CN113862387A

CN113862387A - 水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113862387A
Application number: CN202111007901.XA
Authority: CN
Inventors: 刘鸿艳; 马孝松; 罗利军; 李恩熙
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-08-27
Also published as: CN113862387B

Abstract

本发明提供了一种水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，通过发明人对于水稻DNA基因组与耐旱性能地深入分析，筛选得到了与耐旱性能相关地分子标记OsNAC6_InDel_221，并设计得到合适地扩增序列，用于通过该分子标记筛选耐旱基因型，从而能够快速判断水稻的基因型以加快育种进程。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

Description

水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一个水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物。水稻产量对我国粮食安全起着重要的作用。近年来，随着全球气候变暖，干旱、高温等自然灾害频发，对农业生产造成了严重的威胁。水稻是用水大户，水稻生产消耗了我国50％的淡水资源。然而我国是世界13个贫水国之一，我国人均水资源占有量仅2400m³，淡水资源仅为世界人均的1/4。

干旱是影响水稻生长发育及产量的主要非生物胁迫。目前，中国旱灾发生的频率和范围在加大，培育耐旱水稻品种是抵御干旱胁迫的一种可行的途径。但水稻的耐旱性是多基因控制的复杂性状，同时还显著地与环境互作，更加剧了水稻耐旱机制的复杂性，我国水稻的生产正面临着水资源短缺危机。因此，在育种过程中我们需要选育耐旱水稻品种才能保证水稻在遭遇干旱胁迫时的高产稳产。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，具体技术方案如下：

一种水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，所述分子标记为OsNAC6_InDel_221，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如下：

OsNAC6_InDel_221F：5’-TAGCTAAATCCCGAAAGCAAATAAG-3’SEQ ID NO.1；

OsNAC6_InDel_221R：5’-CCACCATCGGCTTCCTCT-3’SEQ ID NO.2。

在其中一些实施例中，所述水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记位于1号染色体；优选地，由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对在基因组位置上下游200bp内扩增得到。

本发明还提供了一种分子标记OsNAC6_InDel_221在检测和/或预测水稻的耐旱性中的应用。

本发明还提供了一种分子标记OsNAC6_InDel_221在水稻育种中的应用。

具体地，所述水稻育种包括：

(1)检测、预测水稻的耐旱性；和/或

(2)鉴定水稻耐旱性调控基因OsNAC6的基因型；

筛选耐旱水稻品种。

具体地，所述筛选耐旱品种的判断标准为：

基因组DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物扩增后，电泳显示329bp的单条带表示所述样品含有强耐旱品种珍汕97B等位基因型；电泳显示550bp的单条带表示所述样品含有不耐旱的品种IRAT109等位基因型；电泳显示329bp和550bp两条带表示所述样品为OsNAC6杂合基因型。

本发明还提供了一种使用水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记基因型鉴定及水稻育种的方法，包括以下步骤：

提取供试水稻样品基因组DNA；

利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

琼脂糖凝胶检测扩增产物。

优选地，所述琼脂糖凝胶电泳检测根据电泳条带判断水稻产品的耐旱性。

具体地，

电泳显示329bp的单条带表示所述样品含有强耐旱品种珍汕97B等位基因型；或

电泳显示550bp的单条带表示所述样品含有不耐旱的品种IRAT109等位基因型；或

电泳显示329bp和550bp两条带表示所述样品为OsNAC6杂合基因型。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物，PCR buffer。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃18-22s，53±1℃下18-22s，72±1℃下28-32s进行30-35个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

本发明还提供了一种水稻耐旱性调控基因OsNAC6的鉴定试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，所述分子标记为OsNAC6_InDel_221。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括Taq酶，缓冲液等。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过发明人对于水稻DNA基因组与耐旱性能的深入分析，筛选得到了与耐旱性能相关的分子标记OsNAC6_InDel_221，并设计得到合适的扩增序列、引物，用于通过该分子标记筛选耐旱基因型，从而能够快速判断水稻的基因型以加快育种进程。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1是分子标记OsNAC6_InDel_221对9个水稻品种检测的电泳检测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面通过实施例对本发明进行水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记及其应用做进一步说明及详细介绍：

