MX2011010695A - Factor de tolerancia a la sequia y sal (dst) de transcripcion de proteina con dedo de zinc de arroz y uso del mismo para regular la tolerancia a la sequia y sal. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un factor DST de transcripción de proteína con dedo de zinc que tiene la secuencia de aminoácido según lo mostrado en la SEC ID NO.: 2, variantes conservadoras y polipéptidos homólogos de las mismos. También se proporciona la secuencia de ADN que codifica el factor DST de transcripción, vector o célula hospedadora que comprende la secuencia de ADN, elemento de actuación cis que une a la variante de DST, inhibidora o no conservadora del factor DST de transcripción o secuencia de codificación de la misma, y uso del inhibidor o variante no conservadora para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en la planta.

Description

FACTOR DE TOLERANCIA A LA SEQUIA Y SAL (DST) DE TRANSCRIPCION DE PROTEINA CON DEDO DE ZINC DE ARROZ Y USO DEL MISMO PARA REGULAR LA TOLERANCIA A LA SEQUIA Y SAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de bioingeniería vegetal e ingeniería genética para el mejoramiento de la planta. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de los genes del factor de transcripción de proteína cori dedo de zinc de arroz novedosos y sus proteínas o polipéptidos codificados para aumentar la tolerancia a la sequía y sal en plantas, métodos para el mejoramiento de la resistencia a la sal y/o resistencia a la sequía en plantas inhibiendo los ¡genes descritos anteriormente o sus proteínas expresadas, y a plantas transgénicas.

Antecedentes de la Invención Las demandas globales crecientes por alimento y disminución continua de las tierras de cultivo han creado presión constante en la seguridad alimentaria nacional. En la producción alimentaria, la sequía y sales son tensiones (abióticas) no biológicas importantes, que causan la reducción significativa en cantidades y calidades de cosechas cada año. Además, la sequía acompaña frecuentemente a las sales. Por ejemplo, la salinización de la tierra es un fenómeno común ¡de la deterioración de la tierra en áreas de sequía.

Los datos disponibles muestran que las pérdidas anuales de arroz debido de la sequía en China cuestan al menos $2 billones, y la salinización de las tierras de cultivo es también la principal razón de bajas producciones y bajos rendimientos. La sequía y las sales han representado dos serios problemas que enfrenta la agricultura China.

Por lo tanto, cómo mejorar la tolerancia a la sequía y/o sal en cosechas para aumentar producciones, que resuelvan los problemas alimentarios del mundo y China, es de gran importancia. La investigación de la tensión abiótica es uno de los campos más urgentes y más desafiantes de la investigación de la planta.

Hasta la fecha, algunos genes relacionados con la resistencia a la sequía y sal, incluyendo varios factores de transcripción, se han reproducido, y algunas cepas de plantas o cosechas resistentes a las tensiones han sido obtenidas usando técnicas de ingeniería genética. La ayuda de la ingeniería genética a la resistencia a la tensión es mejorar la resistencia a la tensión de la planta modulando la transcripción y expresión del gen, en donde los factores de transcripción tienen desempeños dominantes.

Actualmente, se han reproducido algunos factores de transcripción que participan en la expresión del gen en respuesta a la tensión. Sin embargo, debido a muchos factores de transcripción que participan en estos procesos complejos de la respuesta de tensión en plantas, estos factores de transcripción representan únicamente una pequeña parte. Aún existen mucho más factores de transcripción por ser descubiertos, investigados, y utilizados en la reproducción de cosechas con resistencia a la tensión .

Por lo tanto, existe una necesidad urgente en este campo para investigar los factores de transcripción que participan en la expresión del gen de respuesta de tensión, para desarrollar nuevos métodos para reproducir cosechas resistentes a la tensión y para desarrollar tales nuevas cosechas, de tal modo que mejore las cantidades y calidades de las cosechas.

Breve Descripción de la Invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar un gen novedoso que este estrechamente vinculado a la tolerancia a la sequía y sal en plantas (especialmente en cosechas) —¦ factor DST de transcripción de proteína con dedo de zinc de arroz, y confirmar que este factor de transcripción es un regulador negativo de tolerancia a la sal y sequía en plantas. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una manera nueva de mejorar la resistencia a la tensión de sal y/o sequía en plantas. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para generar plantas transgénicas con tolerancia a la sequía y sal mejorada y las plantas transgénicas generadas por estos métodos. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para analizar plantas que hayan mejorado la resistencia a la sal y sequía y plantas obtenidas por estos métodos de análisis.

En el primer aspecto, la presente invención proporciona factores de transcripción de proteína con dedo de zinc aislados, incluyendo los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO.: 2, polipéptidos que tienen mutaciones conservadas en los polipéptidos precedentes, u homólogos de los polipéptidos precedentes.

En una modalidad preferida, los polipéptidos antes mencionados incluyen un dominio estructural de dedo de zinc tipo Cys-2/His-2.

En otra modalidad preferida, los polipéptidos participan en la regulación de los genes relacionados con las enzimas que trabajan en los peróxidos, controlando la acumulación de peróxido de hidrogeno y/o regulación de la apertura de estomas, ¡de tal modo que afecta a la tolerancia a la sequía y sal en arroz.

En una modalidad de la presente invención, el polipéptido está seleccionado del siguiente grupo: (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido derivado de (a) con una o más sustituciones, supresiones, ó inserciones del residuo de aminoácido, y capaz de aumentar la sensibilidad a la sequía y sal en una planta; o (c) un homólogo del polipéptido de (a) o (b) que tiene un dominio estructural de dedo de zinc tipo Cys-2/His-2 y capaz de aumentar la sensibilidad a la sequía y sal en una planta.

En una modalidad preferida, las plantas son plantas dicotiledóneas o plantas monocotiledóneas, preferiblemente cosechas.

En otra modalidad preferida, las plantas se seleccionan de: Gramineae, alvaceae gossypium, Crucíferae brássica, Compositae, Solanaceae, Labiatae, o Umbelliferae, preferiblemente Gramineae.

En otra modalidad preferida, las plantas se seleccionan de: arroz, maíz, trigo, cebada, caña de azúcar, sorgo, Arabidopsis, algodón o cañóla, más preferiblemente arroz, maíz, trigo, cebada, caña de azúcar o sorgo.

En otra modalidad preferida, las sales se refieren a. cloruro de sodio, carbonato de sodio, sulfato de sodio, o bicarbonato de sodio.

En el segundo aspecto, la presente invención propprciona polinucleótidos aislados, que incluyen secuencias de nucleótido que codifican los polipéptidos de la presente invención.

En una modalidad preferida, el polinucleótido codifica la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO.: 2 o sus homólogos del polipéptido.

En una modalidad de la presente invención, la secuencia del polinucleótido es una seleccionada de lo siguiente: (a) una secuencia de nucleótido que comprende la secuencia SEC ID NO: 1; (b) una secuencia de nucleótido que comprende nucleótidos 1-435 en la SEC ID NO.: 1 ; o (c) una secuencia de polinucleótido complementaria !a una de las secuencias de nucleótido de (a) - (b).

En el tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector, que contiene un polinucleótido de la presente invención.

En una modalidad preferida, el vector está seleccionado de: un plásmido bacteriano, fago, un plásmido de levadura, un virus de planta, o un virus mamífero; preferiblemente, pCAMBIÁI 301 , pEGFP-1, pBM 21 , pCAMBIAI 300, pCAMBIA2301 o pHB, y, preferiblemente, pCAMBIAI 301.

En el cuarto aspecto, la presente invención proporciona células ospedadoras genéticamente dirigidas, que contienen un vector de la presente invención o tienen un poíinucleótidq de la presente invención integrada en el genoma.

En una modalidad preferida, la célula hospedadóra se selecciona de una célula procariótica, una célula eucariótica inferior o una célula eucariótica superior, preferiblemente una célula bacteriana, célula de levadura o célula de planta, preferiblemente E. coli, Streptomyces, Agrobacterium, levadura, más preferiblemente Agrobacterium, el Agrobacterium incluye, pero que no está limitada a: EHA105, SOUP1301 o; C58, preferiblemente, EHA105.

En el quinto aspecto, la presente invención proporciona un elemento de actuación cis, que incluye la secuencia SEC ID NO.: 3, capaz de unir a un factor de transcripción de la presente invención.

En una modalidad preferida, el elemento de actuación cis tiene la secuencia de TGCTANN(A/T)TTG, en donde N se selecciona de A, C, G o T.

En otra modalidad preferida, el elemento de actuación cis se une a un dominio estructural de dedo de zinc de un factor de transcripción de la presente invención. 1 En otra modalidad preferida, la unión del elemento de actuación cis a un factor de transcripción de la presente invención puede aumentar la sensibilidad a la sequía y sal en plantas.

En el sexto aspecto, la presente invención proporciona antagonistas para las proteínas o polinucleótidos del factor de i transcripción de dedo de zinc.

En una modalidad preferida, los antagonistas son pequeñas interferencias de ARNs, anticuerpos u oligonucleótidos antisentido.

