPT5-5基因在转录水平上的分子检测的验证结果。M为DL2000DNA Ladder Marker，1-4为不耐盐的非转基因对照拟南芥植株，5-12为耐盐的T1代转基因拟南芥植株(依次属于T1F7-2、T1F7-5、T1F7-8和T1F7-13四个耐盐株系，每个株系 2株)，13为35S-GhZPT5-5-2300质粒PCR阳性对照,14为空白水对照。
具体实施方式
以下结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自New England Biolabs公司。
实施例1、盐胁迫下棉花SSH文库构建：
具体方法为：
利用Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建抑制差减文库。在实验过程中以盐处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为对照 (driver)。具体步骤简述如下：
(1)供试材料：
非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838) 播种到经过灭菌处理的蛭石基质上，在25℃、光暗周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS液体培养基(含9.39mM KNO3，0.625mM KH2PO4，10.3mM NH4NO3，0.75mM MgSO4，1.5mM CaCl2，50μMKI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30 μM ZnSO4，1μM Na2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4) 一次。当苗株长高达25-30cm时用于实验。
(2)材料处理：
将供试幼苗分为2组，每组4株。第一组为对照组，在25℃、光照下培养，放置到1/2MS液体培养基中。第二组为处理组，25℃、光照下培养，放置到添加有终浓度为200mM NaCl的1/2MS液体培养基中，处理6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。
(3)总RNA提取：
分别取对照组和盐处理组的棉花叶片0.5g，用植物RNA提取试剂盒 (Invitrogen)提取棉花叶片的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001 测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA 纯化试剂盒(Purification of poly A+RNA from totalRNA)分离mRNA。
(4)抑制差减杂交：
按Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将Driver mRNA和Tester mRNA分别反转录,得到双链cDNA,再以2μg Tester cDNA和2μg Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Tester cDNA和Driver cDNA用Rsa I酶切1.5h，然后将酶切后的Tester cDNA分成两等份,连接上不同的接头,而Driver cDNA 不连接头。两种连有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver cDNA混合, 进行第一次正向差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合,再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交,然后通过两次抑制性PCR扩增差异表达的片段,使其得到富集。
(5)cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定
依照pGEM-T Easy试剂盒(购自Promega)的产品说明书所示方法，将上述合并的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物(使用QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy载体连接，具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl，T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-T Easy载体1μl，T4DNA 连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μL连接反应产物,加入到100μL大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TAKARA)中,冰浴30min、热休克60s、冰浴2min, 然后加入250μL LB培养液(含1％Tryptone购自OXOID，0.5％Yeast Extract 购自OXOID，1％NaCl购自国药)置37℃水浴中,以225r/min振荡培养30min, 取200μL振荡培养后的菌液种植于含50μg/mL氨苄青霉素(购自北京拜尔迪)、 40μg/mL X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、24μg/mL IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(X-gal和IPTG均购自TAKARA)的LB(同上)固体培养板上,37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数,随机挑取300个白色菌落(编号：Gh-S2-001至Gh-S2-300)。将所有白色菌落分别接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板 (CORNING)中,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％,于–80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R(Clontech公司的PCR-selectTM cDNASubtraction Kit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增验证,得到231个阳性克隆, 对所有阳性克隆在送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序
(6)差异克隆的cDNA测序分析：
将上述231个差异克隆的DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到203个有效EST(Unigene)。
实施例2非洲棉锌指蛋白基因GhZPT5-5的克隆
克隆子Gh-S2-090的测序结果去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID NO:3，本文将SEQ IDNO:3对应的全长编码基因命名为GhZPT5-5，其对应的蛋白命名为 ZPT5-5。
SEQ ID NO：3
GhZPT5-5全长编码基因的克隆
根据已经获得的SEQ ID NO：3序列，设计两条特异性引物，作为3’RACE 的5’端特异性引物：
GhZPT5-5GSP1：SEQ ID NO:4：
CGAGTGTTCCATCTGCCACAAGAG
GhZPT5-5GSP2：SEQ ID NO:5：
CGCTGCCACTACGAAGGTG
试剂自带通用引物：
AP:SEQ ID NO:6：
GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT
AUAP:SEQ ID NO:7：
GGCCACGCGTCGACTAGTAC