实施例1水稻耐旱性调控基因OsNAC6分子标记的开发

(1)供试材料：耐旱品种：珍汕97B；不耐旱品种：IRAT109。

(2)水稻基因组DNA提取方法：在研钵中，取12mg水稻叶片，加入适量的液氮，将水稻叶片研磨成粉末，加入400μL 1.5×CTAB(1.5％CTAB,75mmol/L Tris-HCl,15mmol/LEDTA,1.05mol/L NaCl,pH＝8.0)研磨成匀浆，再加入400μL 1.5×CTAB，吸取研磨液至1.5ml离心管中，加入560μL氯仿，混匀，11000r/min离心15min，取上清至另一离心管，加入预冷的等体积异丙醇，11000r/min离心5min，去上清，干燥沉淀物，最后加入120μL ddH2O溶解即可。

(3)基因分子标记OsNAC6的开发：OsNAC6位于第1号染色体，在日本晴参考基因组中基因ID号为：Os01g0884300。

(4)根据核苷酸序列差异，利用Primer Premier 3.0软件设计引物OsNAC6_InDel_221，其正反引物序列为：

OsNAC6_InDel_221F：5’-TAGCTAAATCCCGAAAGCAAATAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

OsNAC6_InDel_221R：5’-CCACCATCGGCTTCCTCT-3’(SEQ ID NO.2)。

(5)利用功能标记OsNAC6_InDel_221对供试水稻品种IRAT109与珍汕97B进行PCR扩增，PCR扩增体系为：50ng/μL水稻基因组DNA模板1μL，10uL 2×Taq Master mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，10uM的前后引物各0.5uL，补充dd H₂O至20uL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按98℃20s，53.5℃下20s，72℃下30s进行32个循环，最后72℃下延伸5min。

(6)取PCR产物8uL上样于0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，第9泳道为籼型水稻品种珍汕97B，条带大小分329bp；第10泳道为粳型水稻品种IRAT109的PCR产物，条带大小为550bp；第8泳道为珍汕97B/IRAT109杂种F1的PCR产物，两条带大小分别为329bp和550bp。从图1可以看出电泳条带清晰，差异明显。

(7)电泳切胶带回收/测序。胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的胶回收试剂盒(离心柱型，产品目录号：EG101-02)，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果见表1。

IRAT109：(SEQ ID NO.3)

TAGCTAAATCCCGAAAGCAAATAAGCAGTAATCGGACAGCGACTCGACCGGGATTAGTTAAACAATGGCTTGATTAATTAGATGCTGGAATTTGGAGCCTTCTGATAAGTttagggcctgtttggcacagctccagctccagcttcaccccttctggagctggagctcagccaaacagtttcggctccaccaaaacggggagtggagctgggtggagctctctcacaaaatgaactagagttgtggagttgggtttaggcagctccacaactccactccagactcaactcctggagttaaatttaggagttggagctgtaccaaacaggcccttaGTTTTGCACTTGGTACTTTAATTTTTTTTTGAGTGAGTGTAAATTTGTTTCTAAACTTTGTTTATGAATTTGTTTTGTATTGGTGCAGTTGGATGATTGGGTGCTGTGCCGGATTTACAACAAGAAGGGCGGGCTGGAGAAGCCGCCGGCCGCGGCGGTGGCGGCGGCGGGGATGGTGAGCAGCGGCGGCGGCGTCCAGAGGAAGCCGATGGTGG

珍汕97B(SEQ ID NO.4)