En el séptimo aspecto, la presente invención proporciona métodos para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en plantas, los métodos incluyen inhibir los factores de transcripción de dedo de zinc de la presente invención, inhibir la expresión de polinucleótidos de la presente invención, o inhibir la unión del elemento de actuación de cis con los factores de transcripción de la proteína con dedo de zinc de la presente invención.

En una modalidad preferida, la inhibición se lleva a cabo por métodos de supresión, mutación, ARNi, regulación negativa o dominante antisentido.

En otra modalidad preferida, la inhibición incluye la introducción de uno o más aminoácidos o sustitución del nucleótido, supresión, o inserción a los factores de transcripción de la presente invención o polinucleótidos de la presente invención, resultando en plantas que tienen tolerancia mejorada a la sequía y sal.

En otra modalidad preferida, de acuerdo a la secuencia del aminoácido de la SEC ID NO.: 2, la inhibición implica transformar asparragina a ácido aspártico en el aminoácido 69, transformando alanina a treonina en el aminoácido 162, que resulta en plantas con estas secuencias mutantes que tienen tolerancia a la sequía y sal mejorada.

En otra modalidad preferida, los métodos incluyen usar un antagonista de la presente invención a una planta.

En otra modalidad preferida, la inhibición incluye: transformar plantas con un vector que contiene un pequeño ARN de interferencia que se dirige a un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de la presente invención, o plantas de transformación que usan células hospedadoras que contienen esos vectores.

En otra modalidad preferida, los métodos además incluyen plantas de cruzamiento que tienen tolerancia a la sequía y sal mejorada obtenida por los métodos descritos anteriormente con las plantas no-transgénicas u otras plantas transgénicas.

En otra modalidad preferida, las sales se refieren a: cloruro de sodio, sulfato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio.

En el octavo aspecto, la presente invención proporciona métodos para analizar plantas con tolerancia a la sequíajy sal, tales métodos incluyen: (i) detectar en una planta candidato el nivel de un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de la presente invención, el nivel de expresión de un polinucleótido de la presente invención, y/o niveles de enlace de un elemento de actuación cis de la presente invención con un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de la presente invención; y (ii) comparar el nivel en la planta candidato detectado en la etapa (i) con el nivel en una planta de control, si el nivel en la planta candidato es más bajo que el de la planta de control, la planta candidato es una planta tolerante a la sequía y sal.

En una modalidad preferida, las sales se refieren a: cloruro de sodio, sulfato de sodio, carbonato de sodio, o bicarbonato de sodio.

En el noveno aspecto, la presente invención proporciona los métodos para preparar un factor de transcripción de la prjoteína con dedo de zinc, caracterizados en que, los métodos incluyen: (a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención bajo condiciones convenientes para expresión; y (b) aislar un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de los medios de cultivo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona usos de un inhibidor o una secuencia mutante no conservada de un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc o una secuencia de nucleótido de la presente invención para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en una planta.

En una modalidad preferida, el inhibidor es un pequeño ARN de interferencia, un anticuerpo, o un oligonucleótido antisentido, que se dirige al factor de transcripción o secuencia de nucleótido.

En otra modalidad preferida, la secuencia del mutante no conservada inhibe la traducción o expresión de un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc o una secuencia de nucleótido de la presente invención en una planta que contiene la secuencia mutante no conservada, que resulta en una mejor tolerancia a la sequía y sal que el de una planta tipo silvestre, que no contiene la secuencia mutante no conservada.

En otra modalidad preferida, la secuencia mutante no conservada es la secuencia del polinucleótido de la SEC ID NO.: 1 con dos mutaciones: A en la posición 205 se transforma a G y G en la posición 484 se transforma a A; o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO.: 2 con dos mutaciones: asparagijna en t la posición 69 se transforma al ácido aspártico y la alaninajen la posición 162 se transforma a treonina. | En una modalidad de la presente invención, el mejoramiento I a la tolerancia a la sequía y sal en plantas incluye: i (i) aplicar directamente un inhibidor (antagonista) dejscrito anteriormente en una planta; : (i¡) introducir una secuencia muíante no conservada descrita anteriormente en una planta; o ! (íii) diseñar un marcador molecular específico para la secuencia muíante no conservada, y utilizar el marcador molecular para analizar a retoños derivados del cruzamiento de una planta mutante que tiene la secuencia mutante no conservada con otra especie de arroz para seleccionar un retoño individual que contenga la secuencia mutante no conservada.

En una modalidad preferida de la presente invención, el marcador molecular comprende un par de cebadores que ¡tienen las secuencias mostradas en la SEC ID NO.: 10 y SEC NÓ.: 11, y/o un par de cebadores que tiene las secuencias mostrada? en la i SEC ID NO.: 12 y SEC ID NO. : 13.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en una planta, el método incluye: (a) proporcionar un inhibidor ¡o una secuencia mutante no conservada para un factor de transcripción t de la proteína con dedo de zinc o de una secuencia de polinucleótido de la presente invención; (b) someter una planta a uno o más tratamientos seleccionados de lo siguiente: (i) aplicar el inhibidor directamente a la planta; (ii) introducir la secuencia muíante no conservada en la planta; o (iii) diseñar un marcador molecular específico para la secuencia mutante no conservada, y usar el marcador molecular para analizar retoños del cruzamiento de una planta mutante que tiene la secuencia mutante no conservada y otra cepa de arroz para seleccionar un retoño individual que contenga la secuencia mutante no conservada.

En una modalidad preferida de la presente invención, el marcador molecular es un par de cebadores que tiere las secuencias mostradas en la SEC ID NO.: 10 e SEC ID NO.: 11, y/o un par de cebadores que tiene las secuencias mostradas en la SEC ID O. : 12 y SEC ID NO.: 13.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para preparar una planta transgénica, los m,étodos incluyen: (1) transfectar una célula de la planta, tejido de la planta u órgano de la planta con un constructo que contiene una secuencia mutante no conservada de un factor de transcripción de la proteina con dedo de zinc de la presente invención o un constructor que contiene una secuencia mutante no conservada de un polinucleótido de la presente invención; (2) seleccionar una célula de la planta, tejido de la planta, o un órgano de la planta que contenga la secuencia mutante no conservada; y (3) regenerar una planta de la célula de la planta, tejido de la planta u órgano de la planta obtenidos en la etapa (2), en donde la planta transgénica obtenida tiene una tolerancia más alta a la sequía y sal que la planta no transgénica.

En otra modalidad preferida, los métodos también incluyen el cruzamiento de la planta transgénica obtenida con una planta no transgénica u otra planta transgénica, de tal modo que obtiene un retoño híbrido que contiene la secuencia mutante no conservada, el retoño híbrido tiene tolerancia más alta; a la sequía y sal que una planta no transgénica, preferiblemente el retoño híbrido tiene rasgos genéticos estables.

En otra modalidad preferida, los métodos también incluyen el diseño de un marcador molecular específico para la secuencia mutante no conservada para analizar retoños obtenidos del cruzamiento de la planta transgénica para obtener una planta que tiene tolerancia a la sequía y sal mejorada.

Basada en la presente descripción, otros aspectos de la invención serán evidentes al experto en la técnica.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1: Secuencia del gen DST de arroz (figura 1A) y su secuencia de aminoácido codificada (figura 1B).

Figura 2: Comparación de los fenotipos del mutante dst del gen DST de arroz y de los fenotipos de arroz tipo silvestre bajo condiciones de sequía y sal. En cada panel, el tipo silvestre (Zhonghua 11, ZH11) está a la izquierda y el muíante dst está a la derecha.

Figura 3: La comparación de fenotipos, bajo condiciones de sal y sequía, de tipo silvestre, mutante dst obtenido por la complementación del gen DST, y de plantas con la función DST reducida por ARNi.

Figura 4: Análisis de la activación de transcripción DST usando Matchmaker™ GAL4 yeast two-hybrid system 3 (Clontech).

Figura 5: Resultados del ensayo del cambio de movilidad de la electroforesis.

Figura 6: Análisis de alineación de secuencia de los dominios de la proteína con dedo de zinc homólogos de DST entre cosechas de Gramineae.

Descripción Detallada de la Invención Después de una larga e intensiva investigación, los inventores de la presente invención descubrieron un gen DST del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc dé arroz novedoso (Gen de Tolerancia a la Sequía y Sal) y confirmaron que este gen es un factor regulador negativo para la tolerancia a la sequía y sal, capaz de controlar la tolerancia a la sequía y sal en plantas, y que la inhibición de la expresión de este gen puede aumentar la resistencia a la tensión de sal o sequía en plantas. Por lo tanto, este gen desempeña un papel importante en plantas reproductoras que son resistentes a la sequía y sal. Basado en esto, los inventores han reducido la invención a la práctica.

Específicamente, usando una biblioteca del mutante de arroz (EMS mutagénesis) y técnicas de clonación basadas en el mapa, los inventores realizaron un cribado a gran escala bajo condiciones de tensión de sal para obtener un gen nuevo DST que controla la tolerancia a la sequía y sal en arroz. La longitud del gen genómico DST es 906bp, el cual no incluye ningún intrón. Por lo tanto, el ORF integral (marco de lectura abierto) es 906bp.

Este gen codifica 301 aminoácidos, una proteína de aproximadamente 29KDa que incluye un dominio de dedo d'e zinc conservado. Esta proteína es un factor de transcripción.

