CN116814846B - 与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记及其在水稻耐盐性状鉴定和育种中的应用。本发明以强耐盐东乡普通野生稻渗入系为研究材料，利用连锁分析、BSA分析方法，在第4染色体上发掘到与水稻耐盐性相关的基因位点qSST4，具体位置为chr 4:1713994‑‑1714182，其与分子标记SST4‑1紧密连锁，并基于分子标记SST4‑1提供了鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法，可用于水稻品种耐盐性的改良。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记及其应用。
背景技术
盐胁迫是影响作物产量和品质的主要非生物胁迫之一。水稻属于中度盐敏感作物，在高盐碱条件下发芽率显著降低，幼苗生长受到抑制，有效分蘖数、结实率、穗数和千粒重等降低明显，单位面积产量下降严重；培育耐盐品种是解决在盐碱地上种植水稻的有效方式之一。
水稻耐盐性是由多基因控制的数量性状，多个研究人员利用重组自交系、近等基因系、染色体片段置换系等群体开展连锁定位和全基因组关联分析，已定位和克隆了多个贡献率大的水稻耐盐QTL。但是，当前研究大多利用的是水稻育成品种或者地方品种，而从野生稻资源中发掘耐盐相关基因还鲜有报道。野生稻是水稻的近缘野生种，蕴藏了大量抗逆基因；利用野生稻资源发掘耐盐基因，进而创制耐盐新种质，对于改良水稻品种耐盐性、扩大品种的遗传基础具有重要意义。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种快速鉴定水稻苗期耐盐性的方法。为了解决该问题，本发明利用强耐盐东乡普通野生稻渗入系为研究材料，在第4染色体上定位到耐盐性相关的基因位点qSST4，其耐盐性的增效效应来源于东乡普通野生稻，与分子标记SST4-1连锁。利用分子标记SST4-1，可用于品种耐盐性的鉴定和分子育种。
为了解决上述问题，本发明首先提供了一种东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记，是位于水稻第4染色体的SST4-1，在染色体位置为chr4:1713994---1714182，对于耐盐品种而言，该位点在1714036处有GTTTGTGAACTGAGAGTA的18 bp 插入（SEQ ID No.5）。更详细的，敏盐品种中该段核苷酸序列为189 bp：
GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTATTGAAGGAATAAAAATTTTTGATGGGTATTTTGGGACAAAGTTTGAATTCTAGAAATAGAAATAGATTTATTTTGTCAAACAGTAAATACATAATTTGACAAAATAGCTGTAGTTATCTGAAATTTACTCAAATTAATTGAAATGTGTACAAATTTGATGTTTTCCG（SEQ ID No.3）；而耐盐品种相应的该段核苷酸序列为207 bp：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTATTGAAGGAATAAAAATTTTTGGTTTGTGAACTGAGAGTAATGGGTATTTTGGGACAAAGTTTGAATTCTAGAAATAGAAATAGATTTATTTTGTCAAACAGTAAATACATAATTTGACAAAATAGCTGTAGTTATCTGAAATTTACTCAAATTAATTGAAATGTGTACAAATTTGATGTTTTCCG（SEQ ID No.4）。
本发明进而提供了鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的引物对。优选地，本发明提供的引物对由引物A和引物B组成；
所述引物A为如下：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTAT所示的单链DNA分子（SEQ IDNo.1）；
所述引物B为如下：CGGAAAACATCAAATTTGTACACAT所示的单链DNA分子（SEQ IDNo.2）。
上述引物对中，所述引物A和所述引物B的摩尔浓度比为1:1。
本发明提供了上述引物对在鉴定或辅助鉴定或辅助培育水稻耐盐性植株或品种中的应用。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的方法包括如下过程：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的耐盐性：
若PCR产物大小为189 bp，则待测水稻为或候选为敏盐水稻品种；
若PCR产物大小为207 bp，则待测水稻为或候选为耐盐水稻品种。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种选育耐盐水稻品种的方法。
本发明提供的选育耐盐水稻品种的方法包括如下过程：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；选择PCR产物大小为207 bp的待测水稻材料进行育种。
本发明的优点是：本发明利用强耐盐东乡普通野生稻渗入系研究材料，定位到野生稻耐盐基因位点qSST4，利用与该基因紧密连锁的分子标记SST4-1可以鉴定筛选耐盐水稻资源，为培育耐盐水稻品种提供亲本资源。本发明的分子标记可用于水稻苗期基因型鉴定和筛选，获得携带优异等位变异的植株，可以缩短育种周期。
附图说明
图1为强耐盐东乡普通野生稻渗入系IL91、强耐盐对照品种Pokkali和日本晴3个材料苗期耐盐性比较。