TAGCTAAATCCCGAAAGCAAATAAGCAGTAATCGGACAGCGACTCGACCGGGATTAGTTAAACAATGGCTTGATTAATTAGATGCTGGAATTTGGAGCCTTCTGATAAGTTTAGTTTTGCACTTGGTACTTTAATTTTTTTTTTGAGTGAGTGTAAATTTGTTTCTAAACTTTGTTTATGAATTTGTTTTGTATTGGTGCAGTTGGATGATTGGGTGCTGTGCCGGATTTACAACAAGAAGGGCGGGCTGGAGAAGCCGCCGGCCGCGGCGGTGGCGGCGGCGGGGATGGTGAGCAACGGCGGCGGCGTCGAGAGGAAGCCGATGGTGG

实施例2：OsNAC6_InDel_221分子标记的亲本多态性检测

(1)提取供试水稻品种基因组，提取方法同实施例1。供试水稻品种分别为：旱恢3号、旱恢15、秀水115、秀水123、沪旱15、湘晴、沪旱7B。

(2)PCR扩增，同实施例1。

(3)电泳检测，同实施例1。结果如图1所示，旱恢3号(第1泳道)、旱恢15(第2泳道)、秀水115(第3泳道)、秀水123(第4泳道)、沪旱15(第5泳道)、湘晴(第6泳道)、沪旱7B(第7泳道)。

注：其中1-10分别表示水稻品种旱恢3号、旱恢15、秀水115、秀水123、沪旱15、湘晴、沪旱7B、珍汕97B/IRZT109杂种、珍汕97B、IRAT109；M表示D2000Marker。

同时，对水稻的耐旱系数进行检测、计算。步骤如下：

将水稻种质资源材料播种育苗生长至4叶期，移栽至上海市农业科学院白鹤基地抗旱大棚内，每个材料种植4行7株，待生长至分蘖期开始干旱胁迫，直到抽穗后复水，成熟后收种脱粒测量单株产量。同时种植在水田作为对照测量正常水田单株产量。最终计算耐旱系数＝旱田单株产量/水田单株产量。

供试水稻的耐旱系数以及采用OsNAC6_InDel_221分子标记检测条带情况如下：

实施例3：OsNAC6_InDel_221分子标记的验证与应用

(1)利用OsNAC6基因分子标记OsNAC6_InDel_221对水稻耐旱品种珍汕97B与不耐旱品种IRAT109的杂种F₁代单株基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳分型，在杂种F₁单株中检测到有329bp和550bp两条带，说明该检测样品为OsNAC6杂合基因型，表明OsNAC6_InDel_221可以用于杂种F₁的鉴定，检测样品为OsNAC6基因杂合基因型。

(2)利用OsNAC6基因分子标记OsNAC6_InDel_221对175个IRAT109/珍汕97B的F₁₂代重组自交系的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别有92个株系含有珍汕97B的等位基因型(329bp条带)、83个株系含有与IRAT109一致的等位基因型(550bp条带)，重组自交系群体苗期(F₁₃)耐旱性鉴定方法为：将每个株系材料发芽种植于96孔板(带孔)的PCR板上，每个材料播种6个独立的PCR板，利用水培方法种植，待生长至4叶期的时候，每个株系选取3个PCR板的材料用20％的PEG6000进行干旱胁迫处理，另外3个PCR板的苗继续正常条件下生长，约10天，分别取样测量生物量，计算耐旱系数。耐旱系数＝干旱处理条件下的生物量/正常条件下的生物量。耐旱鉴定结果表明，含有珍汕97B等位基因型的株系平均耐旱系数为0.46，含有IRAT109等位基因型的株系平均耐旱系数为0.38。含有珍汕97B等位基因型株系的耐旱性极显著高于IRAT109等位基因型的株系(P＝2.0E-03)。

(3)利用OsNAC6基因分子标记OsNAC6_InDel_221对152份水稻种质资源的基因组DNA进行OsNAC6基因型鉴定，产物在0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现在110份种质资源中为329bp带型，42份种质资源为550bp带型，含329bp的水稻种质资源耐旱系数平均值为0.95，含有550bp的水稻种质资源耐旱系数平均值为0.26。含有329bp带型的水稻种质资源的耐旱性极显著高于含有550bp带型的水稻种质资源(P＝2.1E-05)。