Los resultados de la identificación del fenotipo muestran que los mutantes de este gen (por ejemplo, gen DST con 2 mutaciones del nucleótido, resultan de 2 sustituciones del aminoácido) exhiben tolerancia a la sequía y sal. Usando el ARNi para Sobre- I regular la expresión de este gen también produjo tolerancia a la sequía y sal mejorada.

Los resultados de los estudios bioquímicos muestran que DST es un factor de transcripción que incluye no sólo un dominio i de activación de transcripción, sino también un dominio de enlace de ADN. El análisis del chip del gen muestra que DST funciona i como un factor de transcripción que regula una serie de| genes corriente abajo. \ Los estudios funcionales muestran que, con respecto ial tipo silvestre, los mutantes tienen más peróxido de hidrógeno ¡(H202) acumulado alrededor de estomas, tienen aberturas de estomas más pequeñas, y permiten que las hojas mantengan contenidos de agua relativamente más altos bajo tensión de sequía. Por lo tanto, los mutantes tienen tolerancia más alta a la séquía.

Además, debido a las aberturas de estomas más pequeñas en mutantes, la conductancia de estomas es más baja, y el índjice de vaporización del agua es más lento. Consecuentemente, el transporte de iones de Na+ de las raíces a las partes sobre la tierra (hojas, etc.) se reduce, y por lo tanto la toxicidad de Na+ es más baja, de tal modo que mejora la tolerancia a la sal.! Este estudio muestra que DST participa en la regulación de losjgenes relacionados con la peroxidasa, controla la acumulación de peróxido de hidrógeno (H202), regula la abertura de estomas, por lo tanto afecta a la tolerancia a la sequía y sal en arroz. ? I Los estudios antes mencionados muestran que el gen DST es un factor regulador negativo para la resistencia a la sequía y resistencia a la sal, inhibiendo su expresión puede mejorar la 1 resistencia a la tensión de sal o sequía en plantas. ! Esta propiedad puede utilizarse para producir plantas transgénicas con una resistencia significativamente más alta a la tensión de sal y sequía. Así, el gen DST tiene un gran potencial j en el mejoramiento de la capacidad de cosechas para tolerar tensiones adversas, tales como tensión de sal y sequía.

I Además, la búsqueda en base de datos revela que: |un gen homólogo de DST en el genoma de sorgo (Sorghum bicolor), tiene i 54.3% de semejanza con la proteína; tres genes homólogos de DST en el genoma del maíz (Zea mays), tiene 51.7%, 36!.1%, y l 33.5% de semejanzas con la proteína; un gen homólogo d;e DST en el genoma de cebada (Hordeum vulgare), tiene 38.4% de semejanza con la proteína; y tres genes homólogos de DST en el genoma de caña de azúcar (Saccharum officinarum) , tiene 38.2%, 38.2% y 34.5% de semejanzas con la proteína. Estos ¡ genes homólogos todos tienen un dominio estructural de dedo de zinc tipo C2H2 conservado, con altas semejanzas en la terminal N, sugiriendo que los genes homólogos de DST en otras plantas (preferiblemente, Gramineae) tendrían funciones similares como las del gen DST de arroz. j PROTEINAS O POLIPEPTIDOS DE DST Y SUS SECUENCIAS DE i CODIFICACION j En la presente invención, los términos "proteíjnas o polipéptidos de DST", "gen de DST codificado con proteínas o polipéptidos", o "factores de transcripción de la proteína con dedo de zinc" se refieren a las proteínas o polipéptidos codificados por los genes de DST de la presente invención. Estas definiciones incluyen mutantes de las proteínas o polipéptidos descritos anteriormente con mutaciones conservadas, o sus polipéptidos homólogos. Todos tienen dominios estructurales de dedo ele zinc tipo Cys-2/His-2, y, cuando la expresión de las proteínas o polipéptidos se inhibe, la resistencia a las tensiones de sequía o sal puede aumentarse en plantas.

En una modalidad de la presente invención, los factores de transcripción participan en la regulación de genes relacionados con la peroxidasa, controlan la acumulación de peróxido de hidrógeno y/o regulan la abertura de estomas, de tal modo que afectan a la tolerancia a la sequía y sal en arroz.

Las secuencias de la proteína o polipéptido de DST se seleccionan de: (a) polipéptidos que tienen la secuencia del aminoácido de la SEC ID NO.: 2; (b) polipéptidos derivados de (a) tienen uno o más sustituciones de residuos del aminoácido, supresiones o inserciones en la secuencia del aminoácido de la SEC ID NO.: 2, y capaz de aumentarla susceptibilidad a la sequía y sal en plantas; o (c) homólogos del polipéptido de los polipéptidos de (a) o (b) que tienen dominios estructurales con dedo de zinc tipo Cys-2/His-2 y capaz de aumentar la susceptibilidad a la sequía y sal en plantas. Preferiblemente, las proteínas o polipéptidos pueden unirse a TGCTANN(A/T)TTG, en donde N representa A, C, G o T.

Las proteínas y polipéptidos de la presente invención pueden ser productos naturales purificados, o productos químicamente sintetizados, o producidos, usando tecnología recombinante, desde las células hospedadoras eucarióticas o procarióticas (por ejemplo, bacterias, levadura, plantas más altas, insectos y células mamíferas). Las proteínas de DST o polipéptidos de la presente invención, son codificados preferiblemente por el gen de DST de Gramineae (preferiblemente, arroz) o sus genes homólogos o genes de familia.

Los tipos de mutaciones en proteínas o polipéptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: supresiones, inserción y/o sustitución de uno o más (usualmente 1-50, preferiblemente 1-30, más preferiblemente 1-20, mayormente preferible 1-10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10) aminoácidos, y adición en el término C y/o término N de uno o varios (usualmente 20 o menos, preferiblemente menos jde 10, más preferiblemente menos de 5) aminoácidos. Por ejemplo, se conoce en la técnica que, cuando se sustituyen los aminoácidos que tienen propiedades similares o relacionadas, las funciones de proteínas o polipéptidos usualmente no cambian. Como otro ejemplo, la adición de uno o varios aminoácidos en el término C y/o término N no cambia generalmente las funciones e las proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, las proteínas de DST o polipéptidos de la presente invención pueden o no pueden incluir la iniciación del residuo de metionina y aún tienen la actividad para aumentar la resistencia a los metales pesados o tensión de sal en plantas. Un experto en la técnica, basado en el conocimiento común en la técnica y/o experimentación de rutina, puede identificar fácilmente estos varios tipos de mutación que no afectarían a la actividad de las proteínas y polipéptidos.

En la presente invención, el término "polipéptidos mutantes conservados" se refiere a polipéptidos, con respecto a la secuencia del aminoácido de la SEC ID NO.: 2, que tiene hasta 20, preferiblemente hasta 10, más preferiblemente hasta 5, mayormente preferible hasta 3 aminoácidos sustituidos con aminoácidos que tienen propiedades similares o relacionadas. Estos polipéptidos mutantes conservados pueden generarse de acuerdo a la siguiente tabla para las sustituciones del aminoácido: Residuos de Aminoácido Sustituciones Sustituciones Representativas Preferidas Ala (A) Val; Leu; He Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro; Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg lie (1) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu Leu (L) He; Val; Met; Ala; Phe He Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met ( ) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Leu; Val; lie, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala Leu Las proteínas y polipéptidos de (b) pueden obtenerse por exposición a la radiación o mutágenos para producir mutagénesis aleatoria, o a través de mutagénesis dirigida al sitio u otras técnicas de biología molecular conocidas. Las secuencias que codifican las proteínas o polipéptidos pueden utilizarse para construir plantas transgénicas para analizar e identificar las proteínas o polipéptidos basados en si las plantas transgénicas tienen características alteradas.

Las formas mutantes de polipéptidos incluyen: secuencias homologas, mutantes conservados, mutantes alélicos, mutantes naturales, mutantes inducidos, proteínas codificadas por las secuencias que pueden hibridizarse con las secuencias de codificación para la proteína de DST bajo condiciones rigurosas altas o bajas, y polipéptidos o proteínas obtenidas usando el antisuero de la proteína anti-DST. Otros polipéptidos también pueden utilizarse en la presente invención, tal como proteínas de fusión que contienen una proteína de DST o su fragmento. En t adición de los polipéptidos casi integrales, la presente invención también incluye fragmentos solubles de las proteínas dé DST. Generalmente, los fragmentos solubles contienen por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos en la secuencia de la proteína de DST, generalmente por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos consecutivos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos consecutivos, mayormente preferible por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos consecutivos.

Dependiendo de los anfitriones usados para producir recombinantes, las proteínas o polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados, o pueden ser no glicosilados. El término también incluye fragmentos activos y derivados activos de las proteínas de DST.

En la presente descripción, los términos "gen de DST", "gen de la planta DST", o "secuencias de codificación de factores de transcripción de la presente invención" son intercambiables. Todos se refieren a las secuencias que codifican las proteínas de DST o los polipéptidos de la presente invención. Son altamente homólogos a la secuencia del gen de DST de arroz (ver SEC ID NO.: 1); son las moléculas que pueden hibridizarse con la secuencia del gen bajo condiciones rigurosas; o son moléculas del gen de familia altamente homologas a las moléculas. ¡Inhibir la expresión del gen resulta en el mejoramiento definitivo de la resistencia a la tensión de sequía o sal en plantas.