图2为强耐盐东乡普通野生稻渗入系IL91与受体亲本日本晴F2分离群体和亲本在SST4-1位点的电泳谱带图。P1和P2分别表示日本晴和IL91；1-34表示F2分离群体中随机选择的33个单株；IL91为携带野生稻qSST4等位基因的东乡普通野生稻渗入系，表现为苗期强耐盐；日本晴表现为苗期敏盐。
图3为分子标记SST4-1鉴定水稻品种苗期耐盐性的电泳谱带图。P1和P2分别表示日本晴和IL91；1-10表示开展苗期耐盐性鉴定的10个水稻品种。
实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的水稻品种或者种质：IL91、日本晴、旱稻红芒、水原91号、容城白芒子、稻品136、BNA258、镇79-1、庄463、云农4号、满大陆和双丰均来自国家作物种质库，公众可以从国家作物种质库申请并无偿获得。
实施例1、东乡普通野生稻耐盐基因qSST4及其紧密连锁分子标记的获得
一、水稻耐盐QTL定位及东乡普通野生稻耐盐基因qSST4的获得
1、供试材料
以东乡普通野生稻也供体亲本、日本晴为轮回亲本，通过多次回交，构建了一套野生稻渗入系。其中渗入系IL91在苗期耐盐性鉴定中表型为强耐盐，耐盐性与强耐盐种质Pokkali相当；该渗入系已种植到BC5F8世代，各性状表型稳定。苗期耐盐性定位群体是利用IL91为母本、日本晴为父本杂交形成的F2:3群体，包括307个株系。
2、基因型鉴定
在中国农业科学院作物科学研究所北京昌平试验基地种植供试材料，分蘖期取幼嫩叶片，按照Doyle和Dickson（1987）的十六烷基三乙基溴化铵法（CTAB）进行基因组DNA提取。利用均匀分布于12条染色体的203对引物鉴定F2:3群体的基因型。
PCR扩增反应体系20 μl，包括2 μl DNA（20 ng/μl）模板，2 μl（2 pmol，F+R）引物，2 μl 10×Buffer（Mg2+ Free），1.2 μl MgCl2（25 mM），0.1 μl dNTP（2.5 mM），0.2 μlrTaq（5 U/μl，TaKaRa）和12.5 μl ddH2O；扩增反应在Professional Thermocycler（BiometraInc.）扩增仪上进行，反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃30 sec，34个循环；72℃延伸5 min。PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（200V恒定电压，1.5小时）。
3、苗期耐盐性鉴定
将待测种子置于45℃的烘箱中放置1周，以打破休眠。每个株系选择150粒饱满完整的种子放入50 mL离心管中，用10%次氯酸钠灭菌；常温浸种24小时候，于30℃烘箱催芽2天；每个家系选40粒催芽均匀的种子置于96孔发芽板中，置于光照培养箱（白天28℃、晚上25℃，光照和黑暗时间分别为16小时和8小时，相对湿度60%）中培养3天，然后在Yoshida 营养液中继续培养10天（每2天更换一次营养液）至两叶一心期。盐处理使用含0.9% NaCl浓度的Yoshida 培养液，每两天更换一次NaCl培养液以保持盐浓度一致。处理10-14天后调查盐害症状及耐盐等级，分1 - 9级进行评价。
表1 耐盐等级调查标准
4、QTL定位
利用QTL IciMapping软件进行QTL定位分析，采用逐步回归的加性QTL似然比检验（RSTEP-LRT-ADD）），LOD阈值设置为2.5；QTL定位结果表明，位于第4染色体的qSST4位点（连锁标记为BS3-7）被检测到，LOD值为4.62，表型贡献率为19.24%；加性效应来自于东乡普通野生稻。
为了验证和进一步精细定位qSST4位点，针对F2:3群体，利用BSA分析，从F2:3群体株系中选取30个耐盐性强至极强和30个弱至极弱的单株，组成2个极端混池进行BSA分析。基于G-value分析法，在第2和第4染色体发现2个超过阈值的候选区间，分别为27.8~29.7 Mb，和0~1.90 Mb。
综合连锁定位和BSA定位，将qSST4定位在第4染色体的0~1.90 Mb区间内。
二、与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4紧密连锁的分子标记
针对qSST4定位区间，通过进一步设计多态性标记，并进行连锁分析，筛选到与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4紧密连锁的分子标记，即是位于水稻第4染色体的SST4-1，染色体上的具体位置为chr 4:1713994---1714182，18 bp插入位点为1714035。
引物扩增的全序列，具体染色体位置为chr 4:1713994---1714182，18 bp插入位点为1714035。就此设计检测的引物对，即利用primer Premier 5 软件，根据多态性位点、引物序列特异性、引物错配数和PCR产物长度等因素综合考虑，设计InDel分子标记。引物对如下：
正向引物：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTAT（SEQ ID No.1）；
反向引物：CGGAAAACATCAAATTTGTACACAT（SEQ ID No.2）。
其中，扩增敏盐品种的该段核苷酸序列为189 bp：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTATTGAAGGAATAAAAATTTTTGATGGGTATTTTGGGACAAAGTTTGAATTCTAGAAATAGAAATAGATTTATTTTGTCAAACAGTAAATACATAATTTGACAAAATAGCTGTAGTTATCTGAAATTTACTCAAATTAATTGAAATGTGTACAAATTTGATGTTTTCCG（SEQ ID No.3）；