实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。
用SEQ ID NO:4与3’端引物SEQ ID NO:7(试剂盒自带的AUAP引物)，以SEQ ID NO:6引物(试剂盒自带的AP引物)和棉花mRNA反转录得到的cDNA 为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0 μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94 ℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min)， 72℃延伸10min。
所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO: 5与3’端引物SEQ ID NO:7进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0 μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:7各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5 min，33个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。第二次PCR产物回收片段(Gel Extraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T Easy Vector，转化到大肠杆菌JM109(具体方法同上)，随机挑取8 个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO:5与3’端引物SEQ ID NO: 7进行菌液PCR扩增,得到6个阳性克隆,送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序,获得该基因的cDNA的3’端。
所得的3’RACE产物克隆子测序获得序列与SEQ ID NO:3进行拼接，获得 SEQ IDNO:8：
根据已经获得的SEQ ID NO:8序列，设计三条特异性引物，作为反转录引物及5’RACE的3’端特异性引物。
GhZPT5-5 GSP1：SEQ ID NO:9：
GCAGATGGAACACTCGTGAAG
GhZPT5-5 GSP2：SEQ ID NO:10：
GGAACGCCTTGTCACAAAC
GhZPT5-5 GSP3：SEQ ID NO:11：
GGAAGACCGACGAATAACATC
实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。
用SEQ ID NO：10与通用引物AAP(试剂盒自带)，以棉花mRNA反转录所得的cDNA(反转录引物SEQ ID NO:9)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0 μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO:10和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5 min，33个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。
将所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO: 11与通用引物AUAP(试剂盒自带)进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO:6和AUAP各2.0 μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。回收第二轮PCR产物条带(使用Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接到pGEM-T Easy载体，然后将其转化到JM109感受态细胞中(具体方法同上),并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。使用SEQ ID NO:11与通用引物AUAP进行菌液PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上),得到3个阳性克隆,送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序,获得该基因的cDNA的5’端。
将所得的5’RACE产物克隆测序后所得序列与SEQ ID NO:8序列拼接，获得SEQ IDNO:12：
根据SEQ ID NO:12序列设计一对引物如下：
GhZPT5-5 F：SEQ ID NO:13：
ATGGCGCTTGAAGCTCTG
GhZPT5-5 R：SEQ ID NO:14：
TTATGCTAATGAAGAATCCAGTTTCTC
使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14作为引物来克隆GhZPT5-5全长编码序列。
采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR 反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP， 2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTARHS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:14各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min)， 72℃延伸10min。
PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl 10×Ex Buffer， 0.5μl 5mM的dATP，2.5μl 10×Ex Taq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约900bp的DNA片段回收(使用Omega回收试剂盒)，并将其连接至pGEM T-easy载体上(得到GhZPT5-5-pGEM),然后将所得质粒转化到JM109感受态细胞中(方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mLX-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14进行菌液 PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上),得到4个阳性克隆,送至英潍捷基 (上海)贸易有限公司测序,序列为SEQ ID NO:2，其编码的ZPT5-5蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
ZPT5-5蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO:1
GhZPT5-5编码基因的核苷酸序列：SEQ ID NO：2
实施例3GhZPT5-5基因植物表达载体构建
选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的组成型启动子35S 及终止子Tnos分别作为GhZPT5-5基因的启动子和终止子，构建流程如图1所示。
使用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP， 1.0μl pBI121，1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过EcoRⅠ、BglⅡ酶切后将所得PCR产物连接到pCAMBIA2300(购自Promega，T4连接酶盒)，获得pCAMBIA2300-1。
SEQ ID NO:15：
GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT
SEQ ID NO:16：
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
使用引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18以pBI121质粒为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pBI121质粒，1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12各2.0μl，以及 31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过Sac Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切后将所得PCR产物连接到pCAMBIA2300-1，获得pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO:17：
AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
SEQ ID NO:18：
TCAGAATTCCGCAGACGCTGCACTTGT
使用引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20以pCAMBIA2300质粒为模板扩增 CaMV35S启动子。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PSBuffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pCAMBIA2300质粒DNA，1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO:13和 SEQ ID NO:14各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性 5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过HindⅢ、PstⅠ酶切后将所得PCR产物连接(连接方法同上) 到pCAMBIA2300-2，获得pCAMBIA2300-3。
SEQ ID NO:19：
ACTAAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCTC
SEQ ID NO:20：
TGACTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG
使用引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22扩增GhZPT5-5(模板是实施例2 所获得的阳性GhZPT5-5-pGEM质粒)，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl GhZPT5-5-pGEM质粒，1.0μl PrimeSTAR HSDNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件： 94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸 2min)，72℃延伸10min。以PstⅠ和SacⅠ酶切后将所得PCR产物连接(连接方法同上)到pCAMBIA2300-3，并经验证获得植物表达载体35S-GhZPT5-5-2300 (图2)。
SEQ ID NO:21：
TGACTGCAGATGGCGCTTGAAGCTCTG
SEQ ID NO:22：
AAGGAGCTCTTATGCTAATGAAGAATCCAGTTTCTC
实施例4 35S-GhZPT5-5-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌LBA4404(购自Biovector Science Lab,Inc)感受态细胞的制备：将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h) 至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液(1:20的比例)接种于 100ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量冰预冷的10％甘油重悬浮菌体,4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用冰预冷的10％甘油重复洗3-4次；加入适量冰预冷的10％甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞。然后以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。
转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl 的实施例3中所得的阳性35S-GhZPT5-5-2300质粒，混匀后冰浴约10min。将冰浴后的感受态细胞和35S-GhZPT5-5-2300质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的0.1cm规格的电击杯(购自bio-rad)中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入1ml 28℃预热的LB液体培养基。快速而轻柔的用微量移液器将细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃、225rpm培养1h。取100～200μl的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于-70℃保存备用。
实施例5用于转化的拟南芥种植
选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1：1)作为拟南芥种植土壤。直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗拟南芥种子(哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心)。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃﹑光照强度3500-4000lx﹑光照周期为12h 黑暗/12h光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基。培养30天后，每盆保留4-5棵植株，光照周期调整为8h黑暗/16h光照培养。待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1-2个角果时，便可用于转化。
实施例6拟南芥花浸转化
将实施例4所得的含35S-GhZPT5-5-2300质粒的农杆菌LBA4404转化阳性克隆的菌液接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，第二天早上以1:50接种至含有抗生素的新的LB培养基(1L)中，培养约8个小时，至农杆菌液OD600在1.0到1.2之间。5000rpm室温离心5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的浸染培养基里(1/2MS；含5％蔗糖；用KOH调至 pH5.7；并含有200μl/lSilwet L-77)，使OD600在0.8左右。将拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃动，约2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。24小时后移去塑料透明罩，将水浇透。浸泡后2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水，1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选。