En una modalidad de la presente invención, el polinucleótido incluye: (a) las secuencias de nucleótido de la SEC ID NO.; 1; (b) una secuencia de nucleótido que tiene nucleótidos 1-435 de la SEC. ID NO.: 1; o (c) polinucleótidos complementarios a una de las secuencias de nucleótido en (a) - (b). ! En la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" se refiere a: (1) hibridación y lavado bajo fuerza iónica baja y temperaturas altas, tales como 0.2* SSC, 0.1% SDS 60°C; o (2) hibridación en la presencia de un agente de desnaturalización, tal como 50% (v/v) formamida, 0.1% suero bovino/0.1% F icol 1 , 42°C etc.; o (3) hibridación que ocurre únicamente cuando la homología entre las dos secuencias alcanza por lo menos 50%, preferiblemente 55% o más, 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, ó 90% o más, más preferiblemente 95% o más. Por ejemplo, las secuencias pueden ser secuencias complementarias ¡a las secuencias definidas en (a).

Integral o fragmentos de las secuencias de nucleótido del gen de DST de la presente invención pueden generalmente obtenerse por la amplificación de PCR, recombinación o métodos sintéticos. Para la amplificación de PCR, las secuencias relacionadas pueden obtenerse diseñando cebadores basados en las secuencias del nucleótido relacionadas descritas en la presente invención, específicamente el marco de lectura abierto, y utilizando las bibliotecas de ADNc generalmente disponibles o bibliotecas de ADNc generadas con los métodos comunes conocidos por un experto en la técnica como plantillas. Al tratar con secuencias largas, son generalmente necesarias dos o más amplificaciones de PCR, y después se ensamblan los fragmentos obtenidos de la amplificación de acuerdo a las órdenes correctas.

Deberá entenderse que el gen de DST de la presente invención es preferiblemente de arroz. Otros genes obtenidos de i . ? otras plantas que compartan la alta homología con el gen DST de arroz (tal como 50% o más, preferiblemente 55% o más, 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, más preferiblemente 85% o más, tal como 85%, 90%, 95% o incluso 98% de la identidad de la secuencia) también se consideran estar dentro del alcance de la presente invención. Los métodos y herramientas para comparar la identidad de la secuencia también son bien conocidos en la técnica, tal como BLAST.

PLANTAS Y SU RESISTENCIA A LA TENSION DE SAL Y/O SEQUIA Según lo utilizado en la presente descripción, las "plantas" incluyen (pero no se limita a): Gramineae, plantas Malvaceae Gossypium, crucifera Brassica, Compositae, Solanaceae, plantas Labiatae o Umbelliferae, etc. Preferiblemente, las plantas son plantas Gramineae, más preferiblemente cosechas Gramineae. Por ejemplo, las plantas pueden seleccionarse de: arroz;, maíz, trigo, cebada, caña de azúcar, sorgo, Arabidopsis, algodón o cañóla, más preferiblemente arroz, maíz, trigo, cebada, caña de azúcar o sorgo.

Según lo utilizado en la presente descripción, el término "cosechas" se refiere a las plantas de valores económicos en el grano, algodón, aceite, agricultura etc. y la industria. Los valores económicos pueden reflejarse por semillas de plantas, frutas, raíces, retoños, hojas y otras partes útiles. Las cosechas incluyen, pero no se limitan a: dicotiledonos o monocotilédonos.

I ? Las plantas monocotiledóneas preferidas son plantas Gramineae, más preferiblemente arroz, trigo, cebada, maíz, sorgo etc.j Las dicotiledonas preferidas incluyen, pero no se limitan a: Plantas de algodón Malvaceae, plantas cruciferas tales como Brassica, más j preferiblemente algodón y cañóla.

Según lo utilizado en la presente descripción, el término "tensión de sal" se refiere a: un fenómeno que, cuando las plantas crecen en tierra o en alta concentración de agua de !sales, i su crecimiento sería inhibido o incluso morirían. Las sale|s que causan la tensión de sal incluyen (pero no se limitan) a: cloruro de sodio, sulfato de sodio, carbonato de sodio, o bicarbonato de sodio. Los genes de DST de la presente invención ó sus proteínas o polipéptidos codificados pueden aumentar la resistencia a la tensión de sal en plantas. La resistencia creciente i puede observarse por comparación con las plantas de control que no se han tratado con los genes, proteínas, o polipéptidos. El i crecimiento y desarrollo de las plantas no son afectados o menos afectados por altas concentraciones de sal, o las plantas pueden sobrevivir en concentraciones más altas de sal.

Según lo utilizado en la presente descripción, el término "tensión de sequía" se refiere a: un fenómeno que cuando las plantas crecen en tierra seco u otros ambientes de sequía, su crecimiento sería inhibido o incluso morirían. Los genes de DST de la presente invención o sus proteínas o polipéptidos codificados pueden aumentar la resistencia de plantas! a la tensión de sequía, la resistencia creciente puede observarse por comparación con las plantas de control que no se han tratado con los genes, proteínas, o polipéptidos. El crecimiento y desarrollo de las plantas no son afectados o menos afectados por la carencia de agua, o las plantas pueden sobrevivir en condiciones de sequía.

PLANTAS TRANSGENICAS, VECTORES Y HOSPEDADORES La presente invención también se refiere a vectores que contienen genes de DST, y células hospedadoras que contienen vectores generados por la ingeniería genética, y plantas transgénicas generadas por la transfección del gen y expresión de altos niveles de DST.

Usando la tecnología de ADN recombinante convencional (Science, 1984; el 224:1431), las secuencias de codificación de la presente invención pueden utilizarse para expresar o producir las proteínas recombinantes de DST. En general, esto implica las siguientes etapas: (1) células hospedadoras convenientes de transfección o transformación con las proteínas de DST que codifican a los polinucleótidos (o mutantes) de la presente invención, o pon los vectores de expresión recombinante que contienen los polinucleótidos; (2) cultivar las células hospedadoras en medios de cultivo convenientes; y (3) aislar y purificar proteínas o polipéptidos de los medios de cultivo o células.

En la presente invención, los términos "vectores" y "vectores de expresión recombinante" pueden utilizarse alternativamente, con referencia a, plásmidos bacterianos, bacteriófagos, plásmidos de levadura, virus de la célula de planta, virus de la célula mamífera u otros vectores, que son bien conocidos en la técnica. En conclusión, cualquier plásmido y vector puede utilizarse para que puedan duplicarse y sean células hospedadores interiores estables. Una característica importante de los vectores de expresión es que usualmente contienen un origen de réplica, un promotor, gen marcador y un elemento de control de translación.

Los métodos bien conocidos por un experto en la técnica se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación de DST y una señal de control de transcripción/traslación conveniente. Estos métodos incluyen tecnología de ADN recombinante in vitro, tecnología de síntesis de ADN, y tecnología de recombinación in vivo, etc. Las secuencias de DNA pueden ligarse efectivamente a los promotores convenientes en los vectores de expresión, dirigiendo la síntesis de ARNm. Los vectores de expresión también incluyen sitios de enlace de ribosoma para la iniciación de traslación y sitios de terminación de transcripción. En la presente invención, pEGFP-1, pB 1121 , pCAMBIAI 300, pCA BIAI 301 , pCAMBIA2301 o pHB se utiliza preferiblemente.

Además, los vectores de expresión incluyen preferiblemente uno o más genes del marcador de selección, proporcionando los fenotipos para la selección de células hospedadoras transfectadas, tales como reductasa de dihidrofolato, resistencia de neomicina y proteína fluorescente verde (GFP) para uso en el cultivo celular eucariótico, o resistencia a la tetracic ina o ampicilina para uso en E. Coli.

Los vectores que contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente y los promotores o elementos de control convenientes pueden utilizarse para transformar las células hospedadoras convenientes, permitiéndoles expresar las proteínas o polipéptidos. Las células hospedadoras pueden ser células procarióticas, tales como células bacterianas; o células eucarióticas más bajas, tales como células de levadura; o células eucarióticas más altas, tales como células de la planta. Los ejemplos representativos incluyen: E. Coli, Streptoitiyces, Agrobacterium; células fungicidas tales como levadura; células de la planta, etc. En la presente invención, las células hospedadoras son preferiblemente Agrobacterium.

Para expresar los polinucleótidos de la presente invención en células eucarióticas superiores, la transcripción ¡puede mejorarse, si las secuencias reforzadas se insertan en vectores. Los reforzadores son factores de actuación cis de DNA, aproximadamente de 10 a 300 bp generalmente, actuando en promotores para mejorar la transcripción del gen. El experto en la técnica sabría cómo seleccionar vectores convenientes, promotores, reforzadores y células hospedadoras.