而耐盐品种中，扩增该段核苷酸序列在位点1714035处插入了GTTTGTGAACTGAGAGTA（18 bp），所以长度为207 bp：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTATTGAAGGAATAAAAATTTTTGGTTTGTGAACTGAGAGTAATGGGTATTTTGGGACAAAGTTTGAATTCTAGAAATAGAAATAGATTTATTTTGTCAAACAGTAAATACATAATTTGACAAAATAGCTGTAGTTATCTGAAATTTACTCAAATTAATTGAAATGTGTACAAATTTGATGTTTTCCG（SEQ ID No.4）。
实施例2、水稻苗期耐盐鉴定方法及在水稻品种耐盐性鉴定中的应用
一、水稻苗期耐盐鉴定方法的基本步骤如下
1、提取待测水稻的基因组DNA，以DNA为模板、SST4-1分子标记为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
PCR反应体系、扩增程序和PCR产物检测同实施例1。
2、根据PCR产物大小确定待测水稻中胚轴伸长特性：
若PCR产物大小为189 bp，则待测水稻为或候选为长敏盐水稻品种；
若PCR产物大小为207 bp，则待测水稻为或候选为耐盐水稻品种。
二、水稻苗期耐盐鉴定方法在水稻品种耐盐性鉴定中的应用
1、供试材料
供试材料为日本晴、IL91、旱稻红芒、水原91号、容城白芒子、稻品136、BNA258、镇79-1、庄463、云农4号、满大陆和双丰；于中国农业科学院作物科学研究所北京昌平试验基地种植。
2、苗期耐盐性表型鉴定
按照实施例1步骤一中的方法对上述供试材料的苗期耐盐性进行鉴定。结果如表1所示。容城白芒子、稻品136和云农4号的苗期耐盐等级在3级及以下，表现为强或者极强耐盐性，与IL91耐盐性类似，均为耐盐材料；旱稻红芒、水原91号、BNA258、镇79-1、庄463、满大陆和双丰的苗期耐盐等级在5级及以上，属于耐盐性弱或者极弱材料，与日本晴耐盐性类似，均为敏盐材料。
表2. 供试水稻品种的基因型及苗期耐盐性鉴定结果
3、基因型鉴定
提取待测水稻的基因组DNA，以DNA为模板、SST4-1分子标记为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR反应体系、扩增程序和PCR产物检测同实施例1。
电泳结果如图2所示。泳道1-10分别为旱稻红芒、水原91号、容城白芒子、稻品136、BNA258、镇79-1、庄463、云农4号、满大陆和双丰；其中容城白芒子、稻品136和云农4号的PCR产物均为207 bp，按照实施例2中本发明的水稻耐盐性鉴定方法，这3个品种均为耐盐品种。旱稻红芒、水原91号、BNA258、镇79-1、庄463、满大陆和双丰的PCR产物均为189 bp，按照实施例2中本发明的水稻耐盐性鉴定方法，这5个品种均为敏盐品种。
由此可见，本发明的水稻苗期耐盐性的鉴定方法与步骤二中的苗期耐盐等级鉴定结果完全一致。说明本发明的水稻苗期耐盐性鉴定方法准确、实用。
Claims (9)
1.一种东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记SST4-1，其特征在于，所述分子标记SST4-1 由SEQ ID No.3 所示的核苷酸和SEQ ID No.4 所示的核苷酸组成，其中敏盐品种为如SEQ ID No.3 所示，所述SEQ ID No.3 的核苷酸序列为189 bp；耐盐品种为如SEQ ID No.4 所示，所述SEQ ID No.4 的核苷酸序列为207 bp。
2.将如权利要求1所述的分子标记SST4-1作为检查靶点鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性，或与水稻耐盐性的水稻品种育种。
3.鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的引物对，其特征在于，所述引物对用于检测如权利要求1所述的分子标记SST4-1，以区分敏盐品种或耐盐品种；
其中，所述引物对由引物A和引物B组成；
所述引物A为如下：GTGGGTAGGTTGGTAAGGGGTAT所示的单链DNA分子；
所述引物B为如下：CGGAAAACATCAAATTTGTACACAT所示的单链DNA分子。
4.鉴定或辅助鉴定水稻耐盐性的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求3所述的引物对。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物A和所述引物B的摩尔浓度比为1：1。
6.如权利要求3所述的引物对在鉴定或辅助鉴定或辅助培育耐盐水稻品种中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的耐盐性：
若PCR产物大小为189 bp，则待测水稻为候选敏盐水稻品种；
若PCR产物大小为207 bp，则待测水稻为候选耐盐水稻品种。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，还包括选择PCR产物大小为207 bp的待测水稻材料进行后续育种的步骤。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，通过电泳或测序的方法检测PCR产物的大小。
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