实施例7拟南芥转基因阳性转化子的筛选
种子消毒：先用70％乙醇浸泡10分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含50μg/ml 卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基表面上(一块150mm直径的平皿最多播种1500 棵)，4℃春化2天。然后，恒温22℃﹑光照强度3500-4000lx﹑光照周期为8h 黑暗/16h光照条件下，培养7-10天。能够正常萌发并生长的种子即为转基因种子。所述转基因种子在含50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体平板上萌发2周以后，将能够存活并继续生长的阳性植株转入土壤继续培养，并每株剪取1-2个叶片，提取DNA作为模板，用引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR 检测。去除PCR阴性植株，收集阳性植株的种子，分别标号为T0F7-1至T0F7-20 并保存。
实施例8过表达GhZPT5-5转基因拟南芥T1代植株的种植
选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1:1)作为拟南芥种植土壤。将T0F2-1至T0F2-20每个转化株系播种2盆，非转基因对照拟南芥播种2盆，每盆播种20-30颗种子。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃﹑光照强度3500-4000lx﹑光照周期为12h黑暗/12h光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基。培养25天后，剪取转基因拟南芥株系的叶片并提取其基因组DNA作为模板，用引物SEQ ID NO:13和SEQID NO:14 进行PCR检测。去除PCR阴性植株，保留7-8阳性棵苗，继续培养10天后，每盆保留大小较一致的4-5棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。
实施例9过表达GhZPT5-5转基因拟南芥T1代植株的耐盐实验
取实施例8中转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆不作处理，正常浇灌1/2 MS 液体培养基；另外将转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆浇灌含有150mM NaCl 的1/2 MS液体培养基，恒温22℃、光照强度3500-4000 lx、12小时光培养/12 小时暗培养循环，10天后观察实验结果。T1代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的植株)的耐盐性鉴定表明，T1F7-2、T1F7-5、T1F7-8、T1F7-13与T1F7-15 五个株系表现出显著的耐盐性(见图3，以T1F7-8为例，余者结果与之类似，在此未图示)。
实施例10在转录水平上验证ZPT5-5蛋白表达
将实施例9中耐盐性状良好的转基因T1代植株中随机选取8棵(分别属于上述T1F7-2、T1F7-5、T1F7-8和T1F7-13四个耐盐株系，每个株系2株)，实施例6中对照植株随机选取4棵，各剪取150mM NaCl处理14天的叶片0.05 g，用植物RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。紫外分光光度测定总 RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照Invitrogen 反转录试剂盒SuperScriptⅢReverse Transcriptase所示方法进行反转录(1μg总RNA作为模板，反转录引物为SEQ ID NO:14)。
通过SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24引物扩增Atactin-2 (http://www.uniprot.org/uniprot/Q96292)，检测看家基因Actin-2蛋白的相对表达情况，作为内参。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR HSDNA 聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24各2.0μl，以及30 μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，32个循环(94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。
SEQ ID NO:23：
GCTGATGATATTCAACCAATCGTG
SEQ ID NO:24：
CTCTGCTGTTGTGGTGAACATG
通过引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14扩增GhZPT5-5，检测ZPT5-5 蛋白相对表达情况。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTARHS DNA聚合酶、10μM 的引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，32个循环(94℃变性30s，58℃退火30 s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。
产物电泳结果如图4所示。图中所示上下两个部分条带分别属于GhZPT5-5 与Atactin-2，以Atactin-2作为内参。1-4为不耐盐的非转基因对照拟南芥植株，5-12为耐盐的T1代转基因拟南芥植株(分别属于上述T1F7-2、T1F7-5、T1F7-8 和T1F7-13四个耐盐株系，每个株系2株)，13为35S-GhZPT5-5-1-2300质粒 PCR阳性对照，14-17为转基因不耐盐拟南芥植株(分属2个株系，各检测2株)， 18为无模板的空白对照。结果表明，不耐盐非转基因对照拟南芥植株中无 GhZPT5-5的转录,耐盐转基因拟南芥T1代植株中GhZPT5-5的转录水平较高，不耐盐转基因拟南芥植株GhZPT5-5的转录水平很低。

Claims (7)

1.棉花的一个锌指蛋白，其序列为SEQ ID NO：1。
2.编码权利要求1的锌指蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO：2。
3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；所述表达载体是pCAMBIA2300。
4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体；所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5.一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；所述植物是拟南芥。
6.一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体的植物或植物组织，其中所述植物是拟南芥。
7.权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组表达载体或者权利要求4所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途，其中所述植物是拟南芥。
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