Los transformantes obtenidos pueden cultivarse usando los métodos convencionales, expresando polipéptidos codificados por los genes de la presente invención. Dependiendo de las células hospedadoras, los medios de cultivo usados para cultivar pueden seleccionarse de cualquier medio convencional. El cultivo puede llevarse a cabo bajo condiciones convenientes para el crecimiento de la célula hospedadora. Cuando las células hospedadoras crecen a la densidad de la célula apropiada, los métodos convenientes (tales como cambió de temperatura o inducción química) se utilizan para inducir a los promotores seleccionados, y después el cultivo se continúa durante otro periodo de tiempo.

Los polipéptidos recombinantes obtenidos de los métodos antes mencionados pueden expresarse en las células, en la membrana celular, o secretadas fuera de las células. En caso de necesidad, las proteínas recombinantes pueden aislarse y purificarse usando varios métodos de aislamiento basados én sus propiedades físicas, químicas, y otras. Estos métodos son bien conocidos por un experto en la técnica. Los ejemplos de estos métodos incluyen, pero no se limitan a: tratamiento de renaturalización convencional, tratamiento con los agentes de precipitación de la proteína (método de a sal), centrifugación, lisis osmótica de bacterias, tratamiento ultrasónico, ultracentrifugación, cromatografía del tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio I I iónico, cromatografía líquida del alto rendimiento (HPLC) y otra tecnología de la cromatografía líquida y una combinación de las misma.

Las plantas de transformación pueden lograrse usando la transformación de Agrobacterium o transformación del arma del gen, etc., tal como transformación mediada de Agrobacterium de i discos de la hoja. Las células, tejidos u órganos de planta transformados pueden regenerarse en las plantas usando métodos convencionales, resultando en plantas con resistencia mejorada a las enfermedades.

ELEMENTOS DE ACCION CIS Según lo utilizado en esta descripción, el término "elementos de actuación cis" se refiere a las secuencias que se localizan en las regiones flanquedas de genes y pueden afectar a la expresión de gen. Sus funciones son participar en la regulación de la expresión de gen. Un elemento de actuación cis no codifica por sí mismo ninguna proteína; este únicamente proporciona un sitio de actuación. Interactúa con los factores de actuación trans que resulta en sus funciones.

A través de la investigación, los inventores de la presente invención descubren: las proteínas DST de la presente invención tienen capacidades de unión de ADN. Sus elementos de unión central son elementos de actuación cis, TGCTANN(A/T)TTG, en donde N representa A, C, G o T. Los elementos de actuación cis de la presente invención se unen con factores de transcripción de DST, aumentando la sensibilidad a la sequía y sal en plantas, de tal modo que disminuyen la tolerancia a la sequía y sal en plantas. Los elementos de actuación cis ¡nteractúan preferiblemente con un dominio de dedo de zinc de DST.

Inversamente, si las interacciones entre los elementos de actuación cis y los factores de transcripción de DST de la presente invención se inhiben, resultaría en tolerancia a la sequía y sal en plantas mejorada.

METODOS PARA EL MEJORAMIENTO EN LA TOLERANCIA A LA SEQUIA Y SAL EN PLANTAS Según lo descrito en la presente descripción, las proteínas de DST de la presente invención, sus secuencias de codificación o las uniones de las proteínas de DST a los elementos de actuación cis tienen una relación estrecha con la tolerancia a la sequía y sal en las plantas. La inhibición de las proteínas de DST, sus secuencias de codificación o las uniones de las proteínas de DST con los elementos de actuación cis conducirían a la tolerancia realzada de sequía y sal mejorada en plantas.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en plantas inhibiendo las proteínas de DST, sus secuencias de codificación, o unión de las proteínas de DST a los elementos de actuación cis.

En una modalidad de la presente invención, los antagonistas de las proteínas de DST o sus secuencias de codificación pueden utilizarse para inhibir su expresión. Los antagonistas incluyen, pero no se limitan a: ARN de interferencia de la pequeña molécula, anticuerpos, reguladores negativos dominantes u oligonucleótidos antisentido. Un experto en la técnica, que ha conocido las proteínas de DST o sus secuencias de codificación, sabría cómo utilizar los métodos convencionales y pruebas para analizar y obtener a los antagonistas.

Según lo utilizado en la presente invención, el término "mutación no conservada" o "mutación no conservadora" se refiere a uno o más aminoácidos o sustitución de nucléótido, i supresión o inserción (preferiblemente, no conservado) en una proteína de DST o su secuencia de codificación, que resulta en la tolerancia a la sequía y sal mejorada en las plantas.

En otra modalidad de la presente invención, los métodos conocidos en la técnica pueden utilizarse para introducir mutaciones no conservadas en las proteínas de DST de la presente invención o de sus secuencias de codificación!. P°r ejemplo, las mutaciones del nucléótido en las secuencias de codificación de la proteína de DST pueden utilizarse para introducir mutaciones no conservadas en las secuencias de aminoácido de proteínas de DST que contengan la SEC ID NO.: 2, dotando a las plantas que contienen las secuencias del muíante con tolerancia a la sequía y sal mejorada. Por ejemplo, la mutación en el aminoácido 69, de la asparagina a ácido aspártico, o de la mutación en el aminoácido 162, de la alanina a treortina.

En otra modalidad de la presente invención, las plantas transgénicas con la expresión inhibida de los genes de DST o las proteínas pueden prepararse, y estas plantas transgénicas pueden cruzarse opcionalmente con las plantas no transgénicas u otras plantas transgénicas. Por ejemplo, las plantas pueden transformarse con los vectores que contienen el ARN de interferencia de molécula pequeña, vectores antisentido, vectores de regulación negativa dominante que se dirigen específicamente las proteínas de DST o sus proteínas o células hospedadoras codificadas que hospedan a los vectores.

METODOS PARA ANALIZAR PLANTAS TOLERANTES A LA SEQUIA Y SAL De acuerdo a las propiedades únicas de los genes de DST de la presente invención y de sus proteínas codificadas, la presente invención incluye adicionalmente métodos para analizar plantas tolerantes a la sequía y sal.

En una modalidad, un método de cribado de la presente invención incluye: (i) evaluar, en una planta candidato, el nivel de un factor de la transcripción de la proteína con dedo de Zinc de DST de la presente invención, el nivel de expresión de su polinucleótido de codificación, y/o el nivel de unión de un elemento de actuación cis de la presente invención a un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de DST; (ii) comparar el nivel detectado en la planta candidato en la etapa (i) -con el nivel correspondiente en una planta de control, si el nivel en la planta candidato es más bajo que el de la planta de control, entonces la planta candidato es una planta tolerante a la se¡quía y sal .

En otra modalidad, las técnicas de selección de marcador molecular conocidas en la técnica pueden utilizarse para introducir el gen de DST tolerante a la sal y sequía en otras variantes para analizar y cultivar nuevas variantes que son tolerantes a la sequía y sal. Los métodos pueden utilizar métodos de cruzamiento convencionales. Su ventaja está en que ninguna transferencia de gen se requiere, evitando preocupaciones con relación a la transferencia del gen. Los métodos pueden incluir: el diseño de los marcadores moleculares específicos para la secuencias mutantes no conservadas, usando los marcadores moleculares para analizar retoños del cruzamiento de los mutantes que tienen las secuencias mutantes no conservadas y otras variantes de arroz, de tal modo que la selección de plantas individuales abrigan las secuencias de muíante no conservadas. VENTAJAS PRINCIPALES DE LA PRESENTE INVENCION Las ventajas principales de la presente invención incluyen: (1) identificar los genes de DST y sus proteínas o polipéptidos codificados, y confirmar su relación con la tolerancia a la sequía y sal en las plantas, de tal modo que proporcionan nuevos métodos para estudiar la tolerancia a la sequía y sal en plantas; (2) proporcionar plantas transgénicas que tengan resistencia a la tensión de la sequía o sal, de tal modo que proporcionen materias primas y productos excelentes para producir y procesar granos, algodón y aceites; y (3) proporcionar métodos para analizar retoños tolerantes a la sequía y sal usando marcadores moleculares, los cuales pueden realizarse usando métodos de cruzamiento convencionales, sin la necesidad de la transferencia del gen, de tal modo que evita preocupaciones de seguridad en la transferencia del gen.

La presente invención proporciona nuevos métodos para mejorar la resistencia a la tensión de sal o sequía en plantas con gran potencial en aplicaciones.

Ejemplos La siguiente descripción, combinada con ejemplos específicos, ilustra adicionalmente la presente invención. Deberá entenderse que estos ejemplos se utilizan para explicar la presente invención y no deberán utilizarse para limitar el alcance de la presente invención.

En los siguientes ejemplos, cuando las condiciones no están especificadas en métodos experimentales, se basan generalmente en condiciones convencionales (por ejemplo, favor de ver, Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Labbratory Manual", tercera edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press) o condiciones de acuerdo a sugerencias de fabricantes. A menos que se indique lo contrario, se calculan los porcentajes y relaciones basadas en pesos.

A menos que esté definido de otra manera, todos los términos profesionales y científicos usados en la presente descripción tienen los mismos significados que los bien conocidos por el experto en la técnica. Además, cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción pueden utilizarse en la presente invención. Los métodos y materiales preferidos descritos en la presente descripción se utilizan únicamente para ilustración.