(4)因此表明可以利用分子标记OsNAC6_InDel_221进行水稻耐旱性调控基因OsNAC6的鉴定和/或水稻耐旱性的分子标记辅助选择育种。辅助选择育种的具体判断标准如下：

如果有329bp的单条带，则表示该检测样品含有强耐旱品种珍汕97B的等位基因型；检测样品对应水稻的耐旱系数高。

如果有550bp的单条带，则表示该检测样品基因型为不耐旱品种IRAT109等位基因型；检测样品对应的耐旱系数较低，不适合干旱环境。

该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagctaaatc ccgaaagcaa ataag 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaccatcgg cttcctct 18

<210> 3

<211> 550

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

tagctaaatc ccgaaagcaa ataagcagta atcggacagc gactcgaccg ggattagtta 60

aacaatggct tgattaatta gatgctggaa tttggagcct tctgataagt ttagggcctg 120

tttggcacag ctccagctcc agcttcaccc cttctggagc tggagctcag ccaaacagtt 180

tcggctccac caaaacgggg agtggagctg ggtggagctc tctcacaaaa tgaactagag 240

ttgtggagtt gggtttaggc agctccacaa ctccactcca gactcaactc ctggagttaa 300

atttaggagt tggagctgta ccaaacaggc ccttagtttt gcacttggta ctttaatttt 360

tttttgagtg agtgtaaatt tgtttctaaa ctttgtttat gaatttgttt tgtattggtg 420

cagttggatg attgggtgct gtgccggatt tacaacaaga agggcgggct ggagaagccg 480

ccggccgcgg cggtggcggc ggcggggatg gtgagcagcg gcggcggcgt ccagaggaag 540

ccgatggtgg 550

<210> 4

<211> 329

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

tagctaaatc ccgaaagcaa ataagcagta atcggacagc gactcgaccg ggattagtta 60

aacaatggct tgattaatta gatgctggaa tttggagcct tctgataagt ttagttttgc 120

acttggtact ttaatttttt ttttgagtga gtgtaaattt gtttctaaac tttgtttatg 180

aatttgtttt gtattggtgc agttggatga ttgggtgctg tgccggattt acaacaagaa 240

gggcgggctg gagaagccgc cggccgcggc ggtggcggcg gcggggatgg tgagcaacgg 300

cggcggcgtc gagaggaagc cgatggtgg 329

Claims

1.水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，其特征在于，所述分子标记为OsNAC6_InDel_221，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如下：

OsNAC6_InDel_221F：5’-TAGCTAAATCCCGAAAGCAAATAAG-3’SEQ ID NO.1；

OsNAC6_InDel_221R：5’-CCACCATCGGCTTCCTCT-3’SEQ ID NO.2。

2.根据权利要求1所述的水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，其特征在于，所述水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记位于1号染色体，由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的引物对在基因组位置上下游200bp内扩增得到。

3.权利要求1或2所述的分子标记在检测和/或预测水稻的耐旱性中的应用。

4.权利要求1-3任一项所述的分子标记在水稻育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻育种包括：

(1)检测、预测水稻的耐旱性；和/或

(2)鉴定水稻耐旱性调控基因OsNAC6的基因型；

筛选耐旱水稻品种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述筛选耐旱品种的判断标准为：

7.一种使用水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记基因型鉴定及水稻育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

2)利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)琼脂糖凝胶检测扩增产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR buffer。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃18-22s，53±1℃下18-22s，72±1℃下28-32s进行30-35个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

10.一种水稻耐旱性调控基因OsNAC6的鉴定试剂盒，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻耐旱性调控基因OsNAC6的分子标记，所述分子标记为OsNAC6_InDel_221。