Varios medios usados en los ejemplos (medio de cultivo líquido YEB, medio de cultivo líquido AB, medio de cultivo líquido AAM, medio de cultivo N6D2, medio de cultivo, medio de cultivo N6D2C, pre-diferenciación del medio de cultivo, diferenciación del medio de cultivo, medio de cultivo 1/2 MSOH, medio de cultivo de arroz, medio de cultivo SD, etc.) se preparan de acuerd a las descripciones en las literaturas relacionadas (Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Hiei, Y., etc., Plant J., 1994, 6, 271-282) EJEMPLO 1: EXPERIMENTOS DE TRANSFERENCIA DEL GEN DST DE ARROZ 1. Generación de mutantes de DST que tienen alta tolerancia a la sequía y sal, sus características y localización subcelular.

Las semillas de arroz se tratan con 0.6% de EMS (metanosulfonato de etilo) para construir una biblioteca mutante de arroz que contiene aproximadamente 9,000 líneas mutantes de arroz. En análisis a gran escala de la librería muíante de arroz fue llevada a cabo bajo tensión de sal de cloruro de sodio 140 mm. Los fenotipos tolerantes a la sal y sequía fueron verificados sometiendo mutantes candidatos a la tensión repetida de sal de 140 mm de cloruro de sodio y 20% de PEG400 de tensión de sequía simulada. Se obtiene un mutante altamente tolerante a la sal y sequía (dst)).

Usar marcadores moleculares, el gen de DST se localiza preliminarmente en el cromosoma de arroz 3. Cruzando al mutante dst con tensiones sensibles a la sal, se construyen retoños F2 a gran escala. Usando marcadores moleculares para analizar retoños de cruzamiento del grupo, combinado con genotipos y fenotipos de los retoños de cruzamiento, fue realizada la clonación basada en el mapa. Esto condujo a la clonación exitosa de un gen de DST. El gen de DST codifica una proteína con dedo de zinc (factor de transcripción) de la función desconocida que tiene un dominio de dedo de zinc tipo C2H2 conservado. No se encuentra otra copia homologa de DST en el genoma de arroz, y no se encuentra el gen homólogo en el genoma de Arabidopsis. La longitud del gen genómico es 906 bp, sin intrones. El ORF integral (lectura-marco abierto) es 906 bp largo, codificando 301 aminoácidos. El peso molecular del producto de la proteína se estima para ser 29KDa (figura !l). El análisis de comparación de la secuencia muestra que el gen DST en este mutante contiene 2 mutaciones de nucleótido, que conducen a 2 sustituciones del aminoácido (aminoácido 69 se transforma de asparagina a ácido aspártico, y el aminoácido 162 se transforma de alanina a treonina) y resulta en un fenotipo resistente a la sal y sequía. Esta observación indica que DST es un regulador negativo para la resistencia a la sequía y sal.

Para determinar la localización del constructo de| fusión DST, DST y GFP (proteína fluorescente verde) se produce y transfiere en las células epidérmicas de la cebolla usando el método de arma del gen para la expresión transitoria. Las localizaciones de la fluorescencia dentro de las células se investigan usando un microscopio confocal de la fluorescencia. A través de este estudio subcelular de localización DST se encuentra por localizarse específicamente en el núcleo. 2. Construcción de plásmidos transgenes que contienen fragmentos genómicos de DST: Los clones BAC de arroz tipo silvestre se digieren con la enzima de restricción ApaL\, seguida por la polimerasa ADN TA para generar extremos redondeados, que después se digieren con i la enzima de restricción Sa/I. Un fragmento genómico 4.6fkb tipo silvestre (que contiene ORF integral de DST, región promotora, y del codón de suspensión con la región corriente abajo) se recupera así. Un vector binario de expresión de la planta pCAMBIAI 301 (comprado de CAMBIA) se digiere con ¡ EcoRI, seguido por la polimerasa de DNA T4 genera extremos redondeados, que se digiere con Sa/I y después se liga con los fragmentos recuperados mencionados anteriormente para construir con éxito el plásmido p-DST, que se utiliza para transformar mutantes y conducir experimentos de complementación. Todas las enzimas se compran de , Nueva Inglaterra Biolabs. 3. Construcción de los plásmidos de expresión DST-RNAi: Utilizar los oligonucleótidos en los extremos 5' y 3' como cebadores (SEC ID NO.: 4 y 5) para amplificar el fragmento de DST que tiene la región de codificación única (535-bp) por PCR. Ligar este fragmento con el vector p1300RNA¡ (obtenido modificando pCAMBIAI 300 a través de la inserción de un intrón como un enlazador, flanqueado por poli-A y poli-T en ambos extremos) para construir el plásmido de DST-RNAi.

La secuencia del cebador del oligonucleótido 5' es: 5'-AAGCTTTCCTTGCGAAGCCAAATAGC-3' (SEC ID NO. 4) La secuencia del cebador 3' es: 5'-GGATCCCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGA-3' (SEC ID NO. 5) 4. Arroz transgénico DST: Los dos plásmidos recombinantes descritos anteriormente se transfieren en la cepa de Agrobacterium EHA105 usando el método hielo-deshielo. Agregar 0.5-1 pg (aproximadamente 10 µ?) de plásmido de ADN a cada 200 µ? de las células competentes EHA105, mezclarlos, y después colocarlos sucesivamente en hielo, en nitrógeno líquido y en agua a 37°C durante 5 minutos cada uno. La mezcla de reacción se diluye a 1 mi con medio cultivo de líquido fresco YEB y después se incuban agitando a 28°C durante 2-4 horas. Tomar una parte alícuota de 200 µ? y esparcirla en una placa de YEB que contiene antibióticos de canamicina (Kan) (50 pg/ml). Incubar la placa a 28°C durante 2-3 días. Manchar las colonias obtenidas tres veces en las placas de YEB que contienen Can (50 pg/ml) para seleccionar colonias solas.

Recoger una sola colonia de Agrobacterium de la placa de YEB e inocularla en 3 mi de los medios de cultivo líquidos de YEB que contienen 50 pg/ml de antibióticos de Can e incubar con agitación a 28°C durante la noche. El día 2, transferir Í1 % de inóculo a 50 mi de un medio líquido AB que contiene 50( pg/ml antibióticos de Can y continua la incubación con agitación a 200 rpm hasta que OD6oo alcance aproximadamente de 0.6 a 0.8. Centrifugar el cultivo de Agrobactrium fresco a 5000 rpm y a 4°C durante 5 minutos. Recolectar y suspender nuevamente el gránulo en 1/3 volumen de medios de cultivo líquidos de AAM. Esta suspensión puede utilizarse para transformar los varios materiales del recipiente de arroz.

Este experimento utiliza un método de transformación mediado por Agrobacterim convencional para transformar el callo de los embriones de arroz Zhonghua 11 (o sus mutantes). Sumergir las semillas no maduras de Zhonghua 11 (12-15 días después de la polinización) en 70% de etanol durante un minuto, esterilizarlos en una solución de NaCIO (mezclada con agua en 1:3, agregar 2-3 gotas de Tween 20) durante 90 minutos o más, y enjuagar las semillas con agua estéril 4-5 veces. Después, los embriones de las semillas se recolectan usando un escalpelo y pinzas y son colocadas en placas en el medio de cultivo N6D2 para inducir la formación del tejido calloso, por el cultivo á 26 ± 1°C, en obscuridad. Después de 4 días, están listas para la transformación. i Sumergir los tejidos callosos embrionarios obtenidos en el medio líquido de Agrobacterium AAm fresco con agitación frecuente. Retirar los materiales de arroz después de 20 minutos, utilizar los papeles de filtro estéril para remover el excesó de la solución de bacterias, después transferirlos en el medio de cultivo N6D2C cubiertos con papeles de filtro estéril, y el co-cuítivo a 26°C durante 3 días. Agregar el Acetosyringone al medio de co-cultivo como el activador del gen Agrobaterium Vir, a una concentración de 100 µ????/?.

Después de 3 días, remover los tejidos callosos de los medios de co-cultivo, cortar los gérmenes y transferirlos al medio de selección N6D2S1 (medio N6D2 que contiene 25 mg/l Hyg) por selección. Después de 7-12 días, transferir los tejidos callosos resistentes a un medio de selección de N6D2S2 (medios N6D2 que contienen 50mg/l Hyg) y continuar la selección. ' Después de 10-12 días, transferir los tejidos callosos resistentes vigorosamente crecientes a los medios de cultivo de i ? pre-diferenciación e incubar por aproximadamente una semana. Después, transferirlos a los medios de cultivo de diferenciación para permitir diferenciarlos (12 h luz/día). Una vez que las raíces de las plantas del semillero regeneradas crecen en medios de cultivo de 1/2 MSOH, son transferidas a la tierra del recipiente y crecen en cámaras controladas por clima. 1 Después de que las plantas regeneradas sobrevivan la transplantación, se identifican las plantas transgénicas positivas usando los métodos conocidos en la técnica, detectando la ß-glucosidasa (Beta-glucuronidasa, GUS, ver Jefferson y colaboradores EMBO J. 6, 3901-3907, 1987) o manchando en las hojas con 0.1% de herbicida. Extraer el ADN total de las hojas de las plantas transgénicas positivas, y usar PCR para una verificación adicional de estas plantas transgénicas.

En experimentos posteriores, las plantas transgénicas de generación T2 obtenidas por los métodos antes mencionados se utilizan para investigar los fenotipos tolerantes a la sequía y sal, bajo tratamientos de tensión de sal y sequía (140 mM (NaCI), para confirmar las funciones del gen de DST.

EJEMPLO 2: CULTIVO DE LA PLANTA TRANSGENICA Y PRUEBA DE TENSION DE SEQUIA Y SAL Tomar las semillas del arroz transgénico obtenidas del EJEMPLO 1 e incubarlas en un horno a 45°C durante una semana para romper el letargo. Después, mojarlas con agua de la llave a temperatura ambiente durante 3 días, y prepararlos para germinar I a 37°C durante 2 días. Después de la germinación, manchar los semilleros en las placas de 96 pozos. Después, transferirlas a las incubadoras de luz, incubarlas a 30°C, y exponerlas a la luz durante 13 horas por día. Después de un día, disminuir gradualmente la temperatura a 28°C y 26°C e incubarlas por un día cada una, y cultivarlas a 20°C durante la noche. Después de que los semilleros todos han crecido, sustituir el agua de la llave con medios de cultivo de arroz y continuar cultivando.

Después de aproximadamente 14 días de cultivó, los semilleros crecieron en un estado de dos hojas y un corazón. Someterlos al tratamiento de sal en los medios de cultivo de arroz que contienen 140 mm de NaCI durante 12 días, o el tratamiento PEG en los medios de cultivo.de arroz que contienen 20% (m/v) PEG-4000 durante 7 días para simular la tensión de sequía.1 Con respecto al tratamiento de sequía en las tuberías de PVP (tubería de polivinilpirrolidona, 1.2 m alto, 20 óm en diámetro, dos orificios de drenaje en la parte inferior de la tubería), trasplantar los semilleros crecidos en la incubadora de agua durante 25 días en las tuberías de PVP que contienen tierra y cultivo de los semilleros en una cámara controlada por clima. La temperatura es de 24°C~30°C, y la humedad es de 50%~60%. Drenar el agua 30 días después de la trasplantación, abrir los orificios de drenaje inferiores para drenar el agua, y realizar los tratamientos de sequía durante 12 días.

La figura 2 y figura 3 muestran los resultados experimentales. Según se muestra en la figura 2, el dst muíante i de arroz tiene tolerancia significativamente más alta a la sequía y sal que el tipo silvestre (Zhonghua 11, ZH11). A través de la observación y comparación, también se encuentra: con respecto al tipo silvestre, los mutantes tienen más peróxido de hidrógeno (H202) acumulado alrededor de los estomas, una abertura de estoma más pequeña, contenidos de agua relativamente más altos en hojas bajo tensión de sequía. Así, los mutantes tienen resistencia más alta a la sequía. Además, debido a que los mutantes tienen una abertura de estoma más pequeña, una conductancia de estomas más baja, e índices de vaporización de agua más lenta, de tal modo que reduce el transporte de los iones de Na+ de raíces a las partes de tierra antes mencionadas (hojas, etc.) y disminuyendo la toxicidad de Na + , y por lo tanto, la tolerancia creciente de sal.

Según se muestra en la figura 3: la transfección del fragmento genómico de DST del arroz tipo silvestre (Zhonghua 11, ZH11) en un mutante de dst restaura el fenotipo sensible a la sal y sequía de tipo silvestre en las plantas complementadas transgénicas; considerando que cuando el nivel de expresión de DST es reducido por el ARNi (Zhonghua de transformación 11 ), la tolerancia a la sequía y sal en Zhonghua 11 se mejora significativamente.

Estos resultados muestran que: El gen de DST se reproduce con éxito y con ingeniería genética que implica el DST, la i resistencia a la tensión en arroz puede aumentarse significativamente.

EJEMPLO 3: ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DE LA ACTIVACION TRANSCRIPTIVA DE DST El igualador del sistema de dos híbridos de levadura GAL4 3 (Clontech) se utiliza para analizar la activación de transcripción de DST. Para construir el vector de control positivo pÁD, las secuencias (AD) del dominio de activación NLS y GAL4 son amplificadas por PCR e insertadas en sitios de corte de BamHI/Sall pGBKT7 (comprado de Clontech) (los cebadores son SEC ID NO.: 6 y 7) para fusionar con el dominio de unión del ADN GAL4 en pGBKT7.

Después, se utiliza PCR para amplificar ORF integral de DST (los cebadores son la SEC ID NO.: 8 y 9). Después de la confirmación por la secuencia, el producto PCR se construye en i el vector pGBKT7 en los sitios de BamHI y Sa/I para fundir con el dominio de unión de ADN GAL4 para obtener el vector de PGBKT7-DST. Varios vectores después se transforman en la levadura AH109. Después de crecer durante la noche, el cultivo se diluye y se coloca en placas en medios de cultivo SD sin Trp o sin tres aminoácidos (-Trp/-His/-Ade) . Después, observar el crecimiento de las levaduras y determinar la actividad de activación de transcripción de DST.

Las secuencias de cebadores de oligonucleótido son: 5'-AAAGGATCCAAGCGGAATTAATTCCCGAG-3' (SEC ID NO: 4 6); ! 5'-AAAGTCG ACCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGG-3' (SEC ID NO.: 7); 5'-AAAGGATCCTGATGGACTCCCCGTCGCCT-3' (SEC ID NO.: 8); 5'-AAAGTCGACCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGAG-3' (SEC ID NO.: 9).

Los resultados se muestran en la figura 4. Según se muestra en la figura: la proteína de DST de arroz tiene actividad de activación de transcripción, mientras que las proteínas del mutante DST y las proteínas con la supresión de la terminal N pierden la actividad de activación de transcripción.

Los resultados indican que pGBKT7-DST tiene una actividad de activación de transcripción más fuerte, y el dominio de activación de transcripción está localizado en la terminal N, indicando que DST es un factor de transcripción con actividad de I activación de transcripción.

EJEMPLO 4: ANALISIS DE LAS PROTEINAS DE DST Y ENSAYO DEL CAMBIO DE MOBILIDAD DE ELECTROFERESIS 1. Expresión de las proteínas procarióticas: ' Vector digestivo pGBKT7-DST con EcoRl y Sa/I para obtener el ADNc integral de DST, el cual después se reconstruye en PET32a( + ). Transfectar el vectro de expresión procariótico pET32a( + ) que contiene el DST recombinante en BL21, usar IPTG para inducir la expresión procariótica, y después purifiéar las proteínas usando las columnas His-tag (granos). 2. Generación del anticuerpo: Inmunizar conejos con las proteínas purificadas descritas anteriormente usando métodos convencionales para generar los anticuerpos anti-DST. 3. Sintetizar las pruebas, etiquetarlas con biotina, purificarlas i en geles PAGE, y recuperar las pruebas etiquetadas por electroelución. 4. Permitir las pruebas etiquetadas para reaccionar con las proteínas de DST expresadas procarióticas purificadas. Después, los complejos se someten a electroforesis de PAGE nativo y se transfieren sobre las membranas de nylon usando métodos de transferencia de la membrana semi-seca. Las membranas de nylon después se exponen a las películas de rayos 'X por autoradiografía para observar las vendas de cambio.

La figura 5 muestra los resultados experimentales. Según se muestra en la figura 5, DST tiene capacidad de unión del ADN. El elemento base para la unión de DST es: un elemento de actuación cis TGCTANN(A/T)TTG (SEC ID NO.: 3).

El presente estudio muestra que DST une al elemento de actuación cis que puede regular la expresión de genes corriente abajo, de tal modo que afecta la tolerancia a la sequía y sal en plantas. Por lo tanto, la unión de DST al elemento de actuación cis desempeña un papel importante en la regulación negativa de la tolerancia a la sequía y sal.

I EJEMPLO 5: EXISTENCIA DE HOMOLOGOS DE GENES DE DST EN DIFERENTES PLANTAS La búsqueda de base de datos (http://plantta.jcvi.org/index.shtml) revela, un homólogo del gen de DST en el sorgo (sorgo bicolor), con similitud de la protéína de 54.3%; tres homólogos de los genes en el genoma de maíz (Zea i mays), con semejanzas de la proteína de 51.7%, 36.1%, y 33.5%; un homólogo del gen de DST en el genoma de la cebada (Hordeum vulgare), con semejanza de la proteína del 38.4%; tres homólogos del gen en el genoma de la caña de azúcar (Saccharum officinarum), con semejanzas de la proteína del 38.2%, 38.2% y 34.5%.

Todos estos homólogos del gen han conservado dominios de i dedo de zinc tipo C2H2. Comparten el dominio de dedo de zinc idéntico. Al mismo tiempo, las semejanzas son altas en los dominios de la terminal N (la figura 6 muestra la secuencia compartida de estos homólogos del gen. La secuencia compartida es DGKDVRLFPCLFCNKKFLKSQALGGHQNAHKKERSIGWNPYFYM, es decir, posiciones 45-85 en la SEC ID NO.: 2). Las proteínas con dedo de zinc tipo C2H2 se unen a los elementos de actuación cis vía los dominios de dedo de zinc. Por lo tanto, existe una relación correspondiente entre estos homólogos del gen y los elementos de actuación cis, indicando que los homólogos del gen de DST de otras cosechas del Gramineae pueden compartir funciones similares como la del gen DST de arroz.

EJEMPLO 6: APLICACIONES DE ARROZ Y OTRAS TECNICAS DE SELECCION ASISTIDA POR EL MARCADOR MOLECULAR DE LAS COSECHAS DEL GEN DST EN MEJORAS GENETICAS DE CULTIVO PARA MEJORAR LA RESISTENCIA EN LAS COSECHAS A través de la mutagénesis química (EMS), dos mutaciones del nucleótido en el gen de DST se producen (A se transforma a G en el nucleótido 205, y G se transforma a A en el nucleótido 484), causando dos sustituciones de aminoácido (la asparagina se transforma al ácido aspártico en la posición 69, y la alanina se transforma a treonina en la posición 162), resultando en el fenotipo resistente a la sequía y resistente a la sal. Diseñar los siguientes dos pares de cebadores, SNP5 y SNP3, en el gen, de modo que los productos amplificados incluyen el primer punto de mutación y el segundo punto de mutación, respectivamente.

SNP-5S: ATGGACTCCCCGTCGCCT (SEC ID NO.: 10) SNP-5A: GTGCGCCGGGAGAAGCCC (SEC ID NO.: 11) SNP-3S: GCGGTGCCGACGTCGTTCCC (SEC ID NO.: 12) SNP-3A: GCCGCCGTCGTCGTCGTCTTC (SEC ID NO.:! 13) La primer punto de mutación genera un sitio de corte de la enzima de restricción de ScrF\, mientras que el segundo punto de mutación destruye el sitio de corte de la enzima de restricción de BstU\. Digerir los productos amplificados obtenidos con los cebadores SNP5 con ScrF\ produce fragmentos de 311 bp, y 31 85 bp, y 31 bp en el tipo silvestre, mientras que el producto mutante amplificado produciría fragmentos de 202 bp, 109 bp, 85 bp, y 31 bp, de tal modo que produce polimorfismo. Digerir los productos amplificados obtenidos con los cebadores SNP3 con BstU\ produce fragmentos de 66 bp, 40 bp, y 25 bp en el tipo silvestre, mientras que el producto mutante amplificado produciría fragmentos de 91 bp y 40 bp, de tal modo que también produce polimorfismo. Por lo tanto, estos pares de cebadores SNP5 y SNP3 pueden utilizarse como marcadores moleculares, para uso en la reproducción selectiva asistida por el marcador molecular.

Utilizar los mutantes de dst resistentes a la sal y sequía para cruzarlos con los variantes de arroz, y analizar a los retoños para que un marcador molecular o dos marcadores moleculares seleccionen individuos que llevan un gen mutante de DST. Después, cultivar las nuevas variantes (líneas) que tienen resistencia a la sal y sequía.

El método utiliza métodos convencionales de cruzamiento, sin la transferencia del gen, de tal modo que evita las preocupaciones de seguridad asociadas a la transferencia del gen. Por lo tanto, tales métodos son ventajosos.

Todos las literaturas citadas en la presente invención se utilizan como referencias en la presente aplicación, como si cada literatura se refiera singularmente. Además, deberá entenderse, que un experto en la técnica que ha leído la descripción de la presente invención descrita anteriormente podría cambiar o modificar varios aspectos de la presente invención. Estos t equivalentes se ubican dentro del alcance de las reivindicaciones anexas en la presente aplicación.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc, caracterizado en que el factor de transcripción comprende: un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 42-85 de la SEC ID NO.: 2, un polipéptido mutante conservado del mismo, o un homólogo de polipéptido del mismo.

2. El factor de transcripción de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que el polipéptido se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO.: 2; (b) un polipéptido derivado de (a), que tiene uno o .más residuos de aminoácido sustituido, suprimido, o insertado, y capaz de aumentar la sensibilidad de la sequía y sal en plantas; o (c) un homólogo del polipéptido de los polipéptidos de (a) -(b) que comprende un dominio estructural de dedo de zinc tipo Cys-2/H¡s-2 y capaz de aumentar la sensibilidad de la sequía y sal en plantas.

3. Un polinucleótido, caracterizado en que el polinucleótido comprende una codificación de secuencia del polinucleótido para el polipéptido de acuerdo a la reivindicación 1.

4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado en que una secuencia del polinucleótido se selecciona de: (a) una secuencia que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 1; (b) una secuencia que comprende la secuencia de 1r435 de la SEC ID NO.: 1; o (c) una secuencia complementaria a una de las secuencias de (a) - (b).

5. Un vector, caracterizado en que el vector comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3.

6. Una célula hospedadora genéticamente dirigida, caracterizada en que la célula hospedadora comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 5 o un genoma que tiene el polinucleótido de acuerdo a la reivindicación 3 integrada en: el mismo.

7. Un elemento de actuación cis, en donde el elemento comprende la secuencia de SEC ID NO.: 3 y puede unirse con el factor de transcripción de acuerdo con la reivindicación 1.

8. Un inhibidor o una secuencia mutante no conservada del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1, o del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3.

9. Un método para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en una planta, en donde el método comprende: inhibir del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1, inhibir la expresión del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, o inhibir la unión entre el elemento de actuación cis de acuerdo con la reivindicación 7 y el factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1; en donde, preferiblemente, el método comprende usar el i inhibidor de acuerdo con la reivindicación 8 o producir la secuencia mutante no conservada de acuerdo con la reivindicación en la planta, más preferiblemente, introducir mutaciones no conservadas en la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO.: 1 o la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO.: 2, o usar los inhibidores de la secuencia de nucleótido ø de la secuencia de aminoácido, más preferiblemente, introducir una mutación en el nucleótido 205 de A a G y una mutación en la posición 484 de G a A en la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO.: 1, o introducir una mutación en el aminoácido ¡ 69 de asparagina al ácido aspártico y una mutación en el amihoácido 162 de alanina a treonina en la secuencia del aminoácido de la SEC ID NO.: 2.

10. Un método para seleccionar una planta tolerante a la sequía y sal, que comprende: (i) determinar en una planta candidato un nivel del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdó con la reivindicación 1, un nivel de expresión del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, y/o un nivel de unión entre el elemento de actuación cis de acuerdo con la reivindicación 7 y el factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1; y (ii) comparar el nivel en la planta candidato determinada en la etapa (i) con un nivel correspondiente en una planta de control, si el nivel en la planta candidato es más bajo que del nivel en la planta de control, entonces la planta candidato es una planta tolerante a la sequía y sal.

11. Uso de un inhibidor o una secuencia mutánte no conservada del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1 o la secuencia de nucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 en el mejoramiento de la tolerancia a la -sequía y sal en una planta; en donde el inhibidor es preferiblemente un ARN de interferencia molecular pequeña, un anticuerpo, o un oligonucleótido antisentido que se dirige al factor de transcripción o la secuencia de nucleótido.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el mejoramiento a la tolerancia a la sequía y sal en la planta comprende: (i) poner en contacto la planta directamente con el inhibidor; (ii) introducir la secuencia mutante no conservadá en la planta; o (¡ii) diseñar un marcador molecular específico para la secuencia de la mutación no conservada, usando el marcador i molecular para seleccionar, de retoños de hibridación entre el mutante que contiene la secuencia de mutación no conservada y una variante de arroz, una planta individual que contiene la secuencia de mutación no conservada; en donde el marcador molecular comprende un par de cebadores de la SEC ID NO.: 10 y SEC ID NO. : 11, y/o un par de cebadores de la SEC ID NO.: 12 y SEC ID NO.: 13.

13. Un método para mejorar la tolerancia a la sequía y sal en una planta, en donde el método comprende: (A) proporcionar un inhibidor o una secuencia mutante no conservada del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1 o de la secuencia de nucleótido de acuerdo con la reivindicación 3; (B) someter a la planta a uno o más tratamientos seleccionados de: (i) poner en contacto la planta directamente con el inhibidor; (ii) introducir la secuencia mutante no conservada en la planta; o (iii) diseñar un marcador molecular específico del para la secuencia de mutación no conservada, usando el marcador molecular para seleccionar, retoños de hibridación entre el mutante que contiene la secuencia de mutación no conservada y una variante del arroz, una planta individual que contiene la secuencia de mutación no conservada; en donde el marcador molecular comprende un par de cebadores de la SEC ID NO.: 10 y la SEC ID NO.: 11, y/o un par de cebadores de la SEC ID NO.: 12 y la SEC ID NO.: 13.

14. Un método para producir una planta transgénica, caracterizado en que comprende: (1) transformar una célula de la planta, un tejido de la planta, o un órgano de la planta con un constructo que contiene una secuencia mutante no conservada del factor de transcripción de la proteína con dedo de zinc de acuerdo con la reivindicación 1 o una secuencia mutante no conservada del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3; (2) seleccionar una célula de la planta, un tejido de la planta o un órgano de la planta transformados por la secuencia mutante no conservada; y (3) regenerar una planta de la célula de la planta, del tejido de la planta o del órgano de la planta de la etapa (2), en donde la planta regenerada tiene una tolerancia a la sequía y sal más alta que una planta no transformada.